CN104928305B - 一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents
一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇及其应用。本发明来源于深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 03032(保藏编号为:CCTCC NO.M 2011258)的heronamides的生物合成基因簇,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2662‑82562位所示,包含20个基因;其中的P450氧化酶基因HerO,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第24299‑25546位的碱基序列所示,编码P450氧化酶HerO,其能催化heronamide G形成heronamide F,缺失P450氧化酶基因HerO的基因工程菌能用于制备heronamide G。本发明所提供的heromanides生物合成相关的所有基因和蛋白信息,有助于阐释二十元环大环内酰胺类化合物的生物合成机制,通过对上述生物合成基因的改造可获得heromanides的结构类似物,同时可用来寻找和挖掘自然界中可用于医药卫生及工农业的化合物或基因蛋白。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域,具体涉及一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇及其应用。
背景技术
Heronamides属于二十元环大环内酰胺类化合物,目前鉴定的6个天然产物都是从海洋放线菌中分离得到,最近的研究表明hernamides可以特异性的与细胞膜结合,诱导非正常细胞的形成。另外hernamides还具有独特的分子内成环结构和不饱和的侧链基团,其生物合成机制目前还没有研究清楚。
近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术,为改造heronamides的生产菌——深海放线菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032带来了新的机遇。在理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上,人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作,不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物,而且还可以提高天然产物的产量,或定向积累所需要的天然产物,为天然产物的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。迄今为止,有关大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇、P450氧化酶等生物催化制备大环内酰胺类化合物heronamides方面的研究,国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇。
本发明是以印度洋深海沉积物来源放线菌中二十元环大环内酰胺类化合物heronamides为目标分子,在筛选到生物合成基因簇的基础上,综合运用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学以及有机化学相结合的技术,阐述了heronamides的生物合成机制,为利用组合生物合成方法修饰改造heronamides类化合物提供依据,为药物筛选提供化合物实体。
本发明的heronamides生物合成基因簇来源于印度洋深海沉积物放线菌Streptomyces sp.SCSIO 03032,其特征在于,该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第2662-82562位的碱基序列所示,包含20个基因,具体为:
1)大环内酰胺骨架合成基因,即herA1、herA2、herB、herC、herD、herE、herF、herG共8个基因:
herA1位于基因簇核苷酸序列第65521-79383个碱基处,长度为13863位碱基,编码聚酮合成酶,4620个氨基酸;
herA2位于基因簇核苷酸序列第79416-82562个碱基处,长度为3147位碱基,编码聚酮合成酶,1048个氨基酸;
herB位于基因簇核苷酸序列第6446-17113个碱基处,长度为10668位碱基,编码聚酮合成酶,3555个氨基酸;
herC位于基因簇核苷酸序列第3771-5855个碱基处,长度为2085位碱基,编码聚酮合成酶,694个氨基酸;
herD位于基因簇核苷酸序列第25639-35769位碱基处,长度为10131个碱基,编码聚酮合成酶,3376个氨基酸;
herE位于基因簇核苷酸序列第53050-57999位碱基处,长度为4950个碱基,编码聚酮合成酶,1649个氨基酸;
herF位于基因簇核苷酸序列第42833-53002位碱基处,长度为10170个碱基,编码聚酮合成酶,3389个氨基酸;
herG位于基因簇核苷酸序列第36832-42825位碱基处,长度为5994个碱基,编码聚酮合成酶,1997个氨基酸;
2)负责β-氨基引入基因herI、herU:
herI位于基因簇核苷酸序列第2662-3774位碱基处,长度为1113个碱基,编码甘氨酸氧化酶,370个氨基酸;
herU位于基因簇核苷酸序列第5886-6449位碱基处,长度为564个碱基,编码硫酯酶,187个氨基酸;
3)负责氨基保护/去保护基因,即herJ、herK、herL、herP、herS共5个基因:
