KR101969333B1

KR101969333B1 - 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 프로드러그의 증강된 치료적 용도

Info

Publication number: KR101969333B1
Application number: KR1020137024895A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 비. 파커; 에릭 제이. 소셔
Original assignee: 더 유에이비 리서치 파운데이션; 서던리서치인스티튜트
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2019-04-16
Also published as: CA2827645A1; JP6650953B2; EP2675483B1; US20130330315A1; EP2675483A2; AU2012219269A1; WO2012112984A2; EP3434288A1; WO2012112984A3; CA2827645C; AU2012219269B2; US20180360929A1; US10080784B2; US20220031817A1; JP2018080196A; CN103501824A; EP2675483A4; JP2014508757A; ES2699531T3; KR20140051843A

Abstract

푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 또는 이들 효소들 중 하나의 발현을 암호화하는 벡터의 용도는 복제하거나 복제하지 않는 표적화 세포의 직접적인 주사 억제제의 제조를 위해 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제에 의해 개열된 프로드러그와 함께 개시되어 있다. 표적화 세포는 정상적으로는 상기 도입된 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제를 발현하지 않는다. 상기 효소 및 프로드러그는 단일 투여 또는 표적화 세포에 대한 개별적인 주사 또는 투여로서 혼합 및 주사에 바람직하다. 상기 물질 및 프로드러그의 효능은 X선 방사선에 대한 표적화 세포의 노출을 통해 증강된다. 표적화 세포로의 투여 경로와는 무관한 프로드러그의 투여는 표적화 세포를 살해하거나 표적화 세포의 기능을 억제하기 위해 X선 방사선 요법과 조합하는 경우에 효과적이다.

Description

푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 프로드러그의 증강된 치료적 용도{ENHANCED THERAPEUTIC USAGE OF A PURINE NUCLEOSIDE PHOSPHORYLASE OR NUCLEOSIDE HYDROLASE PRODRUG}

본 발명은 일반적으로 세포 독성제를 산출하기 위해 원위치에서 제어된 프로드러그의 시험관 내 개열(cleavage)을 통한 세포 사멸의 유도에 관한 것으로, 특히 프로드러그, 치료용 방사선, 또는 이의 조합의 직접적인 원위치 주사와 동시에 개열을 실시함으로써 치료 효과의 증강에 관한 것이다.

관련 출원서

본 출원서는 2011년 02월 18일자로 출원된 미국 가출원 제 61/444,261 호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에서 참고로 인용되어 있다.

화학 요법은 다수의 인간 종양의 치료를 위한 중추이지만, 휴면 또는 느리게 분화하는 암에 대한 생체 내 효능이 좋지 않다(문헌[Takimoto 등, Cancer Management Handbook (11 ^th Edition), UBM Medica 2009]; 문헌[Sang 등, Trends Mol Med 2010; 16(1): 17-26]; 및 문헌[Mellor 등, Br J Cancer 2005; 93(3): 302-9]). 방사선 요법 및 전신 투여형 화학 요법은 DNA 복제를 교란시킴으로써 특이성을 달성하지만, 간헐적으로 주기를 이루는 휴면 중인 종양 조직을 제거할 수 없다. 분화하지 않는 종양 세포(추정상의 종양 줄기세포 구획을 포함함)를 파괴하는데 있어서의 무능력은 다수의 기타 종양들 중에서 전립선, 유방, 폐 및 결장의 낮은 성장 분획 종양을 포함하는 일반적인 인간 악성 종양에 대한 하나의 실패 이유로서 인지된다(문헌[Vessella 등, Cancer Biol Ther 2007; 6(9): 1496-504]; 및 문헌[Kusumbe 등, Cancer Res 2009; 69(24): 9245-53]). 특징 없이 높은 유사분열 지수(예를 들어, 약 40%의 성장 분획)를 갖는 고형 종양의 경우, 및 통상적인 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 누적 노출에 의해 분화하는 암세포 모두가 완전히 파괴된다는 것을 추정하는 경우에도, 질량은 여전히 2배 미만일 수 있으며, 이는 전처리 치수를 달성할 수 없다.

비-전이성 유방암, 전립선암, 후두암 및 뇌암은 일반적으로 한정적인 외과적 절제 이전에 근치 척도(debulking measure)로서 수술전 방사선 요법(XRT)으로 치료된다(문헌[DeVita 등, Principles and Practice of Oncology (8 ^th Edition). Ronald A. DePinho and Robert A. Weinbert, Eds. Lippincott Williams & Wilkins, 2008]). 국부적으로 침습성인 기타 비-전이성 종양은 생명 연장용 XRT에 적합하고, 내장(예를 들어, 위, 후두, 결장, 또는 기도)을 막는 수술 불가능한 악성 종양은 통상적으로 일시적 완화를 위해 국부적인 방사선 요법으로 치료한다(Washington 등, Principles and Practice of Radiation Therapy (3 ^rd Edition). Mosby, 2009]). 이들과 같은 종양은 변함없이 낮은 성장 분획을 나타내며, 임의의 시점에는 방사선 요법 및 가장 이용 가능하게는 화학 요법 둘 모두에 대해 반응성이 없게 된다.

상술한 바와 같은 일반적인 암을 포함한 국부적으로 침습성인 비-전이성 종양의 치료를 개선하기 위한 시도에서 더욱 새로운 몇몇 양상에서 발전이 있어왔다. 예를 들어, 극저온 기술, 자성 기술, 열적 기술 및 초음파 세포 제거 기술 모두가 연구되어 다양한 정도의 임상 전 성공 또는 초기 임상적 성공을 거두었다(문헌[Osada 등, Anticancer Res 2009; 29(12): 5203-9]; 문헌[Krishnan 등, Int J Hyperthermia 2010 Sep 21 [Epub ahead of print]]; 및 문헌[Margreiter 등, J Endourol 2010; 24(5): 745-6]). GDEPT(유전자-지향된 효소 프로드러그 요법; 소위 "자살 유전자" 전략)와 같은 실험적인 유전자 요법이 광범위하게 시험되어 왔지만, 적어도 2개의 이유 때문에 국부적으로 침습성인 비-전이성 종양에 대해 제한된 성공만이 달성되었다(문헌[GW Both. Curr Opin Mol Ther 2009; 11(4): 421-32]; 문헌[Altaner 등, Cancer Lett 2008; 270(2): 191-201]; 및 문헌[Dachs 등, Molecules 2009; 14(11): 4517-45]). 첫째, 현재 이용 가능한 유전자 전달 벡터를 이용한 종양 세포의 형질 도입 효율은 낮다 . 항암성 이식 유전자를 발현하는 소수의 악성 세포는 종종 종양 덩어리에서 형질 도입되지 않은 세포에 대해 강력한 방관자 효과를 나타내기에는 충분하지 않다. 둘째로, GDEPT는 종양 내 화학 요법을 활성화시키기 위해 주로 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제(HSV-tk) 유전자 또는 원핵생물의 시토신 디아미나아제(CD) 유전자를 이용해 왔으며, 이들 2개의 효소에 의해 생성된 화합물(간사이크로비르 모노포스페이트(gancyclovir monophosphate) 및 5-플루오로우라실(FUra) 각각)은 분화하는 종양 세포에 대해 주로 활성을 나타낸다. 낮은 형질 도입 효율, 빈약한 방관자 활성, 및 분화하지 않는 암 세포의 살해 실패는 진료소에서 비-전이성인 고형 종양에 대한 제1 생성 GDEPT 접근법의 실패에 책임이 있다.

대장균(E. coli)의 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(PNP) 유전자는 2-플루오로아데닌(F-Ade) 또는 6-메틸푸린(MeP)과 같은 매우 강력한 화합물을 종양 내에서 생성하는 것으로 나타났다(문헌Ungerechts 등, Cancer Res. 2007; 67: 10939-10947]; 문헌[Fu 등, Cancer gene Ther. 2008; 15: 474-484]; 문헌[Fu W, Lan 등, Cancer Sci. 2008; 99: 1172-1179]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2011 Jun;18(6): 390-8]; 및 문헌[Gadi 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 304: 1280-1284]). 이들과 같은 푸린 염기는 모든 세포에서 편재하고 있는 촉진된 확산 경로를 경유하여 대장균 PNP가 형질 도입된 세포 및 이웃하는 (방관자) 세포 사이에서 자유롭게 확산하고, 현저한 방관자 살해 효과를 부여한다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]). 상기 화합물은 RNA 및 단백질 합성을 교란시키는 특이한 기작에 의해 작동하며, 따라서 분화하는 종양 세포 및 분화하지 않는 (휴면) 종양 세포 둘 모두에 대해 생체 내에서 활성을 나타낸다(문헌[Parker 등, Biochem . Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]). F-Ade는 세포 내 대장균 PNP에 의해 2-F-2'-데옥시아데노신(F-dAdo) 또는 플루다라빈(fludarabine) 포스페이트(F-araAMP)와 같은 프로드러그로부터 생성될 수 있다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]; 문헌[Parker 등, Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, Human Gene Therapy 1998; 9: 1617-1626]; 문헌[Mohr 등, Hepatology 2000; 31: 606-614]; 문헌[Voeks 등, Gene Therapy 2002; 9: 759-768]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 1343-1357]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2003; 10: 23-29]; 문헌[Parker 등, Human Gene Therapy 1997; 8: 1637-1644]; 및 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 43-54]). 후자의 약제인 F-araAMP는 만성 림프성 백혈병의 치료를 위해 임상적으로 승인되었지만, 비림프성 악성 종양에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.

