JP6328427B2

JP6328427B2 - プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼのプロドラッグ関連用途の増強された治療的使用

Info

Publication number: JP6328427B2
Application number: JP2013554669A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムビー．パーカー; エリックジェイ．ソーシャー
Original assignee: ザユーエイビーリサーチファンデイション; サザン・リサーチ・インスティテュート
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2018-05-23
Anticipated expiration: 2032-02-20
Also published as: CN103501824A; KR20140051843A; US10080784B2; WO2012112984A3; CA2827645A1; WO2012112984A2; CA2827645C; US20220031817A1; US20180360929A1; AU2012219269B2; AU2012219269A1; EP2675483B1; US20130330315A1; EP2675483A4; EP2675483A2; JP6650953B2; CN107496910A; ES2699531T3; JP2014508757A; JP2018080196A

Description

本出願は、その内容が本明細書に参照により援用される２０１１年２月１８日に出願された米国仮出願第６１／４４４，２６１号の優先権利益を主張するものである。

本発明は、一般に、プロドラッグの直接インサイチュー注入（ｉｎｓｉｔｕｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に合わせた切断、放射線治療、またはそれらの組み合わせを行うことによる、細胞毒性を生じさせるための、および、特に、治療効果を増強させるための、制御されたサイチューインビボ（ｓｉｔｕｉｎｖｉｖｏ）でのプロドラッグの切断による、細胞死の誘導に関する。

化学療法は、多くのヒト腫瘍の治療の中心であるが、静止またはゆっくり分裂するがんに対するインビボでの有効性は乏しい（Ｔａｋｉｍｏｔｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＭａｎａｇｅｍｅｎｔＨａｎｄｂｏｏｋ（１１^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ），ＵＢＭＭｅｄｉｃａ２００９；Ｓａｎｇｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ２０１０；１６（１）：１７−２６；Ｍｅｌｌｏｒｅｔａｌ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ２００５；９３（３）：３０２−９）。放射線療法および全身に投与される化学療法は、ＤＮＡ複製を中断させることにより特異性を達成するが、間欠的周期の静止腫瘍組織を除去することはできない。非分裂の腫瘍細胞（推定の腫瘍幹細胞の部分を含む）を破壊することの不可能性は、数多くある中でも、前立腺がん、乳がん、肺がん、および大腸がんの低増殖分画腫瘍（ｌｏｗ−ｇｒｏｗｔｈｆｒａｃｔｉｏｎｔｕｍｏｒｓ）を含む一般的なヒト悪性腫瘍に対する失敗の１つの理由として認識される（Ｖｅｓｓｅｌｌａｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＴｈｅｒ２００７；６（９）：１４９６−５０４；Ｋｕｓｕｍｂｅｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００９；６９（２４）：９２４５−５３）。特徴的でない高い分裂指数（例えば増殖分画（ｇｒｏｗｔｈｆｒａｃｔｉｏｎ）約４０％）を有し、従来の化学療法または放射線療法への累積曝露によって全ての分裂がん細胞が完全に破壊されたと仮定する固形腫瘍の場合でさえ、その大きさは、なお治療前のサイズの２分の１に満たない。

非転移性の乳がん、前立腺がん、喉頭がん、および脳腫瘍は、一般に、最終的な外科的切除の前に、減量処置（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇｍｅａｓｕｒｅ）としての術前放射線治療（ＸＲＴ）で処置される（ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ（８^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）．ＲｏｎａｌｄＡ．ＤｅＰｉｎｈｏａｎｄＲｏｂｅｒｔＡ．Ｗｅｉｎｂｅｒｔ，Ｅｄｓ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ&Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００８）。他の局所的浸潤性、非転移性腫瘍は、延命ＸＲＴに適切であり、内臓（例えば、胃、喉頭、大腸、または気道）を詰まらせる、手術不可能な悪性腫瘍は、緩和のための局所的な放射線療法で日常的に処置される（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＴｈｅｒａｐｙ（３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ）．Ｍｏｓｂｙ，２００９）。これらのような腫瘍は、常に低増殖分画を示し、ある時点で、放射線療法および利用可能な最良の化学療法の両方に反応しなくなる。

様々な最新のモダリティは、上述のもののような一般的ながんを含む、局所的浸潤性、非転移性腫瘍の治療を改善するための試みにおいて進歩している。例えば、低温による、磁気による、熱によるおよび超音波による細胞切除技術は、全て、前臨床または早期臨床で様々な成功の度合で研究されている（Ｏｓａｄａｅｔａｌ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ２００９；２９（１２）：５２０３−９；Ｋｒｉｓｈｎａｎｅｔａｌ．ＩｎｔＪＨｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ２０１０Ｓｅｐ２１［Ｅｐｕｂａｈｅａｄｏｆｐｒｉｎｔ］；Ｍａｒｇｒｅｉｔｅｒｅｔａｌ．ＪＥｎｄｏｕｒｏｌ２０１０；２４（５）：７４５−６）。ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ｇｅｎｅｄｉｒｅｃｔｅｄｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｒｕｇｔｈｅｒａｐｙ）；「自殺遺伝子」ストラテジーと呼ばれる）のような、実験的な遺伝子治療が広く試験されているが、少なくとも２つの理由から、局所的浸潤性、非転移性腫瘍に対して大した成果はない（ＧＷＢｏｔｈ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ２００９；１１（４）：４２１−３２；Ａｌｔａｎｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ２００８；２７０（２）：１９１−２０１；Ｄａｃｈｓｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００９；１４（１１）：４５１７−４５）。第一に、腫瘍細胞の形質導入の効率が、現在のところ利用可能な遺伝子導入ベクターでは低い。抗がん導入遺伝子を発現する悪性細胞のごく一部は、腫瘤（ｔｕｍｏｒｍａｓｓ）中の形質導入されていない細胞に対して強いバイスタンダー効果を上乗せるために十分でないことが多い。第二に、ＧＤＥＰＴは、腫瘍内化学療法を活性化するために、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子または原核生物シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子を主に使用していて、これらの２つの酵素により生産される化合物（それぞれ、ガンシクロビルモノホスフェートおよび５−フルオロウラシル（ＦＵｒａ））は、主に分裂腫瘍細胞に対して活性である。低い形質導入効率、乏しいバイスタンダー活性、および非分裂のがん細胞の死滅失敗は、診療所での非転移性の固形腫瘍に対する、初代ＧＤＥＰＴアプローチの失敗の主な原因となる。

Ｅ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子は、２−フルオロアデニン（Ｆ−Ａｄｅ）または６−メチルプリン（ＭｅＰ）のような非常に強力な化合物を腫瘍内に産生することが示されている（Ｕｎｇｅｒｅｃｈｔｓｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７；６７：１０９３９−１０９４７；Ｆｕｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００８；１５：４７４−４８４；ＦｕＷ，Ｌａｎｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．２００８；９９：１１７２−１１７９；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０１１Ｊｕｎ；１８（６）：３９０−８；Ｇａｄｉｅｔａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００３；３０４：１２８０−１２８４）。これらのようなプリン塩基は、全ての細胞中に遍在する促進された拡散経路を介して、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ形質導入細胞および隣接（バイスタンダー）細胞の間を自由に拡散して、そして、顕著なバイスタンダー死滅効果をもたらす（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）。化合物は、ＲＮＡおよびタンパク質合成を阻害する独自のメカニズムにより働き、したがって、インビボにおいて、分裂および非分裂の（静止）腫瘍細胞の両方に対して活性である（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１）。Ｆ−Ａｄｅは、２−Ｆ−２’−デオキシアデノシン（Ｆ−ｄＡｄｏ）またはフルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）のようなプロドラッグから、細胞内Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰにより生産することができる（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９８；９：１６１７−１６２６；Ｍｏｈｒｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２０００；３１：６０６−６１４；Ｖｏｅｋｓｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００２；９：７５９−７６８；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：１３４３−１３５７；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００３；１０：２３−２９；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；８：１６３７−１６４４；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：４３−５４）。後者の薬剤であるＦ−ａｒａＡＭＰは、慢性リンパ性白血病の治療に臨床的に承認されているが、非リンパ系悪性腫瘍に対する活性を有さない。

