JP2022530774A - イソオイゲノールからのバニリンの生合成 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2019年4月29日出願の米国仮特許出願第62/840,276号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は一般に、細菌、酵母若しくは他の細胞系において、又は非細胞系においてイソオイゲノールからバニリンへのバイオ変換を触媒するために、真菌リグノスチルベン-アルファ,ベータ-ジオキシゲナーゼを利用するための方法及び材料に関する。
バニラフレーバーは、世界中で最も頻繁に使用されるフレーバーの一部である。それらは、アイスクリーム、乳製品、デザート、菓子、ベーカリー製品及び蒸留酒などの多数の食品の風味付けに使用されている。それらは、香水、医薬品及び個人衛生製品にも使用されている。
本明細書で使用する場合、単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「その」は、内容が特に明確に指示しない限り、複数参照を含む。
本発明は、本明細書に記載のリグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼをコードし、必要な遺伝子工学操作を行うために適用することができる核酸配列に関する。本発明はまた、本明細書に具体的に開示される配列に対してある程度の「同一性」を有する核酸に関する。例えば、本発明の態様は、配列番号1に対して少なくとも60%の同一性、配列番号1に対して少なくとも65%の同一性、配列番号1に対して少なくとも70%の同一性、配列番号1に対して少なくとも75%の同一性、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、配列番号1に対して少なくとも85%の同一性、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性、配列番号1に対して少なくとも95%の同一性、又は配列番号1に対して少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に有用なリグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼをコードするために使用される核酸配列は、配列番号1と同一の核酸配列を有することができる。
いくつかの態様では、本発明は、リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターのような構築物に関する。
イソオイゲノールは、プロペニルベンゼンの側鎖の酸化を伴うエポキシドジオール経路を介してバニリンに代謝される(図1)。発明者らは、驚くことに、フザリウム・フジクロイ(Fusarium fujikuroi)由来の推定リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼ(FfLSD)が、以前に報告された細菌IEM及びLSDと比較してイソオイゲノールからバニリンへのバイオ変換において驚くほど高い活性を示したことを発見した。より具体的には、FfLSD遺伝子を保有する宿主株を操作し、操作された宿主株をイソオイゲノール含有混合物中で培養することによって、発明者らは、90%超の変換率で、14g/L超の力価でバニリン生成を達成することができた。他の粗酵素及び/又はサブファクターを使用せずに、高い力価及び高い変換率が得られた。
細菌株、プラスミド及び培養条件
DH5a及びBL21(DE3)の大腸菌株をInvitrogenから購入した。大腸菌株W3110は、イェール大学の大腸菌遺伝子リソースの大腸菌遺伝子ストックセンター(http://cgsc2.biology.yale.edu/)から取得した。プラスミドpET28aは、EMD Millipore(Billerica,MA,USA)から購入した。本発明者らが、配列番号3を用いて、図2に示す図に基づき、プラスミドpUVAPを構築し、遺伝子クローニングと遺伝子発現の両方の目的のために使用した。
全てのDNA操作を標準的な手順に従って行った。制限酵素、T4 DNAリガーゼをNew England Biolabsから購入した。全てのPCR反応を、製造業者のガイダンスに従って、New England Biolabs社のPhusion PCRシステムを用いて行った。
NCBI参照配列がXM_023575505.1である1569bpの完全なORF(オープンリーディングフレーム)を有する推定遺伝子を、フザリウム・フジクロイのゲノムから同定した。その推定タンパク質、すなわちFFUJ-11801は、リグノスチルベン-アルファ,ベータ-ジオキシゲナーゼであると注釈がついていた(Wiemannら 2013)。このORFは、522個のアミノ酸(配列番号2)を有するタンパク質をコードし、理論分子量が59kDaであり、計算された等電点(pI)は6.26である。対応するヌクレオチドを、大腸菌での発現のためにコドン最適化した後に、GeneUniversal Inc.Company(Newark,NJ,USA)により合成した(配列番号1)。
FfLSDのオープンリーディングフレーム(ORF)を、組換えタンパク質がN末端に抽出及び精製に便利な6×Hisタグを有するようにpET28aのNde I/Xho I制限部位にクローニングした。FfLSDのORFを、表1のFfLSD-NdeI-FとFfLSD-Xho I-R1のプライマー対を用いて、5’末端にNde I制限部位及び3’末端にXho I部位を導入して増幅した。Nde IとXho Iで消化した後、発現ベクターpET28aのNde IとXho Iの制限部位にPCR断片をライゲーションし、DH5アルファコンピテントセルに形質転換し、FfLSD-pET28のプラスミドを作製した(図3)。配列の確認後、大腸菌株BL21(DE3)への形質転換用のプラスミドを用意した。
