CN102174531B - 谷田霉素的生物合成基因簇 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060产生的谷田霉素的生物合成基因簇。整个基因簇共包含31个基因:8个骨架合成相关基因;2个甲基转移酶基因;10个氧化还原酶及辅基蛋白基因;3个未知功能酶基因;3个调节基因;5个抗性基因。通过对上述生物合成基因簇的遗传操作可阻断谷田霉素的合成,一个氧化还原酶基因ytkT的替换可以产生中间体化合物,两个基因ytkJ和ytkK表达的蛋白经分离纯化可以得到可溶蛋白。本发明所提供的基因也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。
Description
技术领域:
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域,具体涉及抗真菌、抗肿瘤抗生素谷田霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
技术背景:
谷田霉素(Yatakemycin)是日本Toyama大学的科学家Igarashi等于2003年在进行新型抗真菌化合物筛选时由链霉菌(Streptomyces sp.TP-A0365)发酵培养基中分离出的微生物次级代谢产物[J Antibiot(2003)56,107-113]。经NMR和CID-MS/MS实验最初分析结构证明其属于一类新型的抗生素家族。此家族中的化合物被认为是DNA烷基化试剂,包括CC-1065,多卡霉素A(duocarmycinA),多卡霉素SA(duocarmycinSA),他们最明显的特征是吡咯吲哚环上的环丙基结构。2004年美国Scripps研究所的Dale L.Boger小组首次发表了对(+)-谷田霉素的全合成工作并确定了其结构[J Am Chem Soc(2004)126,8396-8398]。
实验显示,谷田霉素可以抑制致病真菌如:曲霉,烟曲霉,黄曲霉,白色念珠球菌,新型隐球菌的生长。其最小抑菌浓度(MIC)值为0.01~0.03μg/mL,是两性霉素(amphotericinB/MIC:0.1~0.5μg/mL)和伊曲康唑(itraconazole/MIC:0.03~0.2μg/mL)的10~100倍。另外,它表现出对肿瘤细胞极强的毒性,比另一种烷基化抗肿瘤药物丝裂霉素对肿瘤细胞的毒性高1000倍[J Am Chem Soc(2003)125,10971-10976]。最近的研究表明该家族化合物不仅可以对游离DNA双螺旋发生烷基化修饰,还可以高效地对核小体颗粒(nucleosome core particles)中的DNA进行烷基化修饰,甚至是几乎全部组蛋白包围的DNA,因此这类化合物为研究真核细胞染色体中DNA-组蛋白的动力学识别及DNA损伤导致的生物效应提供了有力的工具[Nature Chem Biol(2006)2,64-66]。
谷田霉素与DNA烷基化作用的机制是:腺嘌呤中3位的N亲核进攻谷田霉素环丙基上取代最少的碳原子,形成对DNA的烷基化物。其对DNA的烷基化位点都是腺嘌呤,没有检测到鸟嘌呤的参与。经试验发现DNA链中所有N-3位被烷基化的腺嘌呤旁侧碱基都是A或T[J Am Chem Soc(2006)128,7136-7137;JAm ChemSoc(2006)128,15683-15696]。谷田霉素的抗真菌和细胞毒性活性来自于其独特的化学结构。其骨架部分是由一个吲哚与两个吡咯吲哚环通过两个酰胺键连接构成,与家族系列化合物相比,除共有的中间吡咯吲哚环上的环丙基外,其分子左侧吡咯吲哚环上独特的硫酯键也是谷田霉素引人关注的重点。由于结构上的特点,谷田霉素及其家族化合物被形象的称作“三明治”结构系列化合物。
我们以微生物来源的谷田霉素为目标分子,从克隆其在链霉菌Streptomycessp.TP-A2060生物合成基因簇出发,采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成,通过体内基因操作的方法初步对其生物合成机制的研究揭示包括环丙基在内的独特化学结构形成的酶学机理,在此基础上运用代谢工程的原理,合理修饰谷田霉素的生物合成途径,探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。
发明内容:
本发明涉及一种由链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060产生的具有抗真菌、抗肿瘤活性的DNA烷基化抗生素一谷田霉素的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。
本发明中整个基因簇共包含31个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1),其中8个基因(ytkD,ytkF,ytkG,ytkJ,ytkL,ytkN,ytkQ,ytkV)用于编码骨架合成相关蛋白;2个基因(ytkU,ytkW)用于编码甲基转移酶;10个基因(ytkA,ytkB,ytkC,ytkH,ytkI,ytkK,ytkM,ytkO,ytkS,ytkT)用于编码氧化还原酶及辅因子;3个基因(ytkE,ytkP,ytkX)用于编码未知功能酶;3个基因(ytkR1,ytkR7,ytkR8)用于编码调节蛋白;5个基因(ytkR2,ytkR3,ytkR4,ytkR5,ytkR6)用于编码抗性相关蛋白。
本发明还提供了一个编码黄嘌呤脱氢酶含钼蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列2中,命名为ytkA,其基因的核苷酸序列位于序列1中第4567-6774个碱基处。