Ｆ−Ａｄｅは、抗がん剤として、ＦＵｒａよりも、およそ１，０００倍高い活性がある。この力価にもかかわらず、非常に多くの研究室が、Ｆ−ＡｄｅはＧＤＥＰＴの一環として安全に用いることができることを示している。１）細胞核酸への強い腫瘍内隔離、２）ごく近傍の隣接（バイスタンダー）がん細胞による取り込みを伴って、腫瘍細胞死に続く全身性区画への徐放、および、３）腫瘍から放出される任意の化学療法の広範囲にわたる希釈（宿主全体にわたる）という理由で、その方法は、非常に多くの動物モデルにおいてインビボで、安全で一貫した抗腫瘍の有効性をもたらす（Ｕｎｇｅｒｅｃｈｔｓｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７；６７：１０９３９−１０９４７；Ｆｕｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００８；１５：４７４−４８４；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０１１Ｊｕｎ；１８（６）：３９０−８；Ｇａｄｉｅｔａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００３；３０４：１２８０−１２８４；Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９８；９：１６１７−１６２６；Ｍｏｈｒｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２０００；３１：６０６−６１４；Ｖｏｅｋｓｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００２；９：７５９−７６８；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：１３４３−１３５７；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００３；１０：２３−２９；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；８：１６３７−１６４４；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：４３−５４；Ｄｅｈａｒｖｅｎｇｔｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２００７；３０：１３９７−１４０６；Ｋｉｋｕｃｈｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００７；１４：２７９−８６）。Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰと初代ストラテジー（ＨＳＶ−ｔｋおよびＣＤ）との様々な直接比較は、ＰＮＰに基づくメカニズムによるＧＤＥＰＴのかなりの増大を示す（Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９８；９：１６１７−１６２６；ｅｔａｌ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９７；３：２０７５−８０；Ｎｅｓｔｌｅｒｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；４：１２７０−７７；Ｐｕｈｌｍａｎｎｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９９；１０：６４９−６５７）。その方法は、最近になって、米国での臨床試験のための食品医薬品局により承認されている（ＩＮＤ＃１４２７１，２０１０年３月１９日承認）。

特にＥ．ｃｏｌｉＰＮＰによる生成に続くＦ−Ａｄｅ代謝物の持続的な腫瘍内半減期（>２４時間）（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００３；１０：２３−２９）は、静止腫瘍細胞と腫瘍幹細胞のバイスタンダー死滅とともに（ＲＮＡおよびタンパク質の合成を除くことにより）、腫瘍組織内での集中した強力な化学療法のための「ポイント・アンド・アブレート（ｐｏｉｎｔａｎｄａｂｌａｔｅ）」モダリティとしてのＰＮＰの使用可能性を示唆した。

化学療法剤でのがん治療は、全身性投与を、腫瘍内注入と同等またはこれに勝るものとして頼りにしている。腫瘍内取り込みの乏しさ、化学療法の腫瘍細胞利用の乏しさ、およびインビボでの、無視できるほどの腫瘍細胞致死性のために、化学療法剤の直接腫瘍内注入は、抗腫瘍効果を導くことにおいて、全身性経路よりも、慣用的な従来技術によって、もはや有効であるものとして考えられていない。加えて、腫瘍内投与は苦労のいる手段である一方で、静脈を経由する全身性投与または他の全身性経路は行うのが比較的簡単である。

このように、インビボでの標的細胞および特に腫瘍細胞に対する、より効果的な阻害治療を提供する必要性が存在する。また、標的細胞に対するバイスタンダー阻害効果を改善して、そして、そのような効果を長期間維持する必要性が存在する。

複製性または非複製性の標的細胞の直接注入阻害の調製のための、プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはヌクレオシドヒドロラーゼ、またはこれらの酵素のうちの１つの発現をコードするベクターの使用が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼにより切断されるプロドラッグの使用とともに詳述される；標的細胞は、通常は、導入されるプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼを発現しない。酵素およびプロドラッグは、単回投与としての混合および注入、または別個の注入としての、または標的細胞への他の投与経路に適している。酵素の細胞内発現は、有効性を改善する。本発明の物質の使用は、トランスフェクト細胞の近位の細胞および酵素を含む細胞間液が、プロドラッグの切断により放出される薬剤と接触して細胞を機能阻害するまたは死滅させるバイスタンダー効果の結果として、腫瘍の治療において特に効率的である。物質およびプロドラッグの有効性は、標的細胞をＸ線照射に曝すことにより高められる。

プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼの、標的細胞への送達を含む、複製性または非複製性の標的細胞を阻害するための方法もまた、提供される。プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼにより切断されるプロドラッグは、標的細胞を死滅させるまたは機能阻害するようにプリン塩基の細胞毒性を標的細胞に放出するために、標的細胞の近位に直接注入される。その方法は、腫瘍への投与に特に良く適している。プロドラッグの投与は、全身的に標的細胞の近位に直接的であるかどうかにかかわらず、Ｘ線照射治療と組み合わせて、標的細胞を死滅させるまたは機能阻害するために効果的である。

時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、５％の細胞においてＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍に対する、全身性腹腔内（ＩＰ）フルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）の異なるスケジュールの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、１０％のそれらの細胞においてＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現して抗腫瘍活性をもたらす腫瘍へ腫瘍内注入された、Ｆ−ａｒａＡＭＰの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、細胞のいずれもＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を示さないＤ５４腫瘍における、高濃度でのＦ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入の効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、１０％の細胞がＰＮＰ活性を示すＤ５４腫瘍増殖に対する、腫瘍へのＦ−ａｒａＡＭＰ注入の効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、細胞のいずれもＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を示さないＤ５４腫瘍増殖に対する、腫瘍へのＦ−ａｒａＡＭＰ注入の効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現しない腫瘍へのＦ−ａｒａＡＭＰの直接腫瘍内注入（１回／日または２回／日）は、腫瘍増殖に対して効果がないことを示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、１０％のそれらの細胞においてＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現する腫瘍へのＦ−ａｒａＡＭＰの直接腫瘍内注入は、６回注入が３回注入よりも非常に良好な抗腫瘍活性をもたらすことを示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、２４ｍｇの腫瘍内プロドラッグの高いＦ−ａｒａＡＭＰ投与計画での、Ｄ５４腫瘍に対する、アデノウイルスベクター（Ａｄ）ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、より低いＦ−ａｒａＡＭＰ投与計画（１８ｍｇ）での、Ｄ５４腫瘍に対する、アデノウイルスベクター（Ａｄ）ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、直接腫瘍内投与の変更された配列および異なる起源のＰＮＰ配列の下での効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、細胞のいずれもＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を示さないＤ５４腫瘍増殖に対する、腫瘍への直接腫瘍内注入によるＦ−ｄＡｄｏの有効性を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を示すＤ５４腫瘍増殖に対する、腫瘍への直接腫瘍内注入によるＦ−ｄＡｄｏの有効性を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、ＤＵ１４５腫瘍に対する、腫瘍内のＦ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺腺がんに対する、腫瘍内のＦ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍に対する、Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入プラス放射線の効果を示している。時間関数としての腫瘍重量のプロットであり、様々な放射線計画に関して、１０％Ｄ５４／ＰＮＰ腫瘍に対する、Ｆ−ａｒａＡＭＰの腹腔内（ＩＰ）注入プラス放射線の効果を示している。

本発明は、標的細胞腫瘤の阻害、および特定の実施態様ではインビボの腫瘍増殖の阻害に有用性がある。驚くことに、一般的におよび特に腫瘍内への直接的な注入による、標的細胞へのプロドラッグの直接近位投与に関して、酵素による切断時に腫瘍などの標的細胞腫瘤の中に細胞毒性塩基が産生され、経口、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内、腹腔内、または経皮を含む送達の従来の全身性経路よりも、酵素を含むことまたは発現することが効果的であることが見出された。これは、標的細胞内で、酵素が細胞内活性化される場合に、さらにより効果的であることに注意されたい。

プロドラッグの直接腫瘍内注入は、一部には血管に富んだ性質の腫瘍および上記の他の点のために、全身性プロドラッグ送達に比べて不必要で効果がないとして、従来、軽視されていた。酵素を発現している、または酵素の近位の細胞への、そのようなプロドラッグの投与は、投与経路にかかわらず、腫瘍照射と組み合わせた場合に、より効果的になる。ＰＮＰまたはＮＨは、それぞれの酵素単独で、またはプロドラッグ基質の存在下で、放射線感作物質であることが知られてはいないため、これは驚くことであると考えられる。

本発明は、高レベルのバイスタンダー阻害および死滅をもたらす、非宿主のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）またはヌクレオシドヒドロラーゼ（ＮＨ）を発現している標的細胞の近位へのフルダラビンホスフェートなどのプロドラッグの注入；および、マウスモデルのインビボでの、大きなヒト腫瘍異種移植片の破壊に基づく。非宿主のＰＮＰまたはＮＨおよびこの酵素のためのプロドラッグ基質は、プロドラッグ投与の割合にかかわらず、放射線療法を増強して、独特なメカニズムで働く。特に、２−フルオロアデニンまたはプロドラッグ由来で全身性区画へ徐放されて宿主内で非常に希釈される他の毒性プリンの腫瘍内生成は、改善された効果を有する。Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するアデノウイルスベクターに続くフルダラビンホスフェートまたは他のプロドラッグでの、大きな皮下腫瘍の注入は、腫瘍退縮および腫瘍増殖の持続的阻害をもたらす。１）がん組織内での強力な化学療法の捕捉、および２）滴定可能な方法での悪性実質組織の破壊をもたらすために、利用可能な薬剤に対して耐性の腫瘍が、治療反復（例えば毎日）により安全に浸透される、抗がんの方法が提供される。

