CN101629169A - 分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。采用PCR技术从嗜热乳链球菌(Streptococcus thermophilus)中扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)全长片段，用pET－43.1b(+)质粒载体构成pET－43.1b(+)－PNP重组载体，用定点突变的方法将片段第230位半胱氨酸突变为丙氨酸，用E.coli BL21(DE3)转化为工程菌。将工程菌发酵培养、诱导原核细胞表达，亲和层析纯化重组嘌呤核苷磷酸化酶。采用本发明得到的酶，热稳定性得到改良，并且可以提高产率，还可以缩短生产周期、降低成本。

Description

分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶是许多诊断试剂的关键原料酶，如腺苷脱氨酶(ADA)、5’--核苷酸酶等测定试剂中需要嘌呤核苷磷酸化酶作为工具酶。上述两种试剂均有重要的临床意义，如腺苷脱氨酶(ADA)广泛存在于人体各种组织，尤其是T淋巴细胞中。ADA测定主要用于肝胆疾病的诊断，其临床意义类似ALT，ADA分子较ALT小，在肝细胞损害时较ALT容易释放入血中，是肝损伤的敏感指标，对反映急性肝损害的残存病变和慢性肝损害比ALT为先，可作为肝功能常规检查项目之一。

5’-核苷酸酶(5’-NT)广泛存在于肝脏和各种组织中。血清中5’-NT活力增高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、原发及继发性肝癌等，且通常其活力变化与ALP活力变化相平衡。但在骨骼系统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、甲状旁腺机能亢进、佝偻病等，通常ALP活力增高，而5’-NT正常。因此临床上可采用两者结合来对肝胆疾病和骨骼系统疾病进行诊断与鉴别。

目前，国内许多医院已经将上述两种试剂作为常规检验项目开展。两种试剂检测反应步骤中均需要用嘌呤核苷磷酸化酶将肌苷转化为次黄嘌呤，因此嘌呤核苷磷酸化酶是诊断试剂的重要工具酶。

嘌呤核苷磷酸化酶蛋白为六聚体，广泛存在于真核和原核生物中。酶从天然微生物中提取存在菌体使用量高、转化反应时间长、转化效率低等问题，限制了它们在工业上的应用。通过基因工程手段对酶进行重组表达是酶制剂工业的发展趋势。日本TOYOBO公司(JP 2002017354)从嗜热乳链球菌Streptococcusthermophilus IFO13957提取分离得到嘌呤核苷磷酸化酶，并公布了酶的基因序列。但该酶在使用中存在热稳定性差的缺点，不适合作为液体诊断试剂的原料。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供通一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。

分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶突变体DNA序列的表达产物；突变体氨基酸序列是通过使SEQ ID NO.1所示的序列中230位半胱氨酸突变替换为丙氨酸，得到具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。

载体是含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。所述的载体适合于在大肠杆菌中表达。

嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法包括以下步骤：

·嘌呤核苷磷酸化酶基因序列引物设计、PCR扩增；

·嘌呤核苷磷酸化酶基因片段与克隆载体的连接，得到携带嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·基因序列230位定点突变，PCR扩增得到携带突变嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·重组表达载体转化宿主菌株中，得到重组体细菌；

·重组体细菌培养、提取得到纯化的嘌呤核苷磷酸化酶。

所述的重组体细菌是重组的大肠杆菌细菌。

本发明通过过定点突变的方法对嘌呤核苷磷酸化酶基因进行分子改造，改良后的酶在温度的耐受性方面更加优良。首先，本发明通过引物设计，用PCR方法扩增出序列，对序列230位氨基酸进行定点突变，使原半胱氨酸突变为丙氨酸。接着，用基因工程技术将序列与pET-43.1b(+)质粒连接。最后转化构建工程菌，使嘌呤核苷磷酸化酶高效表达，达到工业化生产的要求。

附图说明

图1是质粒连接模式示意图；

图2是PCR扩增得到PNP基因目的条带图片，图中，Lane 1：DNA MarkerDL 2000，Lane 2-4：基因PNP酶切产物，Lane 5-7：pET-43.1b(+)酶切产物；