本发明还提供了一个编码含钼脱氢酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列3中,命名为ytkB,其基因的核苷酸序列位于序列1中第6771-7760个碱基处。
本发明还提供了一个编码氧化还原酶铁硫簇结合亚基的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列4中,命名为ytkC,其基因的核苷酸序列位于序列1中第7747-8265个碱基处。
本发明还提供了一个编码酰基转移酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列5中,命名为ytkD,其基因的核苷酸序列位于序列1中第8468-9049个碱基处。
本发明还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列6中,命名为ytkE,其基因的核苷酸序列位于序列1中第9238-10188个碱基处。
本发明还提供了一个编码乙酰辅酶A(CoA)转移酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列7中,命名为ytkF,其基因的核苷酸序列位于序列1中第10525-12384个碱基处。
本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列8中,命名为ytkR1,其基因的核苷酸序列位于序列1中第12457-13095个碱基处。
本发明还提供了一个编码腺嘌呤单磷酸(AMP)-连接酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列9中,命名为ytkG,其基因的核苷酸序列位于序列1中第13055-14686个碱基处。
本发明还提供了一个编码DNA烷基化修复蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列10中,命名为ytkR2,其基因的核苷酸序列位于序列1中第14719-15474个碱基处。
本发明还提供了一个编码依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的黄素单核苷酸(FMN)还原酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列11中,命名为ytkH,其基因的核苷酸序列位于序列1中第15497-16093个碱基处。
本发明还提供了一个编码铁氧化还原蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列12中,命名为ytkI,其基因的核苷酸序列位于序列1中第16093-16320个碱基处。
本发明还提供了一个编码水解酶/磷酸转移酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列13中,命名为ytkR3,其基因的核苷酸序列位于序列1中第16320-16961个碱基处。
本发明还提供了一个编码脱氧核糖核酸酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列14中,命名为ytkR4,其基因的核苷酸序列位于序列1中第16969-17865个碱基处。
本发明还提供了一个编码核酸内切酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列15中,命名为ytkR5,其基因的核苷酸序列位于序列1中第17846-18682个碱基处。
本发明还提供了一个编码色氨酸合成酶-β亚基的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列16中,命名为ytkJ,其基因的核苷酸序列位于序列1中第18769-20151个碱基处。
本发明还提供了一个编码钼蛋白氧化还原酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列17中,命名为ytkK,其基因的核苷酸序列位于序列1中第20412-22505个碱基处。
本发明还提供了一个编码L-酪氨酸脱羧酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列18中,命名为ytkL,其基因的核苷酸序列位于序列1中第22505-23842个碱基处。
本发明还提供了一个编码氧化还原酶/脱氢酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列19中,命名为ytkM,其基因的核苷酸序列位于序列1中第23839-24963个碱基处。
本发明还提供了一个编码辅酶A(CoA)连接酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列20中,命名为ytkN,其基因的核苷酸序列位于序列1中第24960-26183个碱基处。
本发明还提供了一个编码二氢吡咯-5-羧酸还原酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列21中,命名为ytkO,其基因的核苷酸序列位于序列1中第26180-27133个碱基处。
本发明还提供了一个编码3-脱氢奎尼酸合酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列22中,命名为ytkP,其基因的核苷酸序列位于序列1中第27189-28295个碱基处。
本发明还提供了一个编码辅酶A(CoA)连接酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列23中,命名为ytkQ,其基因的核苷酸序列位于序列1中第28302-29681个碱基处。