F-Ade는 FUra보다 항암제로서 약 1,000배 더 높은 활성을 갖는다. 이러한 효능에도 불구하고, 다수의 실험실에서는 F-Ade는 GDEPT의 일부로서 안전하게 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 1) 세포성 핵산 내로의 강력한 종양 내 격리, 2) 바로 인접하게 서로 이웃하는 (방관자) 암 세포에 의한 섭취와 함께 종양 세포 사멸 이후의 체계적인 구획 내로의 느린 방출, 및 3) 종양으로부터 방출된 임의의 화학 요법제의 광범위한 희석(숙주를 통한 희석)으로 인해, 상기 접근법은 다수의 동물 모델에서 안전하고 일관된 항종양 효능을 생체 내에서 초래한다(문헌[Ungerechts 등, Cancer Res . 2007; 67: 10939-10947]; 문헌[Fu 등, Cancer Gene Ther . 2008; 15: 474-484]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2011 Jun;18(6): 390-8]; 문헌[Gadi 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 304: 1280-1284]; 문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, Human Gene Therapy 1998; 9: 1617-1626]; 문헌[Mohr 등, Hepatology 2000; 31: 606-614]; 문헌[Voeks 등, Gene Therapy 2002; 9: 759-768]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 1343-1357]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2003; 10: 23-29]; 문헌[Parker 등, Human Gene Therapy 1997; 8: 1637-1644]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 43-54]; 문헌[Deharvengt 등, Int. J. Oncol. 2007; 30: 1397-1406]; 및 문헌[Kikuchi 등, Cancer Gene Ther. 2007; 14: 279-86]). 대장균 PNP 및 제1 생성 전략(HSV-tk 및 CD) 사이의 몇몇 직접적인 비교에 따르면, PNP 기반 기작에 의해 GDEPT가 실질적으로 증대되는 것으로 나타났다(문헌[Martiniello-Wilks 등, Human Gene Therapy 1998; 9: 1617-1626]; 문헌[등, Clin Cancer Res 1997; 3: 2075-80]; 문헌[Nestler 등, Gene Therapy 1997; 4: 1270-77]; 및 문헌[Puhlmann 등, Human Gene Therapy 1999; 10: 649-657]). 상기 접근법은 미국 임상 시험용으로 식품 의약국(Food & Drug Administration)에 의해 최근에 승인되었다(2010년 3월 19일자로 승인된 IND #14271).

휴면 종양 세포 및 종양 줄기세포의 방관자 살해(RNA 및 단백질 합성을 제거함으로써)와 함께 특히 대장균 PNP에 의한 생성 이후의 F-Ade 대사산물의 종양 내 반감기의 연장(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]; 문헌[Parker 등, Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]; 및 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2003; 10: 23-29])은 종양 조직 내부에 강력한 화학 요법제를 농축하기 위한 "포인트 및 제거" 양상으로서 PNP의 가능한 용도를 제시하였다.

화학 치료 약제에 의한 암 치료는 종양 내 주사와 동일하거나 우수한 것으로서 전신 투여에 의존해 왔다. 화학 치료제의 직접적인 종양 내 주사는 빈약한 종양 내 섭취, 종양 세포에서 화학 치료제의 빈약한 이용, 및 종양 세포의 무시 가능한 생체 내 치명성으로 인해 통상적인 선행 기술분야에서 항종양 효과를 유도하는 데에 있어 전신 경로보다 더욱 효과적인 것으로는 고려되지 않는다. 부가적으로, 정맥 내 또는 기타 전신 경로를 통한 전신 투여의 수행이 상대적으로 간단한 반면, 종양 내 투여는 엄격한 과정이다.

따라서 생체 내 표적 세포 및 특히 종양 세포에 대한 더욱 효과적인 억제 요법을 제공할 필요성이 존재한다. 표적 세포에 대한 방관자 억제 효과를 향상시키고 장기간 동안 이 같은 효과를 유지할 필요성이 또한 존재한다.

푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 또는 이들 효소들 중 하나의 발현을 암호화하는 벡터의 용도는 복제하거나 복제하지 않는 표적화 세포의 직접적인 주사 억제제의 제조를 위해 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제에 의해 개열된 프로드러그와 함께 개시되어 있으며, 이때 상기 표적화 세포는 정상적으로는 상기 도입된 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제를 발현하지 않는다. 상기 효소 및 프로드러그는 단일 투여 또는 표적화 세포에 대한 개별적인 주사 또는 기타 투여 경로로서 혼합 및 주사에 바람직하다. 상기 효소의 세포 내 발현은 효능을 향상시킨다. 본 발명의 물질의 용도는 형질 감염된 세포 및 상기 효소를 함유하는 세포 내 유체에 인접한 세포가 프로드러그 개열에 의해 방출된 약제와 접촉하는 세포의 기능을 억제하거나 상기 세포를 살해하는 방관자 효과의 결과로서 종양을 치료하는데 있어서 특히 효과적이다. 상기 물질 및 프로드러그의 효능은 X선 방사선에 대한 표적화 세포의 노출을 통해 증강된다.

복제하거나 복제하지 않는 표적화 세포를 억제하는 공정이 또한 제공된다. 여기서, 상기 공정은 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제의 표적화 세포로의 전달을 포함한다. 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제에 의해 개열된 프로드러그는 표적화 세포를 살해하거나 상기 표적화 세포의 기능을 억제하기 위해 표적화 세포의 인접부에 직접 주사되어 상기 표적화 세포에 대해 독성을 갖는 푸린 염기를 방출한다. 상기 공정은 특히 종양 내로의 투여를 위해 매우 적합하다. 상기 표적화 세포에 대한 인접부 내로 직접 전신 투여되는지의 여부와는 무관한 프로드러그의 투여는 표적화 세포를 살해하거나 상기 표적화 세포의 기능을 억제하기 위해 X선 방사선 요법과 조합하는 경우에 효과적이다.

본 발명에 따르면, 정상적으로는 발현되지 않는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 및 이의 프로드러그는 단일 투여 또는 표적화 세포에 대한 개별적인 주사 또는 기타 투여 경로로서 혼합 및 주사에 바람직하고, 상기 효소의 세포 내 발현은 효능을 향상시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 물질 또는 이의 프로드러그는 방관자 효과의 결과로서 종양을 치료하는데 있어서 특히 효과적이며, 이의 효능은 X선 방사선에 대한 표적화 세포의 노출을 통해 증강될 수 있다.

도 1은 5%의 세포에서 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에 대한 전신의 복강 내(IP) 플루다라빈 포스페이트(F-araAMP)의 상이한 스케줄의 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 2a는 10%의 종양 세포에서 대장균 PNP을 발현하고, 그 결과 항종양 활성을 야기하는 종양 내로의 종양 내 주사된 F-araAMP의 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 2b는 어떠한 세포도 대장균의 PNP 활성을 발현하지 않는 D54 종양에서 고농도의 F-araAMP의 종양 내 주사 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 2c는 10%의 세포가 대장균의 PNP 활성을 발현하는 D54 종양의 성장에 대한 종양 내로의 F-araAMP의 주사 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 2d는 어떠한 세포도 대장균의 PNP 활성을 발현하지 않는 D54 종양의 성장에 대한 종양 내로의 F-araAMP의 주사 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 3은 대장균 PNP를 발현하지 않는 종양 내로의 F-araAMP의 직접적인 종양 내 주사(1일 1회 또는 1일 2회)가 종양의 성장에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 보여주는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 4는 10%의 종양 세포에서 대장균 PNP를 발현하는 종양 내로의 F-araAMP의 직접적인 종양 내 주사가 매우 양호한 항종양 활성을 초래하며, 6회의 주사에 의한 항종양 활성이 3회의 주사보다 더욱 양호하다는 것을 보여주는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 5a는 24㎎의 종양 내 프로드러그의 높은 F-araAMP 투여 처방에서 F-araAMP와 함께 아데노바이러스 벡터(Ad) PNP의 D54 종양에 대한 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 5b는 보다 적은 F-araAMP 투여 처방(18㎎)에서 F-araAMP와 함께 아데노바이러스 벡터(Ad) PNP의 D54 종양에 대한 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 5c는 직접적인 종양 내 투여의 다양한 순서 및 기원이 상이한 PNP 순서 하에서의 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 6a는 어떠한 세포도 대장균의 PNP 활성을 발현하지 않는 D54 종양의 성장에 대한 종양 내로의 직접적인 종양 내 주사를 통한 F-dAdo의 효능을 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 6b는 10%의 세포가 대장균의 PNP 활성을 발현하는 D54 종양의 성장에 대한 종양 내로의 직접적인 종양 내 주사를 통한 F-dAdo의 효능을 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 7a는 DU145 종양에 대한 종양 내 F-araAMP 및 Ad/PNP의 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 7b는 NCI-H322M 비-소세포 폐 선암종에 대한 종양 내 F-araAMP 및 Ad/PNP의 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 8a는 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에 대한 방사선과 함께 F-araAMP의 종양 내 주사 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이고;
도 8b는 다양한 방사선 처방을 위해 10%의 D54/PNP 종양에 대한 방사선과 함께 F-araAMP의 복강 내(IP) 주사 효과를 나타내는 시간의 함수로서의 종양의 중량의 도면이다.

본 발명은 표적 세포 덩어리를 억제하고, 특정 실시형태에서는 생체 내 종양 성장을 억제하는데 있어서 유용성을 갖는다. 놀랍게도 이는 효소에 의한 개열 시에 세포 독성 염기가 종양과 같은 표적화 세포 덩어리 내에서 수득되고, 효소를 함유하거나 발현하는 것이 경구, 비경구(예를 들어, 정맥 내), 근육 내, 복강 내 또는 경피 내 전달 경로를 비롯한 통상적인 전신 전달 경로보다 더 효과적인 것으로 일반적이면서 특별하게도 직접적인 종양 내 주사에 의해 표적화 세포에 대해 프로드러그의 직접적인 인접 투여용으로 발견되었다. 이는 상기 효소가 표적화 세포 내에서 세포 내 활성화 되는 경우에 더욱 더 효과적인 것으로 주지된다.

