CN103382496B - 一种制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

一种制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法,通过将pet8基因转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,显著地促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。并且,将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因与pet8基因共转S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,则可进一步提高S-腺苷甲硫氨酸产量。采用本发明的方法,克服了现有技术中S-腺苷甲硫氨酸生产菌株难于分泌表达S-腺苷甲硫氨酸的技术难题,有利于下游S-腺苷甲硫氨酸的分离或纯化。

Description

一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域,更具体地,本发明涉及一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,简称SAM)为生物体代谢中最重要的甲基供体,除了起着转甲基作用之外,还具有转硫和转氨丙基作用,分别参与同型半胱氨酸(SAH)、谷胱甘肽(GSH)等重要的抗氧化活性物质和多胺的代谢。临床上SAM具有很高的药用价值,被用于在肝病、抑郁症等神经系统疾病、关节炎和纤维性肌痛等疾病的治疗。80年代中期,SAM在欧洲首先被推荐为抗忧郁症的精神病药物。1990年在美国也通过了FDA的随机双盲法验证。由于现有生产工艺的制约,SAM生产成本与价格相对较为昂贵。高效与成本低廉的SAM生产工艺与方法的研究具有重要意义。
SAM是由Cantoni于1951年发现的一种广泛存在于生物体内的含硫化合物,其分子式为C15H22N6O5S,分子量为399,结构式如下。
生物体内的SAM来源主要是由在含有Mg2+和K+条件下由SAM合成酶催化L-甲硫氨酸和ATP合成的。
SAM的规模化生产则经历了化学合成法、酶促转化法和微生物合成法的过程。其中化学合成法产率较低,产物构型较为复杂,酶促转化法则受制于获取大量且高活性的SAM合成酶的难度与成本控制,利用微生物合成与制备SAM的方法成为产业化研究的重要方向。
现在微生物合成法主要是通过酵母菌进行合成,方法是在培养酵母过程中添加SAM的前体甲硫氨酸,利用酵母能在胞内积累SAM的特性,采用化学、法式压榨、高压匀浆或者热处理的方式破壁,然后使用热水抽提、高氯酸抽提、三氯酸抽提,最后再使用色谱层析、选择性沉淀剂(如苦味酸、Reinack盐、硼酸等)等分离提取SAM。该方法的缺点在于产生的SAM储存于酵母细胞内,必须经过细胞破碎后再经纯化后获得,工艺过程尤其是纯化较为复杂。如果能够实现微生物菌株产生的SAM分泌到细胞外的培养基上清中,则可以显著提高SAM的生产效率,显著简化纯化的过程与提高纯化效率。
生物技术研究的不断进步尤其是合成生物学研究的飞速发展,促使人们不断尝试通过对微生物进行有针对性的改造,使微生物成为生产特定目标产物的细胞工厂。在专利CN 1570126A中,苏珊·莱昂哈特斯伯格和托马斯·迈尔以大肠杆菌为宿主过量表达大鼠肝脏合成酶基因,发现改造的工程菌株能把SAM分泌到培养基中,与之前使用的酵母菌宿主相比,简化了工艺流程。在专利CN185303A中托马斯·施勒塞尔等除了在大肠杆菌中过量表达大鼠肝脏合成酶基因以外,还发现cmr(mdfA)基因能够促进大肠杆菌把SAM分泌到培养基中,这一实验结果提示可以通过提高SAM的分泌转移途径的效率,有效提高SAM的产量。然而由于cmr(mdfA)基因是多药耐药基因,利用cmr改造后的大肠杆菌可能存在潜在生物安全性问题。
从70年代开始,对不同生物体内如酿酒酵母,大鼠(肝脏),普氏立克次氏体,非洲锥虫SAM的转运就开始了研究,不过只是提出了存在SAM转运蛋白的假说,并没有对SAM转运蛋白进行鉴定。直到2003-2006年,人们陆续发现在酵母、人类、拟南芥、大鼠、果蝇等多种生物体内存在一种比较保守的线粒体转运蛋白PET8P,该转运蛋白定位于线粒体和叶绿体,能够进行单向和双向的SAM转运。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。
在本发明的第一方面,提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法,包括:在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的PET8P(S-腺苷甲硫氨酸转运蛋白)多肽,从而所述S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。
在一个优选例中,还包括:在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括(但不限于):大肠杆菌SAM合成酶(METK),酿酒酵母SAM合成酶(SAM2),大鼠肝脏SAM合成酶或古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶(如P.furiosus S-腺苷甲硫氨酸合成酶)。
