CN107496910A - 与嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前体药物的改进的治疗用途相关的应用 - Google Patents

与嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前体药物的改进的治疗用途相关的应用 Download PDF

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Abstract

本申请详述了，一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或编码任意一个这些酶的表达的载体，连同被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药，在用于产生复制型或非复制型靶细胞的直接注射抑制方面的用途。靶细胞通常不表达引入的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶。酶和前药适合于混合，并且以单次量或以分次注射的方式注射或给药到靶细胞。通过将靶细胞暴露于X射线辐射来提高药物及前药的效力。不管针对靶细胞的给药途径如何，前药的给药与X射线放射疗法组合来杀死或是抑制靶细胞的功能是有效的。

Description

与嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前体药物的改进的治疗 用途相关的应用
本申请为申请日是2012年2月20日、优先权日是2011年2月18日、申请号是201280018791.X、发明创造名称是“与嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前体药物的改进的治疗用途相关的应用”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求享有2011年2月18日提交的美国临时申请序列号61/444,261的优先权，该文献的内容在此通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及通过原位控制一种前药的体内裂解以产生细胞毒性来诱发细胞死亡，且特别涉及通过与直接在原位注射前药、放疗或者它们的组合配合来实施裂解来提高治疗效果。
背景技术
化学疗法是一种治疗许多人类肿瘤的主要方法，但对于休眠的(quiescent)或是慢分裂恶性肿瘤(slowly dividing cancers)的体内疗效较差(Takimoto et al.CancerManagement Handbook(11th Edition),UBM Medica 2009；Sang et al.Trends Mol Med2010；16(1):17-26；Mellor et al.Br J Cancer 2005；93(3):302-9)。放射治疗和全身化疗(systemically administered chemotherapy)通过破坏DNA复制来获得特异性，但这两种方法不能切除间歇地循环的休眠的肿瘤组织。无法摧毁不分裂的肿瘤细胞(包括一个假定的肿瘤干细胞池)被公认为是对抗常见的人类恶性肿瘤失败的许多原因中的一个，这些常见的恶性肿瘤包括了前列腺肿，乳腺，肺和结肠的低生长比率的肿瘤(Vessella etal.Cancer Biol Ther 2007；6(9):1496-504；Kusumbe et al.Cancer Res 2009；69(24):9245-53)。即使在一种具有不寻常的高有丝分裂指数(例如：生长比率～40％)的实体肿瘤的情况中，并假设通过累积地受到传统的化或放疗来彻底摧毁所有分裂的癌细胞，肿瘤团(the mass)仍然距离达到预处理尺寸的不到一个加倍。
乳腺、前列腺、喉和脑的非转移性恶性肿瘤的治疗通常是采用术前放疗(XRT)作为在最终手术切除之前的减瘤(debulking)的措施(DeVita et al.Principles andPractice of Oncology(8th Edition).Ronald A.DePinho and Robert A.Weinbert,Eds.Lippincott Williams&Wilkins,2008)。其他局部浸润的非转移性肿瘤适合于延长生命的XRT，且阻碍了内脏(例如：胃，喉，结肠，或是呼吸道)的不能动手术的的恶性肿瘤采用局部放疗的方式进行常规治疗以减轻症状(Washington et al.Principles and Practiceof Radiation Therapy(3rd Edition).Mosby,2009)。像这些肿瘤，总是呈现出低生长比率，并在某些时候对放疗和最佳可用的化疗方法都没有反应。
为了改善包括诸如上述的那些常见恶性肿瘤在内的局部浸润的非转移性的肿瘤的治疗，几个更新的技术形式已经得到改进。例如低温的、磁的、热的和超声的细胞消融技术都已经研究取得不同程度的临床前或者早期临床的成功(Osada et al.Anticancer Res2009；29(12):5203-9；Krishnan et al.Int J Hyperthermia 2010Sep 21[Epub ahead ofprint]；Margreiter et al.J Endourol 2010；24(5):745-6)。实验性基因疗法，例如GDEPT(基因导向的酶前药治疗；所谓的“自杀基因”策略)，已经过广泛测试，但是其因至少两个原因在对抗局部浸润的非转移性肿瘤的治疗仅获得有限的成功(GW Both.Curr Opin MolTher 2009；11(4):421-32；Altaner et al.Cancer Lett 2008；270(2):191-201；Dachs etal.Molecules 2009；14(11):4517-45)。第一，使用目前可用的基因转移载体的肿瘤细胞转导效率较低。一小部分的表达一抗癌转基因的恶性细胞往往不足以在瘤块中增加一个强大的旁观者效应以对抗未转染细胞。第二，GDEPT主要是利用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因或原核胞嘧啶脱氨酶(CD)基因以激活瘤内化疗，并且由这两种酶(分别是丙氧鸟苷单磷酸盐(gancyclovir monophosphate)和5-氟尿嘧啶(FUra))所产生的化合物主要是有效地对抗正在分裂的肿瘤细胞。低转导效率，较差的旁观者活性，以及不能杀死不分裂的癌细胞是导致在临床中对抗非转移性的实体肿瘤的第一代GDEPT方法失败的原因。
大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因已经被证明能在瘤内产生诸如2-氟腺嘌呤(F-Ade)或6-甲基嘌呤(MeP)的高效化合物(Ungerechts et al.Cancer Res.2007；67:10939-10947；Fu et al.Cancer Gene Ther.2008；15:474-484；Fu W,Lan et al.CancerSci.2008；99:1172-1179；Parker et al.Cancer Gene Therapy 2011Jun；18(6):390-8；Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003；304:1280-1284)。诸如这些的嘌呤碱可以通过在所有细胞中普遍存在的易化扩散途径，在被转导的大肠杆菌PNP和相邻的(旁观者)细胞之间自由地扩散，并产生了一个显著的旁侧杀死效应(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615)。这些化合物通过一种干扰RNA与蛋白质合成的独特机制起作用，且因此可以在体内有效地对抗分裂和不分裂(休眠的)肿瘤细胞(Parker etal.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681)。F-Ade可通过胞内大肠杆菌PNP从诸如2-F-2’-脱氧腺苷(F-dAdo)或磷酸氟达拉滨(F-araAMP)的前药产生(Hong et al.CancerRes.2004；64:6610-6615；Parker et al.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681；Martiniello-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998；9:1617-1626；Mohr etal.Hepatology 2000；31:606-614；Voeks et al.Gene Therapy 2002；9:759-768；Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004；6:1343-1357；Parker et al.Cancer GeneTherapy 2003；10:23-29；Parker et al.Human Gene Therapy 1997；8:1637-1644；Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004；6:43-54)。后者药物，F-araAMP，在临床中被批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病，但对于非淋巴组织的恶性肿瘤没有活性。