통상적으로, 프로드러그의 직접적인 종양 내 주사는 부분적으로는 충분히 혈관 형성된 천연 종양 및 상술한 기타 견지로 인해 프로드러그의 전신 전달에 비해 불필요하고 비효율적인 것으로 도외시되었다. 투여 경로와는 무관하게, 상기 효소를 발현하거나 상기 효소에 인접한 세포로의 이 같은 프로드러그의 투여는 종양의 조사와 결부되는 경우에 더욱 효과적인 것으로 된다. 이는 PNP 또는 NH가 방사선 증감제인 것으로 공지되어 있지 않기 때문에 놀랄만한 것으로 간주되며, 상기 각각의 효소는 단독 또는 프로드러그 기질의 존재 하에 사용된다.

본 발명은, 높은 수준의 방관자 억제 및 살해를 초래하는 비-숙주성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(PNP) 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제(NH)를 발현하는 표적 세포의 인접부 내로 플루다라빈 포스페이트와 같은 프로드러그의 주사; 및 쥐 모델에서 대형 인간 종양 이종 이식편의 생체 내 파괴에 기반을 두고 있다. 프로드러그의 투여율과는 무관하게, 비-숙주성 PNP 또는 NH 및 상기 효소에 대한 프로드러그 기질은 방사선 요법을 증대시키고, 특이한 기작에 의해 작동한다. 특히, 프로드러그로부터 2-플루오로아데닌 또는 기타 독성 푸린의 종양 내 생성은 향상된 효과를 나타내며, 여기서 상기 2-플루오로아데닌 또는 기타 독성 푸린은 전신 구획으로 천천히 방출되어, 숙주 내에서 충분히 희석된다. 대형 피하 종양에 대장균 PNP를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 주사 이후 플루다라빈 포스페이트 또는 기타 프로드러그의 주사는 종양의 퇴화 및 종양 성장의 지연된 억제를 초래한다. 이용 가능한 약제에 대해 내성을 갖는 종양이 1) 암 조직 내에 강력한 화학 요법제의 트래핑(trapping) 및 2) 적정(titration) 가능한 방식으로 악성 유조직(parenchyma)의 파괴를 제공하기 위해 반복 치료(예를 들어, 1일 기준)에 의해 안전하게 침투되는 항암 과정이 제공된다.

연장된 표적 세포 억제는 서방형 제형에서 표적 세포에 대한 프로드러그의 직접적인 주사에 의해 증진된다. 프로드러그의 연장된 방출은 낮은 성장 분획을 갖는 종양의 억제를 증진시킨다.

본원에서 작동 가능한 효소는 대장균, 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 또는 실제로는 프로드러그 기질을 전환하여 세포 독성 푸린 염기를 생산할 수 있는 임의의 기타 비인간으로부터 수득된 것과 같은 비인간 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(PNP) 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제(NH)이다. 적합한 프로드러그와 함께 비-숙주성 뉴클레오시드 하이드롤라아제는 본 발명을 실시하기 위한 기반으로서 본원에서 또한 작동 가능한 것으로 인지된다. 하이드롤라아제의 개열을 통해 얻어진 프로드러그는 비교적 높은 세포 독성을 갖는 화합물을 생산하기 위해 선택된다. 미국 특허 제 US 7,488,598 호에 개시된 것들과 같은 돌연변이체 PNP 및 하이드롤라아제는 프로드러그로부터 세포 독성 푸린 염기를 생성하도록 본원에서 작동 가능하며, 형질 감염되어 있거나 단순히 상기 효소에 인접해 있는 이들 인간 개체 세포의 재생 및 심지어는 살해와 같은 세포 기능을 억제하기에 적합한 것으로 추가로 인지된다. 본원에서 사용된 바와 같은 효소는 충분한 효능을 갖는 세포 독성 푸린 염기가 방관자 효과를 나타내도록 하며, 그 결과 방관자 세포뿐만 아니라 형질 감염된 세포 및 형질 도입된 세포를 억제하는 것으로 인지된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인접"이란 용어는 약 50개의 인접한 세포 직경의 간격 또는 등가의 선형 간격, 바람직하게는 20개의 인접한 세포 직경 또는 등가의 선형 간격 내의 표적 세포에 인접한 종양뿐만 아니라, 예를 들어 종양 덩어리와 같은 한정된 조직 덩어리 내로의 직접 도입을 의미하도록 의도된다.

본원에서 작동 가능한 프로드러그는 여전히 개체 세포에 대해 비교적 독성을 나타내지 않는 특성을 가지며, 상기 프로드러그의 효소적 개열 시에는 세포 독성 푸린 염기를 생산한다. 대표적인 프로드러그는 당해 기술분야에 공지되어 있다(문헌[Ungerechts 등, Cancer Res. 2007; 67: 10939-10947]; 문헌[Fu 등, Cancer Gene Ther. 2008; 15: 474-484]; 문헌[Fu 등, Cancer Sci. 2008; 99: 1172-1179]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy In press]; 문헌[Gadi 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 304: 1280-1284]; 문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]; 문헌[등, Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, Human Gene Therapy 1998; 9: 1617-1626]; 문헌[Mohr 등, Hepatology 2000; 31: 606-614]; 문헌[Voeks 등, Gene Therapy 2002; 9: 759-768]; 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 1343-1357]; 문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2003; 10: 23-29]; 문헌[Parker 등, Human Gene Therapy 1997; 8: 1637-1644]; 및 문헌[Martiniello-Wilks 등, J. Gene Med. 2004; 6: 43-54]). 하기 데이터에는 F-dAdo 및 F-araAMP의 문맥과 관련하여 본 발명의 실시가 상세하게 개시하고 있을지라도, 이들 결과는 기타 프로드러그로 확대 가능한 것으로 인지된다.

D54 인간 신경교종 모델은 몇몇 이유로 인해 대장균 PNP/F-araAMP의 안전성 및 효능을 조사하기 위해 선택된다. 먼저, 마우스에서의 D54 종양은 인간의 신경교종 치료를 위해 임상적으로 승인된 BCNU와 같은 화합물을 포함한 통상적인 화학 치료제에 대해 내성을 갖는다. 둘째, 상기 D54 모델은 마우스에서 비교적 느리게 성장하고(배가 시간: 10 내지 15일), 하나의 접근법이 분화하는 종양 세포 및 분화하지 않는 종양 세포 둘 모두를 살해하는 지의 여부를 조사하기 위한 수단을 제공한다. 후술된 F-araAMP의 투여 스케줄이 3일에 걸쳐 이루어지기 때문에 완전한 퇴화 또는 치유는 종양 덩어리의 비-확산성 구획의 파괴를 확립한다. 셋째, 인간 신경교종은 GDEPT의 임상적 시험을 위한 표적이었다. 인간 D54 종양은 화학 요법, 방사선 요법 및 유전자 요법 기반의 개입에 대해 고도로 내성을 갖는다. 비록 신경교종 모델이 본 분석을 위해 선택되었을 지라도 F-Ade 또는 기타 프로드러그와 같은 푸린 염기에 의한 세포 살해(RNA 및 단백질 합성의 파괴)의 확립된 기작은 다양한 악성 세포 유형에 대해 활성을 나타내는 것으로 인지되어야 한다(문헌[Parker 등, Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]). 하기 실험에서는 렌티바이러스성 형질 도입 또는 아데노바이러스성 유전자 전달 이후에 휴면 종양 세포의 제거가 개시되어 있다. 다수의 기타 유전자 전달 벡터 및 암호화된 효소에 대한 프로드러그 기질뿐만 아니라 DU145를 포함한 기타 종양은 본원에서 작동 가능한 것으로 인지된다.

본 발명의 요법의 범위 및 효능을 탐구하기 위해, NCI-H322M 비-소세포 폐 선암 세포주가 또한 연구된다. 통상적인 화학 요법 및 방사선 요법 프로토콜에 따르면, 이러한 암에 걸린 환자는 5년 생존율이 15% 미만이다. NCI-H322M은 상기 종양이 통상적인 요법에 대해 일반적으로 내성을 갖는다는 점에서 다수의 D54 인간 신경교종의 특성을 공유한다. 분화하는 NCI-H322M 세포 및 분화하지 않는 NCI-H322M 세포 둘 모두를 살해하는 본 발명의 능력에 의해 다양한 표적 세포 유형을 살해하거나, 그러지 않는 경우에 상기 표적 세포 유형에서 세포 기능을 억제할 수 있는 청구된 발명의 개론이 증명된다.

본 발명에는 종양 유조직에서 일반적이면서 구체적으로 표적 세포의 부피 내에서 매우 강력한 세포 독성제를 특이적으로 생성하기 위한 공정이 개시되어 있다. 본 발명의 전략은 종양 덩어리 내에서의 생성 이후에 F-Ade의 제한된 확산 반경, 및 죽어가는 종양 세포로부터의 방출 이후에 광범위한 희석(혈청에서 측정 불가능한 F-Ade 수준까지의 희석)에 기초하여 안전한 것으로 나타났으며, 일관된 생체 내 방관자 살해를 제공한다. 본 발명의 항종양 활성 기작은 또한 근본적으로는 GDEPT에 대한 기타 모든 접근법과는 상이하다. F-Ade의 항종양 활성은 RNA 및 단백질 합성의 붕괴에 기인하며, 이는 분열하는 종양 세포 및 분열하지 않는 종양 세포 둘 모두의 제거를 야기한다(문헌[Parker 등, Biochem. Pharmacol. 1998; 55: 1673-1681]). 비교적 느리게 성장하는 D54, NCI-H322M 또는 DU145 종양이 종양 내 치료 3일 정도에 덩어리 크기가 감소한다는 발견(특히 도 5a, 도 5b 및 도 7b뿐만 아니라 도 2c 참조)에 따르면, 순환하는 종양 세포 및 순환하지 않는 종양 세포 둘 모두에 대해 생체 내 활성을 나타낸다.