持続的な標的細胞の阻害は、徐放性製剤での標的細胞へのプロドラッグの直接注入により進められる。プロドラッグの持続放出は、低増殖分画を有する腫瘍の阻害を促進する。

本明細書で有効な酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ由来のもののような非ヒトプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）またはヌクレオシドヒドロラーゼ（ＮＨ）、または実に、細胞毒性のプリン塩基を産生するためにプロドラッグ基質を変換することができる任意の他の非ヒトＰＮＰである。また、非宿主ヌクレオシドヒドロラーゼは、適切なプロドラッグとともに、本発明を実施するための基礎として本明細書で有効であると評価される。プロドラッグは、ヒドロラーゼ切断により、比較的より高い細胞毒性の化合物を産生するように選択される。ＵＳ７，４８８，５９８に詳述されているもののような、ＰＮＰおよびヒドロラーゼの変異体が、プロドラッグから細胞毒性のプリン塩基を産生するために本明細書で有効であり、そして、繁殖のような細胞機能を阻害する、およびさらには、形質転換されたまたは単に酵素に近位のヒト対象のこれらの細胞を死滅させるために適切であることが、さらに評価される。本明細書において用いられる酵素は、十分な効力の細胞毒性のプリン塩基がバイスタンダー効果を生じさせるのを可能にして、それにより、形質転換細胞、形質導入細胞、およびバイスタンダー細胞を阻害することが評価される。

本明細書において用いられる「近位」は、例えば腫瘤などの、定義される組織腫瘤への直接の、および、およそ５０の隣接細胞直径（ａｄｊａｃｅｎｔｃｅｌｌｄｉａｍｅｔｅｒｓ）またはこれと同等の直線空間（ｌｉｎｅａｒｓｐａｃｉｎｇ）および好ましくは２０以内の隣接細胞直径またはこれと同等の直線空間の空間内の標的細胞に隣接しての、導入を意味することを目的とする。

本明細書で有効なプロドラッグは、対象細胞に対して比較的非毒性である特質を有するが、プロドラッグの酵素的切断の際に、細胞毒性のプリン塩基を産生する。代表的なプロドラッグは当技術分野で公知である（Ｕｎｇｅｒｅｃｈｔｓｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７；６７：１０９３９−１０９４７；Ｆｕｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００８；１５：４７４−４８４；Ｆｕｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．２００８；９９：１１７２−１１７９；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＩｎｐｒｅｓｓ；Ｇａｄｉｅｔａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００３；３０４：１２８０−１２８４；Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５；ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９８；９：１６１７−１６２６；Ｍｏｈｒｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２０００；３１：６０６−６１４；Ｖｏｅｋｓｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００２；９：７５９−７６８；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：１３４３−１３５７；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００３；１０：２３−２９；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；８：１６３７−１６４４；Ｍａｒｔｉｎｉｅｌｌｏ−Ｗｉｌｋｓｅｔａｌ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００４；６：４３−５４）。以下のデータは、Ｆ−ｄＡｄｏおよびＦ−ａｒａＡＭＰとの関連で本発明の実施を詳述するが、これらの結果は、他のプロドラッグに拡張することができることが認められる。

ヒトグリオーマモデルＤ５４は、様々な理由から、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ／Ｆ−ａｒａＡＭＰの安全性および有効性を調べるために選択される。第一に、マウスでのＤ５４腫瘍は、ヒトグリオーマ治療に関して臨床認可されたＢＣＮＵなどの化合物を含む、従来の化学療法剤が無効である。第二に、Ｄ５４モデルは、マウスにおいて比較的ゆっくり増殖して（倍加時間１０〜１５日）、そして、ある方法が分裂と非分裂の両方の腫瘍細胞を死滅させるかどうか試験するための手段を提供する。下記のＦ−ａｒａＡＭＰ投与スケジュールは、３日の期間にわたって与えられるため、完全退縮または治癒は、腫瘤の非増殖性区画の破壊を確立させる。第三に、ヒトグリオーマは、ＧＤＥＰＴの臨床試験のための標的であった。ヒトＤ５４腫瘍は、従来の化学療法、放射線療法、および遺伝子療法に基づく介入に対して、非常に抵抗性である。グリオーマモデルが本分析に選択されるが、Ｆ−Ａｄｅなどのプリン塩基または他のプロドラッグ（ＲＮＡおよびタンパク質の合成の阻害）による細胞死滅の確立されたメカニズムは、様々な悪性細胞型に対して活性であることに留意すべきである（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１）。以下の実験は、レンチウイルス形質導入またはアデノウイルス遺伝子送達のいずれかに続く静止腫瘍細胞のアブレーションを説明する。ＤＵ１４５を含む他の腫瘍、ならびに、多くの他の遺伝子導入ベクターおよびコードされる酵素のためのプロドラッグ基質が本明細書で有効であることが認められる。

本発明の治療の幅と有効性を調べるために、非小細胞肺腺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍも研究される。従来の化学療法および放射線療法のプロトコルは、このがんの患者に、１５％未満の５年生存を可能にする。ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍは、腫瘍が従来の治療に通常は無効であるヒトグリオーマＤ５４の多くの特質を共有する。分裂および非分裂のＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞の両方を死滅させる本発明の能力は、様々な標的細胞のタイプにおいて、死滅させるまたはさもなければ細胞機能を阻害することが可能である、特許請求の範囲に記載された本発明の普遍性を示す。

本発明は、特に、一般に標的細胞塊（ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｖｏｌｕｍｅ）内に、および特に腫瘍実質組織内に、非常に強力な細胞毒性の薬剤を産生するための方法を詳述する。本発明のストラテジーは、腫瘤内での産生に続くＦ−Ａｄｅ拡散の制限された半径、および、死にかけている腫瘍細胞からの放出後の広範な希釈（血清中の測定不能なＦ−Ａｄｅレベルまで）に基づき、安全であることが示されていて、そして、一貫したインビボのバイスタンダー死滅をもたらす。また、本発明の抗腫瘍活性のメカニズムは、ＧＤＥＰＴに対する他のアプローチの全てとは根本的に異なる。Ｆ−Ａｄｅの抗腫瘍活性は、分裂および非分裂の腫瘍細胞の両方のアブレーションをもたらすＲＮＡおよびタンパク質合成の阻害が原因である（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５５：１６７３−１６８１）。比較的ゆっくり増殖するＤ５４、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、またはＤＵ１４５腫瘍が３日間の腫瘍内治療で腫瘤が減少するという知見（特に図２Ｃならびに図５Ａ、５Ｂ、および７Ｂを参照）は、インビボでの、周期および非周期の腫瘍細胞の両方に対する活性を示す。

本発明のＦ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入は、プロドラッグへの全身性曝露を最小限にして、腫瘍組織自体などの標的細胞腫瘤内での薬剤レベルを最大限にする。Ｆ−ａｒａＡＭＰまたは他のプロドラッグの腫瘍内注入に続く顕著な抗腫瘍活性は、ＰＮＰまたはＮＨ発現の状況において顕著である。ここで、本発明によれば、Ａｄ／ＰＮＰと腫瘍内Ｆ−ａｒａＡＭＰ注入の組み合わせは、Ａｄ／ＰＮＰに続く全身性Ｆ−ａｒａＡＭＰよりも、著しく有効であることを留意すべきである。プロドラッグ注入は、ＰＮＰまたはＮＨとの単回ボーラスで、または実質組織における非ヒトのＰＮＰまたはＮＨ酵素の存在に対して時間的にずらした注入で投与される場合に、効果的であることを留意すべきである。

