CN103131716A

CN103131716A - 盐霉素的生物合成基因簇及其应用

Info

Publication number: CN103131716A
Application number: CN201110397282XA
Authority: CN
Inventors: 白林泉; 姜春艳; 王后根
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及盐霉素的生物合成基因簇及其应用，具体地，本发明提供了一类由白色链霉菌产生的具有球虫抑制活性和生长促进活性的抗生素-盐霉素(salinomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含30个基因：17个是盐霉素生物合成的结构基因，1个是盐霉素生物合成的调节基因，2个是转运相关基因，其它基因共10个：slnM，orf11，orf12，orf13，orf14，orf15，orf16，orf17，orf18，orf19。本发明所提供的基因及其蛋白可以用来寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

盐霉素的生物合成基因簇及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体地，涉及盐霉素的生物合成基因簇及其应用。

背景技术

盐霉素(salinomycin)属于聚醚类抗生素(图1)，是白色链霉菌XM211的发酵代谢产物，可以作为球虫抑制药和生长促进剂，因而被广泛的应用于畜牧业和家禽饲养业。

盐霉素的作用机制通常被认为是：和病原微生物及球虫细胞外的阳离子，尤其是K⁺和Na⁺形成络合物，然后再通过细菌或细胞膜上的“膜转运蛋白”不断将阳离子送入细胞内，破坏细胞膜内外的离子平衡，使细胞失活，达到抗球虫的目的。最新研究还发现，盐霉素能够高效抑制上皮肿瘤干细胞，其活性为目前临床上使用的紫杉醇的100倍(Gupta，P.B.et al，Cell 138：645-59)。

虽然盐霉素具有优异的活性，但是由于其具有复杂的结构，使得单纯利用全合成的方法进行改造步骤繁多，实际生产成本过高。近年来随着基因组学和蛋白质组学的深入研究以及新型生物技术的快速发展，使我们利用微生物作为“细胞工厂”，通过遗传控制来大量合成具有良好生物活性和新型作用机制的天然产物及其类似物成为可能。这也为我们在微生物体内获得所需要的盐霉素提供了一条新的思路。

与盐霉素结构相类似的抗生素莫能霉素(monensin)，南昌霉素(nanchangmycin)，拉沙里菌素(lasalocid)等的生物合成基因簇已被克隆，然而关于盐霉素的生物合成途径至今尚未阐明，

因此我们以微生物来源的盐霉素为目标分子，从克隆盐霉素的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学以及有机化学相结合的方法来研究其生物合成，阐明其生物合成途径及调节机制，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰盐霉素的生物合成途径，探索生物利用度更好、并能通过微生物发酵大量生产的药物。

发明内容

本发明涉及一类白色链霉菌产生的具有良好抗球虫活性的抗生素-盐霉素(salinomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种盐霉素的生物合成基因簇，所述基因簇包括编码盐霉素生物合成所涉及的30个基因，具体为：

1)负责盐霉素生物合成的基因，即slnA1，slnA2，slnA3，slnA4，slnA5，slnA6，slnA6，slnA7，slnA8，slnA9，slnBI，slnBII，slnBIII，slnC，slnDI，slnDII，slnE，slnF；共17个基因：

slnA1位于基因簇核苷酸序列第13658～28435位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为4925个氨基酸；

slnA2位于基因簇核苷酸序列第28468～40221位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为3917个氨基酸；

slnA3位于基因簇核苷酸序列第40244～48322位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为2692个氨基酸；

slnA4位于基因簇核苷酸序列第48450～53378位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为1642个氨基酸；

slnA5位于基因簇核苷酸序列第53431～64683位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为3750个氨基酸；

slnA6位于基因簇核苷酸序列第64789～69105位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为1435个氨基酸；

slnA7位于基因簇核苷酸序列第69148～74082位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为1644个氨基酸；

slnA8位于基因簇核苷酸序列第74150～85324位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为3724个氨基酸；