본 발명의 F-araAMP의 종양 내 주사는 프로드러그에 대한 전신 노출을 최소화하고, 종양 조직 자체와 같은 표적 세포 덩어리 내의 약제 수준을 최대화한다. F-araAMP 또는 기타 프로드러그의 종양 내 주사 이후의 현저한 항종양 활성은 PNP 또는 NH 발현 환경에서 현저하다. 종양 내 F-araAMP 주사와 Ad/PNP의 조합은 Ad/PNP보다 유의하게 더 효과적이고, 이어 본 발명에 따른 전신성 F-araAMP보다 더 효과적인 것으로 본원에 언급되어 있다. 프로드러그의 주사는 PNP 또는 NH를 갖는 단일 볼보스(bolus)로 투여되는 경우, 또는 유조직에 존재하는 비-인간 PNP 또는 NH 효소에 비해 일시적으로 치환되는 주사로 투여되는 경우에 효과적인 것으로 언급되어 있다.

이들 결과에 따르면, 인간 개체에서의 필적할만한 전략을 적용하기 위한 간단한 수단이 제시되며, 벡터 친화성(vector tropism)의 개질, 증강된 방관자 살해, 또는 재표적화가 필요하지 않다. 아데노바이러스 벡터 및 F-araAMP 둘 모두는 이전 임상 실험에서 광범위하게 연구되어 왔다. 게다가, 마우스에서 300㎎의 종양을 치료하기 위해 국부적인 요법으로서 제시된 F-araAMP의 투여량(3회 투여된 양: 3 내지 24㎎)은 인간에서 표준 임상적 관리의 일부로서 일상적으로 투여된 F-araAMP의 양(투여 당 약 40㎎×매 4주마다 제공된 1일 5회 투여량)보다 훨씬 적다. 본 발명은 F-araAMP, F-Ade, 또는 기타 PNP 개열된 프로드러그에 대한 전신 노출을 최소화하면서 큰 종양 영역을 순서적으로 파괴하기 위해 빈도(예를 들어, 1일) 기반으로 Ad/PNP에 이어 F-araAMP가 주사바늘이 접근 가능한 종양(전립선암, 유방암, 두경부암, 또는 방사선학 지침서에 따른 기타 종양 덩어리)에 반복적으로 투여되는 치료적 양상을 제공한다. "포인트 및 제거" 접근법은 증식하지 않는 종양 세포에 대한 활성과 함께 F-Ade의 강력한 항종양 활성 및 이의 높은 방관자 활성으로 인해 PNP GDEPT 접근법에 대해 특이적으로 실행 가능하다. F-Ade의 종양 내 생성은 상기 약제를 종양 내 농축하고 숙주에서 전신 노출을 최소화하기 위한 수단을 제공해야 한다.

방사선 요법은 주로 활발하게 분화하는 종양 세포를 표적화하지만, 특히 괴사 영역 내의 휴면 종양 조직을 제거하지 못한다(문헌[Puhlmann 등, Human Gene Therapy 1999; 10: 649-657]). 본 발명은 PNP 또는 NH 프로드러그와 조합하는 경우에 방사선 요법의 증강을 제공한다. XRT와 다른 기작을 통해 작용하는 매우 강력한 항암제가 고형 악성 종양의 순환하지 않는 구획을 치료하기 위해 본원에 제공된다. 분화하는 종양 세포 및 분화하지 않는 종양 세포 둘 모두를 강력하게 살해하는 F-Ade는 이러한 점에서 바람직한 화합물이다. 외과적 절제 이전에 방사선 요법이 실시되는 일반적인 종양(치료적 또는 완화적 의도로 치료되는 신경교종, 유방암, 전립선암, 두경부암, 폐암, 및 기타 암)도 또한 본 발명의 조합 요법으로부터 이익을 얻는다.

상술한 본 발명의 방법에서, 살해될 포유류 세포는 종양 세포일 수 있다. 임의의 고형 종양의 악성 여부와 무관하게 상기 고형 종양을 포함하는 세포는 PNP 또는 NH 유전자를 선택적으로 상기 종양을 포함하는 적어도 작은 비율의 세포에 전달하거나 상기 PNP 또는 NH 유전자를 발현하는 능력에 기초한 본 발명에 의해 살해될 수 있다. 예를 들어, DNA를 함유하는 리포솜의 주사는 특정 세포 유형에서의 유전자의 표적화 발현을 매개할 수 있는 것으로 나타났다. PNP 또는 NH 유전자의 표적화, 또는 종양 덩어리에서 작은 분획의 세포에 대한 유전자의 발현 이후의 기질 투여는 복구 작용(involution)을 매개하기에 적당할 수 있다(문헌[Zhu 등, Science 261: 209-211, 1993]). 실시예에서 증명된 분화하지 않는 세포의 실질적인 방관자 효과 및 살해를 통해, 본 발명의 방법은 종양을 파괴할 수 있다. 예시된 방법에서 포유류 세포가 간 신경교종, 비-소세포 폐 선암, 또는 전립선 세포일지라도, 본원에 교시된 방법은 기타 세포에 적용될 수 있으며, 본 발명에 대한 이들의 민감성은 교시된 바와 같이 결정될 수 있는 것으로 인지될 수 있다.

종양 세포의 살해 이외에 본 발명의 방법은 또한 바이러스 감염된 세포를 살해할 수 있다. 바이러스 살해 실시형태에서, 선택된 유전자 전달 방법은 바이러스 감염된 세포에서 PNP의 발현을 표적화하는 이의 능력 때문에 선택될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 감염된 세포는 유전자 발현을 조절하고 허용하기 위해 특별한 바이러스 유전자 서열(즉, 바이러스 특이적 프로모터)을 이용할 수 있다. 이 같은 서열은 감염되지 않은 세포에 존재하지 않는다. 대장균 또는 기타 PNP 유전자가 이 같은 바이러스 프로모터에 대해 적절히 배향되어 있는 경우, PNP는 바이러스 감염된 세포 내에서만 활성화될 수 있으며, 기타 감염되지 않는 세포에서는 활성화되지 않는다. 이러한 경우, 바이러스 감염된 세포는 표적 세포에 인접하게 전달되는 경우에 PNP 또는 NH에 의해 독성 형태로 전환되도록 설계된 F-araAMP, MeP-dR 또는 기타 기질의 투여에 훨씬 더 민감하게 될 수 있다.

본 발명의 기타 응용에서, 개체의 임의의 목적하는 부피의 표적 세포를 살해하거나, 그렇지 않는 경우에 상기 표적 세포의 기능을 억제하기 위해 의약이 제공된다. 세포를 살해하거나 그렇지 않는 경우에 상기 세포의 기능을 억제하기 위한 본 발명의 광범위한 적용 가능성은 다양한 통상적인 목적에 대해 개선된 치료 프로파일뿐만 아니라 우수한 투여 제어를 임상의에 제공한다. 본 발명은 뜸술(cautery) 및 절제술(절제)을 포함한 과정에 대한 화학적 세포 제거 대안을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명에 의해 제공된 화학적 세포 제거는 뜸술, 방사선 제거술(radioablation), 또는 절제 기법과 연관된 과립화 및 난절법(scarification)을 배제하며, 그 결과 화학적 제거 위치 주변에 우수한 치료 조직을 제공하며, 그 결과로서 본 발명은 심부정맥의 치료, 낭종 감소, 신경절 치료, 남성 불임술, 화장품의 피부학적 과정, 및 흑색종 치료에서의 용도를 갖는다. 본 발명에 따른 화학적 세포 제거는 PNP 또는 NH를 위한 프로드러그의 인접한 전달과 더불어 PNP 또는 NH 효소, 및 본원에 개시된 바와 같은 임의의 형태의 바이러스 벡터의 투여에 의해 용이하게 수행되는 것으로 인지된다. 화학적 세포 제거를 위한 표적 세포의 위치에 기초하여 본 발명의 의약은 카테터, 미세 주사기, 캐뉼러(canula) 또는 주사기를 통해 투여되고, 뿐만 아니라 크림 베이스로 국부적으로 투여된다. 바람직하게는 PNP 또는 NH 효소는 세포 내 발현된다.

포유류 세포에서 비-인간 또는 유전적으로 변형된 인간 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제를 암호화하는 단리된 핵산이 본 발명에서 제공된다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 포유류 세포에서 대장균 PNP를 암호화하는 핵산을 제공한다. "단리된"이란 용어는 PNP 유전자가 수득되는 자연적으로 발생하는 유기체에서 발견되는 기타 핵산으로부터 분리된 것을 의미한다.

상술한 바와 같이, 바람직한 실시형태에서는 본 방법에 사용된 PNP 또는 NH는 살해될 세포 중의 고유의 PNP 또는 NH가 인식하지 못하거나 매우 빈약하게 인식하는 기질과 반응할 수 있는 유전적으로 변형된 인간 또는 비인간 포유류 PNP 또는 NH를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 PNP 또는 NH를 암호화하는 본 발명의 핵산은, 이들이 상이한 유기체로부터 유래하거나 이들이 이들의 천연 상태에서 변형되었기 때문에 이들은 천연적으로 발견되지 않는 세포에 존재한다. PNP 또는 NH를 암호화하는 핵산의 주요 요건은 이들이 상기 세포 고유의 PNP 또는 NH에 의해 잘 인식되지 않는 기질을 인식하여 상기 기질과 작용할 수 있는 기능성 효소를 암호화해야 한다는 것이다.

비-인간 또는 유전적으로 변형된 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 진핵성 전달 벡터가 또한 제공된다. 상기 벡터는 적어도 일부의 표적화된 세포를 형질 도입하거나 형질 감염시킬 수 있어야 한다. 상기 전달 벡터는 유전자를 세포 내로 전달하기 위한 임의의 뉴클레오티드 구조(예를 들어, 플라스미드), 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 전략의 일부, 예를 들어 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러의 일부로서 뉴클레오티드 구조일 수 있다(문헌[Ram 등, Cancer Res. 53: 83-88, 1993]). 상기 실시예는 PNP를 암호화하는 핵산을 함유하는 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 기능성 PNP 또는 NH를 발현할 수 있는 숙주 내에 있을 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 바와 같이, 숙주 세포는 살해될 세포로서, PNP 또는 NH를 발현하고 효소와 효소적 기질인 프로드러그의 독성 반응 산물에 의해 살해된다. 민감성을 결정하는 방법이 실시예에 제공되며, 상기 실시예에는 숙주 세포의 형질 감염을 위한 프로토콜이 개시되어 있으며, 기질의 존재 하에 PNP의 발현 및 숙주 세포에 대한 독성이 증명되어 있다. 대안적으로는, 활성 효소 또는 이의 전구 효소가 표적 세포 덩어리 내에 투여된다.