F-Ade作为抗癌药物比FUra大约有效1000倍。尽管有这样的效力，很多实验室已表明F-Ade可以被安全地用作GDEPT的成分。因为1)强的瘤内螯合作用到细胞核酸中；2)伴随着肿瘤细胞的死亡而缓慢地释放到全身腔室中，被紧邻区域的邻近(旁观者)癌细胞摄取；3)从肿瘤中释放出任何化疗的广泛稀释(遍及寄主)，该方法在许多动物模型体内产生了安全且一致的抗肿瘤功效(Ungerechts et al.Cancer Res.2007；67:10939-10947；Fu etal.Cancer Gene Ther.2008；15:474-484；Parker et al.Cancer Gene Therapy 2011Jun；18(6):390-8；Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003；304:1280-1284；Hong etal.Cancer Res.2004；64:6610-6615；Martiniello-Wilks et al.Human Gene Therapy1998；9:1617-1626；Mohr et al.Hepatology 2000；31:606-614；Voeks et al.GeneTherapy 2002；9:759-768；Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004；6:1343-1357；Parker et al.Cancer Gene Therapy 2003；10:23-29；Parker et al.Human GeneTherapy 1997；8:1637-1644；Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004；6:43-54；Deharvengt et al.Int.J.Oncol.2007；30:1397-1406；Kikuchi et al.Cancer GeneTher.2007；14:279-86)。大肠杆菌PNP与第一代策略(即HSV-tk和CD)间的几个直接的比较，通过一个基于PNP机制，表明了GDEPT的大量增加(Martiniello-Wilks et al.Human GeneTherapy 1998；9:1617-1626；et al.Clin Cancer Res 1997；3:2075-80；Nestler etal.Gene Therapy 1997；4:1270-77；Puhlmann et al.Human Gene Therapy 1999；10:649-657)。此方法近来在美国被食品药品监督管理局批准临床试验(IND#14271,批准于3/19/2010)。
F-Ade代谢物的延长的瘤内半衰期，特别是通过大肠杆菌PNP伴随产生的(大于24小时)(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615；Parker etal.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681；Parker et al.Cancer Gene Therapy 2003；10:23-29)，连同休眠肿瘤细胞和肿瘤干细胞的(通过消融RNA与蛋白质的合成)旁观者杀死(bystander killing)，暗示了为了在肿瘤组织内集中有效化疗，PNP作为一种“定位与消融”模式的可能用途。
使用化疗药物的癌症治疗依赖于全身性给药，即相当于或优于瘤内注射。化疗的直接瘤内注射不被传统的现有技术认为是较全身路径在诱发抗肿瘤效果方面更有效，这是因为在体内瘤内吸收差，化疗肿瘤细胞利用率低以及微不足道的肿瘤细胞杀伤力。此外，瘤内给药是一个严格的程序，然而通过静脉内或其他全身路径的全身给药比较容易实施。
因此，目前需要提供一种更有效的对抗体内靶细胞且尤其是肿瘤细胞的抑制疗法。进一步的，还需要改善一种对抗靶细胞的旁观者抑制效果并且长时间保持这种效果。
发明内容
本申请详述了，一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或编码任意一个这些酶的表达的载体，连同被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药，在用于产生复制型或非复制型靶细胞的直接注射抑制方面的用途。靶细胞通常不表达引入的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶。该酶和前药适合于混合，并且以单次量或以分次注射的方式注射或给药到靶细胞。该酶的胞内表达改善了疗效。本发明的药物的使用，因旁观者效应，在肿瘤的治疗中特别有效，在该旁观者效应中，邻近转染细胞的细胞和含有该酶的细胞间液体与经前药裂解而被释放的药物接触来抑制细胞功能或杀死细胞。药物和前药的疗效通过将靶细胞暴露在X射线辐射下得到提高。
本发明也提供了一种抑制复制型或非复制型靶细胞的方法，其包括了将一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶递送到靶细胞。被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药被直接注射到靶细胞的邻近以释放一种对靶细胞有细胞毒性的嘌呤碱基来杀死或者抑制靶细胞功能。该方法特别适合于给药到肿瘤内。全身性的前药的给药，不论是否直接给药到靶细胞邻近，其与X射线放射疗法的组合对于杀死或是抑制靶细胞功能是有效的。
附图说明
图1是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了全身性的腹膜内(IP)磷酸氟达拉滨(F-araAMP)的不同时间对5％的细胞表达大肠杆菌PNP的D54肿瘤的影响；
图2A是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了通过瘤内注射至10％的细胞表达大肠杆菌PNP的肿瘤内的F-araAMP的效果和产生的抗肿瘤活性；
图2B是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了在没有细胞表达大肠杆菌PNP的活性的D54肿瘤中瘤内注射高浓度的F-araAMP的影响；
图2C是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了F-araAMP注射至10％的细胞表达大肠杆菌PNP活性的肿瘤内对D54肿瘤生长的影响；
图2D是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，F-araAMP注射至没有细胞表达大肠杆菌PNP的活性的肿瘤内对D54肿瘤生长的影响；
图3是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了F-araAMP的直接瘤内注射到不表达大肠杆菌PNP的肿瘤内(每日一次或是每日两次)对于肿瘤生长没有影响；
图4是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了当F-araAMP的直接瘤内注射进入具有10％表达大肠杆菌PNP肿瘤细胞的肿瘤时，会产生非常好的抗肿瘤活性，采取六次注射比三次注射活性更好；