在另一优选例中,所述的PET8P是:(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽;或(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个,更佳地1-20个,更佳地1-10个,更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽;或(c)与(a)限定的序列具有70%以上(较佳地80%以上,更佳地90%以上,更佳地95%以上,更佳地98%以上,如99%或更高)的序列相同性的,且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述的METK是:(a1)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽;或(b1)将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个,更佳地1-20个,更佳地1-10个,更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽;或(c1)与(a1)限定的序列具有70%以上(较佳地80%以上,更佳地90%以上,更佳地95%以上,更佳地98%以上,如99%或更高)的序列相同性的,且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述的SAM2是:(a2)SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽;或(b2)将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个,更佳地1-20个,更佳地1-10个,更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽;或(c2)与(a2)限定的序列具有70%以上(较佳地80%以上,更佳地90%以上,更佳地95%以上,更佳地98%以上,如99%或更高)的序列相同性的,且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述的重组表达外源的PET8P多肽或S-腺苷甲硫氨酸合成酶的方法是:提供重组构建物,所述的重组构建物中包含有PET8P多肽的编码基因的表达盒,以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因的表达盒;将所述的重组构建物转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,从而重组表达外源的PET8P多肽。
在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是细菌。
在另一优选例中,所述的细菌是大肠杆菌。
在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株为固定化的菌株;或为游离的菌株。
在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株培养方法如下:将S-腺苷甲硫氨酸生产菌株在适当条件下培养之后加入L-甲硫氨酸,生产S-腺苷甲硫氨酸。
在另一优选例中,将S-腺苷甲硫氨酸生产菌株在转速280±100rpm(更佳地280±50rpm)温度37±2℃(更佳地37±1℃)条件下培养3小时,至OD600达到0.6±0.2(更佳地0.6±0.1)时,加入IPTG至终浓度0.1±0.05mmol/L(更佳地0.1±0.02mmol/L),诱导3小时以后,加入L-甲硫氨酸至终浓度为0.5±0.2g/L(更佳地0.5±0.1g/L),培养20-60小时。
在另一优选例中,还包括步骤:从分泌产物中分离或纯化S-腺苷甲硫氨酸。
在本发明的另一方面,提供一种表达构建物,包括:
表达盒1,该表达盒1包含:启动子,PET8P多肽的编码基因,终止子;和
表达盒2,该表达盒2包含:启动子,S-腺苷甲硫氨酸合成酶(包括METK或SAM2)的编码基因,终止子。
在本发明的另一方面,提供一种重组的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,其中包含外源的表达构建物,该表达构建物包括表达盒1,该表达盒1包含:启动子,PET8P多肽的编码基因,终止子。
在一个优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中还包含外源的表达构建物,该表达构建物包括表达盒2,该表达盒2包含:启动子,S-腺苷甲硫氨酸合成酶(包括METK或SAM2)的编码基因,终止子。
在本发明的另一方面,提供PET8P多肽的用途,用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、pet8基因和蛋白电泳图。
(a)泳道1、DL10000DNA marker;泳道2、pet8的PCR产物条带;
(b)泳道1、蛋白分子量标准;泳道2、阴性对照(空白菌);泳道3、p-pet8基因表达(0.1mM IPTG诱导)。
图2、metk基因和蛋白电泳图。
(a)泳道1、DL 10000DNA marker;泳道2、阴性对照;泳道3、metk的PCR产物条带;
(b)泳道1、蛋白分子量标准;泳道2、阴性对照(空白菌);泳道3、p-metk基因表达(无IPTG);泳道4、p-metk基因表达(0.1mM IPTG诱导)。
图3、sam2基因和蛋白电泳图。
(a)泳道1、DL10000DNA marker;泳道2、sam2的PCR产物条带;
(b)泳道1、蛋白分子量标准;泳道2、阴性对照(空白菌);泳道3、p-sam2基因表达(0.1mM IPTG诱导)。
图4、metk-pet8和sam2-pet8共表达蛋白电泳图。
(a)泳道1、蛋白分子量标准;泳道2、阴性对照(空白菌);泳道3、p-metk基因表达(0.1mM IPTG诱导);泳道4、p-pet8基因表达(0.1mM IPTG诱导);泳道5、p-metk-pet8基因共表达(0.1mM IPTG诱导);
(b)泳道1、蛋白分子量标准;泳道2、阴性对照(空白菌);泳道3、p-sam2基因表达(0.1mM IPTG诱导);泳道4、p-pet8基因表达(0.1mM IPTG诱导);泳道5、p-sam2-pet8基因共表达(0.1mM IPTG诱导)。
图5、不同改造菌株24和48h的SAM产量图。
(a)和(b)分别为24h和48h的结果。
B:空白菌;M:p-metk;S:p-sam2;
P:p-pet8;MP:p-metk-pet8;SP;p-sam2-pet8。
图6、改造后的质粒图谱。
