CN108424943A - 一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产2’‑脱氧‑2’‑氟‑β‑D‑阿拉伯糖腺苷酸的方法。本发明揭示了在嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)氨基酸序列的一些特定位点上的突变，获得的一系列突变体，所述的突变体的转糖基活性发生极为显著的提高。

Description

一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法

技术领域

本发明属于化学工程及酶工程领域，更具体地，本发明涉及一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法。

背景技术

RNA干扰是控制正常基因表达的一种机制，近来作为一种潜在的技术应用于肿瘤、传染病和代谢性疾病的治疗。在RNA干扰技术的发展过程中，曾经遇到了一些障碍，主要在于：1)寡核苷酸会被核酸酶降解；2)与靶RNA的结合选择性和稳定性差；3)不需要地触发免疫反应；4)转运和结合蛋白存在一定障碍。

很快，人们发现化学修饰的核苷酸可以解决上面提到的一些障碍。因此，第一代化学修饰的寡核苷酸出现，是硫代磷酸键取代磷酸二酯键，这样可以防止核酸酶的降解。在修饰的化学基团中，2’-FANA(2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖)修饰的核苷具有独特的RNA干扰特性。数据表明，2’-FANA修饰的核苷酸拆入合成的siRNA效果是普通siRNA的4倍多，在血清中的半衰期大概有6h，普通的siRNA半衰期是小于15min(Thomas Dowler，et al.NucleicAcids Research，2006，34:1669-1675)。

2’-FANA核苷酸的合成有化学法和酶法，化学合成是一个多步骤的过程，为了实现区域和立体选择性，需要对官能团进行保护和脱保护等复杂的程序。另外，化学合成通常涉及对健康和环境有害的试剂。酶法合成能够在温和的反应条件下，有效地催化反应，具有严格的区域和立体选择性。不需要复杂的反应程序和危险化学品。以尿苷酸和腺嘌呤为底物，在核苷磷酸化酶的转糖基作用下，生成腺苷酸。

酶法合成2’-FANA-A(2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸)可以2’-FANA-U(2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸)和腺嘌呤A为底物，在核苷磷酸化酶的转糖基作用下生成，如图1。但是E.coli的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC.2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP，EC.2.4.2.2)在以2’-FANA修饰的核苷酸为底物时转化率很低，限制了其大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸(2’-FANA-A)的方法，所述方法包括：以2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸(2’-FANA-U)和腺嘌呤(A)为底物，以突变型嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)催化，获得2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸；

所述突变型嘌呤核苷磷酸化酶，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶序列存在选自下组的突变：

第86位I→R，且第180位E→T；

第34位L→V；

第150位R→S；

第86位I→R；

第86位I→R，且第180位E→V；

第86位I→R，且第89位V→T；

第178位G→Q；

第204位S→T；或

第220位T→L；

所述突变型嘧啶核苷磷酸化酶，对应于其野生型嘧啶核苷磷酸化酶序列存在选自下组的突变：

第36位T→R，且第45位M→L；

第13位K→L；

第80位H→S；

第36位T→L，且第84位A→L；

第36位T→R；

第13位K→T；

第45位M→V；

第23位G→R；或

第84位A→Q。

在一个优选例中，所述的野生型嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC.2.4.2.1)和/或野生型嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP，EC.2.4.2.2)来源于大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的野生型嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或所述的野生型嘧啶核苷磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一方面，提供一种突变型嘌呤核苷磷酸化酶，其具有提高的转糖基活性，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶序列，存在选自下组的突变：

第86位I→R，且第180位E→T；

第34位L→V；

第150位R→S；

第86位I→R；

第86位I→R，且第180位E→V；

第86位I→R，且第89位V→T；

第178位G→Q；

第204位S→T；或

第220位T→L。

在本发明的另一方面，提供一种突变型嘧啶核苷磷酸化酶，其具有提高的转糖基活性，对应于野生型嘧啶核苷磷酸化酶序列，存在选自下组的突变：

第36位T→R，且第45位M→L；

第13位K→L；

第80位H→S；

第36位T→L，且第84位A→L；

第36位T→R；

第13位K→T；

第45位M→V；

第23位G→R；或

第84位A→Q。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶或突变型嘧啶核苷磷酸化酶。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，它含有所述的任一多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶的用途，用于以2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸和腺嘌呤为底物，催化所述底物，获得2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种提高嘌呤核苷磷酸化酶转糖基和/或嘧啶核苷磷酸化酶转糖基活性的方法，所述方法包括：