图3是pET-43.1b(+)-PNP酶切鉴定图片，图中，Lane 1：DL 2000TM DNAMarker，Lane 2-8：重组质粒的酶切条带；

图4是pET-43.1b(+)-PNP PCR鉴定图片，图中，Lane 1：DL 2000TM DNAMarker，Lane 2-7：重组质粒的PCR反应条带；

图5是37℃，IPTG诱导凝胶电泳图片，图中，Lane 1：Protein Marker，Lane 2：诱导1h，Lane 3：诱导2h，Lane 4：诱导3h，Lane 5：诱导4h，Lane 6：诱导5h，Lane 7：诱导过夜，Lane 8：无IPTG；

图6是室温(25-30℃)IPTG诱导凝胶电泳图片，图中，Lane 1：ProteinMarker，Lane 2：诱导1h，Lane 3：诱导2h，Lane 4：诱导3h，Lane 5：诱导4h，Lane 6：诱导5h，Lane 7：诱导过夜，Lane 8：无IPTG。

具体实施方式

本发明通过PCR技术大量扩增PNP全长片段，将片段插入pET-43.1b(+)质粒载体构成pET-43.1b(+)-PNP重组载体，对基因片段进行分子改造、定点突变，将序列230半胱胺酸改造为丙氨酸，以提高酶的热稳定性，转化工程菌E.coliBL21(DE3)。小规模诱导筛选最佳的培养条件，根据最佳条件，发酵培养、诱导原核细胞表达，亲和层析纯化重组蛋白。此系统不但可以提高产率，还可以缩短生产周期、降低生产成本，从而极大地提高在市场上的竞争力。

分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶突变体DNA序列的表达产物；突变体氨基酸序列是通过使SEQ ID NO.1所示的序列中230位半胱氨酸突变替换为丙氨酸，得到具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。

载体是含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。所述的载体适合于在大肠杆菌中表达。

嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法包括以下步骤：

·嘌呤核苷磷酸化酶基因序列引物设计、PCR扩增；

·嘌呤核苷磷酸化酶基因片段与克隆载体的连接，得到携带嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·基因序列230位定点突变，PCR扩增得到携带突变嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·重组表达载体转化宿主菌株中，得到重组体细菌；

·重组体细菌培养、提取得到纯化的嘌呤核苷磷酸化酶。

所述的重组体细菌是重组的大肠杆菌细菌。

实施列1：嗜热乳链球菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因序列引物设计、PCR扩增。

1、根据PNP基因序列(GenBank：BD107242)，以pET-43.1b(+)作为表达载体，利用primer 5.0引物设计软件进行全基因引物设计

上游引物P1：

5’-tgtctaagtcaccccggggcatgtcactacttgaaaaaattagagttacg-3’；

下游引物P2：

5’-cgagtcgactggtacctta gacaaaatagctttaagcaatcctttgaag-3’

P1、P2的5’端分别包含Sma I、Kpn I两个限制性酶切位点并在酶切位点前加了3-7个保护性碱基。

2、PCR反应，嗜热乳链球菌(Streptococcus thermophilus IFO13957)为DNA为模板，应用PCR反应，通过特定的设计引物引入Sma I、Kpn I两个酶切位点，PCR扩增PNP目的基因片段。

(1)PCR反应体系如下

(2)PCR反应条件

通过PCR扩增的产物，经限制性内切酶Kpn I、Sma I两次单酶切反应后，经葡萄糖琼脂电泳显示，预期碱基大小处存在PNP目的片段(见图2)，测序后(委托上海生工)序列如序列表中SEQ ID NO.1。

实施列2：嘌呤核苷磷酸化酶基因与克隆载体的连接，得到携带嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体

1、将PCR反应产物用UNIQ-10柱式(购于上海生工生物公司)质粒小量抽提试剂盒回收，得到较纯的DNA。用Sma I、Kpn I限制性内切酶进行两次单酶切，条件如下：

a)限制性内切酶Kpn I酶切体系

37℃恒温水浴下，3h。

b)DNA沉淀

通过Kpn I酶切的反应体系，需通过DNA沉淀进行第二次酶切。

DNA沉淀体系

13000rpm离心8min，去上清，加70％乙醇洗涤，13000rpm 4min，去上清，再离2min，用200ul加样枪吸去上清。室温敞开干燥5min，待用。

c)限制性内切酶Sma I酶切体系

30℃恒温水浴，2.5h。

d)目的基因PNP切胶回收、纯化

50ul体系加10ul 6×loading buffer进行0.8％的Agarose凝胶电泳，110V跑40min，紫外灯下观察结果，切下目的Agarose凝胶，利用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒进行纯化，待用。