(a)空质粒pET21;(b)p-metk;(c)p-sam2;(d)p-pet8;(e)p-metk-pet8;(f)p-sam2-pet8。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的试验,发现将pet8基因在转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株后,能够显著地促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。并且,将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因与pet8基因共转S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,则可以进一步地提高S-腺苷甲硫氨酸产量。采用本发明的方法,克服了现有技术中S-腺苷甲硫氨酸生产菌株难于分泌表达S-腺苷甲硫氨酸的技术难题,有利于下游S-腺苷甲硫氨酸的分离或纯化。
术语
如本文所用,“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如,如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的,则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用,所述的“启动子”是指一种核酸序列,其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端),能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地,启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中,所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体,该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为PET8P多肽或S-腺苷甲硫氨酸合成酶)所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括以下元件:启动子、编码多肽的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用,所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用,术语“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%,优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上,更优选是95%以上时才发生杂交。
如本文所用,所述的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”;“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
PET8P多肽
PET8P是保守地存在于酵母、人类、拟南芥、大鼠、果蝇等多种生物体内的一种线粒体转运蛋白,该转运蛋白定位于线粒体和叶绿体。本发明中,发现在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中表达外源的PET8P多肽后,能够显著地促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。
本发明还包括所述的PET8P多肽的片段、衍生物和类似物。这里的“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的PET8P多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列,或融合多肽)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“PET8P多肽”指具有促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸功能的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个,还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
本发明还提供了编码本发明PET8P多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列或其变异形式的蛋白,但与SEQ ID NO:1中的编码区序列有差别的核酸序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸,它们是与上述多核苷酸具有至少70%,更佳地至少80%相同,更佳地至少90%;更佳地至少95%;更佳地至少98%或99%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。这些多核苷酸所编码的蛋白也具有促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸功能。
本发明的PET8P多肽核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,可进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明中,编码PET8P多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PET8P多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
增加PET8P多肽表达的方法是本领域周知的。例如,可通过转入携带PET8P多肽编码基因的表达构建物使酵母细胞过表达PET8P多肽;或可通过用强启动子驱动从而增强PET8P多肽的表达;或者通过增强子来增强该PET8P多肽的表达
S-腺苷甲硫氨酸合成酶