herJ位于基因簇核苷酸序列第17201-18799个碱基处,长度为1599个碱基,编码乙酰辅酶A连接酶,532个氨基酸;
herK位于基因簇核苷酸序列第19157-20098位碱基处,长度为942个碱基,编码酰基转移酶,313个氨基酸;
herL位于基因簇核苷酸序列第20468-21982位碱基处,长度为1515个碱基,编码腺苷化结构域,504个氨基酸;
herP位于基因簇核苷酸序列第35777-36712位碱基处,长度为936个碱基,编码氨基肽酶,311个氨基酸;
herS位于基因簇核苷酸序列第20113-20349位碱基处,长度为237个碱基,编码肽酰转运蛋白,78个氨基酸;
4)P450氧化酶基因HerO:
herO位于基因簇核苷酸序列第24299-25546位碱基处,长度为1248个碱基,编码P450单加氧酶,415个氨基酸;
5)调控和转运基因,即herH、herM、herN、herR共4个基因:
herH位于基因簇核苷酸序列第62052-64952位碱基处,长度为2901个碱基,编码转录调控因子,966个氨基酸;
herM位于基因簇核苷酸序列第21965-22561位碱基处,长度为597个碱基,编码转录调控因子,198个氨基酸;
herN位于基因簇核苷酸序列第22663-24225位碱基处,长度为1563个碱基,编码分泌蛋白,520个氨基酸;
herR位于基因簇核苷酸序列第58504-61344位碱基处,长度为2841个碱基,编码转录调控因子,946个氨基酸;
SEQ ID NO.1所示序列的第2662-82562位碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到,且第2662-82562位的碱基序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应DNA或DNA重组技术获得。本发明提供了构建至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第2662-82562位中DNA片段的重组DNA载体途径。
本发明还提供了heronamides生物合成基因被中断或其他基因改造的途径,至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1的第2662-82562位中的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可使用PCR探针法或Southern杂交等技术,从其他生物体重筛选获得heronamides生物合成基因簇同源基因。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可用于Streptomyces sp.SCSIO03032基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包括本发明中的部分序列,也包含Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组中邻近区域未克隆DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段,可以被体内外突变等修饰,包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆,可以通过合适表达系统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。
本发明提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽,可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性,或提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达及揭示它们在宿主代谢中的功能。
包含本发明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过DNA重组技术构建重组载体,以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活,进而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。
本发明提供了heronamides生物合成基因簇在制备heronamides及其类似物中的应用。
本发明所提供的P450氧化酶HerO为P450单加氧酶,可用于heronamides的结构中8位碳的羟基化,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第24299-25546位碱基所示。
本发明提供了P450氧化酶基因HerO缺失突变株中累积制备中间体heronamide G的应用,P450氧化酶HerO在体外生化法催化heronamide G制备heronamid F中的应用。
总之本发明所提供的包括heronamides合成相关的所有基因和蛋白信息,帮助人们理解二十元环大环内酰胺类天然产物的氨基形成、内部成环等关键机制,为进一步遗传改造提供材料和理论基础。本发明所提供的基因和蛋白质可以用来寻找和发现可用于医药、卫生或农业的heronamides类化合物、基因或蛋白。
本发明的链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC NO:M2011258,其公开于专利号为:ZL201210087537.7,发明名称为:链霉菌、抗肿瘤化合物Spiro-Indimycin A-D及其制备方法和应用的专利中。
附图说明
图1是Heronamide D-G化学结构式。
图2是Heronamides生物合成基因簇示意图。包括了重叠覆盖heronamides生物合成基因簇的阳性克隆子pCSG5-8F、pCSG14-11A、pCSG13-8A和pCSG11-10G。