将野生型的嘌呤核苷磷酸化酶进行选自下组的突变：第86位I→R，且第180位E→T；第34位L→V；第150位R→S；第86位I→R；第86位I→R，且第180位E→V；第86位I→R，且第89位V→T；第178位G→Q；第204位S→T；或第220位T→L；和/或

将野生型嘧啶核苷磷酸化酶进行选自下组的突变：第36位T→R，且第45位M→L；第13位K→L；第80位H→S；第36位T→L，且第84位A→L；第36位T→R；第13位K→T；第45位M→V；第23位G→R；或第84位A→Q。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸(2’-FANA-A)的试剂盒，所述试剂盒中包括：

所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶；或

宿主细胞，所述的宿主细胞表达所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶；

较佳地，所述试剂盒中还包括反应底物2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸和腺嘌呤。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、酶法合成2’-FANA-A可以2’-FANA-U和腺嘌呤A为底物，在核苷磷酸化酶的转糖基作用下生成的示意图。

具体实施方式

本发明人致力于2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸(2’-FANA-A)的酶法生产，经过深入研究，首次揭示了在嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)氨基酸序列的一些特定位点上的突变，可以极为显著地提高，在此基础上获得了一类酶突变体，与野生型相比，所述突变体对2’-FANA-U和2’-FANA-A具有极高的转糖基活性。

嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC.2.4.2.1)是嘌呤补救途径中的一种酶，广泛存在于真核和原核生物中，其能催化可逆的嘌呤(2’-脱氧)核苷的N-糖苷键的剪切，产生一个自由的碱基和1-磷酸(2’-脱氧)核糖。

嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP，EC.2.4.2.2)是嘧啶核苷补救代谢途径中的关键酶，广泛分布于微生物及动物组织细胞中，其能催化可逆的嘧啶(2’-脱氧)核苷的N-糖苷键的剪切，产生一个自由的碱基和1-磷酸(2’-脱氧)核糖。

野生型来源于E.coli的PNP和野生型来源于E.coli的PyNP在以2’-FANA修饰的核苷酸为底物时转化率很低。本发明获得了E.coli来源的PNP和PyNP的突变体，使其能够以2’-FANA-U和腺嘌呤A为底物，高效地生成2’-FANA-A。

如本文所用，除非另外说明，所述的“嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶突变体”、“突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶”可互换使用，是指对应于野生型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶，发生至少一个位置的氨基酸序列变异而形成的变体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶”是指突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

本发明的突变体蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶(SEQ ID NO:2)，肯定存在选自下组的突变：第86位I→R，且第180位E→T；第34位L→V；第150位R→S；第86位I→R；第86位I→R，且第180位E→V；第86位I→R，且第89位V→T；第178位G→Q；第204位S→T；或第220位T→L。所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶，对应于野生型嘧啶核苷磷酸化酶(SEQ ID NO:4)，肯定存在选自下组的突变：第36位T→R，第45位M→L；第13位K→L；第80位H→S；第36位T→L，且第84位A→L；第36位T→R；第13位K→T；第45位M→V；第23位G→R；或第84位A→Q。

在本发明中，术语“突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶(SEQ ID NO:2)，肯定存在选自下组的突变：第86位I→R，且第180位E→T；第34位L→V；第150位R→S；第86位I→R；第86位I→R，且第180位E→V；第86位I→R，且第89位V→T；第178位G→Q；第204位S→T；或第220位T→L。所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶，对应于野生型嘧啶核苷磷酸化酶(SEQ ID NO:4)，肯定存在选自下组的突变：第36位T→R，第45位M→L；第13位K→L；第80位H→S；第36位T→L，且第84位A→L；第36位T→R；第13位K→T；第45位M→V；第23位G→R；或第84位A→Q。

本发明还提供了编码本发明突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明的突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码突变型嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞。