本发明还提供了一个编码钼蛋白氧化还原酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列24中,命名为ytkS,其基因的核苷酸序列位于序列1中第29678-30853个碱基处。
本发明还提供了一个编码独立于氧的粪卟啉原III-氧化酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列25中,命名为ytkT,其基因的核苷酸序列位于序列1中第30926-32446个碱基处。
本发明还提供了一个编码甲基转移酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列26中,命名为ytkU,其基因的核苷酸序列位于序列1中第32439-33185个碱基处。
本发明还提供了一个编码睛基水解酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列27中,命名为ytkV,其基因的核苷酸序列位于序列1中第33286-34239个碱基处。
本发明还提供了一个编码硫甲基转移酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列28中,命名为ytkW,其基因的核苷酸序列位于序列1中第34258-34887个碱基处。
本发明还提供了一个编码抗性蛋白的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列29中,命名为ytkR6,其基因的核苷酸序列位于序列1中第34884-37235个碱基处。
本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列30中,命名为ytkR7,其基因的核苷酸序列位于序列1中第37392-37997个碱基处。
本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列31中,命名为ytkR8,其基因的核苷酸序列位于序列1中第37972-38889个碱基处。
本发明还提供了一个编码酯酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列32中,命名为ytkX,其基因的核苷酸序列位于序列1中第39274-40371个碱基处。
序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA质粒的途径。
本发明还提供了产生谷田霉素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径,至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以核酸杂交等方法从其他生物体中得到与谷田霉素生物合成基因相似的基因。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列,也包含有Streptomyces sp.TP-A2060基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失,聚合酶链式反应,错误介导聚合酶链式反应,位点特异性突变,不同序列的重新连接,序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling),或通过紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或得到其他致力于得到的产物。这些外源宿主包括链霉菌、小单孢菌、糖多饱菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性,或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白YtkJ,YtkK等可以催化合成吡咯吲哚,吲哚骨架,进一步催化合成抗生素谷田霉素。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断谷田霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的谷田霉素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高谷田霉素或其衍生物的产量。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来克隆其家族类化合物的生物合成基因簇。
本发明所提供的谷田霉素骨架的后修饰基因可用于通过遗传修饰得到谷田霉素类似物。
本发明所提供的谷田霉素ytkT基因中断突变株发酵产物分离得到谷田霉素类似物Yatakemycin-morfT。
本发明所提供的谷田霉素ytkJ基因和ytkK基因可在大肠杆菌中表达得到相应可溶性蛋白质。
总之,本发明所提供的包含谷田霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解谷田霉素类天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
附图说明:
图1:谷田霉素(Yatakemycin)的化学结构。
图2:谷田霉素生物合成基因簇的基因结构。
图3:谷田霉素在链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060中的生物合成途径。
图4:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株发酵产物的液相色谱-质谱(LC-MS)分析。