본 발명의 유전자 전달 방법 이외에, PNP 유전자 산물은 또한 다수의 상이한 기작에 의해 종양 세포로 선택적으로 전달될 수 있으며, 이러한 PNP는 종양 부위에서 F-Ade를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, PNP 또는 NH 효소는 임의의 목적하는 단일 클론성 항체에 부착될 수 있으며, 환자에 전시적으로 주사되거나 표적 세포에 대해 인접하게 주사될 수 있다. 상기 표적 세포에 결합되어 있지 않은 단일 클론성 항체에 접합된 모든 PNP 또는 NH의 제거를 위해 충분한 시간을 허용한 이후, 표적화 부위에서만 F-Ade로 개열되는 F-araAMP와 같은 프로드러그의 직접적인 주사에 의해 환자가 치료된다. 이 같은 과정에는 적당한 단일 클론성 항체의 이용 가능성만이 요구된다. 단백질을 표적 특이적 단일 클론성 항체에 접합하기 위해 사용되는 과정이 통상적으로 이용 가능하다. 하기 인용문헌은 종양 조직에 대한 표적 특이적 단백질에 대한 이러한 기술의 사용예이다(문헌[Senter 등, Bioconjugate Chem. 2: 447-451, 1991]; 문헌[Bagshawe 등, Br. J. Cancer 60: 275-281, 1989]; 문헌[Bagshawe 등, Br. J. Cancer 58: 700-703, 1988]; 문헌[Senter 등, Bioconjugate Chem. 4: 3-9, 1993]; 문헌[Battelli 등, Cancer Immunol. Immunother. 35: 421-425, 1992]; 문헌[Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews 129: 57-80, 1992]; 및 문헌[Roffler 등, Biochem. Pharmacol 42: 2062-2065, 1991]). 단일 클론성 항체 이외에 기타 리간드는 표적 세포에 대한 이들의 특이성 때문에 선택될 수 있으며, 본원에 교시된 방법에 따라 시험될 수 있다.

리포솜에 단백질을 포획하고 이들을 특정 조직에 표적화하는 것이 또한 가능하다. 따라서 PNP 또는 NH 유전자 산물은 표적화 리포솜을 이용하여 종양 덩어리에 선택적으로 전달될 수 있다. 비-표적화 리포솜 모두가 혈액에서 제거된 이후, 표적화 부위에서만 PNP에 의해 F-Ade로 개열되는 F-araAMP로 환자를 치료한다. 또한, 이러한 과정은 적당한 표적화 부형제의 이용 가능성만을 요구한다. 하기 인용문헌은 특정 단백질을 종양 조직에 표적화하기 위한 이러한 기술의 사용 예이다(문헌[Hughes 등, Cancer Research 49: 6214-62210, 1989]; 및 문헌[Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta 1104: 179-187, 1992]).

비-숙주성 PNP 또는 NH에 대한 효소적 기질을 나타내는 프로드러그는 표적 세포 덩어리 내로 직접 주사되며, 예를 들어 생리 식염수 또는 DMSO와 같이 약학적으로 허용 가능한 담체에서 종양 내 투여되거나, 대안적으로는 프로드러그의 안정성 및/또는 치료적 특징을 개질하기 위해 캡슐화된다. 본 발명의 프로드러그는 겔 또는 페이스트로서 용이하게 투여되거나, 미세 입자 내에 캡슐화된다. 이 같은 프로드러그용 담체는 생리 식염수 용액 중에서의 용해와 비교하여 프로드러그의 연장된 방출, 표적화 세포 덩어리 내에서의 변형된 확산, 및 저장 안정성을 제공하기 위해 용이하게 사용되는 것으로 인지된다. 미세 입자에 의지하여 본 발명의 프로드러그의 방출 속도는 1주 이상, 2주 이상, 심지어는 6주 초과의 기간까지 용이하게 연장된다(문헌[Zentner 등, J. control release 72 (1-3): 203-215, 2001]). 본 발명의 프로드러그는 용이하게 제조되어, 폴리아세트산, 폴리(엡실론-카프롤락톤) 또는 이의 조합의 페이스트로 주사된다(문헌[Jackson 등, Cancer research 60 (15): 4146-4151, 2000]). 프로드러그는 폴리아세트산, 폴리(엡실론-카프롤락톤), 폴리비닐 필롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스 및 기타 다당류를 포함한 다양한 재료로부터 미소구체 내에 적절히 캡슐화된다(문헌[Harper 등, Clin. Canc. Res. 5: 4242-4248, 1999]; 문헌[Dordunno 등, Cancer Chemother. Pharmacol. 36: 279-282, 1995]; 및 문헌[Bert 등, Cancer Lett. 88: 73-78, 1995]). 프로드러그의 제어 방출형 제형에 의해 더욱 많은 투여량의 프로드러그가 연장된 세포 억제 및 방관자 효과를 달성하기 위해 덜 빈번하게 표적 세포 덩어리에 주사되는 것으로 인지된다.

종양과 같은 표적 세포 부피 내로의 효소 및 프로드러그의 주사는 금전상의 보상을 위해 수행될 수 있으며, 이때 표적화 세포의 목적하지 않은 성장 또는 기능을 갖는 개체는 표적 세포의 기능을 억제하거나 심지어는 표적 세포를 살해하기 위하여 본 발명에 따른 주사 제공자에게 보상할 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 대해 추가로 개시된다. 이들 실시예는 첨부된 특허청구범위의 범주를 제한하기 위해 의도된 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 마우스에서 인간 종양 이종 이식편에 의한 연구

D54MG(인간 신경교종) 종양 세포(2×10⁷개의 세포)를 발현하는 양친성의 대장균 PNP는 찰스 리버 실험실(Charles River Laboratories, 매사추세츠주의 윌밍턴 소재)로부터 구입한 누드 마우스(nu/nu)의 옆구리에 피하 주사하였다. 대장균 PNP로 안정하게 형질 도입된 D54 종양 세포는 이전에 개시된 바와 같이 제조하였다(문헌[Parker 등, Cancer Gene Therapy 2011 Jun; 18(6): 390-8]). 종양은 캘리퍼스 및 식[(길이×너비²)/2 = ㎣]을 이용하여 산정된 중량 측정치를 이용하여 측정하였으며, 단위 밀도를 추정하는 단위(㎎)로 전환하였다. 달리 언급되지 않는 한, 치료용 약제, 및 대장균 PNP(Ad/PNP)를 발현하는 아데노바이러스 벡터는 투여된 약제를 균일하게 분산시키기 위하여 각각 약 20㎕의 양으로 8회의 개별적인 주사에 의해 150㎕ 부피로 D54 종양 내에 주사하였다. 각 그룹의 각각의 처리 부문(treatment arm)에는 적어도 6마리의 마우스가 포함된다. 마우스는 중량 감소에 대해 매일 모니터링 되고, 종양 치수에 대해 주 2회 모니터링 된다. T-C(종양 성장 지연)는 약제 처리군과 생리 식염수 처리군 사이의 4배 배가에 대한 일수의 수치로서 나타낸다. 각 동물에 대한 평가 시점에 대한 시간(4배 배가)은 처리군들 사이의 정상 데이터를 통계적으로 비교하기 위해 스튜던트의 t-검정(Student's t-test), 만-휘트니 랭크 섬 시험(Mann-Whitney rank sum test) 또는 생명표 분석(life table analysis)에서 종료점으로서 사용된다. 모든 과정은 서든 리서치 연구소(Southern Research Institute)의 IACUC에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. F-araAMP는 세링 아.-게.(Schering A.-G., 독일 베를린 소재)로부터 수득하였다. 본 실시예 및 후속적인 실시예에서, F-Ade는 캐나다 인코포레이션(Canada, Inc., 캐나다 알베르타의 에드먼턴 소재)로부터 수득하였다. 종양이 250 내지 300㎎(동물의 총 중량의 약 1 내지 1.5%)일 때 개시하였다.

실시예 2: 대장균 PNP 활성의 측정

종양 덩어리에서 렌티바이러스성 형질 도입된 세포의 비율은 약물 치료 첫째 날에 마우스에서 제거된 대표적인 암에서 대장균 PNP 활성을 측정함으로써 확인하였다. 조추출물은 마우스의 옆구리로부터 종장을 절제한 이후에 이전에 개시된 바와 같이 제조하였다(문헌[Parker 등, Human Gene Therapy 1997; 8: 1637-1644]). 상기 추출물은 배양 기간에 걸쳐 선형 반응을 초래하는 추출물의 농도로 50mM의 PO₄, 100μM의 6-메틸푸린-2'-데옥시리보사이드(MeP-dR) 및 100mM의 HEPES 완충액(pH 7.4)과 함께 배양하였다. MeP의 형성은 역상 HPLC를 이용하여 모니터링 하였다. 관례에 따라 하나의 PNP 활성 단위는 1시간의 기간 이내에 1㎎의 단백질 당 1nmole의 MeP-dR을 개열하는데 필요한 추출물의 양으로서 한정되었다.