在本发明的优选实施例中，得到菌株PyNP-50，PyNP-66，PyNP-86，PyNP-99，PyNP-134，PyNP-155，PyNP-289，PyNP-396，PyNP-516有较高的转化率，进行质粒抽提，测序，与野生型PyNP基因进行比对，转化率发生呈现十倍或数十倍的提高。

在本发明的优选实施例中，酶反应条件优选为(终浓度)：2mM2’-FANA-U，3mM腺嘌呤(A)，1mM pH7.4磷酸缓冲溶液，PNP突变酶10ul/ml，PyNP突变酶10ul/ml，37℃反应48h，转化率达18.5％，野生型转化率为1％以下。应理解，所述的反应浓度、pH值、反应时间及反应温度可以存在适当的上下浮动；例如，可上下浮动40％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、野生型PNP、PyNP重组基因工程菌的构建、表达及重组蛋白的纯化

(1)重组质粒的构建

本实施例中，采用的野生型PNP、PyNP基因及氨基酸序列来源于大肠杆菌。野生型PNP的GenBank登录号M60917.2；野生型PyNP登录号U00096.3。根据Genbank中公布的序列设计并合成引物，通过PCR进行扩增。

PNP上游引物序列：

5’-GGAATTCCATATGGCTACCCCACACATTAA-3’(SEQ ID NO:5)；

PNP下游引物序列：

5’-GGCGAGCTCTTACTCTTTATCGCCCAGCAG-3’(SEQ ID NO:6)；

PyNP上游引物序列：

5’-GGAATTCCATATGCTTCAAAGTAATGAGTAC-3’(SEQ ID NO:7)；

PyNP下游引物序列：

5’-GGCGAGCTCTTACAGATAGCGGCACAGATA-3’(SEQ ID NO:8)。

PCR的反应体系如下：

PCR的反应条件如下：

PCR产物用“天根PCR产物回收试剂盒”回收。pET-28b(+)质粒，PCR反应扩增的胶回收产物分别用NdeI和XhoI双酶切。酶切产物在1.0％琼脂糖电泳后纯化，用胶回收试剂盒纯化(天根)。

然后，采用T4DNA连接酶在4℃进行间接反应16hr；连接后的反应产物转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切验证，得到含有PNP、PyNP基因的表达质粒PNP-wt，PyNP-wt。

(2)PNP-wt，PyNP-wt的摇瓶发酵

培养条件：分别挑取单克隆菌株PNP-wt，PyNP-wt接种到含卡那霉素(60微克/毫升)的800ml 2*YT液体培养基，37℃，220rpm培养。当OD₆₀₀达到0.6时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导，诱导培养4小时，离心收集菌体得2.4g，-20℃保存。

(3)PNP-wt，PyNP-wt的纯化

以PNP-wt为例陈述纯化方法，PyNP-wt与其一致。

由于在表达载体构建过程中引入可原核表达载体pET28b(+)中的N端的His-tag，因此利用组氨酸标签进行固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来纯化重组蛋白，具体方法如下：

将上述得到的菌体1g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液(pH7.0，50mM)，置于冰水中进行超声破碎直至澄清，超声破碎条件为：工作2s，间隔5s。将破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12000rpm，4℃，20min)，收集上清，得到重组野生型PNP蛋白，将该粗重组蛋白进行Ni柱(GE)层析，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(GE)进行实时监控，当检测到蛋白峰时，开始收集，直到该峰消失。重组的PNP-wt经Ni柱纯化后保存于无菌离心管中，放置于4℃冰箱，以备后续实验。

实施例2、PNP、PyNP突变体的制备

以PNP为例进行陈述，PyNP与其一致。

1)突变文库的构建

以重组pET-PNP-wt为DNA模板，其中引物为T7通用引物，通过易错PCR的方法构建一个随机突变体文库，并通过调整易错PCR反应体系中Mg2+和Mn2+浓度以及dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率为千分之五，即保证一个突变体有1到3个氨基酸发生突变，构建突变体文库的具体过程如下：