图5:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株及谷田霉素生物合成全部基因簇置换突变菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析
(A)野生型菌株;(B)谷田霉素生物合成基因簇置换突变体(m-HW-Y-qiaochu)。
图6:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株及ytkE基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析
(A)野生型菌株;(B)ytkE基因置换突变体(ΔytkE)。
图7:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株及ytkJ和ytkL基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析
(A)野生型菌株;(B)ytkJ基因置换突变体(ΔytkJ);(C)ytkL基因置换突变体(ΔytkL)。
图8:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株及ytkU和ytkW基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析
(A)野生型菌株;(B)ytkU基因置换突变体(ΔytkU);(C)ytkW基因置换突变体(ΔytkW)。
图9:Streptomyces sp.TP-A2060野生型菌株及ytkT基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析
(A)野生型菌株;(B)ytkT基因置换突变体(ΔytkT)。
图10:Yatakemycin-morfT的分子结构和核磁数据。
图11:(A)蛋白质YtkJ的催化途径(B)YtkJ,YtkK蛋白电泳图。
图12:Yatakemycin-morfT对酵母菌Y-190的生物活性测试
符号说明:
图1Yatakemycin:谷田霉素。
图3YtkA/B/C:钼蛋白氧化酶;YtkJ:色氨酸合成酶;YtkM:氧化还原酶;YtkO:脱氢酶;YtkH:还原酶;YtkQorN:辅酶A连接酶;YtkU:甲基转移酶;YtkI:铁氧还原蛋白;YtkL:脱羧酶;YtkG:腺嘌呤单磷酸连接酶;YtkT:氧化还原酶;YtkK:氧化还原酶;YtkW:甲基转移酶;YtkF:辅酶A转移酶;YtkX:酯酶。
图4Yatakemycin:谷田霉素。
图5WT:野生型;m-HW-Y-qiaochu:谷田霉素基因敲除突变株。
图6WT:野生型;ΔytkE:ytkE基因置换突变株。
图7WT:野生型;ΔytkJ:ytkJ基因置换突变株;ΔytkL:ytkL基因置换突变株。
图8WT:野生型;ΔytkU:ytkU基因置换突变株;ΔytkW:ytkW基因置换突变株。
图9WT:野生型;ΔytkT:ytkT基因置换突变株。
图10Yatakemycin-morfT:突变株ΔytkT中间产物;1H(500MHz)and13C(125MHz)NMR data for Yatakemycin-morfT in pyridine-d5 a:化合物Yatakemycin-morfT在氘带吡啶中500兆赫兹氢谱和125兆赫兹碳谱数据。
图11YtkJ:基因ytkJ表达的蛋白质;YtkK:基因ytkK表达的蛋白质泳道1:YtkJ纯化到的蛋白;泳道2:YtkJ包涵体蛋白;泳道3:YtkJ可溶性蛋白;泳道4:表达YtkJ(49.5kD)的全蛋白;泳道6:YtkK(76kD)的全蛋白;泳道7:YtkK可溶性蛋白;泳道8:YtkK包涵体蛋白;泳道9:YtkK纯化后的蛋白
图12A:50μl甲醇;B:谷田霉素50μl(溶于甲醇中浓度为10nM);C:Yatakemycin-morfT50μl(溶于甲醇中浓度为10nM)
具体实施方式:
以下结合图1-图12对本发明进一步详细说明。
1.谷田霉素的生物合成基因簇的克隆,序列分析及功能分析:
本发明人通过全基因组测序的方法得到了谷田霉素(图1)产生菌(Streptomyces sp.TP-A2060)的基因组序列8Mb,通过基因组搜索以及BLAST比对、功能分析的方法定位了目标基因簇并用体内同源重组的方法将其敲除得到突变株m-HW-Y-qiaochu,然后将其发酵,发酵产物HPLC(高效液相色谱法)检测谷田霉素的产生被中断(图5),从体内证明此基因簇为谷田霉素的生物合成基因簇。将得到的基因组序列信息与数据库比对分析,初步确定谷田霉素的生物合成基因簇为35,805bp,其中31个开放阅读框(open reading frame,ORF)与谷田霉素的生物合成相关。各基因功能的分析结果见表1
表1谷田霉素生物合成基因簇功能分析
2.谷田霉素的生物合成基因簇边界的确定:
根据基因编码的蛋白的功能分析,通过与已有的同类化合物的生物合成基因簇的对比,谷田霉素的生物合成基因簇被确定为从基因ytkA到ytkX(图2),涵盖染色体35.8kb的区域,包含31个开放读码框。整个谷田霉素的生物合成基因簇共31个基因,其中8个基因(ytkD,ytkF,ytkG,ytkJ,ytkL,ytkN,ytkQ,ytkV)用于编码骨架合成相关蛋白;2个基因(ytkU,ytkW)用于编码甲基转移酶;10个基因(ytkA,ytkB,ytkC,ytkH,ytkI,ytkK,ytkM,ytkO,ytkS,ytkT)用于编码氧化还原合成酶及辅因子;3个基因(ytkE,ytkP,ytkX)用于编码未知功能酶;3个基因(ytkR1,ytkR7,ytkR8)用于编码调节蛋白;5个基因(ytkR2,ytkR3,ytkR4,ytkR5,ytkR6)用于编码抗性相关蛋白。
3.谷田霉素骨架合成及后修饰反应:
谷田霉素生物合成基因簇中有8个基因(ytkD,ytkF,ytkG,ytkJ,ytkL,ytkN,ytkQ,ytkV)它们编码的酶与谷田霉素骨架合成相关。整个反应以酪氨酸为前体由上述8个基因编码酶催化生成谷田霉素骨架部分,再经由甲基化基因(ytkU,ytkW),氧化还原合成酶及辅因子基因(ytkA,ytkB,ytkC,ytkH,ytkI,ytkK,ytkM,ytkO,ytkS,ytkT)等基因编码酶作用最终生成谷田霉素(图3)。
4.谷田霉素ytkT基因置换突变株ΔytkT发酵产物中间体的分离鉴定:
orf-ytkT编码的是一类与独立于氧的粪卟啉原III-氧化酶同源性比较高的蛋白,我们推测其在谷田霉素的生物合成过程中与重要部分环丙基的形成有关,对其构建的基因置换突变株ΔytkT发酵产物HPLC检测显示谷田霉素的产生被中断,有一个新的吸收峰出现(图9)。通过对此吸收峰进行分离并采用质谱,核磁的方法进行了结构鉴定,得到分子量为665的化合物并将其命名为Yatakemycin-morfT(图10)。
5.谷田霉素生物合成基因簇的应用——通过对谷田霉素生物合成基因簇中的基因进行基因敲除可以阻断谷田霉素的合成
在克隆、分析了完整的谷田霉素生物合成基因簇,研究了各基因编码蛋白的功能的基础上,本发明对谷田霉素生物合成基因簇中的若干基因进行了敲除。利用同源双交换的方法对未知功能基因ytkE,色氨酸合成酶基因ytkJ,L-酪氨酸合成酶基因ytkL,甲基转移酶基因ytkU,ytkW进行了敲除实验,结果显示相关基因敲除突变株均不再产生谷田霉素化合物(图4-8)。对氧化还原酶基因ytkT的基因敲除突变株除了不产生谷田霉素还有一个新的吸收峰的出现,对ytkT的基因回补实验恢复了谷田霉素的合成。上述基因敲除及回补实验证实了该基因簇与谷田霉素在Streptomyces sp.TP-A2060中的合成相关,通过对该基因簇的遗传操作可以阻断谷田霉素的合成,同时也为进一步对生物合成基因簇进行遗传操作而获得谷田霉素结构类似物提供了技术基础。
6.谷田霉素生物合成基因簇中的基因ytkJ编码蛋白质YtkkJ,ytkK编码蛋白质YtkK的表达和功能分析
YtkJ经过同源序列比对,发现与色氨酸合成酶的β亚基同源,色氨酸合成酶的β亚基负责吲哚和丝氨酸的缩合。因此,根据谷田霉素的分子结构和喂养实验推测YtkJ可能负责酪氨酸(或者多巴)与丝氨酸的缩合。我们将ytkJ克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,得到了可溶性的蛋白(图11)。
YtkK同源序列比对的结果表明它是依赖于钼蝶呤的氧化还原蛋白,可能需要厌氧的环境。单基因缺失的突变株发酵产生了中间产物,我们将这个中间产物分离纯化后鉴定结构,发现它没有谷田霉素中的环丙基三元环结构,所以推测它和谷田霉素中的活性单位三元环的行成有关,由于之前没有类似的报道,这可能是三元环形成的新的机制。
7.Yatakemycin-morfT与谷田霉素的生物活性测试:
谷田霉素的生物毒性很高,在谷田霉素ytkT基因中断突变株发酵产物中分离得到的谷田霉素类似物Yatakemycin-morfT,将其与谷田霉素同时对酵母菌Y-190进行生物活性测试,结果显示Yatakemycin-morfT的生物毒性大幅度下降(图12)。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1
谷田霉素产生菌链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060总DNA的提取:
将100μL 1x108 Streptomyces sp.TP-A2060孢子悬液接种到3mL ISP-2(酵母提取物0.4%,麦芽提取物1.0%,葡萄糖0.4%,pH 7.2)液体培养基中,30℃,230rpm培养约24小时后达到对数生长期后期,取2mL接种到50mL ISP-2中(含25mM氯化镁),30℃,250rpm培养约23hr后达到稳定生长期前期,呈乳黄色浑浊,将菌液4℃,3500rpm,离心15min收集菌丝,用裂解液洗涤,收集淡乳黄色菌丝0.5mL。向1mL菌丝中加入10mL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管,涡旋至均一,37℃水浴15min。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL,用裂解液新鲜配制),1mL 10%十二烷基硫酸钠,混匀后迅速放入70℃水浴15min,呈澄清。置冰上冷却,加入2.5mL 5M醋酸钾(KAc),冰上冷却15min。加入10mL饱和酚,充分混匀,加入10mL氯仿,混匀,12000rpm,4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管,加等量的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,12000rpm,4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管,加2倍的无水乙醇,混匀,有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管,加5mL70%乙醇洗涤,将液体倾出,用枪吸净,加5mL TE溶解,加核糖核酸酶A(RNaseA)使终浓度为50μg/mL,37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次,氯仿-异戊醇抽提两次,向水相中加入0.1体积的3M醋酸钠,2体积的无水乙醇,轻轻的混合充分,有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL 70%乙醇用于洗涤),将液体吸出,再加1mL无水乙醇洗涤,吸出乙醇,超净台中吹干,溶于适当体积的TE(pH 8.0)中。