图5A是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了腺病毒载体(Ad)PNP外加F-araAMP，采用2 4mg瘤内前药的高F-araAMP剂量条件，对于D54肿瘤的影响；
图5B是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了腺病毒载体(Ad)PNP外加F-araAMP，采用较低的F-araAMP剂量条件(18mg)，对于D54肿瘤的影响；
图5C是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了在不同的直接瘤内给药顺序和改变原来的PNP顺序的条件下的效果；
图6A是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了通过直接瘤内注射至没有细胞表达大肠杆菌PNP活性的肿瘤的F-dAdo对D54肿瘤生长的影响；
图6B是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了通过直接瘤内注射至10％的细胞表达大肠杆菌PNP活性的肿瘤的F-dAdo对D54肿瘤生长的影响；
图7A是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了瘤内的F-araAMP和Ad/PNP对于DU145肿瘤的影响；
图7B是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了瘤内的F-araAMP以及Ad/PNP对NCI-H322M非小细胞肺腺癌肿瘤的影响。
图8A是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了F-araAMP的瘤内注射加辐射对于10％的细胞表达大肠杆菌PNP的D54肿瘤的影响；
图8B是肿瘤重量随时间变化的函数关系图，表明了F-araAMP的腹膜内(IP)注射加辐射对于处于不同的辐射条件下的10％D54/PNP肿瘤的影响。
具体实施方式
本发明对抑制一种靶细胞团有效用，以及在一个特定的实施例，对抑制活体内肿瘤的生长有效用。人们惊奇地发现，对于一般情况下的前药直接近端给药至靶细胞且特别是经过酶裂解的直接瘤内注射，会在诸如肿瘤的靶细胞团中产生一种细胞毒性碱，细胞团载有或表达这种酶比包括口服，肠道外给药(例如静脉给药)，肌内给药，腹腔内给药，或经皮给药在内的传统的全身性给药途径更为有效。当这种酶在靶细胞内被激活时，明显更加有效果。
前药的直接瘤内注射照惯例被视作与全身性的前要给药相比是没必要的和低效率的，其原因部分是由于自然肿瘤良好的血管化特性以及上文已述的其他观点。前药的给药，不管给药途径如何，当其与肿瘤辐射照射相结合，给药至表达或邻近该酶的细胞更有效。人们认为这是出人意料的，因为PNP或NH不是已知的放射致敏剂，每个酶单独作用，或在前药底物的存在条件下。
本发明基于将一种前药例如磷酸氟达拉滨注射到表达非寄主嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或核苷水解酶(NH)的靶细胞附近，从而产生高水平的旁观者抑制及杀灭作用；本发明还基于在小鼠模型活体内大量的人类肿瘤异种移植瘤的摧毁。不论前药的给药速率如何，非寄主PNP或NH以及酶的前药底物增强了放疗效果，并通过一个独特的机制产生作用。特别是，一种前药中的2-氟腺嘌呤或其他有毒嘌呤在瘤内产生改善了其效果，其特点是缓慢地释放到全身仓中，并且在宿主中稀释。使用一种表达大肠杆菌PNP的腺病毒载体对大的皮下肿瘤注射，随后是磷酸氟达拉滨或是其他前药，其结果是肿瘤消退及长时间抑制了肿瘤的生长。本发明提供了一种方法，其中对现有药物有耐药性的肿瘤实施重复处理(以每日为重复基准)的安全性渗透，赋予了1)癌组织内强效化疗的捕集；2)恶性薄壁组织的滴定方式的破坏。
通过直接注射缓蚀配方形式的前药至靶细胞，促进延长的靶细胞抑制。前药的延长释放促进低生长分数的肿瘤的抑制。
本发明中的有效的酶是一种非人类嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或核苷水解酶(NH)，所述非人类嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，例如来源于大肠杆菌、阴道毛滴虫，或任何其他可以转变前药底物以产生一种细胞毒性的嘌呤碱基的非人类PNP。可以理解的，本发明中，非寄主核苷水解酶连同一种合适的前药也可以用于作为实施本发明的基础。前药，经水解酶裂解，被选中以产生一种相对较高细胞毒性的化合物。更进一步可以理解的，突变的PNP和诸如那些在US 7,488,598中详述的水解酶在本发明中可以用于从前药来产生细胞毒性的嘌呤碱基，并且适合于抑制诸如繁殖的细胞功能，并且甚至杀死受试人的那些已被转染的或仅仅与酶附近的细胞。可以理解的，本发明所用的一种酶能提供足够效力的细胞毒性嘌呤碱基以产生一种旁观者效应，从而抑制转染细胞，转导细胞，以及旁观者细胞。
本发明中所使用的“邻近(proximity)”是指直接引入到诸如肿瘤块的一确定的组织块中，并且邻近于一靶细胞，距离大约是50个相邻细胞直径的间隔或是等同的线性间隔，较佳地，距离大约是20个相邻细胞直径的间隔或是等同的线性间隔。
本发明中可以使用的前药具有对于受试者细胞相对无毒的属性，然而经该前药的酶裂解产生一种细胞毒性嘌呤碱基。代表性前药已为本领域所知(Ungerechts etal.Cancer Res.2007；67:10939-10947；Fu et al.Cancer Gene Ther.2008；15:474-484；Fu et al.Cancer Sci.2008；99:1172-1179；Parker et al.Cancer Gene Therapy Inpress；Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003；304:1280-1284；Hong et al.CancerRes.2004；64:6610-6615；et al.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681；Martiniello-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998；9:1617-1626；Mohr et al.Hepatology 2000；31:606-614；Voeks et al.Gene Therapy 2002；9:759-768；Martiniello-Wilks etal.J.Gene Med.2004；6:1343-1357；Parker et al.Cancer Gene Therapy 2003；10:23-29；Parker et al.Human Gene Therapy 1997；8:1637-1644；Martiniello-Wilks etal.J.Gene Med.2004；6:43-54)。虽然以下的数据详述了F-dAdo和F-araAMP在本发明的中的使用，应当理解的是，这些结果也可以扩展到其他前药。
选择D54人类神经胶质瘤模型来研究大肠杆菌PNP/F-araAMP的安全性及有效性有以下几个原因：首先，传统的化疗药物难以治疗小鼠体内的D54肿瘤，所述传统的化疗药物包括诸如BCNU的经临床批准用于人类神经胶质瘤治疗的化合物；其次，D54模型在小鼠中生长相对较慢(体积加倍的时间为10到15天)，并提供一种测试一方法是否能同时杀死分裂肿瘤细胞和非分裂肿瘤细胞的手段。由于下面所述的F-araAMP的给药进度是以超过三天为一段时间，完全的消退或是治愈建立了对一种瘤块的非增殖性隔室的破坏。第三，人类神经胶质瘤已成为GDEPT临床测试的一种靶。人类D54肿瘤对常规的化疗，放疗及基因疗法为基础的介入治疗具有高度抵抗作用。应当注意的是，尽管本分析选择了一种神经胶质瘤模型，由例如F-Ade或其他前药的嘌呤碱杀死细胞(干扰RNA与蛋白质合成)的既定机制仍对多种多样的恶性肿瘤细胞类型有效(Parker et al.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681)。下面的实验描述了静态肿瘤细胞的消融，接着发生慢病毒转导或是腺病毒基因传递。应理解的是，其他的肿瘤包括DU145，以及解码酶的许多其他基因转移载体和前药基质在此都是合适的。