T7启动子引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:9)；

T7终止子引物：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO:10)。

反应条件：

将得到的易错PCR产物进行电泳并切胶回收纯化，将纯化后的产物与原核表达载体pET28b(+)分别进行NdeI和XhoI双酶切，酶切2h分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比进行混合，加入T4DNA ligase于16℃过夜连接。次日，按照实施例1的方法构建重组基因工程菌，即可得到库容量大的突变体文库。

2)突变体文库的筛选方法

对突变文库进行筛选，在96孔板中进行培养，诱导时加入2’-FANA-U、2’-FANA-A底物，对培养物进行HPLC鉴定，分析转化率高的菌株。具体步骤如下：

用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库中的单菌落接种于装有LB培养基的96孔板细胞培养板中，其中LB培养基体积为200ul/孔且含有60ug/ml的卡那霉素，于37℃，200rpm的恒温摇床中培养8个小时后，加入0.5mM的IPTG和2mM的2’-FANA-A，于37℃，200rpm的恒温摇床中培养16h。

对培养后的样品进行HPLC分析：反向C18柱，检测260nm光吸收，洗脱溶液为97％20mM醋酸铵和3％乙腈-60％20mM醋酸铵和40％乙腈，10min保留时间。

从突变文库中获得了大量的克隆，研究筛选以期找出转化率提高的突变体。

经过大规模筛选验证，本发明人得到以下转化率发生极为显著地提高的突变体。突变体的突变情况、转化率和突变位点如下表1和表2。

表1

No.	转化率(A/2’-FANA-A)	突变位点
			PNP-wt	1％	——
PNP-2	12.5％	I86R，E180V
			PNP-30	11.7％	I86R，V89T
PNP-59	15.3％	R150S
			PNP-78	15％	I86R
PNP-160	12.3％	S204T
			PNP-188	10.1％	G178Q
PNP-379	16.2％	I86R，E180T
			PNP-478	15.8％	L34V
PNP-534	12.3％	T220L

表2

实施例3、定向突变野生型PNP，PyNP，并进行纯化

1)野生型PNP，PyNP的定点突变

从PNP-wt、PyNP-wt出发，利用QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit进行定点突变，按照试剂盒的操作步骤进行。将PNP-wt 86位的I突变为R，记作“PNP-mutant”；将PyNP-wt 36位的T突变为R，记作“PyNP-mutant”。

2)PNP-mutant，PyNP-mutant的摇瓶发酵和Ni柱纯化

具体步骤参看实施例1。

3)用纯化后的酶进行酶反应，酶反应条件为(终浓度)：2mM 2’-FANA-U，3mM腺嘌呤(A)，1mM pH7.4磷酸缓冲溶液，PNP突变酶10ul/ml，PyNP突变酶10ul/ml，37℃反应48h，

HPLC测定转化率，如表3和表4。

表3、酶反应

HPLC分析：反向C18柱，检测260nm光吸收，洗脱溶液为97％20mM醋酸铵和3％乙腈-60％20mM醋酸铵和40％乙腈，10min保留时间。

表4

No.	转化率(2’-FANA-A/2’-FANA-U)
		1	0.8％
2	18.5％

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围。

序列表

<110> 上海兆维科技发展有限公司

<120> 一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法

<130> 179460

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(E. coli)

<400> 1

atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60

ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120

aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180

atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240

ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300

ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360

tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420

gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480

tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540

atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600

tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660

accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(E. coli)

<400> 2

Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val

1 5 10 15

Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr

20 25 30

Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly

35 40 45

Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly

50 55 60

Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp

65 70 75 80

Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu

85 90 95

Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr

100 105 110

Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala

115 120 125

Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala

130 135 140

Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile

165 170 175

Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu

180 185 190

Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg

195 200 205

Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp

210 215 220

Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu

225 230 235

<210> 3

<211> 285

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(E. coli)

<400> 3

atgcttcaaa gtaatgagta cttttccggc aaagtgaaat caatcggctt ttccagcagc 60

agcactggtc gcgccagcgt gggtgttatg gttgaaggcg aatacacctt cagcaccgct 120

gagccggaag agatgacggt aatcagtggc gcgctgaatg tgttactgcc tgacgcgacc 180

gactggcagg tgtatgaagc cggttcggtg tttaatgttc ccggtcacag tgagtttcat 240

ctgcaagttg ccgaacccac ctcttatctg tgccgctatc tgtaa 285

<210> 4

<211> 94

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(E. coli)