2、pET-43.1b(+)载体片段制备

(1)UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒制备pET-43.1b(+)载体

a)从质粒保存菌平板上挑取数个单菌落，在4个7ml含氨苄青霉素50ug/ml LB液体培养基中37℃，300rpm振荡培养过夜。

b)次日，按照UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒说明书制备得到pET-43.1b(+)质粒载体。

(2)已进行Kpn I、Sma I两次单酶切目的基因PNP、纯化pET-43.1b(+)载体片段，待用。

3、载体pET-43.1b(+)与PNP连接

(1)将pET-43.1b(+)与PNP按1∶5～1∶10比例混匀，DNA浓缩仪抽干。

(2)连接反应体系

22℃连接过夜。

实施列3：基因序列230位定点突变，PCR扩增得到重组表达载体。

用定点突变方法将序列SEQ ID NO1第230位半胱氨酸突变为丙氨酸。设计引物为：

Mut1：5’-cttgaaagttctgggcatttcagcgatctctaactttgcagc-3’

突变位点

Mut2：5’-gctgcaaagttagagatcgctgaaatgcccagaactttcaag-3’

突变位点

(1)PCR反应体系

(2)PCR反应条件

(3)PCR产物(重组表达载体)用Dpn酶切37℃2小时，经DNA测序后(委托上海生工)再转化E.coli BL21(DE3)工程菌，见实施列4，测序后序列如序列表中SEQ ID NO.2。

实施列4：重组表达载体转化宿主菌株中。

(1)E.coli DH 5α感受态制备

a)从E.coli DH 5α保存平板上挑取白色单克隆菌落，在7ml LB液体培养基中37℃恒温水浴箱静置培养过夜。

b)次日，取过夜培养液10ul转种至新LB液体培养基中，37℃，300rpm振荡，培养至OD600值约0.6左右。

c)按感受态制备试剂盒(购自宝生物公司)制备高效感受态细胞。-70℃冷冻备用。

(2)转化

a)实施列3中PCR产物65℃～70℃过夜，灭菌10min。常温自然冷却。

b)从-70℃取出E.coli DH 5α感受态细胞，速溶，插入冰中。将灭菌连接产物全部转至感受态细胞中，轻轻均匀，置冰上30min。

c)42℃热激1min。将感受态细胞液转至含500ul LB液体培养液的EP管中，37℃恒温水浴1h。

d)涂板，那培养物涂布于LB固体培养基，37℃培养过夜。

(3)表达载体pET-43.1b(+)-PNP酶切鉴定

随机挑取6个转化平板上的白色单个菌落于7ml含氨苄青霉素50ug/ml LB液体培养基中37℃，300rpm振荡培养过夜。UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒，按下述体系进行两次单酶切，DNA沉淀过程如上。