为了探索本发明疗法的广泛性和有效性，也要对NCI-H322M非小细胞肺腺癌的细胞株进行研究。常规的化疗和放疗操作规范提供给这种癌症的患者小于15％的五年存活率。NCI-H322M共享了D54人类神经胶质瘤的许多属性，因为常规的疗法对该肿瘤难以治疗。本发明能够同时杀灭分裂与非分裂NCI-H322M细胞，这表明了要求保护的发明具有杀灭或以其他方式抑制各种类型靶细胞功能的普遍性。
本发明详细介绍了一种方法，用以产生一种非常有效的细胞毒性剂，特别是在一个一般的靶细胞体积内，特别是在肿瘤薄壁组织中。濒临死亡的肿瘤细胞释放出F-Ade并带来连贯的体内旁观者杀灭，基于在瘤块内产生F-Ade之后其扩散半径有限，以及其广泛稀释(稀释到F-Ade在血清中级别不能测量出为止)半径有限，本发明所采取的策略已被证明是安全的。本发明的抗肿瘤活性机制也从根本上不同于所有其他方法到GDEPT。F-Ade的抗肿瘤活性归因于干扰RNA与蛋白质合成，这导致了分裂与非分裂肿瘤细胞的消融(Parker etal.Biochem.Pharmacol.1998；55:1673-1681.)。三天的瘤内治疗(特别详见图2C，以及图5A,5B，及7B)使生长相对较慢的D54,NCI-H322M或DU145肿瘤的质量有所减少，该发现反映了其在体内抗循环与非循环肿瘤细胞活性。
本发明的F-araAMP瘤内注射使对前药的全身性接触减至最低程度，并在靶细胞瘤块内，例如一种肿瘤组织本身，实现药物浓度最大化。F-araAMP或其他前药的瘤内注射后，应注意明显的抗肿瘤活性在PNP或NH表达中的设定。此处应注意，在本发明中Ad/PNP与瘤内F-araAMP注射的组合使用比先Ad/PNP后全身性F-araAMP的使用有更显著的效用。应当注意的是，当前药注射以快速灌注的方式与PNP或NH一同给药或以暂时地取代涉及薄壁组织中的非人类PNP或NH酶的存在的注射方式，前药注射是有效的。
这些结果暗示了一种直接的，为在人类受试者中应用一种可比较策略的方法，并且无需修改载体的靶向性(tropism)、增强旁观者杀灭、或重新定靶。腺病毒载体和F-araAMP都在先前的临床试验中进行了深入全面的研究。此外，局部疗法中为治疗小鼠中300mg肿瘤所给定的F-araAMP剂量(3到24mg，分三次给药)远低于作为人类标准临床护理一部分的F-araAMP每日给药量(每四周给药一次，每次给药为一天40mg每剂x 5)。本发明提供了一种治疗方法，Ad/PNP接着是F-araAMP以频繁给药为基础(例如每天)通过重复给药到达针头可接近的肿瘤(前列腺，乳腺，头颈部肿瘤，或是在放射学指导下的其他瘤块)中，依次摧毁一种肿瘤中的大片区域，同时在最小程度上减少全身性接触F-araAMP，F-Ade或是其他的PNP裂解前药。由于F-Ade具有强效的抗肿瘤活性及较高的旁观者活性，以及抵抗非扩散状态肿瘤细胞的活性，一种“定位与消融”方法是可行的，尤其是对于PNP GDEPT方法。F-Ade的瘤内生长应提供一种途径，在瘤内浓缩药剂，并使宿主内的全身性接触最小化。
放疗主要是以主动分裂的肿瘤细胞为目标，但是不能消融休眠的肿瘤组织，特别是在坏死区域(Puhlmann et al.Human Gene Therapy 1999；10:649-657)。本发明提供了一种结合了PNP或NH前药的放射疗法的改进，在此提供了通过一个不同于XRT的机制起作用的非常有效的抗癌药物，用于治疗实体恶性肿瘤的非循环隔室。在这一方面，F-Ade是优选的化合物，能够同时强效杀死分裂及非分裂肿瘤细胞。在手术切除之前进行放疗的常见肿瘤(神经胶质瘤，乳腺癌，前列腺癌，头颈部癌，肺癌以及其他以根治或姑息治疗为意图的癌症)也受益于本发明的结合治疗方法。
在上述的发明方法中，需要杀死的哺乳动物细胞可以是肿瘤细胞。包括任何实体肿瘤的细胞，无论恶性与否，都可以由本发明中的方法杀死，基于能够选择性转移或表达PNP或NH基因到至少小部分比例的组成肿瘤的细胞中的能力。例如，携带DNA的脂质体的静脉内注射已被证明可以介导某些细胞类型的基因靶向表达。将一种PNP或NH或基因表达靶向至瘤块中一小部分的细胞接着进行基质给药足以介导衰退。(Zhu et al.Science 261:209-211,1993)通过在实例中体现旁观者效应以及非分裂细胞的杀灭，本发明方法可以摧毁肿瘤。尽管在所例举的方法中，哺乳动物细胞为人类神经胶质瘤，非小细胞肺腺癌，或是前列腺细胞，应当理解的是本发明所教示的方法可以被应用于其他细胞，它们对本发明方法的敏感性也可以按所教示的确定。
除了杀灭肿瘤细胞，本发明的方法也可以杀灭病毒感染的细胞。在一个杀灭病毒的实施例中，选中的基因转移方法将根据其靶向病毒感染细胞内PNP的表达的能力选定。举个例子，病毒感染细胞可以利用特殊的病毒基因序列来调节并准许基因表达(即病毒特异性启动子)。这种序列不存在于未受感染的细胞。如果大肠杆菌或其他PNP基因对于这样一种病毒启动子的取向合适，那么PNP只会在病毒感染的细胞中被激活，而不是其他未被感染的细胞。在这种情况下，当病毒感染细胞被传送到靶细胞附近时，将更容易受到F-araAMP，MeP-dR或其他被设计成被PNP或NH转换成毒性形式的底物的给药的影响，。
在本发明的其他应用中，提供了一种药物，用于杀灭或抑制受试者的任何要求的靶细胞体积的功能。本发明对于杀灭或抑制细胞功能的广泛适应性能提供临床医师优良的给药控制，以及优于各种传统程序的强化治疗的分析方法。本发明提供了一种化学细胞消融术，作为烧灼术，切除术程序的替代物。值得惊奇地注意到的是，本发明所提供的化学细胞消融术排除了伴随烧灼术，射频消融术或是切除技术产生的造粒及划痕，从而在化学消融部位的周围提供了一种优越的愈合组织。因此，本发明在治疗心律不齐，减小囊肿，神经节治疗，男性绝育，美容皮肤学程序以及黑色素瘤的治疗有所应用。应当理解的是，通过PNP或NH酶的给药及表达在此所详述的一种病毒载体的任何形式基因的给药，并对PNP或NH实施一种前药的近端给药，很容易执行根据本发明的化学细胞消融术。基于对靶细胞实施化学细胞消融术的位置，本发明的药物通过一根导管，微量注射器，套管，或是注射器，并且在膏底物中进行给药。较佳地，PNP或NH酶是胞内表达。
本发明中提供了一种哺乳动物细胞中的编码非人类的或转基因的人类嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的分离的在核酸。更具体地说，本发明提供了一种分离的在哺乳动物细胞中编码大肠杆菌PNP的核酸。所谓的“分离”是指与发现于获得了PNP基因的天然存在的生物的其他核酸分开。
如上所述，在一个优选的实施方案中，本方法所使用的PNP或NH可以包括转基因人类或非人类哺乳动物PNP或NH，其能够与一种待杀死的细胞中的天然PNP或NH无法识别或难以识别的底物发生反应。因此，本发明中的编码本发明的PNP或NH的核酸存在于其没被天然发现的细胞中，这要么因为它们来自于一种不同的生物，要么就是因为它们是从自然状态转变而来的。对于编码PNP或NH核酸最关键的要求是，它们必须编码一种能够识别且作用于对不能被细胞的天然PNP或NH识别的底物的功能性酶。
本发明也提供了一种包含编码非人类的或转基因的人类嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的真核生物的转移载体。载体必须能够转导或转染至少一定比例的靶细胞。转移载体可以是任何用于传送基因至细胞中(例如一种质粒)核苷酸结构，，或是作为一种传送基因的总体策略的部分，例如作为重组逆转录病毒或是腺病毒的部分(Ram etal.Cancer Res.53:83-88,1993)。实施例提供了一种含有编码PNP核算的慢病毒载体或是腺病毒载体。
本发明的载体可以存在于一种能够表达一种功能性PNP或NH的寄主中。本发明所述方法中所使用的寄主细胞是要被杀灭的细胞，它表达PNP或NH并且被酶与作为一酶底物的前药反应所产生的有毒产物杀灭。在实施例中提供了一种确定易感性的方法，给出了转染的宿主细胞的操作规范，并且展示了PNP表达以及在底物存在下的对宿主细胞的毒性。另外，活性酶或及其酶原可以给药至靶细胞肿块中。
除了本发明中的基因转移方法，PNP基因产物也可以通过许多不同的机制选择性地给药到肿瘤细胞中，这种PNP可以用来在肿瘤部位产生F-Ade。