本发明人发现,将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因与pet8基因共转S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,可以进一步地提高S-腺苷甲硫氨酸产量。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶是存在于多种生物体内的一种酶,能够催化L-甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸。
任何本领域已知的S-腺苷甲硫氨酸合成酶均可被应用本发明中,以用于高效生产S-腺苷甲硫氨酸。作为本发明的优选方式,所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括但不限于METK或SAM2。
本发明还包括所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的片段、衍生物和类似物。这里的“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的PET8P多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列,或融合多肽)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶的变异形式也包含在本发明中。这些变异形式包括(但并不限于):在野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶基础上,若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个,还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。
生产S-腺苷甲硫氨酸的方法
本发明提供了一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法,包括:在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的PET8P(SAM转运蛋白)多肽,从而所述S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸。
所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株可以是本领域常规用于生产S-腺苷甲硫氨酸的菌株。由于S-腺苷甲硫氨酸的生产是本领域长期研究的,本领域技术人员熟悉常用的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株为细菌。作为本发明的优选方式,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是大肠杆菌。所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株可以是固定化的菌株;或是游离的菌株。
作为本发明的优选方式,所述的重组表达外源的PET8P多肽或S-腺苷甲硫氨酸合成酶的方法是:提供重组构建物,所述的重组构建物中包含有PET8P多肽的编码基因的表达盒,以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因的表达盒;将所述的重组构建物转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,从而重组表达外源的PET8P多肽。
目前,已知DNA序列,将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术,一般人员只要根据本发明的提示,都可以方便的进行操作。此外,将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养,表达目的多肽。
在本发明的具体实施例中,本发明人从酿酒酵母和大肠杆菌染色体DNA中分别扩增得到酵母转运蛋白基因pet8,酵母SAM合成酶基因sam2和大肠杆菌SAM合成酶基因metk,在pet8基因单独表达或与SAM合成酶共表达情况下,使用HPLC结合UV检测的方法测定了摇瓶发酵液上清中的SAM含量情况,结果发现,单独表达转运蛋白基因pet8能够大幅度提高培养基中的SAM含量,并且在同时表达SAM合成酶(METK和SAM2)的条件下进一步提高了培养基中的SAM含量。这样本发明人获取了能够分泌产生SAM的菌株,为简易的大规模获取SAM提供了新的途径,并为工业化生产的建立与应用提供了有益的参考与借鉴。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
I、材料
菌株
大肠杆菌E.coli DH5α,E.coli BL21,E.coli BL21(DE3)及E.coli Rosetta;
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)。
分子生物学试剂
限制性内切酶EcoRI、SalI、BamHI、HindIII、XhoI、Primstar DNA聚合酶,T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品;蛋白质分子质量标准为上海生化所产品;胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;质粒抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成:DNA测序由六合华大基因科技公司上海分公司完成,SAM标准品购自Sigma公司,乙腈为HPLC色谱纯,其它试剂均为分析纯。
培养基
LB液体培养基:1%(w/v)胰蛋白胨,0.5%(w/v)酵母抽提物,1%(w/v)NaCl,pH 7.0,121℃灭菌20min。
LB固定培养基:LB液体培养基,加2%(w/v)琼脂粉。
YPD液体培养基:1%(w/v)酵母抽提物,2%(w/v)蛋白胨,2%(w/v)D-葡萄糖,121℃灭菌20min。
YPD固体培养基:YPD液体培养基,加2%(w/v)琼脂粉。
II、实施例
实施例1、基因克隆及质粒改造