图3是P450氧化酶herO基因缺失突变株的鉴定。(A)herO基因缺失示意图;(B)herO基因缺失PCR验证图,泳道M为DL2000 DNA Marker,泳道1模板为水,泳道2模板为Streptomyces sp.SCSIO 03032,泳道3模板为突变株HER001。
图4是P450氧化酶HerO功能鉴定。(A)HPLC检测野生菌株Streptomyces sp.SCSIO03032(i),基因herO突变株HER001(△herO)(ii)和P450氧化酶HerO体外生化反应(iii-vi);(B)P450氧化酶HerO催化反应示意图,其中图4A中的D、E、F和G分别代表化合物heronamide D、E、F和G。
图5是SDS-PAGE检测纯化的P450氧化酶HerO。泳道1为纯化的P450氧化酶HerO(HerO-RhFRED重组酶);泳道2为HerO表达菌株(E.coli BL21(DE3)/pCSG614)的上清;泳道3为HerO表达菌株(E.coli BL21(DE3)/pCSG614)的沉淀。
图6是P450氧化酶HerO的体外生化反应。-HerO表示未加入P450氧化酶HerO的heronamide G样品,(ii)-(iv)分别为加入P450氧化酶HerO后反应30min,60min,120min的检测结果,其反应体系是每100uL HerO酶催化体系反应体系中包含100uM的化合物heronamide G、2mM NAD(P)H、2mM纯化的HerO-RhFRED重组酶(P450氧化酶HerO),该反应于pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中28℃温育;(v)为heronamide F标准样品,其中F和G分别代表化合物heronamide D和F。
图7是13C标记的heronamide F的NMR谱。(A)喂养[1-13C]标记的醋酸钠;(B)喂养[1-13C]标记的丙酸钠;(C)喂养[2-13C,d3]标记的醋酸钠;(D)没有标记的对照谱。
图8是推测的heronamides生物合成途径。
图9是heronamide F非酶催化生成环化产物heronamide D和heronamide E。(A)推导的heronamide F非酶催化生成环化产物heronamide D和heronamide E的机制;(B)heronamide F在二甲基亚砜(DMSO)中常温搅拌11天后可自发生成heronamide D和heronamide E。
图10是乙酰化的heronamide G质谱图。
图11是乙酰化的heronamide G NMR谱图。(A)乙酰化的heronamide G的H谱;(B)乙酰化的heronamide G的C谱和DEPT 135谱;(C)乙酰化的heronamide G的HSQC谱;(D)乙酰化的heronamide G的COSY谱;(E)乙酰化的heronamide G的HMBC谱。
具体实施方式
以下是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
1.Heronamides的生物合成基因簇的克隆与功能预测
Heronamides为20元大环内酰胺类化合物,通过对菌株Streptomyces sp.SCSIO03032进行全基因组扫描和注释,分析到80kb的heronamides生物合成基因簇共包含20个开放阅读框(open reading frames,ORFs):包括8个I型聚酮合成酶基因herA1、herA2、herB、herC、herD、herE、herF、herG;2个负责β-氨基引入基因herI、herU;5个负责氨基保护/去保护基因herJ、herK、herL、herP、herS;一个P450氧化酶基因herO及4个调控和转运相关的基因herH、herM、herN、herR;详细基因注释如表1所示。
表1 Heronamides生物合成基因簇中基因功能预测
a氨基酸数目;b括号中包含了同源蛋白的GeneBank号,及相应的一致性/相似性(identity/similarity)。
依据分析到的基因簇序列设计特异引物(表2),从构建的菌株Streptomycessp.SCSIO 03032基因组文库中筛选出包含有目的片段的阳性克隆,阳性克隆子经末端测序及限制性内切酶酶切分析,最终确定4个cosmids,即pCSG5-8F、pCSG14-11A、pCSG13-8A和pCSG11-10G可重叠覆盖heronamides的生物合成基因簇(图2)。
表2 本发明中使用的引物
2.Heronamides的生物合成基因簇的确定与P450氧化酶HerO功能鉴定
为进一步确定所克隆的heronamides生物合成基因簇的正确性,构建了菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032的遗传操作系统,并选取其中的P450氧化酶基因herO进行中断缺失,构建双交换突变株,突变过程示意图和突变株PCR验证如图3所示。构建的突变株HER001丧失了产生heronamide D-F的能力(图4A,i和ii),而累积一个新的代谢中间产物,经发酵分离纯化,质谱、NMR解析确定了单体化合物的结构式,即在heronamide F的基础上8位碳的羟基缺失,该化合物命名为heronamide G(图1),基因herO的缺失结果进一步说明所鉴定的heronamides的生物合成基因簇的正确性,同时暗示P450氧化酶HerO的羟化功能。
为体外验证氧化酶HerO的功能,构建了herO与RhFRED基因融合表达载体pSCG614,并获得可溶性表达(图5),该融合载体的特点是可以自我提供P450酶反应所需要的辅因子。体外催化反应证实HerO可以在NAD(P)H存在的情况转化heronamide G为heronamide F(图4A,iii和iv),且产物heronamide F随着反应时间的延长而增加(图6),在不加入HerO或NAD(P)H的情况下没有产物产生(图4A,v和vi)。通过体内缺失和体外生化实验确证了P450氧化酶HerO的羟化功能,即催化heronamides的结构中8位碳的羟基化。