これらの結果は、ヒト対象での同等のストラテジーを適用するための直接の手段を示唆し、ベクター指向性、亢進したバイスタンダー死滅、または再標的化の改良の必要がない。アデノウイルスベクターおよびＦ−ａｒａＡＭＰの両方が、前臨床試験において包括的に研究されている。さらに、マウスでの３００ｍｇの腫瘍を治療するための局所治療として与えられるＦ−ａｒａＡＭＰの用量（３〜２４ｍｇが３回投与される）は、ヒトでの標準的な臨床治療の一環として日常的に投与されるＦ−ａｒａＡＭＰの量（４週毎に約４０ｍｇ／投与の１日５回投与）よりも、さらに少ない。本発明は、Ｆ−ａｒａＡＭＰ、Ｆ−Ａｄｅ、または他のＰＮＰ切断プロドラッグのいずれかへの全身性曝露を最小限にしながら、腫瘍の広い領域を連続して破壊するための、高頻度の（例えば毎日の）基準での、針が到達できる（ｎｅｅｄｌｅ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）腫瘍（前立腺がん、乳がん、脳腫瘍および頸部がん、または放射線誘導（ｒａｄｉｏｌｏｇｙｇｕｉｄａｎｃｅ）での、他の腫瘤）に対して、Ａｄ／ＰＮＰに続いてＦ−ａｒａＡＭＰが繰り返して投与される治療モダリティを提供する。「ポイント・アンド・アブレート」のアプローチは、非増殖性腫瘍細胞に対する活性とともに、Ｆ−Ａｄｅの強力な抗腫瘍活性およびその高いバイスタンダー活性のために、特にＰＮＰのＧＤＥＰＴアプローチのために実行可能である。Ｆ−Ａｄｅの腫瘍内産生は、腫瘍内に薬剤を濃縮する手段を提供するはずであり、そして、宿主での全身性曝露を最小限にする。

放射線療法は、主に、活発に分裂する腫瘍細胞を標的とするが、特に壊死領域において、静止腫瘍組織をアブレートすることができない（Ｐｕｈｌｍａｎｎｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９９；１０：６４９−６５７）。本発明は、ＰＮＰまたはＮＨプロドラッグと組み合わせて放射線療法の増強を提供する。ＸＲＴと異なるメカニズムにより作用する、非常に強力な抗がん剤が、本明細書において、固形悪性腫瘍の非周期区画を治療するために提供される。分裂および非分裂の腫瘍細胞の両方を強く死滅させるＦ−Ａｄｅは、これに関して好ましい化合物である。外科的切除の前に放射線療法が施さらえる一般的な腫瘍（グリオーマ、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍および頸部がん、肺がん、および、治療または緩和目的で治療される、他のがん）もまた、本発明の併用療法により恩恵を受ける。

上述の本発明の方法では、死滅されるべき哺乳類の細胞は、腫瘍細胞であり得る。悪性であろうとなかろうと任意の固形腫瘍を含む細胞は、腫瘍を含む細胞の少なくとも数パーセントにＰＮＰまたはＮＨ遺伝子を選択的に導入または発現する能力に基づく本発明の方法により、死滅させることができる。例えば、ＤＮＡを保持するリポソームの静脈内注入は、特定の細胞型での遺伝子の標的発現を仲介することができることが示されている。ＰＮＰまたはＮＨ遺伝子の標的化、または、腫瘤中の細胞の小分画への遺伝子発現に続く基質投与は、退縮を仲介するのに適切であり得る（Ｚｈｕｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：２０９−２１１，１９９３）。実施例に示される実質的なバイスタンダー効果および非分裂細胞の死滅によって、本発明の方法は、腫瘍を破壊することができる。例示された方法では、哺乳類の細胞は、ヒトグリオーマ、非小細胞肺腺がん、または前立腺細胞であるが、本明細書で教示される方法は、他の細胞に適用することができて、そして、本発明の方法に対するそれらの感受性は、教示されるようにして決定することができることが認められ得る。

腫瘍細胞の死滅に加えて、本発明の方法は、ウイルス感染細胞を死滅させることもできる。ウイルス死滅の実施態様では、選択される遺伝子導入方法は、ウイルス感染細胞でのＰＮＰの発現を標的とするそれの能力で選ばれる。例えば、ウイルス感染細胞は、遺伝子発現を制御および可能にするための特別なウイルス遺伝子配列（すなわち、ウイルス特異的プロモーター）を利用し得る。そのような配列は、非感染細胞には存在しない。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のＰＮＰ遺伝子が、そのようなウイルスプロモーターに関して適切に配向する場合、ＰＮＰはウイルス感染細胞内でのみ活性化されて、そして、他の非感染細胞内では活性化されない。この場合、ウイルス感染細胞は、Ｆ−ａｒａＡＭＰ、ＭｅＰ−ｄＲ、あるいは、標的細胞の近位に送達されるとＰＮＰまたはＮＨによって毒性型に変換されるように設計された他の基質の投与に、さらにより影響を受けやすい。

本発明の他の適用では、薬剤は、対象の任意の所望の標的細胞塊を死滅させるまたはさもなければ機能阻害するために与えられる。細胞を死滅させるまたはさもなければ機能阻害する、本発明の幅広い適用可能性は、優れた投与制御、および、様々な従来方法に対する改善された治癒特性を臨床医に提供する。本発明は、焼灼、切除を含む方法に代わる化学的細胞アブレーションを提供する。驚くことに、本発明により提供される化学的細胞アブレーションは、放射線アブレーション、切除、または焼灼技術と関連する顆粒化および乱切を排除し、その結果、化学的アブレーションの原位置の周辺に優れた治癒組織をもたらし、そして結果として、本発明は、心不整脈の治療、嚢胞減少、神経節治療、男性不妊手術、化粧皮膚科学的処置、およびメラノーマ治療での用途を有することに留意すべきである。本発明による化学的細胞アブレーションは、ＰＮＰまたはＮＨのためのプロドラッグの近位の送達とともに、ＰＮＰまたはＮＨ酵素、すなわち本明細書に詳述のウイルスベクターの任意の形態を発現する遺伝子の投与により容易に行うことができることが評価される。化学的細胞アブレーションのための標的細胞の位置に基づいて、本発明の薬剤は、カテーテル、マイクロシリンジ、カニューレ、またはシリンジによって；および、局所的にクリーム基剤で、投与される。好ましくは、ＰＮＰまたはＮＨ酵素は、細胞内に発現される。

哺乳類の細胞における、非ヒトまたは遺伝子改変ヒトプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼをコードする単離された核酸が、本発明において提供される。より具体的には、本発明は、哺乳類の細胞における、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰをコードする単離された核酸を提供する。「単離された」は、そこからＰＮＰ遺伝子が得られる天然起源の生物に見出される他の核酸から分離されることを意味する。

上述のように、好ましい実施態様では、本発明の方法で用いられるＰＮＰまたはＮＨは、死滅されるべき細胞における天然のＰＮＰまたはＮＨが認識しないまたは非常にわずかだけ認識する基質と反応することができる、遺伝子改変ヒトまたは非ヒト哺乳類のＰＮＰまたはＮＨを含み得る。このように、本発明のＰＮＰまたはＮＨをコードする本発明の核酸は、それらが異なる生物由来であるため、または、それらの天然の状態から変更されたためのいずれかのために、天然ではそれらが見出されない細胞中に存在する。ＰＮＰまたはＮＨをコードする核酸の重要な要件は、それらは、細胞の天然のＰＮＰまたはＮＨによってはうまく認識されない基質を認識して作用することができる機能酵素をコードしなければならないことである。

非ヒトまたは遺伝子改変プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼをコードする核酸を含む真核生物導入ベクターも提供される。ベクターは、標的とされる細胞の少なくとも数パーセントを形質導入または形質転換することが可能でなければならない。導入ベクターは、遺伝子を細胞内に送達するため（例えばプラスミド）、または遺伝子を送達する総合戦略の一環として、例えば、組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一環として用いられる、任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：８３−８８，１９９３）。実施例は、ＰＮＰをコードする核酸を含むレンチウイルスまたはアデノウイルスベクターを提供する。

本発明のベクターは、機能性ＰＮＰまたはＮＨを発現することが可能な宿主内に存在し得る。本発明の方法で用いられるように、宿主細胞は、ＰＮＰまたはＮＨを発現する、死滅すべき細胞であり、そして、酵素および酵素基質であるプロドラッグの反応の毒性産物により死滅させられる。感受性を判定する方法は、宿主細胞のトランスフェクションのためのプロトコルを教示してＰＮＰの発現および基質存在下での宿主細胞に対する毒性を示す実施例において示されている。あるいは、活性酵素またはそのプロ酵素は、標的細胞腫瘤へ投与される。

本発明の遺伝子導入方法に加えて、ＰＮＰ遺伝子産物は、多くの異なるメカニズムにより腫瘍細胞に選択的に送達されることもできて、そして、このＰＮＰは、腫瘍の部位においてＦ−Ａｄｅを産生するために用いられ得る。