例如，可以将PNP或NH酶附着在任何所需的单克隆抗体上，并且将其注射到患者体内，无论是通过全身性注射还是在靶细胞附近注射。当患者有足够时间清除所有与未束缚于靶细胞的单克隆抗体结合的PNP或NH之后，可以通过直接注射前药治疗患者，例如只在目标位置分裂成F-Ade的前药F-araAMP。这种过程只需要保证一种合适的单克隆抗体可用。下面的参考文献是这种技术应用于对肿瘤组织靶向特定蛋白质的实施例(Senter etal.Bioconjugate Chem.2:447-451,1991；Bagshawe et al.Br.J.Cancer 60:275-281,1989；Bagshawe et al.Br.J.Cancer 58:700-703,1988；Senter et al.BioconjugateChem.4:3-9,1993；Battelli et al.Cancer Immunol.Immunother.35:421-425,1992；Pietersz and McKenzie Immunolog.Reviews 129:57-80,1992；and Roffler etal.Biochem.Pharmacol 42:2062-2065,1991)。除了单克隆抗体之外，其他配体可以根据它们对靶细胞的特异性进行选择，并且根据本发明中所传授的方法进行测试。
另外，也可以将蛋白质包埋在脂质体中并将它们靶向特定的组织。从而可以利用靶向脂质体将PNP或NH基因产物选择性地传送到一种瘤块中。将所有非靶向脂质体从血液中清除后，可以使用只在目标位置分裂成F-Ade的前药F-araAMP治疗患者。再一次地，这种过程只需要保证一种合适的靶向载体可用。下面的参考文献是这种技术应用于对肿瘤组织靶向特定蛋白质的实施例(Hughes et al.Cancer Research 49:6214-62210,1989；andLitzinger and Huang Biochimica et Biophysica Acta 1104:179-187,1992)。
代表了非寄主PNP或NH的酶底物的前药,例如通过一种药学上可以接受的载体例如生理盐水或DMSO直接瘤内注射至靶细胞肿块,或者装入胶囊用以改变前药的稳定性及/或治疗特性。本发明的前药易于以一种凝胶，糊剂或是将微粒装在胶囊中给药。可以理解的是，这样的前药载体，与在生理盐水中溶解相比，易于被用在提供前药的缓释，靶细胞肿块内的改进的扩散，和贮存稳定性。借助于微粒，一种本发明的前药的释放速率易于被延长至超过一周，超过两周，甚至在六周以上(Zentner et al.,J.control release 72(1-3):203-215,2001)。本发明的前药易于制备，并且在一种聚乳酸，聚(ε-己内酯)或是它们的混合物的糊剂中进行注射(Jackson et al.,Cancer research 60(15):4146-4151,2000)。前药也适合于封装在各种材料的微球中，这些材料包括了聚乳酸，聚(ε-己内酯)，聚乙烯基吡咯烷酮，羟丙基纤维素，甲基纤维素，以及其他多糖(Harper et al,Clin.Canc.Res.5:4242-4248,1999；Dordunno et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.36:279-282,1995；Bert et al.,Cancer Lett.88:73-78,1995；)。可以理解的是，通过前药的控释配方，注射较大剂量的前药至靶细胞肿块可以减少注射频率以实现一种延长的抑制细胞效果以及旁观者效应。
可以对带有不良生长或功能的靶细胞的受试者履行将酶和前药注射至诸如肿瘤的靶细胞块内来补偿其金钱付出，同时，受试者补偿本发明注射的提供者在抑制细胞功能甚至杀死靶细胞方面所作出的努力。
本发明就以下的非限制性实施例进行进一步的详述。这些实施例并非旨在限制所附权利要求书的范围。
实施例1：人类移植瘤在小鼠体内的研究。亲代和表达大肠杆菌PNP的D54MG(人类神经胶质瘤)肿瘤细胞(2x 107个细胞)，通过皮下注射至购自Charles River实验室(威尔明顿，马萨诸塞州)的裸鼠(nu/nu)胁腹中。稳定转导了大肠杆菌PNP的D54肿瘤细胞采用前述(Parker et al.Cancer Gene Therapy 2011Jun；18(6):390-8)的方法进行制备。使用测径规测量肿瘤，其重量的估计通过下式计算：(长度×宽度2)/2＝mm3并经假设的单位密度转换成mg。除非另有说明，治疗性药物以及表达大肠杆菌PNP(Ad/PNP)的腺病毒载体通过8次单独注射，每次大约20μl，将150μl的体积注射至D54肿瘤中，努力做到平均地分配给药药剂。每组的每个治疗组包含至少六只小鼠。每天测定小鼠体重的减轻，每周两次测定肿瘤尺寸。T-C(肿瘤生长延迟)被认为是药物治疗组与生理盐水治疗组之间的差异，在几天至肿瘤体积2个加倍的时间内。每个动物(肿瘤体积2个加倍)评测点的时间在学生的t检定，Mann-Whitney(曼-怀氏)秩和法检验，或是一种寿命表中被用作终点，以从统计学上比较治疗组之间的生长数据。所有的过程都根据由南方研究所的IACUC批准的操作标准执行。F-araAMP从Schering A.-G.(Berlin,Germany)得到。在这个及随后的实施例中，F-Ade是从GeneralIntermediates of Canada,Inc.(Edmonton,Alberta,Canada)得到。当肿瘤在250到300mg(～动物总重量的1到1.5％)时启动治疗。
实施例2：大肠杆菌PNP活性的测量。通过测量在药物治疗第一天从小鼠中取出的代表性癌症中大肠杆菌PNP活性，可以验证瘤块中的慢病毒转导的细胞所占比例。从小鼠胁腹中切除肿瘤后，粗提取物如前面所述方法制备(Parker et al.Human Gene Therapy1997；8:1637-1644)。提取物在50mM的PO4，100μM的6-甲基嘌呤-2'-脱氧核苷(MEP-dR)，以及100mM的HEPES缓冲剂(pH为7.4)中培养，保持提取物在一定浓度使其在培育期可以发生一种线性反应。利用反相HPLC监测MeP的形成。按照惯例，单位PNP活性被定义为在一个小时时间内裂解1nmole/mg蛋白质的MeP-dR所需要的提取物的量。
实施例3：监测F-araAPM的瘤内代谢。总的放射性取决于向300mg的D54胁腹肿瘤注射3mg[8-3H]F-araAMP(10μCi)。[8-3H]F-araAMP从Moravek Biochemicals Inc.(Brea,CA)得到。在注射后的10分钟或4小时的时候，将肿瘤从小鼠体内移除，并在55℃下培养四小时的条件下将其溶解在1ml Soluene 350(Packard Instrument,Meriden,CT)中。将每种提取物的一部分与闪烁液混合，并确定了放射性。
实施例4：磷酸氟达拉滨(F-araAMP)的不同时间对5％的细胞表达大肠杆菌PNP的 D54肿瘤的影响。将亲本D54肿瘤细胞与通过慢病毒稳定转导大肠杆菌PNP的D54肿瘤细胞混合，以使得5％的混合物表达PNP转基因。这种95/5比例的混合物通过皮下注射进入裸鼠的胁腹。使用F-araAMP的腹膜内的治疗从第17天开始(250mg/kg，连续三天，每天一次；167mg/kg，连续三天，每天三次；100mg/kg，连续三天，每天五次；或者是载体控制，一天5次×3天)，当肿瘤大约是250mg时。在治疗的时候(第17天)，肿瘤中大肠杆菌PNP的活性为2500±400个单位。所有F-araAMP治疗组中的肿瘤生长与载体治疗组P<0.001中的肿瘤生长有着显著的不同。(图1)
图1描绘了大肠杆菌PNP加上磷酸氟达拉滨(F-araAMP)的抗肿瘤活性，当5％的肿瘤细胞(转导了植入前基因的)表达重组酶时，。F-araAMP的腹膜内(全身性)给药(15次100mg/kg的给药；9次167mg/kg的给药，或3次250mg/kg的给药)导致所有肿瘤的完全消退和所有小鼠痊愈。以往的事实表明，亲本D54肿瘤(即无大肠杆菌PNP)对于使用F-araAMP的疗法不敏感，而且使用F-araAMP的肿瘤消退在设定中表现出剂量对于表达大肠杆菌PNP的肿瘤细胞分数的依赖(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615；Parker et al.HumanGene Therapy 1997；8:1637-1644；also see below)。细胞100％转导了大肠杆菌PNP的肿瘤与不转导的(亲本的)肿瘤以相似的速率生长(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615)，这表明了在整个肿瘤模型的扩张中将会保持一个～5％的转导水平。为了验证这个说法，在药物疗法的第一天，小鼠体中得到的三种代表性肿瘤中制备肿瘤提取物，并且将大肠杆菌PNP的活性水平定为2500±400个单位。126000个单位的大肠杆菌PNP活性存在于这个系中100％表达PNP细胞的肿瘤中(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615)。因此研究结果表明在这个特定的实验中，亲本(无PNP表达)细胞比活体内PNP被转导系小幅生长更快，并且确认了在图1中所述的转导百分比小于等于5％，也许更接近2％到3％。