3.heronamides侧链基团双键位移现象的鉴定
仔细分析heronamides的侧链基团发现,其所含的Δ21,22和Δ23,24两个双键处在β,γ位(图1),不是通常PKS途径合成后所处的α,β位,为确定这种双键产生的机制,我们将[1-13C]标记的醋酸钠,[1-13C]标记的丙酸钠,[2-13C,d3]标记的醋酸钠分别喂养到菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032中,从中分离鉴定标记的化合物heronamide F。经NMR鉴定,在喂养[1-13C]标记的醋酸钠时C-1、C-3、C-7、C-9、C-11、C-15、C-17、C-19、C-21位的C信号明显增强;在喂养[1-13C]标记的丙酸钠时C-5、C-13、C-23位的C信号明显增强;在喂养[2-13C,d3]标记的醋酸钠时C-2、C-4、C-8、C-10、C-12、C-16、C-18、C-20、C-22位的C信号明显增强(图7),喂养的实验结果与PKS延伸单元分析的结果完全符合,即添加9分子的丙二酰辅酶A和3分子的甲基丙二酰辅酶A,同时说明Δ21,22和Δ23,24两个双键存在双键位移现象。
4.heronamides的生物合成机制推导
结合同位素标记实验和生物信息学分析,推导了heronamides的生物合成机制(图8),首先heronamides的聚酮链是两段式合成的,即PKS合成酶HerA1,HerA2和HerC负责侧链基团的合成(其中HerA1的两个DH结构域通过β,γ脱水生成Δ21,22和Δ23,24两个位移的双键,第三个DH结构由HerA2和HerC的部分氨基酸组成,完成正常的α,β脱水),生成中间体3,甘氨酸氧化酶HerU和硫酯酶HerI在中间体3上引入氨基生成5,随后侧链基团被HerJ、HerL和HerS转移到即PKS合成酶HerB继续延伸碳链,经HerB、HerD、HerE、HerF和HerG共同作用下合成碳链骨架,在延伸过程引入的氨基处于保护状态,直到碳链延伸结束,氨基被释放出来与羧基形成酰胺键,生成含有大环内酰胺骨架的heronamide G,heronamide G在P450羟化酶HerO的作用生成heronamide F,最后heronamide F经过非酶催化生成环化产物heronamide D和heronamide E。实验证明heronamide F在DMSO中常温搅拌11天后可自发生成heronamide D和heronamide E(图9),这与heronamides基因簇中没有鉴定到环化相关的酶是吻合的。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1:heronamides生产菌Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组DNA的提取
将新鲜Streptomyces sp.SCSIO 03032的菌丝体按照5%的接种量接种于50mL的TSB培养基(配方:大豆蛋白胨5g,胰蛋白胨15g,蔗糖100g,葡萄糖2.5g,K2HPO4 2.5g,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0)中,28-30℃,振荡培养约3-4d,4000rpm离心10min收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl 75mM,EDTA 25mM,Tris-Cl 20mM,pH=8.0)洗涤两次,向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶,涡旋均匀,37℃温浴3h,加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K,混匀,37℃温浴10min,加入至终浓度1-2%的SDS,混匀,放入55℃水浴约1h,期间颠倒数次。加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V/V=25:24:1),混合均匀,置于冰上冷却30min。12000rpm,4℃离心10min,用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中,用同样的方法反复处理3次,用等体积的氯仿洗涤两次,12000rpm,4℃离心10min。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管,加入1/10体积3mol/L NaAc(pH=5.2),混匀后再加入等体积的异丙醇,混匀后冰上放置,沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中,用70%乙醇洗涤两次,将液体倾出,在37℃下略微烘干,加5mLTE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)溶解,并加入3-5U的RNA酶,由此得到Streptomycessp.SCSIO 03032基因组DNA。
实施例2:heronamides生产菌Streptomyces sp.SCSIO 03032全基因组文库的构建
首先通过一系列的稀释实验确定限制性核酸内切酶Sau3AI的用量,在20μL体系中,含有17μL的基因组DNA,2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度的Sau3A I,其终止反应为4μL 0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组DNA片段,用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