例えば、ＰＮＰまたはＮＨ酵素は、任意の所望のモノクローナル抗体に結合させることができて、そして、全身性または標的細胞の近位のいずれかに、患者に注入することができる。標的細胞に結合されていない、モノクローナル抗体に結合された全てのＰＮＰまたはＮＨの除去に十分な時間が経った後に、患者は、標的部位でのみＦ−Ａｄｅへと切断されるＦ−ａｒａＡＭＰのようなプロドラッグの直接注入により治療される。そのような方法は、適切なモノクローナル抗体の利用可能性のみを必要とする。タンパク質を標的特異的モノクローナル抗体に結合させるために用いられる方法は、日常的に利用可能である。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するための、本技術の使用の例示である（Ｓｅｎｔｅｒｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２：４４７−４５１，１９９１；Ｂａｇｓｈａｗｅｅｔａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６０：２７５−２８１，１９８９；Ｂａｇｓｈａｗｅｅｔａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：７００−７０３，１９８８；Ｓｅｎｔｅｒｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．４：３−９，１９９３；Ｂａｔｔｅｌｌｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５：４２１−４２５，１９９２；ＰｉｅｔｅｒｓｚａｎｄＭｃＫｅｎｚｉｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ１２９：５７−８０，１９９２；ａｎｄＲｏｆｆｌｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ４２：２０６２−２０６５，１９９１）。モノクローナル抗体に加えて、他のリガンドを、標的細胞に関するそれらの特異性で選択することができ、本明細書に教示される方法により試験することができる。

また、タンパク質をリポソーム内に捕捉して、特定の組織に対してそれらを標的化することも可能である。ＰＮＰまたはＮＨ遺伝子産物は、このように、標的化リポソームを用いて、腫瘤に選択的に送達することができる。全ての非標的化リポソームを血液から除去した後に、患者は、標的部位でのみＰＮＰによってＦ−Ａｄｅへと切断されるＦ−ａｒａＡＭＰで処置される。再度、この方法は、適切な標的化ビヒクルの利用可能性のみを必要とする。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するための本技術の使用の例示である（Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ４９：６２１４−６２２１０，１９８９；ａｎｄＬｉｔｚｉｎｇｅｒａｎｄＨｕａｎｇＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１１０４：１７９−１８７，１９９２）。

非宿主ＰＮＰまたはＮＨのための酵素基質を表すプロドラッグは、標的細胞腫瘤内に直接、例えば腫瘍内に、例えば生理食塩水またはＤＭＳＯなどの薬学的に許容できる担体で注入されて、またはあるいは、プロドラッグ安定性および／または治療特性を改良するためにカプセル化される。本発明のプロドラッグは、ゲル、ペーストとして、または微粒子内にカプセル化されて容易に投与される。プロドラッグのためのそのような担体は、プロドラッグの持続放出、標的細胞腫瘤内での改良された拡散、および生理食塩水中の溶解に比較した保管安定性を与えるために、容易に用いられることが認められる。微粒子を用いて、本発明のプロドラッグの放出率は、１週間より多く、２週間より多く、６週間さえも超えて、容易に延長される（Ｚｅｎｔｎｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｌｅａｓｅ７２（１−３）：２０３−２１５，２００１）。本発明のプロドラッグは、ポリ乳酸、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、またはそれらの組み合わせのペーストで、容易に調製されて注入される（Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ６０（１５）：４１４６−４１５１，２０００）。プロドラッグはまた、ポリ乳酸、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、および他の多糖類を含む様々な材料由来の微小球内に適切にカプセル化される（Ｈａｒｐｅｒｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：４２４２−４２４８，１９９９；Ｄｏｒｄｕｎｎｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：２７９−２８２，１９９５；Ｂｅｒｔｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．８８：７３−７８，１９９５；）。プロドラッグの制御放出製剤で、より大量のプロドラッグが、持続的な細胞阻害およびバイスタンダー効果をなかなか得にくい標的細胞腫瘤内に注入されることが評価される。

腫瘍のような標的細胞塊への酵素およびプロドラッグの注入は、標的細胞の機能阻害またはさらに死滅のための努力に対して標的細胞の望ましくない増殖または機能を有する対象が本発明による注入の提供者を補償することで、金銭的補償の支援にて行われ得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例に関してさらに詳述される。これらの実施例は、添付クレームの範囲を限定することを目的としない。

（実施例１）マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片での試験。
親の、およびＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ発現Ｄ５４ＭＧ（ヒトグリオーマ）腫瘍細胞（２×１０^７細胞）は、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入したヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の横腹に皮下注入される。Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰで安定して形質導入されたＤ５４腫瘍細胞が、以前に説明されたとおりに調製される（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０１１Ｊｕｎ；１８（６）：３９０−８）。腫瘍はカリパスで測定されて、重量の推定が、方程式（長さ×幅^２）／２＝ｍｍ^３を用いて計算されて、そして、単位密度を推測するｍｇに変換される。別段の説明がない限り、治療薬およびＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ／ＰＮＰ）は、投与される薬剤が均一に分配されるようにして、１５０μｌの量をそれぞれおよそ２０μｌの８回の別個の注入でＤ５４腫瘍内に注入される。それぞれのグループのそれぞれの治療群は少なくとも６匹のマウスを含んだ。マウスは、体重減少について毎日モニターされて、腫瘍の大きさについて週に２回モニターされる。Ｔ−Ｃ（腫瘍増殖の遅延）は、薬剤処置と生理食塩水処置のグループ間での、倍加日数の差として受け止められる。それぞれの動物に関する評価ポイント（倍加）までの時間は、処置グループ間の増殖データを統計的に比較するために、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーの順位和検定、または生命表分析でのエンドポイントとして用いられる。全ての方法は、南部諸州研究学会のＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコルに従って行なわれる。Ｆ−ａｒａＡＭＰは、ＳｃｈｅｒｉｎｇＡ．−Ｇ．（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。本実施例および後の実施例では、Ｆ−Ａｄｅは、ＧｅｎｅｒａｌＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｏｆＣａｎａｄａ，Ｉｎｃ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から得られる。処置は、腫瘍が２５０〜３００ｍｇ（動物全重量の約１〜１．５％）であるときに始められる。

（実施例２）Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性の測定。
腫瘤でのレンチウイルスの形質導入細胞の割合は、薬剤処置の最初に日にマウスから取り出された代表的ながんにおけるＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を測定することにより検証される。粗抽出物は、マウスの横腹からの腫瘍切除後に、以前に説明されるようにして調製される（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；８：１６３７−１６４４）。抽出物は、インキュベーション時間の終わりに線形反応になる抽出物の濃度で、５０ｍＭのＰＯ_４、１００μＭの６−メチルプリン−２’−デオキシリボシド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｘｉｄｅ）（ＭｅＰ−ｄＲ）、および１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）とともにインキュベートされる。ＭｅＰの形成は、逆相ＨＰＬＣを用いてモニターされる。慣例により、１ユニットのＰＮＰ活性は、１時間で、１ナノモルのＭｅＰ−ｄＲ／ｍｇタンパク質を切断するために必要な抽出物の量として定義される。

（実施例３）Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内代謝のモニタリング。
全体の放射能は、３ｍｇの［８−^３Ｈ］Ｆ−ａｒａＡＭＰ（１０μＣｉ）を３００ｍｇのＤ５４横腹腫瘍に注入した後に判定される。［８−^３Ｈ］Ｆ−ａｒａＡＭＰは、ＭｏｒａｖｅｋＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から得られる。腫瘍は、注入後１０分または４時間にマウスから取り出されて、そして、５５℃で４時間インキュベートすることにより、１ｍｌのＳｏｌｕｅｎｅ３５０（ＰａｃｋａｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）中に溶解される。それぞれの抽出物の一部がシンチレーション流体と混合されて、放射能が判定される。

（実施例４）異なるスケジュールのフルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）の、５％の細胞においてＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍に対する効果。
親のＤ５４腫瘍細胞は、レンチウイルスによりＥ．ｃｏｌｉＰＮＰで安定的に形質導入されたＤ５４腫瘍細胞と、混合物の５％がＰＮＰ導入遺伝子を発現するようにして混合される。この９５／５混合物は、ヌードマウスの横腹に皮下注射で注入される。Ｆ−ａｒａＡＭＰ（２５０ｍｇ／ｋｇ、１回／日で連続３日間；１６７ｍｇ／ｋｇ、３回／日で連続３日間；１００ｍｇ／ｋｇ、１日５回で連続３日間；またはビヒクルコントロール、１日５回×３日）での腹腔内処置が、腫瘍がおよそ２５０ｍｇのときである１７日目に始められる。処置の時点（１７日目）での腫瘍内のＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性は、２，５００±４００ユニットである。全てのＦ−ａｒａＡＭＰ処置グループでの腫瘍増殖は、ビヒクル処理グループでの腫瘍増殖と有意に異なる。Ｐ<０．００１（図１）。