实施例2
谷田霉素产生菌链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060遗传转移系统的建立:
培养含有适当质粒的大肠杆菌(E.coli)S17-1至OD6000.4-0.6,20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集,用等体积的LB洗两次,重悬于2mLLB中,作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于一80℃的Streptomyces sp.TP-A2060的20%甘油孢子悬液500μL,用等体积的TES(2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)缓冲液(50mM TES Na,pH 8.0)洗两次,重悬于等体积的TES缓冲液,50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基,37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM氯化酶的IWL-4平板培养基(甘露糖醇2.0%,黄豆粉2.0%,琼脂粉2.0%)上,30℃温浴20hr后,采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌,在每一平板的表面覆盖1mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。
实施例3
谷田霉素产生菌链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060基因组文库的构建:
EPI300-T1R菌种的复苏:将试剂盒中提供的宿主菌EPI300-T1R取出,涂布或者画线于不含任何抗生素的LB平板上,37℃过夜培养后保存于4℃冰箱中(最好不超过一个星期)。在准备包装的前一天,从保存的平板上挑取单克隆于含10mM硫酸镁的50ml LB中,37℃过夜培养。
插入片段的制备:Fosmid DNA文库插入片段的大小在40kb左右,其制备可以使用注射器或者小孔的吸管(移液管)通过反复的吸取和推出来实现,次数根据片段原始的大小来决定,一般每50次用电泳检查一次效果,直至片段大小合乎要求(10%左右的片段在36kb的control DNA附近)。此步骤中,基因组总DNA的用量最少在2.5μg以上。
目标片段的蔗糖梯度分离及回收:取进口蔗糖梯度离心管(高速离心管,体积10ml,直径约1cm)一只,加入6ml 40%蔗糖,然后小心在其顶部加入6ml10%蔗糖。用封口膜将管口封住(可以用绳子扎住),在干毛巾上缓慢地将管子倾斜成水平位置,用其本身地气泡来调平,室温下放置3.5小时。缓慢将管子回复回复垂直位置,蔗糖梯度即成。拿掉封口膜,把待分离的已打碎的总DNA样品加在12ml的蔗糖梯度上。严格配平,精确到小数点后三位。17℃,2,4000rpm离心16小时。结束离心,以400ul一管的体积从上到下收集,要把枪头剪平。从每管中取出10ul用0.3%或者0.4%的胶电泳检测。取目标管总DNA,加1/10体积的氯化钠,2.5倍体积乙醇沉淀,洗涤,抽干后溶于ddH2O。电泳并定量。
插入片段末端补平、分离及回收:由于插入片段是以平端连入载体的,因此,需要用末端修复酶(End-Repair Enzyme)处理插入片段,使其成为平末端且5’-磷酸化的DNA片段,反应体系如下(所有加样操作应该于冰上完成):
xul双蒸水
8ul 10X末端修复酶缓冲液
8ul 2.5mM dNTP混合液
8ul 10mM腺嘌呤三磷酸
up to 20ug插入片段DNA(约0.5ug/ul)
4ul末端修复酶
80ul总反应体积
室温反应45min,使用上样缓冲液(loading buffer)loading buffer中止反应,并于70℃温浴10min将酶失活。加1/10体积的氯化钠,2.5倍体积乙醇沉淀,洗涤,抽干后溶于双蒸水。
将DNA片段连至载体:以10∶1(载体∶片段)的比例进行连接反应。反应体系如下:
xul双蒸水
1ul 10X快速连接缓冲液
1ul 10mM腺嘌呤三磷酸
1ul黏粒载体(0.5ug/ul)
xul插入片段(0.25ug的″40Kb DNA)
1ul DNA快速连接酶
10ul总反应体积
室温反应2小时。70℃温浴10min将DNA快速连接酶失活失活,然后存于-20℃。
包装:以复苏的EPI300-T1R为种子,以10%的接种量,接入10mM硫酸镁的50ml LB中,37℃培养至OD600=0.8-1.0,冰上放置(最长可放置72h)。以10μl连接产物/1管MaxPlax Lambda包装混合物的比例,冰上融化MaxPlaxLambda包装混合物。取1.5ml灭菌eppendorf管,置于冰上,从每支MaxPlaxLambda包装混合物取25μl(总量的一半)加到eppendorf管中,并迅速将剩下的25μl MaxPlax Lambda包装混合物冻存于-70℃。将5.3中的10μl连接产物加入到含25μl MaxPlax Lambda包装混合物的eppendorf管中,置于冰上。混匀(用移液枪),注意不要引入气泡,短暂离心,将液体甩至管底。30℃温浴90min。将每支MaxPlax Lambda包装混合物剩下并冻存的25μl MaxPlax Lambda包装混合物迅速加入至含反应物的eppendorf管中,混匀。30℃温浴90min。向每支管中加入稀释缓冲液至终体积为1ml.,轻轻混匀后。向每支加入25μl氯仿,轻轻混匀后保存于4℃。
滴度测定:按照下述比例稀释包装DNA(PDB:噬菌体稀释缓冲液)
A)1∶102稀释10ul包装噬菌体于990ul ofPDB.