图1所示的结果确立了，大型肿瘤(大约占动物总体重的1％)的完全消退或痊愈可以被安全地实现通过一种腹膜内基于PNP的GDEPT策略。研究结果还展示了优异的体内旁观者活性。仅有三种F-araAMP瞬时(非缓释性)腹膜内注射导致了大型肿瘤的摧毁，尽管小于等于5％的细胞表达活化基因。此外，使用F-araAMP的治疗导致体重仅有10％到20％的减轻，在F-araAMP疗程完成后体重可以迅速恢复。不管大幅延长了寿命，在直接围绕着肿瘤的区域没有严重的组织损伤，或是显示其他不希望有的后遗症。3x剂量在聚乳酸微栓中占30％重量的F-araAMP的单独的IP注射可获得一个相似的效果。
实施例5：D54肿瘤的F-araAMP瘤内注射。图2A中，亲本D54肿瘤细胞与已经转导了大肠杆菌PNP的D54肿瘤细胞混合，直到最终的比例为其中10％表达了转基因。这种90/10比例的混合物通过皮下注射到裸鼠的胁腹。从第14天开始，连续三天每天一次向肿瘤中注射150μl生理盐水，1.5mg F-araAMP被溶解在生理盐水中，或3mg F-araAMP被溶解在生理盐水中。在治疗的时候(第14天)，肿瘤中大肠杆菌PNP的活性为14300±2600个单位。3mg治疗组中的肿瘤生长与载体治疗组(P<0.001)中的相比有着显著不同，但与1.5mg治疗组(P＝0.458)的相比并无显著不同。图2B中，亲本D54肿瘤细胞(无大肠杆菌PNP表达)通过皮下注射至裸鼠的胁腹。从第14天起，连续三天每天一次，使用150μl生理盐水对肿瘤进行注射，3mg F-araAMP被溶解在生理盐水中，0.15mg F-Ade被溶解在生理盐水中，1.26mg的F-Ade被溶解在150mLDMSO中，0.63mgF-Ade被溶解在DMSO中，或是DMSO。通过单次注射30％的在盐水中有着相似结果的聚乳酸微栓重量的F-araAMP 9mg重复进行此实验。使用在DMSO溶解0.63或1.26mg的F-Ade进行治疗的小鼠的肿瘤生长比起DMSO载体治疗组(分别为P＝0.011和0.002)中的有着显著的不同。
在图2A中，说明了F-araAMP被注射至有10％细胞表达大肠杆菌PNP的肿瘤中有一个很强的抗肿瘤效果。注意，此实验中F-araAMP的剂量大大低于最大耐受量，并且附加的注射被赋予更大的抗肿瘤活性。在低剂量的F-araAMP中，肿瘤中PNP活性在使用F-araAMP治疗后45天后为1250个单位，而在治疗的时候肿瘤中PNP活性为14300个单位。这一结果表明F-araAMP疗法优先杀灭表达大肠杆菌PNP的细胞，这表明抗肿瘤活性依赖于大肠杆菌PNP的表达。被注射的F-araAMP的量为120mg/kg，这远小于这个日程表的最大耐受量(750mg/kg,q1dx3)。更高剂量的F-araAMP当被溶解在DMSO时，可以看到更好的结果：图2C。
实施例6：使用或不使用PNP在D54肿瘤细胞中的F-araAMP瘤内注射。在图2B，图2D以及图3中中显示了F-araAMP的直接瘤内注射到没有表达大肠杆菌PNP活性的细胞的肿瘤不会影响肿瘤的生长。这一结果表明了在图2A，图2C及图4中所示的F-araAMP抗肿瘤活性归因于在亚肿瘤细胞中大肠杆菌PNP的表达。F-Ade的抗肿瘤活性(F-araAMP的活性代谢物)也以和F-araAMP相同的方式被注射至肿瘤。溶解于水中的0.15ml的1mg/ml F-Ade(溶解度极限)显示无抗肿瘤效果。溶解在DMSO中的0.15ml的8.6mg/ml F-Ade被注射至肿瘤；一个轻微的抗肿瘤效果被可以观察到。
这些结果表明，同时包含一种载体(以传送大肠杆菌PNP)以及定时释放的F-araAMP在不然无法治疗的局部癌症的治疗中很有效。本品至少一次的注射将抑制代谢，甚至杀灭任何表达大肠杆菌PNP的细胞加上许多与F-araAMP相关的带有降低全身毒性的旁观者细胞。有必要重复多次这个操作以除去瘤块。举个例子，在门诊基础上一周一次对患者进行带有降低毒性的注射直至肿瘤被完全消除。F-araAMP的多次瘤内注射会导致更强的抗肿瘤活性(图4)。
由于只有小部分IP注射的F-araAMP实质上在活体内灌注了一种恶性肿瘤，需要测试向瘤块中直接注射F-araAMP是否可以增强效力。初步的研究显示了(以及上面所介绍的)10％表达大肠杆菌PNP细胞的肿瘤(图2A)。每次注射3mg F-araAMP的瘤内注射(总共三次注射)可以赋予显著的抗肿瘤效果(p<0.001)，伴随很少或没有重量减轻；然而，当将F-araAMP注射到亲本(无表达大肠杆菌PNP的)肿瘤时，没有这样的效果(图2B)。由于一只小鼠的重量大约是0.025kg，3mg F-araAMP的注射相当于120mg/kg F-araAMP的剂量，是图1中所研究的全身总量的百分之二十五到百分之五十。F-Ade(F-araAMP的活性代谢物)向肿瘤的注射也不能引发抗肿瘤活性，当以尽可能最高溶解度在生理盐水中被测试时(图2B)。F-Ade也被溶解在DMSO中，1.26mg F-Ade(在F-araAMP 3mg的注射的F-Ade的近似摩尔当量)对肿瘤的三次注射，导致最小抗肿瘤活性(图2B；p＝0.011就使用DMSO载体注射的小鼠)，但会造成在体重上有10％的减轻。无论是2.5mg或5mg F-Ade(被溶解在DMSO中)的三次瘤内注射分别导致了6只小鼠中3只死亡以及6只小鼠中4只死亡，这表明了1.26mg非常接近其最大耐受量(MTD)。因此，这个结果因此展示了，不像大肠杆菌PNP的瘤内注射表达后的跟随的，IT F-araAMP，F-Ade的直接IT注射有极小的抗肿瘤疗效。
如前所述，被瘤内注射给予的F-araAMP量(图2A中)小于图1中所述整个腹腔内注射剂量。为了研究较高剂量F-araAMP的影响，F-araAMP被溶解在DMSO中，并被给予耐受IT良好的浓度，但当IP给药远高于最大耐受剂量(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615)。三种6或24mg的剂量通过IT注射给药到10％的细胞表达大肠杆菌PNP的肿瘤(图2C)。亲本D54肿瘤细胞或是10％表达大肠杆菌PNP细胞的D54肿瘤细胞混合物通过皮下注射至裸鼠胁腹。从第17天起，连续三天每日一次使用150μl的DMSO对肿瘤注射，24mg F-araAMP在DMSO中，或6mg F-araAMP在DMSO中。大肠杆菌PNP在有10％表达大肠杆菌PNP的D54肿瘤中的活性(在第17天)为8,600±620个单位。带有PNP肿瘤并使用6或24mg的F-araAMP治疗的小鼠的肿瘤生长相比载体治疗组(分别是P＝0.014和P<0.001)有着显著的不同，但在本实验中彼此并无明显的不同。使用24mg的F-araAMP治疗的六个肿瘤中的三个变得溃烂(在第17天，第21天和第24天)，这就需要更多研究动物。剩下的三个肿瘤完全消退，且小鼠保持免除肿瘤，直到实验在第70天结束。使用6mg的F-araAMP治疗的肿瘤中没有溃烂现象，并且这种疗法中的单独过程导致大型的肿瘤消退并伴随有一个延长的抗肿瘤效果。在最高剂量时F-araAMP的注射导致了体重有一个适度的(7％)的减轻，这一体重的减轻可以在药物治疗后迅速地恢复。F-araAMP在这些剂量时的注射至亲本肿瘤(无PNP表达)不会导致抗肿瘤活性。
实施例7：瘤内F-araAMP以及Ad/PNP对D54肿瘤的影响。一种表达大肠杆菌PNP(Ad/PNP)的复制缺陷型腺病毒载体的随后跟着F-araAMP的全身性疗法的瘤内(IT)注射所产生的适度的抗肿瘤活性被证实了(Hong et al.Cancer Res.2004；64:6610-6615)。基于图2C中所展示的强活性，当F-araAMP以高剂量IT给药时，研究Ad/PNP加上F araAMP的抗肿瘤活性当这两种组分都直接注射至瘤块(图5A)。在所示实验中，2x 1011VP的Ad/PNP被IT给药三天(第15，,16和17天)每天两次，总共6次注射。随后在第20,21和22天使用24mg的F-araAMP每天一次对肿瘤注射。肿瘤内大肠杆菌PNP的活性在第20天(F-araAMP治疗的第一天)为7,500±2,000个单位，这与在有5％到10％稳定表达酶的细胞的肿瘤内所观察到的(2,500,14,300,or 8,600个单位)很相似，并且在预计的由瘤内F-araAMP所引起的强抗肿瘤活性范围内。尽管使用Ad/PNP加上F-araAMP治疗的10只小鼠中有两只死亡，在8只治疗中经历了17％体重损失存活的小鼠中仍然表现出优异的抗肿瘤效果。由于毒性迹象在如图5A所示的实验中被指出，研究以减少的剂量(每次注射18mg)的F-araAMP重复进行。有了这个日程表，治疗组中不会出现与药品相关的死亡，并且尽管小鼠的体重没有下降，在植入后第71天应指出延长的抗肿瘤活性(图5B)。此实验的肿瘤中的大肠杆菌PNP活性为1,900±1,500个单位。结果确立了被瘤内F-araAMP紧随的Ad/PNP的瘤内注射可以引起在其他方式的难治性实体瘤有大幅的优于在瘤内F-araAMP之前的Ad/PNP瘤内注射之后可见的消退效果(Hong etal.Cancer Res.2004；64:6610-6615)。