図１は、５％の腫瘍細胞（注入前に遺伝子導入された）が組み換え酵素を発現する場合の、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ、プラス、フルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）の抗腫瘍活性を示す。Ｆ−ａｒａＡＭＰの腹腔内（全身性）投与（１５回投与される１００ｍｇ／ｋｇ、９回投与される１６７ｍｇ／ｋｇ、または３回投与される２５０ｍｇ／ｋｇ）は、全腫瘍の完全退縮をもたらして、全てのマウスを治癒させる。親のＤ５４腫瘍（すなわちＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを有さない）はＦ−ａｒａＡＭＰでの処置に感受性がなく、この状況でのＦ−ａｒａＡＭＰでの腫瘍退縮は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現している腫瘍細胞の分画に用量依存性を示すことが、以前に示されている（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５；Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９７；８：１６３７−１６４４；以下も参照）。１００％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰで形質導入されている腫瘍と、形質導入されていない（親の）腫瘍は、同様の速度で増殖して（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）、約５％のレベルの形質導入が腫瘍モデルの拡張にわたって維持されることを示している。この断定を確かめるために、薬剤処置の初日にマウスから取られてＥ．ｃｏｌｉＰＮＰのレベルが２，５００±４００ユニットであると判定される３つの代表的な腫瘍から腫瘍抽出物が調製される。１２６，０００ユニットのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性は、この細胞株由来の、１００％ＰＮＰを発現する細胞からなる腫瘍に存在する（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）。したがって、知見は、この特定の実験において、親の（ＰＮＰを発現しない）細胞は、インビボで、ＰＮＰ導入株よりも、わずかに早く増殖したことを示唆し、そして、図１に示された形質導入の割合は５％以下であり、おそらく２〜３％に近いことを確認する。

図１に示される結果は、大きい腫瘍（動物の全体重のおよそ１％）の完全退縮または治癒は、腹腔内ＰＮＰに基づくＧＤＥＰＴストラテジーによって安全に達成され得ることを確証する。この知見はまた、優れたインビボでのバイスタンダー活性を示す。Ｆ−ａｒａＡＭＰの即時の（非徐放性の）わずか３回の腹腔内（ＩＰ）注入は、５％以下の細胞が活性遺伝子を発現するが、大きい腫瘍の破壊をもたらす。さらに、Ｆ−ａｒａＡＭＰでの処置は、体重のたった１０〜２０％の減少をもたらし、それはＦ−ａｒａＡＭＰスケジュール完了後すぐに取り戻される。腫瘍のすぐ周辺の領域における全体組織ダメージ、または実質的な延命に反する望ましくない後遺症の他の痕跡はない。ポリ乳酸微小球中３０重量％の３倍用量Ｆ−ａｒａＡＭＰの単回腹腔内注入は、同様の効果を達成する。

（実施例５）Ｄ５４腫瘍へのＦ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入。
図２Ａでは、親のＤ５４腫瘍細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰで形質導入されたＤ５４腫瘍細胞とともに、１０％が導入遺伝子を発現する最終的な割合に混合される。この９０／１０混合物は、ヌードマウスの横腹に皮下注射で注入される。腫瘍は、１５０μｌの生理食塩水、生理食塩水に溶解された１．５ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ、または生理食塩水に溶解された３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰを、１４日目にスタートして１回／日で連続３日間注入される。処置の時点での（１４日目）、腫瘍におけるＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性は、１４，３００±２，６００ユニットである。３ｍｇ処置グループでの腫瘍増殖は、ビヒクル処置グループでの腫瘍増殖と有意に異なるが（Ｐ<０．００１）、１．５ｍｇ処置グループでの腫瘍増殖とは有意差がない（Ｐ＝０．４５８）。図２Ｂでは、親のＤ５４腫瘍細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現しない）は、ヌードマウスの横腹に皮下注射で注入される。腫瘍は、１５０μｌの生理食塩水、生理食塩水に溶解された３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ、生理食塩水に溶解された０．１５ｍｇのＦ−Ａｄｅ、１５０ｍＬのＤＭＳＯに溶解された１．２６ｍｇのＦ−Ａｄｅ、ＤＭＳＯに溶解された０．６３ｍｇのＦ−Ａｄｅ、またはＤＭＳＯとともに、１４日目にスタートして１回／日で連続３日間接種される。この実験は、生理食塩水中のポリ乳酸微小球中３０重量％の９ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰの単回注入により、同様の結果で繰り返される。ＤＭＳＯ中に溶解された０．６３ｍｇまたは１．２６ｍｇのＦ−Ａｄｅで処置されたマウスでの腫瘍増殖は、ＤＭＳＯビヒクル処置グループでの腫瘍増殖と有意に異なる（それぞれ、Ｐ＝０．０１１および０．００２）。

図２Ａでは、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現する腫瘍への、Ｆ−ａｒａＡＭＰの注入は、強い抗腫瘍効果を有することを示す。本実験でのＦ−ａｒａＡＭＰの量は、最大耐性量よりかなり少なく、そして、さらなる注入は、さらに高い抗腫瘍活性を生じさせることに留意されたい。少ない投与量のＦ−ａｒａＡＭＰでは、処置の時点では、腫瘍でのＰＮＰ活性は１４，３００ユニットであるのに対し、Ｆ−ａｒａＡＭＰでの処置後４５日の腫瘍でのＰＮＰ活性は、１，２５０ユニットである。この結果は、Ｆ−ａｒａＡＭＰ処置は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現している細胞を優先的に死滅させたことを示し、それは、抗腫瘍活性は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰの発現に依存することを示唆する。注入されたＦ−ａｒａＡＭＰの量は１２０ｍｇ／ｋｇであり、このスケジュールでの最大耐性量（７５０ｍｇ／ｋｇ、ｑ１ｄ×３）よりもさらにより少ない。ＤＭＳＯに溶解される場合、さらに良い結果が、より多い用量のＦ−ａｒａＡＭＰでみられる；図２Ｃ。

（実施例６）ＰＮＰを有するおよび有さないＤ５４腫瘍細胞への、Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入。
図２Ｂ、図２Ｄおよび図３では、いずれの細胞もＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性を示さない腫瘍への、Ｆ−ａｒａＡＭＰの直接腫瘍内注入は、腫瘍増殖の効果を有さないことが示される。この結果は、図２Ａ、図２Ｃおよび図４で示されたＦ−ａｒａＡＭＰの抗腫瘍活性は、腫瘍細胞の一部でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの発現に起因することを示す。抗腫瘍活性のＦ−Ａｄｅ（Ｆ−ａｒａＡＭＰの活性代謝物）もまた、Ｆ−ａｒａＡＭＰと同様の方法で、腫瘍に注入される。水に溶解された１ｍｇ／ｍｌのＦ−Ａｄｅ（溶解の限界）０．１５ｍｌは、抗腫瘍効果を示さない。ＤＭＳＯに溶解された８．６ｍｇ／ｍｌのＦ−Ａｄｅ０．１５ｍｌが腫瘍に注入されて；わずかな抗腫瘍効果が見られる。

これらの結果は、ベクター（Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを送達するための）および時間放出型の（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）Ｆ−ａｒａＡＭＰの両方を含む産物は、他の方法では治療できない局所的ながんの治療に効果的であることを示す。この産物の少なくとも１回の注入は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現する任意の細胞、プラスＦ−ａｒａＡＭＰ関連の減少した全身毒性を有する多くのバイスタンダー細胞の代謝を阻害し、または死滅さえもさせる。これは、腫瘤を破壊するのに必要な回数、繰り返される。例えば、腫瘍が完全に除去されるまで、患者は、１回／週、外来患者として、減少した毒性で注入される。Ｆ−ａｒａＡＭＰの複数回の腫瘍内注入は、より高い抗腫瘍活性をもたらした（図４）。