slnA9位于基因簇核苷酸序列第85352～92290位，编码典型的I型聚酮合酶，长度为2312个氨基酸；

slnBI位于基因簇核苷酸序列第92379～92765位，编码环氧化水解酶，长度为128个氨基酸；

slnBII位于基因簇核苷酸序列第99550～99101位，编码环氧化水解酶，长度为149个氨基酸；

slnBIII位于基因簇核苷酸序列第100004～99543位，编码环氧化水解酶，长度为153个氨基酸；

slnC位于基因簇核苷酸序列第100184～101638位，编码环氧化酶，长度为484个氨基酸；

slnDI位于基因簇核苷酸序列第92807～93604位，编码II型硫酯酶，长度为265个氨基酸；

slnDII位于基因簇核苷酸序列第105116～105877位，编码II型硫酯酶，长度为253个氨基酸；

slnE位于基因簇核苷酸序列第94936～94655位，编码铁氧还蛋白，长度为93个氨基酸；

slnF位于基因簇核苷酸序列第96156～94933位，编码细胞色素P450单加氧酶，长度为407个氨基酸；

2)负责盐霉素生物合成的调节基因，即slnR，共1个基因；

slnR位于基因簇核苷酸序列第102168～104888位，编码LuxR家族转录调控蛋白，长度为906个氨基酸；

3)抗生素转运相关基因，slnTI，slnTII，共2个基因；

slnTI位于基因簇核苷酸序列第96333～97292位，编码ABC转运蛋白，长度为319个氨基酸；

slnTII位于基因簇核苷酸序列第97289～98929位，编码ABC转运蛋白，长度为546个氨基酸；

4)其它基因，即slnM，orf11，orf12，orf13，orf14，orf15，orf16，orf17，orf18，orf19，共10个基因；

slnM位于基因簇核苷酸序列第93645～94460位，编码O-甲基转移酶，长度为271个氨基酸；

orf11位于基因簇核苷酸序列第12329～10611位，编码3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶，长度为572个氨基酸；

orf12位于基因簇核苷酸序列第13354～12326位，编码3-草乙酰-乙酰载体蛋白合成酶，长度为342个氨基酸；

orf13位于基因簇核苷酸序列第106029～108617位，编码多肽合成酶，长度为862个氨基酸；

orf14位于基因簇核苷酸序列第108927～108679位，编码未知功能蛋白，长度为82个氨基酸；

orf15位于基因簇核苷酸序列第111671～109104位，编码SARP家族转录调控蛋白，长度为855个氨基酸；

orf16位于基因簇核苷酸序列第111987～113780位，编码包含AMP结合结构域的蛋白，长度为597个氨基酸；

orf17位于基因簇核苷酸序列第113774～115492位，编码乙酰辅酶A脱氢酶，长度为572个氨基酸；

orf18位于基因簇核苷酸序列第115524～115814位，编码多肽载体蛋白，长度为96个氨基酸；

orf19位于基因簇核苷酸序列第115811～116650位，编码4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，长度为279个氨基酸。

在另一优选例中，所述基因簇包括以下结构基因：slnA1，slnA2，slnA3，slnA4，slnA5，slnA6，slnA6，slnA7，slnA8，slnA9，slnBI，slnBII，slnBIII，slnC，slnDI，slnDII，slnE和slnF。

在另一优选例中，所述基因簇包括以下调控基因：slnR；和/或所述基因簇包括以下抗生素转运相关基因：slnTI和slnTII。

在另一优选例中，所述的基因簇的序列如SEQ ID NO：1中第1-127961位所示。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述盐霉素的生物合成基因簇的编码蛋白。

在另一优选例中，所述的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2-31所示，更佳地，所述的编码蛋白是SEQ ID NO.：22所示的环氧化酶slnC。

在另一优选例中，本发明第一方面所述的盐霉素生物合成基因簇或本发明第二方面所述的编码蛋白用于催化合成抗生素盐霉素及类似物。

在本发明的第三方面，提供了一种含有本发明第一方面所述的盐霉素的生物合成基因簇的表达载体。

在本发明的第四方面，提供了一种重组的含有本发明第三方面所述的表达载体或染色体上整合有外源的本发明第三方面所述的盐霉素的生物合成基因簇的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是链霉菌。

在本发明的第五方面，提供了一种产生盐霉素的方法，包括步骤：培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达盐霉素，以及从培养液中分离盐霉素。