同时使用Ad/PNP加上更高剂量F-araAMP的肿瘤注射对肿瘤生长有着巨大的优于使用Ad/PNP加上全身性F-araAMP对肿瘤生长的影响(图5A和图5B)。
实施例8：F-dAfo与F-araAMP相对的影响。F-dAdo或F-araAMP被注射至D54肿瘤三次，每次150μl体积分八次每次大约是20μl的注射。图5A中，利用载体(实心圆)，Ad/PNP(空心圆)，F-araAMP(实心三角形)或Ad/PNP加上F-araAMP(空心三角形)对亲本D54人类神经胶质瘤IT治疗。从第15天起，连续三天每天两次注射Ad/PNP(2x 1011VP)。从第20天起，连续三天每天一次注射溶解在DMSO中的24mg F-araAMP。载体治疗小鼠中的肿瘤使用紧跟着DMSO三次注射的生理盐水注射六次(否则就如上文所述)。D54肿瘤中的大肠杆菌PNP活性(在第20天时)为7,500±2,000个PNP单位。每个治疗组包含10只小鼠。在组合治疗组中，十只小鼠中的两只在结束前死亡。八只剩余小鼠中的四只在第65天时免除肿瘤了，两只小鼠有小的肿瘤(63mg和288mg)，另两只小鼠有生长中的肿瘤(1666mg和1584mg)。使用Ad/PNP加上F-araAMP治疗的小鼠中的肿瘤生长比起仅仅使用F-araAMP或是Ad/PNP(分别是P＝0.010和P＝0.002)治疗的小鼠有着显著的区别。图5B中，小鼠按图5A所述的进行治疗，除了F-araAMP的剂量是每次注射18mg。此实验中大肠杆菌PNP在第18天时的活性为1900±1500PNP单位。使用Ad/PNP加上F-araAMP治疗的小鼠中的肿瘤生长比起仅仅使用F-araAMP或是Ad/PNP(分别是P＝0.001和P＝0.011)治疗的小鼠有着显著的区别。图5C显示使用了T.vaganalis(Tv)-PNP供替换的来源的数据。
使用F-araAMP比起使用F-dAdo可以观察到更好的结果(图6A和图6B)尽管当细胞表达为PNP时F-dAdo对于大肠杆菌PNP是一个比F-araAMP更好的基质。
实施例9：瘤内注射的F-araAMP和Ad/PNP对于DU145(人类前列腺)肿瘤以及NCI- H322M(人类非小细胞腺癌)肿瘤的影响。F-araAMP和Ad/PNP的注射如上文所述执行，除了肿瘤现在是有着相似结果的DU145(图7A)。F-araAMP和Ad/PNP的注射如上文所述执行，除了肿瘤现在是有着相似结果的H322M(图7B)。
实施例10：F-araAMP的瘤内注射加上放射对D54肿瘤的影响。局部晚期实体瘤常常对放射治疗有抵抗。作为在该设定中辅助性大肠杆菌PNP的一个测试，F-araAMP注射与外照射一起被研究。图8A中，对有10％细胞表达了大肠杆菌PNP的肿瘤进行放射给药(为了预先对D54肿瘤细胞赋予一个可测量的效果)，通过三次3mg或没有的F-araAMPIT注射(其剂量为导致肿瘤的抑制而没有无肿瘤幸存，图2A)，。图8B中，对有10％细胞表达了大肠杆菌PNP的肿瘤进行放射给药(为了预先对D54肿瘤细胞赋予一个可测量的效果)，通过三次3mg或无的F-araAMP的全身性IP注射(其剂量为导致肿瘤的抑制而没有无肿瘤幸存，图2A)。结合了大肠杆菌PNP或F-araAMP与放射疗法可以导致一个显著的抗肿瘤活性，这比单独采取任一疗法更强。在所有的治疗组中可以观察到百分之十到十四的重量减轻(这在治疗结束后可迅速恢复)，表明了这两种干扰措施的毒性不是附加的。使用实施例5的缓释F-araAMP可以得到相似的结果。
含有10％表达大肠杆菌PNP细胞的D54肿瘤细胞通过皮下注射至裸鼠胁腹。可以使用辐射，F-araAMP或是F-araAMP加上辐射对肿瘤进行治疗。在两个治疗组中，使用150μl的生理盐水或3mg的F-araAMP生理盐水溶液，连续三天每天一次对肿瘤进行注射。在另外两个治疗组中，在注射了150μl生理盐水(实心方块)或是3mg F-araAMP的生理盐水溶液(空心方块)之后，连续三天每天一次进行3小时的辐射(4Gy)给药。D54肿瘤中大肠杆菌PNP的活性(在第16天)为12,000±3,000个单位。使用辐射加上F-araAMP治疗的小鼠体内的肿瘤生长相比单单使用F-araAMP或辐射治疗的小鼠中的(分别是P＝0.004和P<0.001)有着显著地区别，并且IT注射(图8A)更加优于全身性IP注射(图8B)。
实施例11：F-araAMP瘤内注射后D54肿瘤中的放射性。为了要理解瘤内(IT)F-araAMP的药效，亲本(D54)肿瘤以及有着10％表达大肠杆菌PNP细胞的肿瘤中前药的活化水平需要被监测(表1)。在3mg[3H]-F-araAMP的IT注射10分钟或4小时之后采集肿瘤组织，可以确定留在肿瘤中放射性的含量。在F-araAMP注射后十分钟，亲本和有着10％表达大肠杆菌PNP细胞的D54肿瘤之间并没有差异。经过四小时，表达大肠杆菌PNP的D54肿瘤细胞中的放射性远远高于亲本肿瘤，表现了了F-araAMP转换为F-Ade代谢物的量。这个实验表明了3mg F-araAMP瘤内注射后，每克肿瘤组织会产生并保留190纳摩尔的F-Ade代谢物。三毫克的F-araAMP相当于8200纳摩尔，因此本实验中的肿瘤大约为0.3克，大约在肿瘤组织中保留了57纳摩尔的F-Ade，或者说总的F-araAMP中的0.7％注射到肿瘤中。
表1
F-araAMP瘤内注射后D54肿瘤中的放射性纳摩尔(nmoles)F-araAMP/克组织
将三毫克(8200纳摩尔)的[3H]F-araAMP(每次注射10μCi)注射到D54肿瘤或者有10％细胞表达大肠杆菌PNP的D54肿瘤，如图2所示。在使用F-araAMP和一定量的放射后的10分钟以及4小时，移除肿瘤(大约300mg)。每组有4个肿瘤。重复这个实验可以得到相似的结果。*与D54肿瘤有着显著的不同：P<0.02，配有学生的t测试。
本说明书中提及的专利文献及出版物指示了本发明所涉及领域中的技术人员的水平。这些文件及出版物再次引用作为相同程度的参考文献，就好像每篇文件及出版物被具体地单独地在此引用作为参考。
以上的描述对于本发明中的特定的实施例有说明性，但并不表示限定了本发明的实施。权利要求包括其所有的等同实施方式旨在确定本发明的保护范围。

Claims (43)

1.一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一种编码其表达的载体，和一种被所述的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药，在用于制备功能性抑制或杀死在表现出低生长比率的癌症的实体瘤的非循环隔室中的靶细胞的直接注射药剂方面的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶与所述前药混合。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述前药与一种缓释载体一起配制。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶与含有编码所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒载体一同被递送。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述病毒载体是腺病毒载体。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶来源于大肠杆菌或阴道毛滴虫。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是来源于大肠杆菌的酶的一突变体。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述突变体是一加尾的突变体。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的用途，其中，所述的前药是磷酸氟达拉滨。