腹腔内注入されたＦ−ａｒａＡＭＰのほんの１分画が、実際にインビボで悪性腫瘍に分散されるので、腫瘤内へのＦ−ａｒａＡＭＰの直接注入が有効性を高めることができるかどうか、試験される。最初の試験は、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現した腫瘍に関して示される（および、上記で紹介される）（図２Ａ）。３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ／注入の腫瘍内注入（全３回の注入）は、有意な抗腫瘍効果をもたらし（ほとんど体重減少がないかまたは体重減少がなく（４％未満）、ｐ<０．００１；一方で、Ｆ−ａｒａＡＭＰは、親の（Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現しない）腫瘍に注入されても効果がない（図２Ｂ）。マウスの体重はおよそ０．０２５ｋｇなので、３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰの注入は、Ｆ−ａｒａＡＭＰの１２０ｍｇ／ｋｇの用量と同等であり、それは、図１で試験された総全身量の２５〜５０パーセントである。腫瘍へのＦ−Ａｄｅ（Ｆ−ａｒａＡＭＰの活性代謝物）の注入もまた、生理食塩水での最高の可能な溶解度で試験されたときでも抗腫瘍活性を引き起こすことができない（図２Ｂ）。Ｆ−ＡｄｅはＤＭＳＯにも溶解されて、腫瘍への１．２６ｍｇのＦ−Ａｄｅの３回注入（Ｆ−ａｒａＡＭＰの３ｍｇ注入でのＦ−Ａｄｅとほぼ同等のモル）は、最小限の抗腫瘍活性をもたらしたが（図２Ｂ；ＤＭＳＯビヒクルを注入されたマウスに関してｐ＝０．０１１）、体重の１０％減少をもたらした。２．５ｍｇまたは５ｍｇのいずれかのＦ−Ａｄｅ（ＤＭＳＯに溶解）の３回腫瘍内注入は、それぞれ、６匹のマウスのうちの３匹、および、６匹のマウスのうちの４匹において死に導いて、そのことは、１．２６ｍｇはその最大耐性量（ＭＴＤ）の非常に近くであることを示した。したがって、その結果は、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰの腫瘍内発現に続く腫瘍内（ＩＴ）のＦ−ａｒａＡＭＰとは違い、Ｆ−Ａｄｅの直接腫瘍内（ＩＴ）注入は、抗腫瘍有効性をほとんど有しないことを示す。

上述のように、腫瘍内に与えられるＦ−ａｒａＡＭＰの量（図２Ａにおいて）は、図１に示される腹腔内用量の全量よりも少ない。より多い用量のＦ−ａｒａＡＭＰの影響を調べるために、Ｆ−ａｒａＡＭＰはＤＭＳＯに溶解されて、そして腫瘍内（ＩＴ）に耐容性良好であるが腹腔内投与される場合に最大耐性量を十分に上回る濃度で与えられる（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）。６ｍｇまたは２４ｍｇの３回用量が、腫瘍内（ＩＴ）注入によって、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現した腫瘍に投与される（図２Ｃ）。親のＤ５４腫瘍細胞、または、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍細胞の混合物は、ヌードマウスの横腹へ皮下注射で注入される。腫瘍は、１５０μｌのＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ中の２４ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ、またはＤＭＳＯ中の６ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰを、１７日目にスタートして１回／日で連続３日間注入される。１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性（１７日目）は、８，６００±６２０ユニットである。ＰＮＰ腫瘍を保有していて、６ｍｇまたは２４ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰで処置されたマウスでの腫瘍増殖は、ビヒクル処置グループと有意に異なるが（それぞれ、Ｐ＝０．０１４および<０．００１）、この実験で互いに有意差がない。２４ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰで処置された、６つの腫瘍のうちの３つは、潰瘍性になり（１７日目、２１日目、および２４日目）、試験動物の犠牲が必要となった。残りの３つの腫瘍は、完全に退行して、マウスは、７０日目に実験が終わるまで、腫瘍なしで残った。６ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰで処置された腫瘍には潰瘍化がなく、そして、この処置の単回のコースは、強い腫瘍退縮および持続的な抗腫瘍効果をもたらした。最大用量でのＦ−ａｒａＡＭＰの注入は、体重のわずかな（７％）減少をもたらして、それは薬剤処置の完了後に急速に回復した。親の腫瘍（ＰＮＰを発現しない）への、これらの用量でのＦ−ａｒａＡＭＰの注入は、抗腫瘍活性をもたらさなかった。

（実施例７）腫瘍内のＦ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの、Ｄ５４腫瘍に対する効果。
Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ（Ａｄ／ＰＮＰ）を発現する複製欠損アデノウイルスベクターの腫瘍内（ＩＴ）注入に続くＦ−ａｒａＡＭＰでの全身処置後のわずかな抗腫瘍活性が示されている（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）。図２Ｃで示される、高用量のＦ−ａｒａＡＭＰが腫瘍内投与される場合の強い活性に基づいて、Ａｄ／ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰの抗腫瘍活性が、これらの構成要素の両方が腫瘤内に直接接種される場合について検討される（図５Ａ）。実験が示すところにおいて、２×１０^１１ＶＰのＡｄ／ＰＮＰが、合計６回の注入のために、２回／日で３日間（１５日目、１６日目、および１７日目）、腫瘍内投与される。腫瘍は続いて、２０日目、２１日目、および２２日目に、１回／日、２４ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰを接種される。２０日目（Ｆ−ａｒａＡＭＰ処置の初日）の、腫瘍でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性は７，５００±２，０００ユニットであり、それは５〜１０％の細胞が安定的に酵素を発現した（２，５００、１４，３００、または８，６００ユニット）腫瘍に関して見られたのと同様であり、そして、腫瘍内Ｆ−ａｒａＡＭＰに起因し得る強い抗腫瘍活性は期待される範囲内である。Ａｄ／ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰで処置した１０匹マウスのうちの２匹は死んだが、処置中に１７％の体重減少を経験して後に回復した８匹の生存しているマウスには優れた抗腫瘍効果がある。図５Ａに示される実験での顕著な毒性の証拠のため、研究は減少した用量のＦ−ａｒａＡＭＰ（１８ｍｇ／注入）で繰り返される。このスケジュールでは、処置グループにおいて薬剤関連の死亡は存在せず、マウスの体重は減少しなかったが、移植後７１日をとおして、持続的な抗腫瘍活性が顕著である（図５Ｂ）。この実験の腫瘍でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰ活性は、１，９００±１，５００ユニットである。その結果は、Ａｄ／ＰＮＰの腫瘍内注入に続く腫瘍内Ｆ−ａｒａＡＭＰは、さもなければ難治性の固形腫瘍に対して実質的な退行的効果を引き起こすことができて、Ａｄ／ＰＮＰの腫瘍内注入に続く腹腔内Ｆ−ａｒａＡＭＰ後に見られるものよりも優れていることを確証する（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：６６１０−６６１５）。

Ａｄ／ＰＮＰ、プラス、より多い用量のＦ−ａｒａＡＭＰの両方での腫瘍注入は、Ａｄ／ＰＮＰプラス全身性Ｆ−ａｒａＡＭＰよりも優れた、腫瘍増殖に対する劇的な効果を有した（図５Ａおよび図５Ｂ）。

（実施例８）Ｆ−ｄＡｄｏ対Ｆ−ａｒａＡＭＰの効果。
Ｆ−ｄＡｄｏまたはＦ−ａｒａＡＭＰは、１５０μｌの量をおよそ２０μｌずつの８回の別個の注入で、Ｄ５４腫瘍内へ３回注入される。図５Ａでは、親のＤ５４ヒトグリオーマ腫瘍は、ビヒクル（黒丸）、Ａｄ／ＰＮＰ（白丸）、Ｆ−ａｒａＡＭＰ（黒三角）、またはＡｄ／ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰ（白三角）で腫瘍内処置される。Ａｄ／ＰＮＰ（２×１０^１１ＶＰ）は、１５日目にスタートして、連続３日間、１日に２回注入される。ＤＭＳＯに溶解された２４ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰは、２０日目にスタートして、連続３日間、１日あたり１回、腫瘍に注入される。ビヒクル処置のマウスでの腫瘍は、生理食塩水で６回注入されて、ＤＭＳＯの３回注入が続けられる（他の点は上述のとおり）。Ｄ５４腫瘍でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性（２０日目）は、７，５００±２，０００ＰＮＰユニットである。それぞれの処置群は、１０匹のマウスを含む。組み合わせ処置群では、１０匹のマウスのうちの２匹が、完了前に失われる。８匹の残りのマウスのうちの４匹は、６５日目に腫瘍なしであり、２匹のマウスは小さな腫瘍を有し（６３ｍｇおよび２８８ｍｇ）、そして２匹のマウスは増殖する腫瘍を有した（１６６６ｍｇおよび１５８４ｍｇ）。Ａｄ／ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰで処置されたマウスでの腫瘍増殖は、Ｆ−ａｒａＡＭＰまたはＡｄ／ＰＮＰ単独で処置されたマウスでの腫瘍増殖と有意に異なる（それぞれ、Ｐ＝０．０１０および０．００２）。図５Ｂでは、マウスは、Ｆ−ａｒａＡＭＰの用量が１８ｍｇ／注入であることを除いて、図５Ａで説明されたとおりに処置される。この実験での１８日目のＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性は、１９００±１５００ＰＮＰユニットである。Ａｄ／ＰＮＰプラスＦ−ａｒａＡＭＰで処置されたマウスでの腫瘍増殖は、Ｆ−ａｒａＡＭＰまたはＡｄ／ＰＮＰ単独で処置されたマウスでの腫瘍増殖と有意に異なる（それぞれ、Ｐ＝０．００１および０．０１１）。代替的な起源であるＴ．ｖａｇａｎａｌｉｓ（Ｔｖ）−ＰＮＰを用いたデータを、図５Ｃに示す。