在本发明的第五方面，提供了一种白色链霉菌，所述的白色链霉菌中盐霉素的生物合成基因簇中一个或多个基因被失活，从而不产生盐霉素。

在另一优选例中，所述基因簇中环氧化酶slnC基因被失活。

在另一优选例中，所述基因未失活的同种白色链霉菌可产生盐霉素。

在另一优选例中，所述的白色链霉菌是白色链霉菌XM211。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了盐霉素的化学结构。

图2显示了盐霉素合成基因簇结构示意图，其中，图2A为4个重叠的粘粒，2个BamHI酶切片段代表了测序的白色链霉菌Streptomyces albus XM211基因组约128kb的DNA区域，sln1-4表示探针部分；图2B为盐霉素生物合成基因簇的结构。

图3显示了盐霉素生物合成基因slnC的中断实验示意图及其突变株的HPLC检测图；图3A为环氧化酶基因slnC的中断实验示意图；图3B为slnC基因中断菌株的PCR鉴定结果，其中泳道1为以JCY16-F/R为引物，野生型Streptomyces albus XM211总DNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道2为以JCY16-F/R为引物，突变株JCY16总DNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道3为野生型菌株得到的扩增片段经限制性内切酶SacI酶切，得到0.55kb和0.99kb两个片段；泳道4为突变株菌株JCY16得到的扩增片段经限制性内切酶SacI酶切，得到0.62kb，0.75kb和0.13kb三个片段；图3C为slnC基因突变株JCY16及回补菌株JCY16：：pJTU5376的HPLC检测图。

图4为盐霉素生物合成途径示意图，其中，KS代表酮基合成酶；ATa代表malonyl-CoA酰基转移酶；ATp代表methylmalonyl-CoA酰基转移酶；ATb代表ethylmalonyl-CoA酰基转移酶；DH代表脱氢酶；KR代表酮基还原酶；ER代表烯键还原酶；ACP代表酰基载体蛋白；KSQ代表加载模块中的KS结构域(活性位点半胱氨酸被谷氨酸取代)；KSX代表位于SlnA9蛋白C端的KS结构域；DH^*代表冗余的脱水酶结构域；KR^*代表无活性的酮基还原酶结构域。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从盐霉素产生菌白色链霉菌(Streptomyces albu)中鉴定了盐霉素的生物合成基因簇，具体地，所述整个基因簇共包含30个基因：17个是盐霉素生物合成的结构基因，1个是盐霉素生物合成的调节基因，2个是转运相关基因，其它基因共10个：slnM，orf1，orf12，orf3，orf14，orf15，orf16，orf17，orf18，orf19。在此基础上完成了本发明。

白色链霉菌Streptomyces albus

白色链霉菌为链霉菌属，气生菌丝为白色，基质菌丝为白色，不产色。所产生的孢子为椭球形，表面光滑。在适宜的条件下，白色链霉菌能产生多种抗生素，如盐霉素等。其中，研究已表明，许多种白色链霉菌是产生盐霉素。(例如罗敬完等人，国产盐霉素生产菌株——白色链霉菌61477的诱变育种试验[J]。中国兽医科技，1991，21(12)：37)。这些白色链霉菌可以市售获得，或购自保藏机构，也可分离获得。

一种产生盐霉素的合适菌种是白色链霉菌XM211(Streptomyces albusXM211)，可获自上海交通大学。

盐霉素

盐霉素为聚醚类抗生素，根据同位素前体喂养推测其生物合成是以乙酸为起始单元，经过14步缩合反应，其中5步以malonyl-CoA为底物形成乙酸单元，6步以methylmalonyl-CoA为底物形成丙酸单元，以及3步ethylmalonyl-CoA为底物形成丁酸单元，最终延伸形成聚酮长链。后经过环氧化酶，环氧化水解酶，细胞色素P450单加氧酶等酶对其进行修饰形成盐霉素。已证实，聚醚类抗生素生物合成的关键步骤是从烯键到环氧键，再到醚键成环的过程，从烯键到环氧键是由一个保守高度的环氧化酶催化的。

构建盐霉素产生菌基因组文库

选择含有lamada噬菌体cos位点的载体pCC1Fos构建基因组文库，在本发明的一个优选例中，提取大片段基因组DNA，经脉冲电泳或低电压(30～35V)过夜，使大部分DNA成为30～45kb大小的片段；并进行平末端补齐，5’-磷酸化、以及回收等等。将回收产物(即目标基因组DNA)和载体分子进行连接；对连接产物进行包装，转染感受态的宿主细胞，涂布平板上，筛选含有fosmid的克隆。