改造质粒的原理是:使用基因工程的方法在pET21上插入pet8,metk和sam2基因,然后将含有调控序列的pet8基因克隆到p-metk和p-sam2克隆上,实现转运蛋白和合成酶的共表达。各个改造后质粒的示意图见图6。
1.pet8基因的克隆、质粒构建及表达
由于酿酒酵母基因组中,pet8基因中无内含子,所以可以直接从基因组中扩增而不需要进行RT-PCR。根据Gene ID:855729中pet8基因的基因序列(SEQID NO:1)设计引物,以抽提的酿酒酵母(Saccharomycs cerevisiae S288c)基因组DNA为模板进行PCR扩增,上游引物为pet8-1:5’-CCCAAGCTTATGAATACTTTTTTTC-3’(SEQ ID NO:7);下游引物为pet8-2:5’-TTTTTACGCTCTCATTT-3’(SEQ ID NO:8);其中pet8-1引物中单下划线的为HindIII酶切位点,pet8-2引物中双下划线的为XhoI酶切位点,以便于连接入载体pET21;扩增体系为:
扩增程序为:98℃变性5min,98℃1min,52℃30s,72℃1min,30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
PCR扩增产物首先用胶回收试剂盒进行回收,然后将PCR扩增产物和pET21载体使用HindIII和XhoI双酶切,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收。以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体,转化E.coli DH5α感受态,菌落PCR方法鉴定转化子,方法见《分子克隆》,结果如图1(a)。阳性转化子送到六合华大基因科技公司上海分公司测序。测得的DNA序列翻译为蛋白质序列,与Gene ID:855729收录的pet8基因序列(SEQ ID NO:1)对比完全相同。
将测序正确的重组质粒p-pet8分别转化到E.coli BL21(DE3)和E.coliRosetta中,同时转化空质粒pET21作对照。挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素),过夜培养,以1%接种于液体培养基培养3小时,至OD600达到0.7时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,诱导4小时。离心收集菌体,以2×上样缓冲液处理,SDS-PAGE电泳分析表达产物。
结果如图1(b)。发现转入重组质粒的E.coli Rosetta与转入空白质粒的菌株相比在31kDa处出现特征蛋白质带。根据计算,该蛋白的分子量应为31027Da,与理论值相符。
2.metk基因的克隆、质粒构建及表达
根据Gene ID:8115881中metk基因的基因序列(SEQ ID NO:3)设计引物,以抽提的大肠杆菌BL21基因组DNA为模板进行PCR扩增,上游引物为M1:5’-CCGGAATTCATGGCAAAACACCTTT-3’(SEQ ID NO:9);下游引物为M2:5’-ACGCTTACTTCAGACCGG-3’(SEQ ID NO:10);其中M1引物中单下划线的为EcoRI酶切位点,M2引物中双下划线的为SalI酶切位点,以便于连接入载体pET21;
扩增体系为:
扩增程序为:98℃变性5min,98℃1min,55℃30s,72℃90s,30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
PCR扩增产物首先用胶回收试剂盒进行回收,然后将PCR扩增产物和pET21载体使用EcoRI和SalI双酶切,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收。以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体,转化E.coli DH5α感受态,菌落PCR方法鉴定转化子,方法见《分子克隆》,结果如图2(a)。阳性转化子送到六合华大基因科技公司上海分公司测序。测得的DNA序列翻译为蛋白质序列,与Gene ID:8115881收录的metk基因序列(SEQ ID NO:3)对比完全相同。
将测序正确的重组质粒p-metkmetk转化到E.coli BL21(DE3)和E.coliRosetta中,同时转化pET21作对照。挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素),过夜培养,以1%接种于液体培养基培养3小时,至OD600达到0.7时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,诱导4小时。离心收集菌体,以2×上样缓冲液处理,SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果如图2(b)。
3.sam2基因的克隆、质粒构建及表达
根据Gene ID:852113中sam2基因的基因序列(SEQ ID NO:5)设计引物,以抽提的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)基因组DNA为模板进行PCR扩增,上游引物为:Sam2-f:5’-CGCGGATCCATGTCCAAGAGCAAA-3’(SEQID NO:11);下游引物为Sam2-r:5’-CCGTTAAAATTCCAATTTCTTTGGTT-3’(SEQ ID NO:12);其中Sam2-f引物中单下划线的为BamHI酶切位点,Sam2-r引物中双下划线的为EcoRI酶切位点,以便于连接入载体pET21;
扩增体系为:
扩增程序为:98℃变性5min,98℃1min,55℃30s,72℃9030个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