標準的な化学変換プロトコルを用いて、FfLSD-pET28aの構築物を大腸菌BL21(DE3)細胞に導入して、株FfLSD-BL21を作製した。株FfLSD-BL21を、機能的特徴付けのための組換えタンパク質の発現に使用した。
大腸菌株FfLSD-BL21の単一コロニーを、100mg/Lのカナマイシンを有するLB培地5mL中で、37℃で一晩増殖させた。この種培養物を、100mg/Lのアンピシリンを有するLB培地200mLに移した。細胞を250rpmで、37℃で、0.6~0.8のOD600まで増殖させ、次いで、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.5mMの最終濃度まで添加し、増殖温度を16℃に変更した。大腸菌細胞を、4℃で15分間、4000gで遠心分離することにより、16時間のIPTG誘導後に収集した。生じたペレットを、100mM Tris-HCl、pH7.4、100mM NaOH、10%グリセロール(v/v)の5mLに再懸濁し、氷上で2分間超音波処理した。混合物を4℃で20分間、4000gで遠心分離した。上清中の組換えタンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってClonetech社のHis60 Ni Superflow樹脂で精製した。組換えタンパク質の精製をSDS-PAGEによって確認した(図5)。
FfLSDの活性を、2種類の基質の4,4’-ジヒドロキシ-3,3’-ジメトキシスチルベン及びイソオイゲノールそれぞれによって決定した。4,4’-ジヒドロキシ-3,3’-ジメトキシスチルベンに対する活性を測定するために、適切な量の酵素溶液を含む50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)2.5ml中で、活性を30℃でアッセイした。10μLのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した基質を200μMの最終濃度まで添加することによって、酵素反応を開始した。反応生成物のバニリンをHPLC分析で検出した。
FfLSD-W3110及びFfLSD-W対照の大腸菌W3110株を、種培養物として一晩37℃で3mlのLB中50μg/Lのアンピシリンを有するLB培地でそれぞれ増殖させた。0.2mLの種培養物を、125mLの振盪フラスコに5g/Lの酵母エキス及び50μg/Lのアンピシリンを含む20mLのM9培地に接種した。細胞を30℃で6時間、250rpmの振盪速度で、シェーカー内で増殖させ、次いで、400μlの20%イソオイゲノール(ジメチルスルホキシド(DMSO)中のv/v)をフラスコに添加した。初回添加の12時間及び24時間後に、200μlの20%イソオイゲノール(DMSO中のv/v)を培養物にさらに2回添加した。100μlの培養混合物を、それぞれ示した時間間隔でフラスコから収集し、ボルテックスによって900μlのメタノールとよく混合し、次いで、20,000gで15分間遠心分離した。50μLの生じた上清を、HPLC分析用のHPLC試料バイアルに入れた。実験は三重に行った。
基質として天然イソオイゲノールを用いて発酵槽中で天然バニリンを生成するために、FfLSD-W3110株を使用する発酵プロセスを開発した。具体的には、1mLのFfLSD-W3110のグリセロールストックを、500mLフラスコ中の100mLの種培養用の培地(5g/Lの酵母抽出物、10g/Lのトリプトン、10g/LのNaCl、及び50mg/Lのアンピシリンを有するルリア・ベルタニ培地)に接種した。接種菌液をシェーカー中で、37℃で200rpmの振盪速度で8時間培養し、次いで、5リットル発酵槽中のルリア・ベルタニ培地+10g/Lの初期グルコース、50mg/Lのアンピシリンの3リットルの発酵培地に移した。
配列番号1:FfLSDの核酸配列
ATGAGCGCACCGGAAGAACATCATGGTCTGAAAAGCAAATGGCCTCAGGCATTTGATCTGGCAGGTAGCAATAGCCCGTGTCGTATTGAAGGTGAAATTGGTGATCTGGTTGTTCTGGGTGAAATTCCGCCTGCAATTGATGGCACCTTTTATCGTGTTATGTGTGATCCGTTTGTTCCGCCTCATCCGGATAATGTTCCGCTGGATGGTGATGGTCATGTTAGCGCATTTCGTATCTATAATGGTCGCGTGGACATGAAAATCAAATATGTTGAAACCGAGCGCTACAAACTGGAACGTAAAGCAGGTAAAGCACTGTTTGGTCTGTATCGTAATCCGTTTACACATCATCCGTGTGTTCGTGCAGCAGTTGATAGCACCGCAAATACCAATATGGTTTATTGGGCAGATCGTCTGCTGGCACTGAAAGAAAGCGCACTGCCGTATGAAATGCATCCTGATACACTGGAAACCCTGTGTTATGATCCTTTTGGTGGTCAGGTTAAAGCAAAAGCATTTACCGCACATCCGAAAATCGATCCGTTTAGTGATGAACTGGTTGTGTATGGTTATGAAGCAAAAGGTCTGGCAACCCGTGATATTGTGATTTATAGCCTGGATAAAAACGGCATCAAACACGATGAACAGTGGATTGAAAGCCCGTGGTGTGCACCGATTCATGATTGTGTTATTACCCCGAACTTTATCGTTCTGATTCTGTGGCCGTTTGAAGCAAGCGTTGAACGTATGAAAGCCGGTAAACAGCATTGGGCATGGGATTATAGTCTGCCTGCAACCTTTATTGTTGTTCCGCGTCGTAAAACCAGCAAAATTCCGGCAAGCTGGAAACAGGGTGAACATCGTGTGTATCATTGGAAAAACTGCATGAACATTCATGCCGGTAGCGCATGGGAAGAAGATAACGGTAAACTGTATCTGGAAACCAGCCGTGTTCATGATAATGCCTTTCCGTTTTTTCCTCCGGTTGATGGTCGTATGCCTGCACCGGATGCAAAAGCAGATTTTGTTCGTTGGGAAATTGATCTGAATGCACCGAGCGGCACCCAGATGGCAGATCCGGAAGTTATTCTGGATGTTCCGAGCGAATTTCCGCGTATTGATGAACGTTTTATGACCAAACGTAACGAGTACCTGTTTCTGAATGTGTTTATTCCGGAAACCAGTCAAGGTGGCACCAACATTTTTCATGGCCTGAATGGTCTGGCCATGCATAATCATAGCACCGGTGAAACCAAATGGTTTTTTGCCGGTAAAGATAGCCTGGTTCAAGAACCGATCTTTATTCCGCGTACCGCAGATGCTCCGGAAGGTGATGGTTGGGTTATTGCAATGCTGGAACGTCGTGTTGCAAATCGTAGCGAACTGGTGGTTCTGGATACCCGTGAATTTGAAAAACCGGTTGCATTTATTCAGCTGCCGATGCATCTGAAAGCACAGGTTCATGGTAATTGGATTGATAGTCGTACCCGTGCAAGCACCGAAGCAATTGTTCGTCAGATTGGTGAAGTTAAAGTTAGCGCACGTGGTGCACTGGAACCGCTGGCATAA
配列番号2:FfLSDのアミノ酸配列
MSAPEEHHGLKSKWPQAFDLAGSNSPCRIEGEIGDLVVLGEIPPAIDGTFYRVMCDPFVPPHPDNVPLDGDGHVSAFRIYNGRVDMKIKYVETERYKLERKAGKALFGLYRNPFTHHPCVRAAVDSTANTNMVYWADRLLALKESALPYEMHPDTLETLCYDPFGGQVKAKAFTAHPKIDPFSDELVVYGYEAKGLATRDIVIYSLDKNGIKHDEQWIESPWCAPIHDCVITPNFIVLILWPFEASVERMKAGKQHWAWDYSLPATFIVVPRRKTSKIPASWKQGEHRVYHWKNCMNIHAGSAWEEDNGKLYLETSRVHDNAFPFFPPVDGRMPAPDAKADFVRWEIDLNAPSGTQMADPEVILDVPSEFPRIDERFMTKRNEYLFLNVFIPETSQGGTNIFHGLNGLAMHNHSTGETKWFFAGKDSLVQEPIFIPRTADAPEGDGWVIAMLERRVANRSELVVLDTREFEKPVAFIQLPMHLKAQVHGNWIDSRTRASTEAIVRQIGEVKVSARGALEPLA
配列番号3:プラスミドpUVAPの核酸配列
GGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCATCGTTTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAACTATAAGAAGGAGATATACATATGGCGGATCCGAATTCGGCGCGCCAGATCTCAATTGGATATCGGCCGGCCGACGTCGGTACCGCGGCCGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGGTAACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGGACGAGCCTCAGACTCCAGCGTAACTGGACTGCAATCAACTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCATCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGTGATTACATTTGGGCCCTCATCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCATTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTCTGCTATGGAGGTCAGGTATGATTTAAATGGTCAGTATTGAGCGATATCTAGAGAATTCGTC
Claims (25)
- バニリンを生成するバイオ変換方法であって、
a.FfLSD遺伝子を混合物中で発現させることであって、発現させたFfLSD遺伝子が、前記混合物中に配列番号2に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し;
b.イソオイゲノールを前記混合物に供給すること;及び
c.イソオイゲノールをバニリンに変換すること