37℃恒温水浴2h

30℃恒温水浴2h

表达载体pET-43.1b(+)-PNP酶切鉴定，6个样品都得到目的条带(图3)。

表达载体pET-43.1b(+)-PNP PCR鉴定，6个样品均得到目的条带(图4)。

实施列5：工程菌诱导表达与筛选

1、PNP少量诱导优化培养条件及SDS-PAGE电泳分析

pET-43.1b(+)-PNP的诱导表达

(1)感受态细胞E.coli BL21(DE3)，方法如制备E.coli DH 5α。

(2)将测序比对吻合的重组表达质粒pET-43.1b(+)-PNP转化感受态细胞E.coliBL21(DE3)，37℃过夜培养。

(3)从平板中随机挑取单个白色菌落接种于7ml含氨苄青霉素50ug/ml LB液体培养基中37℃恒温水浴箱静置培养过夜。

(4)次日，转种至14管7ml含氨苄青霉素50ug/ml LB液体培养基中，37℃300rpm振荡培养3-5h，至OD550值0.6左右。

(5)分两组A、B，分别标记1-7号。1-6号加IPTG至终浓度1mmol/L诱导表达，7号不加IPTG，A组37℃300rpm振荡，B组室温振荡。

(6)取1h、2h、3h、4h、5h、过夜六个时间段诱导菌液，无IPTG菌管在1h时取出。

(7)12000rpm 15s收集菌体。

(8)超声波破碎细胞。离心收集上清液，-20℃保存。待SDS-PAGA电泳分析。

2、表达产物分别进行SDS-PAGE分析

(1)制胶：配制12％分离胶20ml，迅速将分离胶灌注于两层玻璃板中，并在胶上小心覆盖一层异丙醇，室温下静置30min；待分离胶聚合后，倒出异丙醇，用蒸馏水洗3遍，并配制5％积层胶6.0ml，直接灌注，并插入干净的梳子，室温下30min。

(2)样品准备：将蛋白样品与3×蛋白上样缓冲液混合，沸水浴3min，自然冷却。取上清适量上样。

(3)电泳：开始时电压为40V，待样品跑过积层胶、Protein Marker分开后，将电压增加打70V，直至染料到啊分离胶底部。

(4)取下凝胶，去掉多余部分，0.25％考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，染色过夜。

(5)脱色液脱色。

从SDS-PAGE电泳结果可见，重组克隆pET-43.1b(+)-PNP/BL21(DE3)经终浓度为1mmol/L IPTG诱导后，在分子大小约95KD出现了明显的表达条带，且亮度超过50％。

A组诱导温度为37℃，300rpm，用1.0mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE电泳结果显示：诱导1h时，基因PNP表达目的蛋白的量最高；诱导时间2-5h。基因PNP表达目的蛋白的量较平均；诱导过夜的产生的蛋白量明显较上少；无IPTG。

B组室温(25-30℃)诱导，用1.0mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE电泳结果显示：基因PNP过夜诱导时产生目的蛋白的效率高于其他时间段。

A、B两组诱导液经过同样的处理，电泳条件、染色条件、脱色条件相同，因此两组结果有一定的可比性。由图5、图6对比可知，37℃基因PNP诱导表达目的蛋白具有更高的效率，更高的量。

实施列7：重组体细菌培养、提取得到纯化的嘌呤核苷磷酸化酶

1、重组体细菌发酵培养

(1)从pET-43.1b(+)-PNP/E.coli BL21(DE3)的氨苄青霉素平板上挑取数个菌落至100ml含氨苄青霉素50ug/ml LB液体培养基中，室温摇过夜。另准备三升发酵液至发酵罐中，高压灭菌。

发酵液配方

(2)次日，发酵液中加100mg/ml氨苄青霉素1.5ml至3L发酵液中，将摇过夜的菌液全部转移至发酵罐中，搅拌400rpm，通气量1升/min/V，发酵培养。

(3)至OD600值2.0左右加IPTG，控制IPTG终浓度1mmol/L，37℃诱导1h。

(4)离心收集菌体吧，4℃保存，次日纯化。

2、提取纯化嘌呤核苷磷酸化酶

(1)3L培养液离心收集沉淀，滤干上清液。

(2)用200ml pH 7.4 PBS重悬细菌沉淀。加入50mg溶菌酶至菌液中，室温0.5h。

(3)加入终浓度为0.5％的TritonX 100，4℃放置0.5h。

(4)9000rpm离心，收集上清液。

(5)过柱，洗涤液充分洗涤。

(6)300mmol/L咪唑系统洗脱。

(7)洗脱液用透析膜4℃脱盐，其间换液6次，PEG浓缩至50ml。

(8)加入100U限制性凝血酶，切除诱导蛋白，得到较纯的PNP目的蛋白。

(9)加入5％蔗糖，冷冻干燥，得到酶的纯品。

实施列6：酶活力测定、分子改造前、后活力分析

PNP酶活性测定：2.9mL反应液(32mmol/L肌苷Inosine，8Ommol/L磷酸钾缓冲液，pH7.7)于37℃水浴预热3min，加入0.1ml适当稀释的酶液(0.1-1u/ml)启动反应，立即计时，用HPLC测定反应液中次黄嘌呤的上升值。

PNP酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟产生1mmol次黄嘌呤所需的酶量定义为一个酶活单位。