PCR扩增产物首先用胶回收试剂盒进行回收,然后将PCR扩增产物和pET21载体使用BamHI和EcoRI双酶切,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收。以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体,转化E.coli DH5α感受态,菌落PCR方法鉴定转化子,方法见《分子克隆》,结果如图3(a)。阳性转化子送到六合华大基因科技公司上海分公司测序。测得的DNA序列翻译为蛋白质序列,与Gene ID:852113收录的sam2基因序列(SEQ ID NO:5)对比完全相同。
将测序正确的重组质粒p-sam2转化到E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中,同时转化pET21作对照。挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素),过夜培养,以1%接种于液体培养基培养3小时,至OD600达到0.7时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,诱导4小时。离心收集菌体,以2×上样缓冲液处理,SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果如图3(b)。
实施例2、metk/sam2与pet8的共同克隆表达
将以上进行制备的三个质粒p-pet8,p-metk,p-sam2进行进一步的重组构建,把pet8基因放到p-metk和p-sam2上实现共表达。
将p-pet8的质粒设计引物从XbaI后面进行,以便把RBS等序列也放到多克隆位点区。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)基因组DNA为模板进行PCR扩增,上游引物为pt-pet-1:5’-CCCAAGCTTAATAATTTTGTTTAACT-3’(SEQ ID NO:13);下游引物为Pt-pet-2:5’-TTTTTACGCTCTCAT TT-3’(SEQ ID NO:14);其中pt-pet-1引物中单下划线的为HindIII酶切位点,Pt-pet-2引物中双下划线的为XhoI酶切位点,以便于连接入载体。
扩增体系为:
扩增程序为:98℃变性5min,98℃1min,53℃30s,72℃1min,30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
PCR扩增产物首先用胶回收试剂盒进行回收,然后将PCR扩增产物和p-metk质粒和p-sam2质粒分别使用HindIII和XhoI双酶切,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收。以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体,转化E.coli DH5α感受态,菌落PCR方法鉴定转化子,方法见《分子克隆》,结果如图4(a)。阳性转化子送到六合华大基因科技公司上海分公司测序。测得的DNA序列翻译为蛋白质序列,与NCBI库(Gene ID:855729)中理论序列相符。
将测序正确的重组质粒p-metk-pet8和p-sam2-pet8分别转化到E.coliBL21(DE3)和E.coli Rosetta中,同时转化pET21作对照。挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素),过夜培养,以1%(v/v)接种于液体培养基培养3小时,至OD600达到0.7时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,诱导4小时。离心收集菌体,以2×上样缓冲液处理,SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果如图4(b)。
实施例3、发酵产物中SAM的提取和纯化
将经过鉴定的分别表达metk,sam2,pet8,metk-pet8和sam2-pet8的E.coliRosetta菌株涂平板,挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/mL氨苄青霉素),过夜培养,以1%(v/v)的比例接种于液体LB培养基中,在转速280rpm温度37℃条件下培养3小时,至OD600达到0.6时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,诱导3小时以后,加入L-甲硫氨酸,使得甲硫氨酸的终浓度为0.5g/L,然后分别于24h和48h取样。将取得的菌液样品于12000rpm离心10min,弃沉淀,将上清用0.22um的超滤膜进行过滤,准备用于HPLC检测。
参照蔡恒等文章[HPLC——UV法测定发酵液中的SAM;蔡恒,郑伟刚,万红贵;《中国生物工程杂志》]中提及的方法,使用HPLC的C18反相柱进行HPLC-UV检测,检测条件为:流动相为10%乙腈和1%TFA(三氟乙酸)水溶液,流速为0.8mL/min,进样量为25μL,使用Waters SPD-6AV UVSEPETROPHOTOMETRIC Detector在254nm的波长检测吸光值。以Sigma公司的SAM为标准品,根据峰的面积与含量成正比,计算样品中SAM的含量。
计算公式如下:含量=A(样品)/A(标准品)×含量(标准品);其中,A为对应峰的面积。
测定培养基中SAM的产量,HPLC结果显示,标准品SAM的出峰时间在5.8min,如表1所示。
表1.不同改造菌株24h和48h的SAM产量
  产量(mg/L)   B   M   S   P   MP   SP
  24h   12.00   152.07   167.06   124.07   217.76   191.29
  48h   11.94   224.29   145.44   262.64   397.23   296.05
其中,B:空白质粒pET21;M:p-metk;S:p-sam2;P:p-pet8;MP:p-metk-pet8;SP;p-sam2-pet8。
将结果产量作图,如图5。
上述结果可见,在细胞内重组表达pet8能一定程度地提高胞外SAM的产量;并且,共表达pet8+sam2或共表达pet8+metk后,胞外SAM产量提高更大,且共表达pet8+metk效果最为理想。
讨论