用于构建文库的载体SuperCos I质粒先用限制性核酸内切酶XbaI从两个cos序列中间切开,然后进行去磷酸化处理,再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶BamHI切开,获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜,连接体系为10μL,含有1.25μg制备的基因组DNA和0.5μg处理后的SuperCos I质粒,1μL的10×Buffer,0.3U的连接酶。连接产物在65℃处理15min,使其失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μL)置于冰上,将包装混合物在指间迅速融化,小心吸取一半包装混合物(25μL)至一个新的离心管中,加入10μL热处理后的连接产物,其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀,30℃温浴90min,加入另外一半包装混合物(25μL),30℃温浴90min。加入500μL噬菌体稀释缓冲液(100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris-HCl,pH=8.3),再加入25μL氯仿,轻轻混匀,于4℃保存。
将冻存于-80℃的菌株E.coli LE392MP(Stratagene)涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天,挑取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4)37℃振荡培养过夜,包装反应当天,取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4),37℃,200rpm振荡至培养物OD600达到0.8-1时,4℃保存备用。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀,于37℃温浴15min,涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上,37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子,用无菌牙签点种于含合适抗生素的LB的96孔板上,37℃培养过夜,加入终浓度为20%的甘油,混合均匀,置于-80℃保存,由此得到Streptomyces sp.SCSIO 03032全基因组文库。
实施例3:从菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组文库中筛选覆盖heronamides生物合成基因簇的阳性克隆子
将菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组DNA送国家人类基因组南方研究中心进行全基因组扫描和注释,根据扫描和注释的结果,通过生物信息学分析,初步确定heronamides生物合成基因簇位于contig50-53,contig64,contig156,contig216上,设计特异性引物ctg51-F/R,ctg53-F/R,ctg64-F/R,ctg64-F1/R1,ctg216-F/R(表2)筛选Streptomyces sp.SCSIO 03032全基因组文库,获得的阳性克隆子通过限制性核酸内切酶EcoRI和BglII酶切及末端测序确定4个克隆子pCSG5-8F,pCSG14-11A,pCSG13-8A,pCSG11-10G可重叠覆盖heronamides生物合成基因簇(图2),contigs之间的缺口通过PCR或者亚克隆填充连接。
实施例4:heronamides生产菌Streptomyces sp.SCSIO 03032遗传操作系统的建立,以敲除P450氧化酶herO为例:
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株,根据获得的heronamides生物合成基因簇序列,设计herO基因的敲除引物herO-TarF/R(表2),随后将构建好的敲除质粒转入接合转移的供体菌中,筛选阳性突变株。具体步骤如下:(1)将cosmid质粒pCSG5-8F(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1-32833位碱基所示)转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG5-8F重组菌株,用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达,并将其制备为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒pIJ773,回收约1.4kb含有接合转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段,以此作为PCR模板,用引物herO-TarF/R(表2)通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物;50μL的PCR反应体系:高保真DNA聚合酶3U,10×Buffer 5μL,dNTPs 0.5mmol/L,DMSO 2.5μL,引物各0.5μmol/L,DNA模板约1ng,加水补至50μL。