B)1∶104稀释10ul 1∶102包装噬菌体于990ul ofPDB.
C)1∶105稀释100ul 1∶104包装噬菌体于900ul ofPDB.
D)1∶106稀释100ul 1∶105包装噬菌体于900ul ofPDB.
取1.5ml灭菌eppendorf管,向其中加入中EPI300-T1R各100μl,并向各管中分别加入10μl 7.1中的稀释液,37℃温浴20min。将转染好的菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板,37℃过夜。克隆计数,计算滴度。
转染与保存:根据滴度确定的稀释比例将得到的包装DNA稀释,此时可以加入甘油至终浓度20%,然后将包装DNA作为初级文库冻存于-70℃;或者进行转染,并将转染后得到的克隆用合适体积的LB洗下后加入甘油(终浓度20%),冻存于-70℃。
实施例4
谷田霉素产生菌链霉菌Streptomyces sp.TP-A2060的发酵、产物分离纯化与鉴定:
1)发酵,分离
发酵培养基为ISP-2固体培养基,取Streptomyces sp.TP-A2060孢子100μL涂布在ISP-2平板上,一般培养三天就可以收孢子,五天后对发酵产物进行提取。提取时先将培养基连同菌捣碎,在80%的丙酮中超声振荡15分钟,搅拌4hr使产品充分溶入溶液中,后用纱布过滤去大部分杂质。37℃旋蒸去大部分丙酮,后用乙酸乙酯对残余液体萃取3遍。萃取液集中后加入无水硫酸镁(或无水硫酸钠)过夜脱水,第二天过滤无水硫酸镁(或无水硫酸钠)后旋蒸干萃取液。将旋蒸剩余物溶于1ml无水甲醇中,离心后取上清4℃保存。进行高效液相色谱法检测时将保存在溶于1ml无水甲醇中的溶液于真空离心干燥器中尽量抽去大部分溶剂,加入100μL无水甲醇取浓缩液20μL上样。
2)高效液相色谱法(HPLC)检测
紫外吸收值(UV)=385nm;
柱子:EC 150/4.6NUCLEOSIL 100-5 C18Ser.No.2085011Batch 21302092;流动相条件:流速(V)=1mL/min;A相=水(0.15%磷酸氢二钾)B相=乙睛(CH3CN)
时间/min | 0 | 3 | 6 | 12 | 19 | 22 | 27 | 28 |
B/% | 15 | 15 | 40 | 40 | 55 | 85 | 85 | 15 |
实施例5
Red-ET基因打靶(PCR-targeting技术)
1)打靶片段制备
以pJTU21251为模版(含壮观霉素Spe抗性基因),PCR溶液组分同前,聚合酶采用TakaraTaq DNA聚合酶(polymerase),进行PCR反应。聚合酶链式反应(PCR)产物用琼脂糖凝胶电泳分离分析,与预期大小符合的条带,试剂盒回收,溶于50μl无酶双蒸水。
聚合酶链式反应(PCR)程序
循环1:94℃,2min,1轮;
循环2:94℃,45sec;50℃,45sec;72℃,90sec;10轮;
循环3:94℃,45sec;55℃,45sec;72℃,90sec;15轮;
循环4:72℃,5min;1轮。
2)电转化
将黏粒转化入大肠杆菌E.coli BW 25113感受态细胞(含有pIJ790),涂布于含有50μg/mLAm和30μg/mLCm的LB平板上30oC培养过夜。挑选取大肠杆菌单菌落接种入3ml含有25μg/mLCm50μg/mLAm的培养基(SOB)中,30oC摇床培养过夜。接种500μL菌液至50mL新鲜的培养基(SOB)培养基(含25μg/mLCm,50μg/mLAm)中,同时添加500μL1M L-阿拉伯糖,30℃培养约2~3h至OD600~0.6。3800rpm,4℃离心10min回收菌体,尽量弃掉上清,加入1mL10%甘油,打散沉淀,再加9mL10%甘油,摇匀。3800rpm,4℃离心10min,弃掉上清,用10%甘油洗涤。重复上面操作4次左右:3800rpm,4℃离心10min,尽量弃去上清,用100μL10%甘油重悬。与此同时准备电击杯,洗净后泡于70%的乙醇中,从乙醇中取出保存好的电击杯,在超净台下用无水乙醇洗涤两次,最大风力下吹干,置于冰上或冰箱预冷30min。将100μL感受态细胞与1~2μL聚合酶链式反应(PCR)产物混匀,加入预冷的0.1cm的电击杯中,电击条件采用200Ω,25uF,1.8kv,电击时间4.5~4.9ms,立即加入1ml预冷的LB,37oC培养60min后;涂布于含有100μg/ml阿伯拉霉素和50μg/ml壮观霉素的LB平板,37℃过夜培养。挑取单克隆接种至100μg/ml阿伯拉霉素和50μg/ml壮观霉素的液体LB中,而后抽提质粒,溶于50μl TE溶液,再次转化大肠杆菌E.coli DH5α中进行纯化,而后挑取单克隆接种,菌液提取质粒进行酶切鉴定。