を含む、バイオ変換方法。 - 前記発現させたFfLSD遺伝子が、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記発現させたFfLSD遺伝子が、配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記発現させたFfLSD遺伝子が、配列番号2に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記FfLSD遺伝子を発現させる工程が、インビトロ翻訳によって前記遺伝子を発現すること;細胞系で前記遺伝子を発現させること;及び細菌又は酵母細胞内で前記遺伝子を発現させることからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質としてFfLSD遺伝子を発現させる工程から前記生成物を精製することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記バニリンを収集することをさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- イソオイゲノールからバニリンへの変換率が80%より高い、請求項7に記載の方法。
- イソオイゲノールからバニリンへの変換率が85%より高い、請求項7に記載の方法。
- イソオイゲノールからバニリンへの変換率が90%より高い、請求項7に記載の方法。
- 単離した組換え宿主細胞を用いてバニリンを生成する方法であって、
(i)単離した組換え宿主細胞を培地中で培養すること;(ii)イソオイゲノールを(i)の培地に添加し、イソオイゲノールからバニリンへの前記バイオ変換を開始すること;及び(iii)前記培地からバニリンを抽出することであって、前記単離した組換え宿主細胞が、リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換され、前記リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼが、配列番号2に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有すること、を含む方法。 - 前記リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼが、配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼが、配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼが、配列番号2に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- 消耗品を作製する方法であって、請求項1又は請求項11に記載の方法に従ってバニリンを生成する工程;前記バニリンを収集する工程;及び消耗品に前記バニリンを組み込む工程、を含む方法。
- 前記バニリンを前記消耗品と混合する工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記バニリンが、フレーバーノートを与えるのに十分な量で前記消耗品に組み込まれる、請求項15又は16に記載の方法。
- 前記消耗品が、香料品、食品、食品前駆体生成物、食品の生成に用いる添加剤、医薬組成物、ダイエットサプリメント、栄養補助食品、及び化粧品からなる群から選択される、請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バニリンがフレグランスノートを与えるのに十分な量で前記消耗品に組み込まれる、請求項15又は16に記載の方法。
- 前記消耗品が、香料品、化粧品、トイレタリー製品、及びハウスクリーニング製品からなる群から選択される、請求項15、16、19、及び20のいずれか一項に記載の方法。
- リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換し、単離した組換え宿主細胞であって、前記リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼが、配列番号2に対して少なくとも70%の同一性のアミノ酸配列を有する、単離した組換え宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号1の前記核酸配列と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項21に記載の単離した組換え宿主細胞。
- 配列番号3の前記単離した核酸配列を含むベクターをさらに含む、請求項21又は請求項22に記載の単離した組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、細菌、酵母、コレトトリカム属ではない糸状菌、シアノバクテリウム、藻類、及び植物細胞からなる群から選択される、請求項21~23のいずれか一項に記載の単離した組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、エシェリキア属;サルモネラ属;バチルス属;アシネトバクター属;ストレプトマイセス属;コリネバクテリウム属;メチロサイナス属;メチロモナス属;ロドコッカス属;シュードモナス属;ロドバクター属;シネコシスティス属;サッカロミセス属;ザイゴサッカロミセス属;クルイベロミセス属;カンジダ属;ハンゼヌラ属;デバリオマイセス属;ケカビ属;ピキア属;トルロプシス属;アスペルギルス属;アルスロボトリス属;ブレビバクテリウム属;マイクロバクテリウム属;アルスロバクター属;シトロバクター属;クレブシエラ属;パントエア属;及びクロストリジウム属からなる微生物群から選択される、請求項21~24のいずれか一項に記載の単離した組換え宿主細胞。
Applications Claiming Priority (3)
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