SAM作为一种重要的生化药物在临床上有着广泛的应用,但是由于其价格昂贵限制了在临床上的应用,所以简单大量的获取SAM成为研究SAM的重要目的。本发明人通过从酿酒酵母和大肠杆菌中克隆SAM合成酶METK/SAM2和PET8P转运蛋白,通过蛋白电泳证实了metk/sam2和pet8的单独和共表达。根据HPLC的检测结果,本发明人发现,单独表达metk/sam2/pet8在培养基中均能够获得一定量的SAM,其中苏珊·莱昂哈特斯伯格等已经证实了表达metk的基因可以于培养基中获取一定量的SAM,并且托马斯·施勒塞尔也发现多要耐药基因cmr能够起到转运SAM的作用,本发明人的实验证实了苏珊·莱昂哈特斯伯格的结论。在表达METK合成酶的大肠杆菌发酵液中SAM的浓度在24h和48h时分别为152.07mg/L和224.29mg/L。另外本发明人还发现SAM2也具有类似的效果,其产生的SAM浓度在24h和48h时产量分别为167.06mg/L和145.44mg/L。而且,本发明人发现单独表达SAM的转运蛋白pet8使得大肠杆菌能够将SAM分泌到培养基中,在24h和48h时培养基中SAM的产量分别为124.07mg/L和262.64mg/L。
在合成酶METK和SAM2分别与转运蛋白PET8P共表达的试验中,本发明人发现共同表达METK合成酶和PET8P的菌株在24h和48h时在培养基中分泌产生的SAM浓度分别为217.76mg/L和397.2mg/L,而共同表达SAM2合成酶和PET8P的菌株在24h和48h时在培养基中分泌产生的SAM浓度分别为191.29mg/L和296.05mg/L。本发明人发现这样的产量与sam2/metk/pet8中的单独表达相比,都有不同程度的提高,这说明产生了增效效应,产生增效效应的原因在于PET8P的转运活性和METK/SAM2的合成酶活性互相弥补,PET8P将metk/sam2合成的SAM源源不断的分泌到培养基中,从而大大提高了培养基中SAM的产量。
这样,本发明人就获得了能够将SAM分泌到细胞质中的大肠杆菌工程菌株,为了以后SAM的提取纯化改良了工艺,也为未来工业化生产的建立与应用提供了有益的参考与借鉴。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法,其特征在于,包括:在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的PET8P多肽,从而所述S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸,所述的PET8P多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括:在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中重组表达外源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括:大肠杆菌SAM合成酶,酿酒酵母SAM合成酶,大鼠肝脏SAM合成酶或古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的重组表达外源的PET8P多肽的方法是:提供重组构建物,所述的重组构建物中包含有PET8P多肽的编码基因的表达盒;将所述的重组构建物转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,从而重组表达外源的PET8P多肽。
5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,重组表达外源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的方法是:提供重组构建物,所述的重组构建物中包含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因的表达盒;将所述的重组构建物转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,从而重组表达外源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是细菌。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株培养方法如下:将S-腺苷甲硫氨酸生产菌株在适当条件下培养之后加入L-甲硫氨酸,生产S-腺苷甲硫氨酸。
8.一种表达构建物,其特征在于,包括:
表达盒1,该表达盒1包含:启动子,PET8P多肽的编码基因,终止子;所述的PET8P多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;和
表达盒2,该表达盒2包含:启动子,S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因,终止子。
9.一种重组的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,其特征在于,其中包含外源的表达构建物,该表达构建物包括表达盒1,该表达盒1包含:启动子,PET8P多肽的编码基因,终止子;所述的PET8P多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
10.如权利要求9所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株,其特征在于,其中还包含外源的表达构建物,该表达构建物包括表达盒2,该表达盒2包含:启动子,S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因,终止子。
11.PET8P多肽的用途,其特征在于,用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株分泌表达S-腺苷甲硫氨酸,所述的PET8P多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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