PCR反应条件为:预变性94℃5min;扩增循环为94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环;最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将回收后的1.4kb PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组,涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿泊拉霉素)上,37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆,使用验证引物herO-TestF/R(表2)验证,抽提经PCR验证的质粒,命名为pCSG762,该质粒中的herO基因的部分片段被接合转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG762转化到E.coli ET12567/pUZ8002中,构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG762重组菌株,作为接合转移的供体菌。
菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032在38#培养基(酵母粉4g,葡萄糖4g,麦芽提取粉5g,FeSO4·7H2O 1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0)平板中划线培养10天,长出的孢子用无菌棉签收集于含3%海盐的TSB培养基中(大豆蛋白胨5g,胰蛋白胨15g,蔗糖100g,葡萄糖2.5g,K2HPO4 2.5g,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0),涡旋振荡,分散孢子。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5mL含3%海盐的TSB培养基中,50℃热激10min,然后于28℃萌发4h,作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG762在50mL含50μg/mL卡那霉素,25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长4h至OD600值约为0.6时,4000rpm离心10min收集菌体,用LB清洗菌体3遍,悬浮于300μL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀,涂布于含有90mM MgSO4不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28℃培养18h,然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,其终浓度为15μg/mL阿泊拉霉素和20μg/mL甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28℃培养箱中,培养8d后观察。
当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的ISP4培养基平板上(可溶性淀粉10g,胰蛋白胨1g,酵母粉0.5g,K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 1g,NaCl 1g,(NH4)2SO4 2g,CaCO3 2g,海盐20g,FeSO4·7H2O 1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,加水定容至1L,pH 7.0),28℃培养3d后,抽取各个突变株的基因组DNA,利用检测引物herO-testF/R通过PCR检测克隆,如图3B所示,阳性结果表示获得herO敲除双交换突变菌株△herO,突变株命名为HER001。
实施例5:Heronamides及其中间体的生物发酵与检测
将菌株Streptomyces sp.SCSIO 03032或△herO突变株HER001在38#培养基平板上(酵母粉4g,葡萄糖4g,麦芽提取粉5g,FeSO4·7H2O 1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0)活化后,刮取适量孢子接种到250ml三角烧瓶含50mlModified-ISP3液体培养基中(可溶性淀粉10g,酵母粉4g,胰蛋白胨2g,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0),于28℃,200rpm,培养5d后,加入等体积丁酮,超声破碎细胞10min,静置分层,吸取上层丁酮萃取液,旋转蒸发仪蒸干。粗提物使用二甲基亚砜溶解,进行HPLC检测,分析条件为:菲罗门Luna C18(5μm,150×4.6mm)反相柱,流动相A相为10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸),流动相B相为90%乙腈水溶液;流速为1mL/min。检测波长为238nm和254nm。HPLC程序:0-20min,5%B to 100%B(线性梯度),20-24min 100%B,24-25min,100%B to5%B,2-30min 5%B。
结果如图4所示,从图4可以看出,△herO突变株HER001丧失了产生heronamide D-F的能力(图4A,i和ii),而累积一个新的代谢中间产物,经发酵分离纯化,质谱、NMR解析确定了单体化合物的结构式(图1),即在heronamide F的基础上8位碳的羟基缺失,该化合物命名为heronamide G,基因herO的缺失结果进一步说明所鉴定的heronamides的生物合成基因簇的正确性,同时暗示氧化酶HerO的羟化功能。
实施例6:Heronamides及其中间体的分离鉴定