10.一种包括嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一种编码其表达的载体的药物和一种被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药的组合的药物，用于直接前药注射以杀死在实体瘤的非循环隔室的靶细胞，其中当与所述实体瘤与辐照相结合时，所述的药物变得更有效。
11.根据权利要求10所述的药物，其中，靶细胞确定了一肿瘤。
12.根据权利要求10所述的药物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶与含有编码所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒载体一同被递送。
13.根据权利要求12所述的药物，其中，所述病毒载体是一种腺病毒载体。
14.根据权利要求10所述的药物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶来源于大肠杆菌或阴道毛滴虫。
15.根据权利要求10所述的药物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是来源于大肠杆菌的酶的一突变体。
16.根据权利要求15所述的药物，其中，所述突变体是一加尾的突变体。
17.根据权利要求11所述的药物，其中，所述前药是经瘤内注射到所述肿瘤内。
18.一种在用于杀死复制型或非复制型靶细胞的方法中的药物组合物，其包括嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一种编码其表达的载体，所述的方法包括：
将一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一种编码其表达的载体递送到靶细胞；和
将一种被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药直接注射到靶细胞附近，以释放对靶细胞有细胞毒性的嘌呤碱基来杀死或者抑制在表现出低生长比率的癌症的实体瘤的非循环隔室中的靶细胞。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，靶细胞确定一肿瘤。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶与含有编码所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒载体一同被递送。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，所述病毒载体是一种腺病毒载体。
22.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶来源于大肠杆菌或阴道毛滴虫。
23.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大肠杆菌的一突变体。
24.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，所述突变体是一加尾的突变体。
25.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，所述前药是经瘤内注射到所述肿瘤内。
26.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，抑制靶细胞是指杀死靶细胞。
27.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，进一步包括了抑制旁观者细胞生长至靶细胞，所述的旁观者细胞为在约50个相邻细胞直径或靶细胞的等同线性间隔内的细胞。
28.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，进一步包括了将靶细胞暴露于X射线辐射。
29.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，其中，所述前药是磷酸氟达拉滨。
30.根据权利要求18至21中任意一项所述的药物组合物，进一步包括了一种凝胶、糊剂或微粒的缓释载体。
31.一种在用于增强放射治疗功能性抑制或杀死靶细胞嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的方法中的药物组合物，其中所述方法包括：
将一种嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶递送到确定了一肿瘤的靶细胞；
将一种被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前药给药以释放对靶细胞有细胞毒性的嘌呤碱基；和
将靶细胞暴露于X射线辐射以杀死或抑制靶细胞功能，其中所述细胞近端为大约50个相邻细胞直径、在相邻的20细胞直径内、或相当的线性间隔。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中，所述前药是通过瘤内注射的方式给药到所述肿瘤中。
33.根据权利要求31所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶与含有编码所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒载体一同被递送。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中，所述病毒载体是一种腺病毒载体。
35.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶来源于大肠杆菌或阴道毛滴虫。
36.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大肠杆菌的一突变体。
37.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，所述突变体是一加尾的突变体。
38.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，所述前药是经瘤内注射到所述肿瘤内。
39.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，抑制靶细胞是指杀死靶细胞。
40.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，进一步包括了抑制旁观者细胞生长至靶细胞。
41.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，其中，所述前药是磷酸氟达拉滨。
42.根据权利要求31至34中任意一项所述的药物组合物，进一步包括了一种凝胶、糊剂或微粒的缓释载体。
43.根据权利要去18或31所述的药物组合物，其特征在于，所述的嘌呤基细胞毒性为2-氟腺嘌呤。
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Yu et al. A Polyplatin with Hands‐Holding Near‐Infrared‐II Fluorophores and Prodrugs at a Precise Ratio for Tracking Drug Fate with Realtime Readout and Treatment Feedback
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Wei et al. A breast cancer targeted photodynamic degrader to activate immunotherapy through EGFR degradation mediated PD-L1 downregulation

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