实施例6
基因敲除突变菌株的获得:
1)单交换突变菌株的获得
将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL)中,30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL),30℃培养7天,收孢子,保存于-80℃;取出10μL在ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL)画线,37℃培养,放置2~3天。挑37℃整合生长的单菌落,接种至液体培养基TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL),37℃,振荡2-3天。取出200μL菌液涂布在ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL),37℃整合5天,收孢子,保存于-80℃。取出200μL菌液接种于在TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL,5mM氯化酶,0.5%甘氨酸)中,30℃振荡培养2天,用于抽提突变菌株的基因组总DNA,用于杂交或者聚合酶链式反应(PCR)方法验证。
2)双交换突变菌株的获得
将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL)中,30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL),30℃培养5天,收孢子,保存于-80℃;取出适当的体积用灭菌双蒸水稀释到合适的浓度,涂布在ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL),37℃培养,放置2天。利用灭菌的圆形滤纸,将生长于ISP-2(阿伯拉霉素=5μg/mL)上的单克隆菌落印迹转移至于ISP-2(壮观霉素=50μg/mL)上,对照ISP-2(阿伯拉霉素=50μg/mL)平板和ISP-2(壮观霉素=50μg/mL)平板,挑取壮观霉素有抗性,阿伯拉霉素敏感的单克隆菌落,接种至液体培养基TSB(壮观霉素=25μg/mL),30℃,振荡2天。取出10μL涂布于ISP-2(壮观霉素=50μg/mL),30℃培养1-2天,再次确证我们挑取的单克隆菌落是壮观霉素抗性而且是阿伯拉霉素敏感的。然后从TSB培养基中取出200μL菌液涂布在ISP-2(壮观阿伯拉霉素=50μg/mL),30℃培养5天,收孢子,保存于-80℃。取出200μL菌液接种于TSB(壮观霉素=25μg/mL,5mM氯化酶,0.5%甘氨酸),30℃振荡培养2天,用于抽提双交换突变菌株的基因组总DNA,用于杂交或者聚合酶链式反应(PCR)方法验证。
实施例7
基因回补突变菌株的获得:
将目标基因和红霉素启动子克隆到pSET152载体。正确的质粒通过S17-1和Streptomyces sp.TP-A2060的属间接合转移得到各突变体的基因回补转化子。将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL)中,30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在MS(阿伯拉霉素=50μg/mL),30℃培养7天,收孢子,保存于-80℃;另取出200μL菌液接种于在TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL,5mM氯化酶,0.5%甘氨酸)中,30℃振荡培养2天,用于抽提突变菌株的基因组总DNA,用于杂交或者聚合酶链式反应(PCR)方法验证。
实施例8
Yatakemycin-morfT与谷田霉素的生物活性测试:
将酵母菌Y-190在液体培养基YPD中培养后,取100μL菌液加入融化后温度降为40度左右的固体YPD培养基,混匀铺板。等培养基凝固后取牛津杯在培养基表面放置,将稀释后的相应测试试剂加入牛津杯中吹干,放置于30度恒温箱培养3天。
Claims (3)
1.一种谷田霉素的生物合成相关基因,其特征在于,所述的谷田霉素的生物合成相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第30926-32446位碱基所示,称为ytkT。
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