从38#培养基(酵母粉4g,葡萄糖4g,麦芽提取粉5g,FeSO4·7H2O 1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0)平板上刮取适量△herO突变株HER001的孢子于Modified-A1BFe+C液体培养基中(可溶性淀粉10g,酵母粉4g,胰蛋白胨2g,海盐30g,加水定容至1L,pH 7.0),于28℃,200rpm摇床中培养3-4天,待其菌体生长良好作为种子;以10%(v/v)的接种量将种子接入Modified-ISP3培养基中(燕麦粉20g,海盐30g,FeSO4·7H2O1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,加水定容至1L,pH 7.0),于28℃,200rpm摇床中培养5天左右,取样检测。
将发酵液以4000rpm离心10min,分离发酵液上清与菌体沉淀。菌体用丙酮浸泡,超声处理后离心,取液体用旋转蒸发仪浓缩,处理三次后将所得水相并入发酵液上清。将上清用丁酮萃取三次,旋转蒸发丁酮萃取液得到粗浸膏(3g)。粗浸膏首先使用正向硅胶(300-400目,150g)梯度洗脱(CHCl3/MeOH,体积比100:0→0:100)得到4个组分Fr.1-Fr.4,其中组分Fr.4(CHCl3/MeOH体积比90:10时洗脱下来的馏分)经过反向C18柱(40×2.5cm ID)中压线性洗脱(H2O/MeOH,体积分数0-100%)得到4个亚组份Fr.4-1至Fr.4-4,亚组份Fr.4-4(H2O/MeOH,体积比20/80洗脱下来的馏分)经过反向高压制备分离得到化合物HeronamideG[制备条件:Phenomenex ODS column(250mm×10.0mm i.d.,5μm;Phenomenex,USA),用水/乙腈体系体积比20:80等度洗脱,保留时间为16.2分钟时得到Heronamide G]。为了提高化合物Heronamide G的可溶性获得更好的NMR谱,8mg的Heronamide G溶于1mL的吡啶和1mL乙酸酐中过夜搅拌,反应结束后加入1mL的乙醇终止反应,减压蒸干,蒸干后的浸膏通过薄层层析制备获得乙酰化的Heronamide G(5mg),随后乙酰化的单体化合物Heronamide G通过MS(图10)及NMR(图11)确定其结构。
实施例7:P450氧化酶HerO体外酶催化体系的构建
以Streptomyces sp.SCSIO 03032的基因组DNA为模板,以表2的herO-EF和herO-ER作为PCR引物,PCR扩增到herO基因(其核苷酸序列是如SEQ ID NO.1的第24299-25546位碱基所示序列的反向互补序列,长度为1248个碱基,编码P450单加氧酶,415个氨基酸),经测序验证后,将herO基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28b-RhFRED。将含herO基因的表达载体pET28b-RhFRED转化至E.coli BL21(DE3)中,得到HerO表达菌株(E.coli BL21(DE3)/pCSG614),诱导表达后,收集细胞,超声破碎获取粗酶液;镍柱亲和层析纯化、SDS-PAGE和Bradford法蛋白浓度测定等,最终获得高纯度HerO-RhFRED重组酶(图5,泳道1为纯化的HerO重组蛋白(HerO-RhFRED重组酶);泳道2为HerO表达菌株(E.coli BL21(DE3)/pCSG614)的上清;泳道3为HerO表达菌株(E.coli BL21(DE3)/pCSG614)的沉淀)。
P450氧化酶HerO体外酶催化体系
组1:每100ul HerO酶催化体系反应体系中包含100uM的化合物heronamide G、2mMNAD(P)H、2mM纯化的HerO-RhFRED重组酶,该反应于pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中28℃,成三个处理,分别温育30、60、120min。。
组2:每100ul HerO酶催化体系反应体系中包含100uM的化合物heronamide G、2mMNAD(P)H,该反应于pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中28℃温育120min。
组3:每100ul HerO酶催化体系反应体系中包含100uM的化合物heronamide G、2mM纯化的HerO-RhFRED重组酶,该反应于pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中28℃温育120min。
结果如图4的iii)-vi)所示,从图4可以看出,体外催化反应证实P450酶HerO(HerO-RhFRED重组酶)可以在NAD(P)H存在的情况转化heronamide G至heronamide F(图4A,iii和iv),且产物随着时间的延长而增加(图6),在不加入P450酶HerO或NAD(P)H的情况下没有产物产生(图4A,v和vi)。P450酶HerO是将heronamides的结构中8位碳羟基化。
Claims (5)
1.一种P450氧化酶基因HerO,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第24299-25546位所示碱基序列的反向互补序列。
2.一种权利要求1所述的P450氧化酶基因HerO编码的P450氧化酶HerO。
3.权利要求2所述的P450氧化酶HerO在催化式1所示的化合物Heronamide G形成式2所示的化合物Heronamide F中的应用
4.一种缺失权利要求1所述的P450氧化酶基因HerO的基因工程菌。
5.权利要求4所述的基因工程菌在制备式1所示的化合物Heronamide G中的应用
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