酶热稳定性测定：在8Ommol/L磷酸钾缓冲液、0.1％叠氮钠溶液中加入适量酶溶液，于37℃水浴，观察酶活力变化。

表一  分子改造酶活力对照表

表中结果可以看出，230位分子改造后酶的热稳定性有了明显的提高。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>杭州利安生物科技有限公司

<120>分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法

<130>GenBank：BD107242

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>Streptococcus thermophilus IFO13957

<400>1

atgtcactac ttgaaaaaat tagagttacg caaacctttt tggaaaacaa aggaattgaa    60

aaacctgagt ttggtttgat tttgggttct ggacttggag aattggctga tgagatccaa    120

gatgctattg taatcgatta cgcagatatt ccaaactggg ggcaatcaac agtagtcggt    180

catgcaggca aacttgtata tggtactttg tctggacgta aggtattggc tcttcaagga    240

cgtttccatt tttatgaagg aaatcctctt gaagtggtaa ctttccctgt acgtgttatg    300

aaagctcttg gttgtgaagg tgttattgta actaatgctg ctggtggtat tagcttcggt    360

cctggtactt tgatggctat tactgaccat atcaatatga ctggtcagaa cccattgatc    420

ggtaaaaact tggatgactt tggcccacgt ttcccagata tgtctaaagc ttacactcca    480

gcctaccgcg aaattgctca taaagtggct gataaacttg gaatcaagtt ggaagaaggg    540

gtttatcttg gagtaactgg tccaacttat gaaactcctg ctgaaattcg tgccttcaag    600

tcattggggg cagatgctgt tggtatgtca acagttcctg aggttatcgt cgcagcacat    660

tctgacttga aagttctggg catttcatgt atctctaact ttgcagctgg tttgcaagaa    720

gaattgaacc acgaagaagt tgtagaagta actgaacgca ttaaggggga cttcaaagga    780

ttgcttaaag ctattttgtc gaaactc                                        807

<210>2

<211>807

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgtcactac ttgaaaaaat tagagttacg caaacctttt tggaaaacaa aggaattgaa     60

aaacctgagt ttggtttgat tttgggttct ggacttggag aattggctga tgagatccaa    120

gatgctattg taatcgatta cgcagatatt ccaaactggg ggcaatcaac agtagtcggt    180

catgcaggca aacttgtata tggtactttg tctggacgta aggtattggc tcttcaagga    240

cgtttccatt tttatgaagg aaatcctctt gaagtggtaa ctttccctgt acgtgttatg    300

aaagctcttg gttgtgaagg tgttattgta actaatgctg ctggtggtat tagcttcggt    360

cctggtactt tgatggctat tactgaccat atcaatatga ctggtcagaa cccattgatc    420

ggtaaaaact tggatgactt tggcccacgt ttcccagata tgtctaaagc ttacactcca    480

gcctaccgcg aaattgctca taaagtggct gataaacttg gaatcaagtt ggaagaaggg    540

gtttatcttg gagtaactgg tccaacttat gaaactcctg ctgaaattcg tgccttcaag    600

tcattggggg cagatgctgt tggtatgtca acagttcctg aggttatcgt cgcagcacat    660

tctgacttga aagttctggg catttcagcg atctctaact ttgcagctgg tttgcaagaa    720

gaattgaacc acgaagaagt tgtagaagta actgaacgca ttaaggggga cttcaaagga    780

ttgcttaaag ctattttgtc gaaactc                                        807

Claims (5)

1.一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于是嘌呤核苷磷酸化酶突变体DNA序列的表达产物；突变体氨基酸序列是通过使SEQ ID N0.1所示的序列中230位半胱氨酸突变替换为丙氨酸，得到具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。

2.一种载体，其特征在于：其含有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于，所述的载体适合于在大肠杆菌中表达。

4.一种如权利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

·嘌呤核苷磷酸化酶基因序列引物设计、PCR扩增；

·嘌呤核苷磷酸化酶基因片段与克隆载体的连接，得到携带嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·基因序列230位定点突变，PCR扩增得到携带突变嘌呤核苷磷酸化酶基因的重组表达载体；

·重组表达载体转化宿主菌株中，得到重组体细菌；

·重组体细菌培养、提取得到纯化的嘌呤核苷磷酸化酶。

5.根据权利要求4所述的一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于，所述的重组体细菌是重组的大肠杆菌细菌。

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