<400> 4

Met Leu Gln Ser Asn Glu Tyr Phe Ser Gly Lys Val Lys Ser Ile Gly

1 5 10 15

Phe Ser Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ala Ser Val Gly Val Met Val Glu

20 25 30

Gly Glu Tyr Thr Phe Ser Thr Ala Glu Pro Glu Glu Met Thr Val Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Leu Asn Val Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Trp Gln Val

50 55 60

Tyr Glu Ala Gly Ser Val Phe Asn Val Pro Gly His Ser Glu Phe His

65 70 75 80

Leu Gln Val Ala Glu Pro Thr Ser Tyr Leu Cys Arg Tyr Leu

85 90

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattccat atggctaccc cacacattaa 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcgagctct tactctttat cgcccagcag 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaattccat atgcttcaaa gtaatgagta c 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgagctct tacagatagc ggcacagata 30

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (10)

1.一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：以2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸和腺嘌呤为底物，以突变型嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶催化，获得2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸；

所述突变型嘌呤核苷磷酸化酶，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶序列存在选自下组的突变：

第86位I→R，且第180位E→T；

第34位L→V；

第150位R→S；

第86位I→R；

第86位I→R，且第180位E→V；

第86位I→R，且第89位V→T；

第178位G→Q；

第204位S→T；或

第220位T→L；

所述突变型嘧啶核苷磷酸化酶，对应于其野生型嘧啶核苷磷酸化酶序列存在选自下组的突变：

第36位T→R，且第45位M→L；

第13位K→L；

第80位H→S；

第36位T→L，且第84位A→L；

第36位T→R；

第13位K→T；

第45位M→V；

第23位G→R；或

第84位A→Q。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的野生型嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或

所述的野生型嘧啶核苷磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种突变型嘌呤核苷磷酸化酶，其具有提高的转糖基活性，其特征在于，对应于野生型嘌呤核苷磷酸化酶序列，存在选自下组的突变：

第86位I→R，且第180位E→T；

第34位L→V；

第150位R→S；

第86位I→R；

第86位I→R，且第180位E→V；

第86位I→R，且第89位V→T；

第178位G→Q；

第204位S→T；或

第220位T→L。

4.一种突变型嘧啶核苷磷酸化酶，其具有提高的转糖基活性，其特征在于，对应于野生型嘧啶核苷磷酸化酶序列，存在选自下组的突变：

第36位T→R，且第45位M→L；

第13位K→L；

第80位H→S；

第36位T→L，且第84位A→L；

第36位T→R；

第13位K→T；

第45位M→V；

第23位G→R；或

第84位A→Q。

5.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求3或4所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶或突变型嘧啶核苷磷酸化酶。

6.重组载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的任一多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

8.权利要求2所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和权利要求3所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶的用途，用于以2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸和腺嘌呤为底物，催化所述底物，获得2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸。

9.一种提高嘌呤核苷磷酸化酶转糖基和/或嘧啶核苷磷酸化酶转糖基活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

将野生型的嘌呤核苷磷酸化酶进行选自下组的突变：第86位I→R，且第180位E→T；第34位L→V；第150位R→S；第86位I→R；第86位I→R，且第180位E→V；第86位I→R，且第89位V→T；第178位G→Q；第204位S→T；或第220位T→L；和/或

将野生型嘧啶核苷磷酸化酶进行选自下组的突变：第36位T→R，且第45位M→L；第13位K→L；第80位H→S；第36位T→L，且第84位A→L；第36位T→R；第13位K→T；第45位M→V；第23位G→R；或第84位A→Q。

10.一种用于生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖腺苷酸(2’-FANA-A)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

权利要求2所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和权利要求3所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶；或

宿主细胞，所述的宿主细胞表达权利要求2所述的突变型嘌呤核苷磷酸化酶和权利要求3所述的突变型嘧啶核苷磷酸化酶；

较佳地，所述试剂盒中还包括反应底物2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖尿苷酸和腺嘌呤。