실시예 3: F-araAMP의 종양 내 물질대사의 모니터링

3㎎의 [8-³H]F-araAMP(10μCi)를 300㎎의 D54 옆구리 종양에 주사한 이후에 총 방사능을 결정하였다. [8-³H]F-araAMP는 모라벡 바이오케미칼스 인코포레이션(Moravek Biochemicals Inc., 캘리포니아주 브레아(Brea) 소재)으로부터 수득하였다. 종양은 주사 후 10분 또는 4시간 시점에 마우스로부터 제거되고, 4시간 동안 55℃에서 배양함으로써 1㎖의 솔루엔(Soluene) 350(코네티컷주의 메리덴 소재의 패커드 인스트루먼트(Packard Instrument))에 용해하였다. 각 추출물의 일부는 섬광 유체와 혼합하고, 방사능을 측정하였다.

실시예 4: 5%의 세포에서 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에 대한 플루다라빈 포스페이트(F-araAMP)의 상이한 스케줄의 효과

양친성 D54 종양 세포를 렌티바이러스에 의해 대장균 PNP로 안정하게 형질 도입된 D54 종양 세포와 혼합하여, 5%의 혼합물이 PNP 이식 유전자를 발현시켰다. 이러한 95/5 혼합물을 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. F-araAMP에 의한 복강 내 치료(연속적인 3일 동안 1회의 250㎎/㎏; 연속적인 3일 동안 1일 3회의 167㎎/㎏; 연속적인 3일 동안 1일 5회의 100㎎/㎏; 또는 1일 5회×3일의 부형제 대조군)는 종양이 약 250㎎인 17일째 날에 시작하였다. 상기 시료 시점(17일째 날)에 종양에서 대장균 PNP의 활성은 2,500±400 유닛이었다. F-araAMP 처리군 모두에서의 종양 성장은 부형제 처리군에서와는 유의하게 상이하였다(p < 0.001)(도 1).

도 1은 5%의 종양 세포(이식 이전에 유전자로 형질 도입됨)가 재조합 효소를 발현하는 경우에 플루다라빈 포스페이트(F-araAMP)와 함께 대장균 PNP의 항종양 활성을 나타낸다. F-araAMP(100㎎/㎏으로 15회 투여, 167㎎/㎏으로 9회 투여, 또는 250㎎/㎏으로 3회 투여)의 복강 내 (전신) 투여는 모든 종양의 완전한 퇴화 및 모든 마우스의 치유를 야기하였다. 양친성 D54 종양(즉, 대장균 PNP의 부재)은 F-araAMP에 의한 치료에 민감성을 나타내지 않았으며, 이러한 환경에서 F-araAMP에 의한 종양의 퇴화는 대장균 PNP를 발현하는 종양 세포의 분획에 대한 투여량 의존성을 나타내는 것으로 이전에 나타나 있다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]; 문헌[Parker 등, Human Gene Therapy 1997; 8: 1637-1644]; 및 또한 하기 참조). 100%의 세포가 대장균 PNP로 형질 도입되어 있는 종양, 및 형질 도입되지 않은 (양친형) 종양이 유사한 속도로 성장하였으며(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]), 이는 종양 모델의 확장을 통해 약 5%의 형질 도입 수준이 유지될 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 주장을 증명하기 위해, 약물 치료 첫째 날에 마우스로부터 추출한 3개의 대표적인 종양으로부터 종양 추출물을 제조하였으며, 대장균 PNP의 수준을 2,500±400 유닛인 것으로 결정되었다. 126,000 유닛의 대장균 PNP 활성은 이러한 세포주로부터 100% PNP를 발현하는 세포로 구성된 종양에 존재한다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]). 따라서 상기 발견에 따르면 이러한 특정 실험에서 양친성 (PNP 비발현) 세포는 PNP가 생체 내 형질 도입된 세포주에 비해 약간 더 빠르게 성장하는 것으로 나타났으며, 도 1에 개시된 형질 도입 비율은 5% 이하이고, 아마도 2 내지 3%에 근접하는 것으로 확인되었다.

도 1에 도시된 결과에 따르면, 대형 종양(동물의 총 체중의 약 1%)의 완전한 퇴화 또는 치유는 복강 내 PNP 기반 GDEPT 전략에 의해 안전하게 달성될 수 있는 것으로 입증되었다. 또한 상기 발견에 따르면, 우수한 생체 내 방관자 활성이 증명되었다. 비록 5% 이하의 세포가 활성화 유전자를 발현하였을지라도 3회 정도의 F-araAMP의 즉시형(비-서방형) 복강 내(IP) 주사는 대형 종양의 파괴를 초래하였다. 게다가, F-araAMP에 의한 치료는 오직 10 내지 20%의 체중 감소를 초래하였으며, 이는 F-araAMP 스케줄이 완료된 이후에 신속하게 복귀되었다. 상기 종양을 바로 둘러싸고 있는 영역에서 심각한 조직 손상이 없거나, 실질적인 생명 연장에도 불구하고 기타 목적하지 않은 후유증의 증거가 나타났다. 폴리아세트산 미소구체 중의 30중량%의 F-araAMP의 3회 투여량의 단일 IP 주사에 의해 유사한 효과가 달성되었다.

실시예 5: D54 종양에 대한 F-araAMP의 종양 내 주사

도 2a에서, 양친성 D54 종양 세포를 10%가 이식 유전자를 발현하는 최종 비율로 대장균 PNP에 의해 형질 도입되었던 D54 종양 세포와 혼합하였다. 이러한 90/10 혼합물을 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 50㎕의 생리 식염수, 생리 식염수에 용해된 1.5㎎의 F-araAM, 또는 생리 식염수에 용해된 3㎎의 F-araAM을 14일째 날에 시작되는 연속적인 3일 동안에 1일 1회 종양에 주사하였다. 처리 시간(14일째 날)에 종양에서의 대장균 PNP의 활성은 14,300±2,600 유닛이었다. 3㎎의 처리군에서의 종양 성장은 부형제 처리군에서와는 유의하게 상이하였지만(p < 0.001), 1.5㎎의 처리군에서와는 유의하게 상이하지 않았다(P = 0.458). 도 2b에서, 양친성 D54 종양 세포(대장균 PNP의 비발현)를 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 150㎕의 생리 식염수, 생리 식염수에 용해된 3㎎의 F-araAMP, 생리 식염수에 용해된 1.5㎎의 F-Ade, 150㎖의 DMSO에 용해된 1.26㎎의 F-Ade, DMSO에 용해된 0.63㎎의 F-Ade, 또는 DMSO를 14일째 날에 시작되는 연속적인 3일 동안에 1일 1회 종양에 접종하였다. 본 실험은 생리 식염수 중의 폴리아세트산 미소구체에서 9㎎의 F-araAMP를 30중량%로 단일 주사함으로서 반복하였으며, 결과는 유사하였다. DMSO에 용해된 0.63㎎ 또는 1.26㎎의 F-Ade로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 DMSO 부형제 처리군에서와는 유의하게 상이하였다(각각 p = 0.011 및 0.002).

도 2a에서, 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 종양 내로의 F-araAMP의 주사는 강력한 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났다. 본 실험에서 F-araAMP의 투여량은 최대 허용되는 투여량보다 상당히 낮으며, 부가적인 주사는 더욱 높은 항종양 활성으로 구현된다는 것을 주지한다. 낮은 F-araAMP 투여량에서, F-araAMP 처리 45일 이후에 종양에서의 PNP 활성은 1,250 유닛인 반면, 처리 당시에 종양에서의 PNP 활성은 14,300 유닛이었다. 이러한 결과에 따르면, F-araAMP 처리는 대장균 PNP를 발현하는 세포를 우선적으로 살해하는 것으로 나타났으며, 이는 항종양 활성이 대장균 PNP의 발현에 의존한다는 것을 암시한다. 주사된 F-araAMP의 양은 120㎎/㎏으로, 이러한 스케줄에서 최대 허용된 투여량(750㎎/㎏, q1dx3)에 비해 훨씬 낮았다. F-araAMP가 DMSO에 용해되는 경우에 더욱 높은 F-araAMP 투여량에서 더욱 양호한 결과가 관측되었다(도 2c).

실시예 6: PNP 유무에 따른 D54 종양 세포에서 F-araAMP의 종양 내 주사

도 2b, 도 2d 및 도 3에서, 어떠한 세포도 대장균의 PNP 활성을 발현하지 않는 종양 내로의 F-araAMP의 직접적인 종양 내 주사는 종양 성장 효과가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과에 따르면, 도 2a, 도 2c 및 도 4에 도시된 F-araAMP의 종양 활성은 종양 세포의 하위세트에서 대장균 PNP의 발현에 기인하는 것으로 나타났다. F-Ade(F-araAMP의 활성 대사산물)의 항종양 활성은 또한 F-araAMP와 동일한 방식으로 종양 내로 주사되었다. 물에 용해된 0.15㎖의 1㎎/㎖ F-Ade(용해도 한계)는 어떠한 항종양 효과도 나타나지 않았다. DMSO에 용해된 0.15㎖의 8.6㎎/㎖ F-Ade를 종양에 주사하였으며, 온당한 항종양 효과가 관측되었다.

이들 결과에 따르면, 벡터(대장균 PNP를 전달하기 위한 벡터) 및 서방형 F-araAMP 둘 모두를 함유하는 생성물이 그렇지 않은 경우에 치료할 수 없는 국부적인 암의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 생성물의 적어도 1회 주사는 물질대사를 억제하거나, 심지어는 F-araAMP와 연관된 전신 독성이 감소된 다수의 방관자 세포와 함께 대장균 PNP를 발현하는 임의의 세포를 살해할 수 있다. 이는 종양 덩어리를 파괴하는데 필요한 시간과 동일한 많은 시간만큼 반복된다. 예를 들어, 종양이 완전히 제거될 때까지 감소된 독성으로 외래 환자에 기초하여 주 1회 환자에 주사하였다. F-araAMP의 다중 종양 내 주사는 항종양 활성의 증가를 초래하였다(도 4).