細胞がＰＮＰを発現する場合にＦ−ｄＡｄｏはＦ−ａｒａＡよりもＥ．ｃｏｌｉＰＮＰのためのさらに良い基質であるが、より良い結果が、Ｆ−ｄＡｄｏよりもＦ−ａｒａＡＭＰで観察される（図６Ａおよび図６Ｂ）。

（実施例９）腫瘍内Ｆ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの、ＤＵ１４５（ヒト前立腺）腫瘍およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（ヒト非小細胞肺腺がん）腫瘍に対する効果。
Ｆ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの注入は、腫瘍がここでは同様の結果を有するＤＵ１４５であることを除き、上述のとおりに行われる（図７Ａ）。Ｆ−ａｒａＡＭＰおよびＡｄ／ＰＮＰの注入は、腫瘍がここでは同様の結果を有するＨ３２２Ｍであることを除き、上述のとおりに行われる（図７Ｂ）。

（実施例１０）Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入プラス放射線の、Ｄ５４腫瘍に対する効果。
局所的進行性固形腫瘍は、しばしば、放射線治療に抵抗性になる。この状況でのアジュバントＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの試験として、体外照射放射線とともにＦ−ａｒａＡＭＰ注入が検討される。図８Ａでは、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現する腫瘍が、３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ（腫瘍抑制をもたらしたが腫瘍無しの生存者は存在しない用量、図２Ａ）の３回の腫瘍内注入とともに、または無しで、放射線（Ｄ５４腫瘍増殖に対して測定可能な効果をもたらすと以前に決定された）が施行される。図８Ｂでは、１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現する腫瘍は、３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ（腫瘍抑制をもたらしたが腫瘍無しの生存者が存在しない用量、図２Ａ）の３回の全身性腹腔内注入とともに、または無しで、放射線（Ｄ５４腫瘍増殖に対して測定可能な効果をもたらすと以前に決定された）が施行される。Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰ／Ｆ−ａｒａＡＭＰを放射線治療と組み合わせることは、いずれかの処置のみよりもさらに高い、顕著な抗腫瘍活性をもたらした。１０〜１４パーセントの体重減少が全ての処置グループにおいて見られ（処置の終了後すみやかに回復する）、２つの毒性の介入が付加的でないことを示す。同様の結果が、実施例５の徐放性Ｆ−ａｒａＡＭＰで得られる。

１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現したＤ５４腫瘍細胞が、ヌードマウスの脇腹に皮下注射で注入される。腫瘍は、放射線で、Ｆ−ａｒａＡＭＰで、またはＦ−ａｒａＡＭＰプラス放射線で処置される。２つの処置グループでは、腫瘍は、１回／日で連続３日間、生理食塩水または生理食塩水に溶解された３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰのいずれか１５０μｌを注入される。２つの他の処置グループでは、１回／日で連続３日間、生理食塩水（黒四角）または生理食塩水に溶解された３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰ（白四角）のいずれか１５０μｌの注入の３時間後に放射線（４Ｇｙ）が施行される。Ｄ５４腫瘍でのＥ．ｃｏｌｉＰＮＰの活性（１６日目）は、１２，０００±３，０００ユニットである。放射線プラスＦ−ａｒａＡＭＰで処置されたマウスでの腫瘍増殖は、Ｆ−ａｒａＡＭＰまたは放射線単独で処置されたマウスでの腫瘍増殖と有意に異なり（それぞれ、Ｐ＝０．００４および<０．００１）、全身性腹腔内注入（図８Ｂ）と比べると、腫瘍内注入で優れている（図８Ａ）。

（実施例１１）Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入後のＤ５４腫瘍での放射能。
腫瘍内（ＩＴ）Ｆ−ａｒａＡＭＰの薬力学を理解しようとする試みでは、親の（Ｄ５４）腫瘍および１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現した腫瘍でのプロドラッグ活性化のレベルがモニターされる（表１）。腫瘍組織は、３ｍｇの［^３Ｈ］−Ｆ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入後１０分または４時間に採取されて、そして腫瘤中に残存する放射能の量が判定される。Ｆ−ａｒａＡＭＰでの注入後１０分、親と１０％の細胞がＥ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現するＤ５４腫瘍との間に違いはない。４時間では、Ｅ．ｃｏｌｉＰＮＰを発現したＤ５４腫瘍での放射能は、親の腫瘍よりもかなり高く、Ｆ−Ａｄｅ代謝物に変換されたＦ−ａｒａＡＭＰの量を表している。実験は、３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰの腫瘍内注入後に、腫瘍組織のグラムあたり、１９０ナノモルのＦ−Ａｄｅ代謝物が生産されて保持されることを示した。３ｍｇのＦ−ａｒａＡＭＰは、８２００ナノモルと同等であり、本実験での腫瘍はおよそ０．３グラムであるので、およそ５７ナノモルのＦ−Ａｄｅまたは腫瘍中に注入された全Ｆ−ａｒａＡＭＰの０．７％が本実験での腫瘍組織内に保持される。

本明細書で言及される特許文献および出版物は、本発明が関連する当業者のレベルを示す。これらの文献および出版物は、あたかもそれぞれの個々の文献または出版物が具体的におよび個々に参照により本明細書中に援用されるかのように、同じ範囲まで、参照により本明細書中に援用される。

前述の説明は、本発明の特定の実施態様の実例であるが、それらの実施に対する制限となることを意図しない。それらのすべての同等物を含む以下のクレームは、本発明の範囲を規定することを目的とする。

Claims

プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはヌクレオシドヒドロラーゼ、またはそれらをコードするベクター、および、
フルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）である、前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼにより切断されるプロドラッグの、
非周期の固形腫瘍における放射線療法の効能を増強するための注入薬剤の調製のための、
使用であって、
前記注入薬剤は、放射線療法と同日に前記腫瘍内またはその近位に投与されるものである、
使用。
請求項１に記載の使用であって、
前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼは、前記プロドラッグと混合されることを特徴とする、
使用。
請求項１に記載の使用であって、
前記プロドラッグは、徐放性担体とともに処方されることを特徴とする、
使用。
請求項１に記載の使用であって、
前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼは、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたは前記ヌクレオシドヒドロラーゼをコードする核酸を含むウイルスベクターで送達されることを特徴とする、
使用。
請求項４に記載の使用であって、
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、
使用。
請求項１に記載の使用であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来であることを特徴とする、
使用。
請求項１に記載の使用であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の酵素の変異体であることを特徴とする、
使用。
請求項７に記載の使用であって、
前記変異体は、テール（ｔａｉｌｅｄ）変異体であることを特徴とする、
使用。
プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはヌクレオシドヒドロラーゼ、またはそれらをコードするベクター、および、
フルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）である、前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼにより切断されるプロドラッグを組み合わせてなる、
非周期の固形腫瘍における放射線療法の効能を増強するための、
医薬であって、
前記医薬は、放射線療法と同日に前記腫瘍内またはその近位に投与されるものである、
医薬。
請求項９に記載の医薬であって、
前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼは、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたは前記ヌクレオシドヒドロラーゼをコードする核酸を含むウイルスベクターで送達されることを特徴とする、
医薬。
請求項１０に記載の医薬であって、
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬。
請求項９に記載の医薬であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来であることを特徴とする
医薬。
請求項９に記載の医薬であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の酵素の変異体であることを特徴とする、
医薬。
請求項１３に記載の医薬であって、
前記変異体は、テール変異体であることを特徴とする、
医薬。
非周期の固形腫瘍における放射線療法の効能を増強する方法で使用するための医薬組成物であって、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはヌクレオシドヒドロラーゼ、またはそれらをコードするベクターを含んでおり、
前記方法は、以下のステップ：
プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはヌクレオシドヒドロラーゼ、またはそれらをコードするベクターを、前記腫瘍に送達するステップ；および
プリン塩基の細胞毒性を前記腫瘍内に放出するために、フルダラビンホスフェート（Ｆ−ａｒａＡＭＰ）である、前記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼにより切断されるプロドラッグを、前記腫瘍の近位へ直接注入するステップ、および
前記腫瘍をＸ線照射に曝すステップ
を含み、
前記各ステップは同日に実施される、
医薬組成物。
請求項１５に記載の医薬組成物であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはヌクレオシドヒドロラーゼは、前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたは前記ヌクレオシドヒドロラーゼをコードする核酸を含むウイルスベクターで送達されることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１６に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来であることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の酵素の変異体であることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、テール変異体であることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記方法は、前記腫瘍に対するバイスタンダー細胞の増殖を阻害するステップをさらに含むことを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
ゲル、ペースト、または微粒子の徐放性担体をさらに含むことを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１５に記載の医薬組成物であって、
前記プリン塩基の細胞毒性は、２−フルオロアデニンであることを特徴とする、
医薬組成物。