복강 내 주사된 F-araAMP의 분획만이 악성 종양을 생체 내 관류시키기 때문에 종양 덩어리 내로 직접 F-araAMP를 주사하는 것이 효능을 증가시키는 지의 여부를 시험하였다. 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현한 종양에 대한 초기 연구에 나타나 있다(상기에 도입됨)(도 2a). 주사 당 3㎎의 F-araAMP의 종양 내 주사(총 3회의 주사)는 유의한 항종양 효과(p < 0.001: 중량 손실이 거의 없음(4% 미만))를 나타내는 반면, F-araAMP는 양친성 (대장균 PNP를 발현하지 않는) 종양 내로 주사되는 경우에 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 2b). 마우스의 중량이 약 0.025㎏이기 때문에 3㎎의 F-araAMP의 주사는 20㎎/㎏의 F-araAMP 투여량과 동일하며, 이는 도 1에서 연구된 총 전신 투여량의 25 내지 50%였다. 종양 내로의 F-Ade(F-araAMP의 활성 대사산물)의 주사는 또한 생리 식염수에서 최대 가능한 용해도에서 시험되는 경우에 항종양 활성을 유도하지 못하였다(도 2b). F-Ade는 또한 DMSO에 용해되었으며, 종양 내로의 1.26㎎의 F-Ade(3㎎의 F-araAMP 주사액 중의 F-Ade의 적절한 몰 등가량)의 3회 주사는 최소 항종양 활성을 초래하였지만(도 2b; DMSO 부형제로 주사된 마우스에 대하여 p = 0.011), 10%의 체중 감소를 야기하였다. 2.5㎎ 또는 5㎎의 F-Ade(DMSO에 용해됨)의 3회 종양 내 주사는 각각 6마리의 마우스 중 3마리, 및 6마리의 마우스 중 4마리의 사망을 초래하였으며, 이는 1.26㎎이 이의 최대 허용된 투여량(MTD)에 매우 근접하다는 것을 나타낸다. 따라서 상기 결과에 따르면 대장균 PNP의 종양 내 발현 이후의 IT F-araAMP와는 달리 F-Ade의 직접적인 IT 주사는 항종양 효능을 거의 나타내지 않은 것으로 증명되었다.

상기에서 언급한 바와 같이, 종양 내 투여된 F-araAMP의 양(도 2a)은 도 1에서 개시된 총 복강 내 투여량보다 적었다. 더욱 높은 F-araAMP 투여량의 영향에 대해 조사하기 위하여, F-araAMP를 DMSO에 용해하고, 종양 내에서 충분히 내성을 나타내는 농도로 투여되었지만, 투여되는 경우에 최대 허용된 투여량을 훨씬 초과하였다(문헌[Hong 등, Cancer Res . 2004; 64: 6610-6615]). 6㎎ 또는 24㎎의 3회 투여량을 IT 주사에 의해 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 종양 내로 투여하였다(도 2c). 양친성 D54 종양 세포, 또는 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양 세포의 혼합물을 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 150㎕의 DMSO, DMSO 중의 24㎎의 F-araAMP 또는 DMSO 중의 6㎎의 F-araAMP를 17일째 날로부터 시작하여 연속적인 3일 동안에 1일 1회 종양에 주사하였다. 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에서 대장균 PNP의 활성(17일째 날)은 8,600±620 유닛이었다. PNP 종양을 가지며 6㎎ 또는 24㎎의 F-araAMP로 처리한 마우스에서의 종양 성장은 부형제 처리군과는 유의하게 상이하였지만(각각 p = 0.014 및 < 0.001), 본 실험에서 서로 유의하게 상이하지는 않았다. 24㎎의 F-araAMP로 처리한 6개의 종양 중 3개가 궤양화 되었으며(17일째, 21일째 및 24일째 날), 실험동물의 희생이 요구되었다. 나머지 3개의 종양은 완전히 퇴화되었으며, 마우스는 70일째 날에 실험이 끝나는 날까지 종양이 없는 상태로 유지되었다. 6㎎의 F-araAMP로 처리된 종양에서 궤양화는 없었으며, 이러한 처리의 단일 과정은 강력한 종양 퇴화 및 연장된 항종양 효과를 야기하였다. 가장 높은 투여량으로 F-araAMP의 주사는 온당한 체중 감소(7%)를 초래하였으며, 이는 약물 치료가 완료된 이후에 신속하게 회복하였다. 양친성 종양 내로 이들 투여량으로 F-araAMP의 주사(PNP의 비발현)는 항종양 활성을 야기하지 않았다.

실시예 7: D54 종양에 대한 종양 내 F-araAMP 및 Ad/PNP의 효과

대장균 PNP를 발현하는 복제 결핍형 아데노바이러스 벡터(Ad/PNP)의 종양 내 (IT) 주사 이후에 F-araAMP에 의한 전치 처리 이후의 온당한 항종양 활성을 증명하였다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]). 높은 투여량의 F-araAMP가 종양 내 투여되었을 때 도 2c에서 증명된 강력한 활성에 기초하여, F-araAMP와 함께 Ad/PNP가 종양 덩어리에 직접 접종되었을 때 이들 성분 둘 모두의 항종양 활성이 조사되었다(도 5a). 도시된 실험에서, Ad/PNP의 2×10¹¹ VP는 총 6회 주사를 위해 3일(15일째, 16일째 및 17일째 날) 동안에 1일 2회 투여되었다. 그 이후에 20일째, 21일째 및 22일째 날에 24㎎의 F-araAMP를 1일 1회 종양에 접종하였다. 20일째 날(F-araAMP 처리 첫째 날)에 종양에서의 대장균의 PNP 활성은 7,500±2,000 유닛이었으며, 이는 5 내지 10%의 세포가 상기 효소(2,500 유닛, 14,300 유닛 또는 8,600 유닛)를 안정적으로 발현하는 종양에 대해 관측된 것과 유사하였으며, IT F-araAMP에 기여 가능한 강력한 항종양 활성이 예상되는 범위 내에 있었다. 비록 F-araAMP와 함께 Ad/PNP로 처리된 10마리의 마우스 중 2마리가 죽었을 지라도, 추후에 분석되었던 치료 도중에 17%의 중량 손실을 경험한 8마리의 생존 마우스에서 우수한 항종양 효과가 있었다. 도 5a에 도시된 실험에 언급한 독성 증거로 인해, F-araAMP의 감소된 투여량(주사 당 18㎎)으로 상기 연구를 반복하였다. 이러한 스케줄에 따르면, 처리군에서 약물 관련 사망은 없었으며, 비록 쥐 체중이 감소하였지만 연장된 항종양 활성은 주입 후 71일째 날까지 내내 현저하였다(도 5b). 본 실험에서 종양에서 대장균의 PNP 활성은 1,900±1,500 유닛이었다. 상기 결과에 따르면, Ad/PNP의 종양 내 주사 이후에 IT F-araAMP의 주사는 그렇지 않는 경우에 내성인 고형 종양에 대한 실질적인 퇴화 효과를 유도할 수 있으며, 이 같은 효과는 Ad/PNP의 종양 내 주사 이후에 IP F-araAMP의 주사 이후에 관측된 것보다 우수한 것으로 증명되었다(문헌[Hong 등, Cancer Res. 2004; 64: 6610-6615]).

더욱 높은 투여량의 F-araAMP와 함께 Ad/PNP 둘 모두의 종양 내 주사는 종양 성장에 대해 극적 효과를 나타냈으며(도 5a 및 도 5b), 이는 전신성 F-araAMP와 함께 Ad/PNP보다 우수하였다.

실시예 8: F-araAMP에 대한 F-dAdo의 효과

F-dAdo 또는 F-araAMP를 각각 약 20㎕의 양으로 8회의 개별적인 주사로 150㎕ 부피로 D54 종양에 3회 주사하였다 도 5a에서, 양친성 D54 인간 신경교종 종양은 부형제(폐쇄된 서클), Ad/PNP(개방 서클), F-araAMP(채워진 삼각형), 또는 F-araAMP와 함께 Ad/PNP(개방 삼각형)로 종양 내 처리되었다. Ad/PNP(2×10¹¹ VP)는 15일째 날에 시작하여 연속적인 3일 동안에 1일 2회 주사되었다. DMSO에 용해된 24㎎의 F-araAMP를 20일째 날에 시작하여 연속적인 3일 동안에 1일 1회 종양에 주사하였다. 부형제 처리된 마우스에서의 종양에는 생리 식염수로 6회 주사한 이후에 DMSO로 3회 주사하였다(그렇지 않는 경우에는 상술한 바와 같음). D54 종양에서의 대장균 PNP의 활성(20일째 날)은 7,500±2,000 PNP 유닛이었다. 각각의 처리 부문에는 10마리의 마우스가 포함되었다. 조합된 처리 부문에서, 10마리의 마우스 중 2마리가 완료 이전에 죽었다. 나머지 8마리의 마우스 중 4마리가 65일째 날에 종양이 없었고, 2마리의 마우스에는 작은 종양(63㎎ 및 288㎎)이 있었으며, 2마리의 마우스에는 종양(1,666㎎ 및 1,584㎎)이 성장하고 있었다. F-araAMP와 함께 Ad/PNP로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 F-araAMP 또는 Ad/PNP 단독으로 처리된 마우스에서와는 유의하게 상이하였다(각각 p = 0.010 및 0.002). 도 5b에서, 마우스는 F-araAMP의 투여량이 주사 당 18㎎인 것을 제외하고는 도 5a에 개시된 바와 같이 처리되었다. 본 실험에서 18일째 날의 대장균 PNP의 활성은 1,900±1,500 PNP 유닛이었다. F-araAMP와 함께 Ad/PNP로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 F-araAMP 또는 Ad/PNP 단독으로 처리된 마우스에서와는 유의하게 상이하였다(각각 p = 0.001 및 0.011). T. 바기날리스(Tv)-PNP의 대안적인 공급원을 이용한 데이터는 도 5c에 도시되어 있다.

비록 상기 세포가 PNP를 발현하는 경우에 F-dAdo가 F-araA보다는 대장균 PNP에 대한 훨씬 더 양호한 기질일지라도, F-dAdo보다는 F-araAMP에 의해서 더욱 양호한 결과가 관측되었다(도 6a 및 도 6b).

실시예 9: DU145(인간 전립선) 종양 및 NCI-H322M(인간 비-소세포 선암 폐) 종양에 대한 종양 내 F-araAMP 및 Ad/PNP의 효과

여기서 종양이 유사한 결과를 나타내는 DU145인 점을 제외하고 상술한 바와 같이 F-araAMP 및 Ad/PN의 주사를 수행하였다(도 7a). 여기서 상기 종양이 유사한 결과를 나타내는 H322M인 점을 제외하고 상술한 바와 같이 F-araAMP 및 Ad/PN의 주사를 수행하였다(도 7b).

실시예 10: D54 종양에 대한 방사선과 함께 F-araAMP의 종양 내 주사 효과

국부적으로 진전된 고형 종양은 종종 방사선 요법에 대해 내성을 나타냈다. 이러한 환경에서 보조의 대장균 PNP의 시험으로서, 외부 빔 방사선과 함께 F-araAMP 주사가 조사되었다. 도 8a에서, 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 종양에는 3㎎의 F-araAMP(종양 억제를 초래하는 투여량이지만 종양이 없는 생존자는 초래하지 않는 투여량, 도 2a)의 3회 IT 주사의 유무에 따라 방사선(D54 종양 성장에 대한 측정 가능한 효과를 부여하기 위해 이전 결정됨)을 투여하였다. 도 8b에서, 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 종양에는 3㎎의 F-araAMP(종양 억제를 초래하는 투여량이지만 종양이 없는 생존자는 초래하지 않는 투여량, 도 2a)의 3회 전신성 IT 주사의 유무에 따라 방사선(D54 종양 성장에 대한 측정 가능한 효과를 부여하기 위해 이전 결정됨)을 투여하였다. 대장균의 PNP/F-araAMP를 방사선 요법과 조합하는 것은 각각의 단독 처리에서보다 훨씬 높은 현저한 항종양 활성을 야기하였다. 10 내지 14%의 중량 손실이 모든 처리군에서 관측되었으며(이는 처리가 완료된 이후에 신속하게 회복됨), 이는 2회의 개입의 독성이 부가적인 것이 아님을 나타낸다. 실시예 5의 서방형 F-araAMP에 의해 유사한 결과가 관측되었다.

10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양 세포를 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 상기 종양에는 방사선, F-araAMP, 또는 방사선과 함께 F-araAMP를 처리하였다. 2개의 처리군에서는 150㎕의 생리 식염수 또는 생리 식염수에 용해된 3㎎의 F-araAMP를 연속적인 3일 동안에 1일 1회 종양에 주사하였다. 2개의 기타 처리군에서는 150㎕의 생리 식염수(채워진 사각형) 또는 생리 식염수에 용해된 3㎎의 F-araAMP(개방 사각형)의 주사 이후에 방사선(4Gy)을 연속적인 3일 동안에 3시간 동안 1일 1회 투여하였다. D54 종양에서의 대장균 PNP의 활성(16일째 날)은 12,000±3,000 유닛이었다. F-araAMP와 함께 방사선으로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 F-araAMP 또는 방사선 단독으로 처리된 마우스에서와 유의하게 상이하였으며(각각 p = 0.004 및 < 0.001), 전신성 IP 주사(도 8b)에 비해 IT 주사(도 8a)에 대해 우수하였다.

실시예 11: F-araAMP의 종양 내 주사 이후의 D54 종양에서의 방사능

양친성 (D54) 종양, 및 종양 내(IT) F-araAMP의 약력학을 이해하기 위한 노력으로, 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 종양에서 프로드러그의 활성화 수준을 모니터링 하였다(표 1). 3㎎의 [³H]-F-araAMP의 IT 주사 10분 또는 4시간 이후에 종양 조직을 수집하고, 종양 덩어리에 잔류하는 방사능 양을 측정하였다. F-araAMP에 의한 주사 10분 후에 양친성 종양과 10%의 세포가 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양 사이에는 어떠한 차이도 없었다. 4시간 정도에 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에서의 방사능은 실질적으로 양친성 종양에서보다 높았으며, 이는 F-Ade 대사산물로 전환된 F-araAMP의 양을 나타낸다. 상기 실험에 따르면, 190nmole의 F-Ade 대사산물이 생성되며, 이는 3㎎의 F-araAMP의 종양 내 주사 이후에 종양 조직의 그램(g) 단위로 보유되는 것으로 나타났다. 3㎎의 F-araAMP는 8,200nmole과 동일하고, 본 실험에서 종양이 약 0.3g이므로 약 57nmole의 F-Ade가 본 실험에서 종양 조직에 보유되어 있거나, 총 0.7%의 F-araAMP가 종양 내로 주사되었다.

F-araAMP의 종양 내 주사 이후의 D54 종양에서의 방사능(1g의 조직 당 F-araAMP의 몰수)
	10분	4시간
D54 종양	980±730	31±6
10% PNP D54 종양	1,100±990	220±75^*

D54 종양, 또는 10%의 세포가 도 2에서 개시된 바와 같이 대장균 PNP를 발현하는 D54 종양에 3㎎(8,200nmole)의 [³H]F-araAMP(10μCi/주사)를 주사한다. 종양(약 300㎎)은 F-araAMP의 주사 10분 및 4시간 후에 제거되고, 각각의 종양에서 방사능량을 측정한다. 그룹당 4개의 종양이 존재한다. 이러한 실험을 반복하여 유사한 결과를 얻었다. * D54 종양과는 유의한 차이 있음: p < 0.02, 짝진 스튜던트의 t-검정.

본 명세서에 언급된 특허 문헌 및 공개공보는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련자의 수준을 나타낸다. 이들 문헌 및 공개공보는 각각의 개별 문헌 또는 공개공보가 본원에서 구체적이고 개별적으로 참고로 인용되는 것처럼 동일한 정도로 본원에서 참고로 인용된다.

상기 상세한 설명은 본 발명의 특정 실시형태를 예시하고 있지만, 본 발명을 실시하는 경우에 이를 제한하기 위한 것은 아니다. 하기 특허청구범위(이의 등가물 모두를 포함함)는 본 발명의 범주를 한정하도록 의도된다.

Claims

푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이의 발현을 암호화하는 벡터, 및 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 개열된 다중 투여량의 프로드러그를 다중 투여량의 마지막 투여 후 적어도 3시간 후의 X선 방사선 노출과 함께 표적화 세포의 살해를 위한 직접 주사 의약의 제조로 이용하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기 프로드러그와 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로드러그는 서방형 담체로 제형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균(E.coli) 또는 트리코모나스 바기날리스(T. vaginalis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균의 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 돌연변이체는 테일드 돌연변이체(tailed mutant)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로드러그는 플루다라빈 포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 세포는 암에 걸린 것을 특징으로 하는 방법.
표적화 세포를 죽이는 직접 프로드러그 주사를 위한 2-플루오로아데닌의 세포 독성 푸린 염기를 방출하기 위한 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이의 발현을 암호화하는 벡터, 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 개열된 다중 투여량의 프로드러그의 물질이며, 마지막 투여 후 적어도 3시간 후 X선 방사선에 노출이 되는 다중 투여량의 프로드러그의 물질.
제 11 항에 있어서, 상기 표적화 세포는 종양을 한정하는 것을 특징으로 하는 물질.
제 11 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 것을 특징으로 하는 물질.
제 13 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 물질.
제 11 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균 또는 T. 바기날리스인 것을 특징으로 하는 물질.
제 11 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균의 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 물질.
제 16 항에 있어서, 상기 돌연변이체는 테일드 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 물질.
제 12 항에 있어서, 상기 프로드러그는 상기 종양 내로 종양 내 주사하는 것을 특징으로 하는 물질.
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제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 세포를 죽이거나 기능을 억제하기 위해 방사선 노출을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 물질.
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방사선 치료에 의한 효과 증진이 포함된 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정에 있어서,
포유류 숙주의 계열성 이종을 갖는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 상기 표적화 세포로 전달하는 단계;
상기 표적화 세포에 대해 독성을 갖는 2-플루오로아데닌의 푸린 염기를 방출하기 위해 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 개열된 프로드러그를 다중 투여량으로 투여하는 단계; 및
포유류 숙주의 고형 악성 종양에서 표적화 세포를 죽일 수 있는 다중 투여량 중 가장 마지막 투여후 적어도 3시간후에 표적화 세포를 X선 방사선에 노출하는 단계를 포함하는 방사선 치료에 의한 효과 증진이 포함된 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항에 있어서, 상기 프로드러그는 고형 악성 종양의 순환하지 않는 구획 내로 종양 내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 36 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균 또는 T. 바기날리스인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 대장균의 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 테일드 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로드러그는 상기 고형 악성종양 내로 종양 내 주사되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
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제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 방관자 세포의 상기 표적화 세포로의 성장을 억제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로드러그는 플루다라빈 포스페이트인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 겔, 페이스트 또는 미세 입자의 서방형 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 43 항에 있어서, 상기 방관자 세포는 표적화 세포의 50개 정도의 인접한 세포 직경의 간격 또는 등가의 선형 간격 내에 있는 세포인 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항에 있어서, 표적화 세포의 퇴행 및 연장 억제가 발생할 때가지 표적화 세포를 하루 단위로 표적화 세포를 X선 방사선에 노출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항에 있어서, 표적화 세포는 적어도 3일 연속으로 방사선에 노출되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34 항에 있어서, 복수 투여량의 프로드러그는 하루 단위로 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.
제 34항에 있어서, 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 전달전에 프로드러그와 혼합되는 것을 특징으로 하는 포유류 숙주 개체의 고형 악성 종양에 있는 표적화 세포를 죽이는 공정.