盐霉素合成基因簇的克隆

根据聚醚类抗生素生物合成的关键步骤是从烯键到环氧键，再到醚键成环的过程，从烯键到环氧键是由一个高度保守的环氧化酶催化的这一事实，本发明人决定以环氧化酶基因片段为探针，来克隆整个生物合成基因簇。

首先根据聚醚类生物合成基因簇中的环氧化酶氨基酸的保守序列涉及简并引物，SEQ ID NO.32(Epo-110-F-2)：5’-GTS ACC GTS RTS GAV CGNGA-3’；和SEQ ID NO.33(Epo-1030-R-1)：5’-GCT CAT SCC RTG SCC GT-3’(S＝C/G，R＝A/G，N＝次黄嘌呤)。

从盐霉素产生菌Streptomyces albus XM211的总DNA中克隆编码环氧化酶基因部分序列，得到与预期片段大小相同(约0.9kb)的特异PCR产物，克隆入pMD18-T载体，经DNA测序分析表明与已知的环氧化酶编码基因有很高的同源性，可作为探针对所构建的基因组文库进行筛选。

以环氧化酶基因片段为探针从Streptomyces albus基因组文库中筛选，分离得到的黏粒。对粘粒进行亚克隆测序，得到的多个序列信息，对符合预期的粘粒进行全长测序。在本发明中，经染色体步移并测序得到了4个黏粒12H8，25E8，10B8，6G11以及19H1上3.58kb以及7.93kb的序列，涵盖了染色体约128kb的区域。生物信息学分析可得，该序列包含了49个开放读码框，包括合成盐霉素必需的所有聚酮合成酶基因，修饰基因，调节基因和转运相关基因。各个基因的功能分析见表1。

这些开放阅读框中推测与盐霉素生物合成相关的基因及其编码的蛋白的氨基酸序列如下：

表1

注：

1.盐霉素生物合成的结构基因：slnA1，slnA2，slnA3，slnA4，slnA5，slnA6，slnA6，slnA7，slnA8，slnA9，slnBI，slnBII，slnBIII，slnC，slnDI，slnDII，slnE，slnF；

2、负责盐霉素生物合成的调节基因：slnR；

3、抗生素转运相关基因：slnTI，slnTII；

4、其它基因：slnM，orf11，orf12，orf13，orf14，orf15，orf16，orf17，orf18，orf19。

盐霉素基因簇中相关基因失活的白色链霉菌

本发明还提供了一种白色链霉菌，所述的白色链霉菌中盐霉素的生物合成基因簇中一个或多个基因被失活，从而不产生盐霉素。在本发明的一个优选例中，所述基因簇中环氧化酶slnC基因被失活，从而不表达盐霉素，所述基因未失活的同种白色链霉菌可产生盐霉素。在另一优选例中，所述的白色链霉菌是白色链霉菌XM211。

本发明提供的盐霉素的生物合成基因簇中一个或多个基因被失活的白色链霉菌可以用于验证盐霉素基因簇中基因功能的模型，和/或用于外源表达盐霉素的宿主细胞。

本发明的应用及优点

利用本发明的基因簇可实现以下目的：

(1)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到盐霉素生物合成基因的同源基因；

(2)包含本发明所提供的基因簇核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces albus基因组文库中定位更多的文库质粒，这些文库质粒至少包含本发明中的部分核苷酸序列，也包含有Streptomyces albus基因组中以前邻近区域未克隆的DNA；

(3)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断盐霉素生物合成的一个或几个步骤或者引入其他同源基因而得到新的盐霉素的前体或衍生物；

(4)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等；

(5)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径；

(6)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等；

(7)本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备；

(8)本发明所提供的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质；

(9)本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质；

(10)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用来调节四霉素或其衍生物的产量；

(11)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能；

(12)本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。

总之，本发明所提供的包含盐霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息有助于阐明与理解盐霉素及相关聚醚抗生素家族生物合成的分子机理，从而为进一步利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法

1.盐霉素产生菌Streptomyces albus XM211基因组DNA的提取

接种200μl 20％甘油保存的Streptomyce salbus XM211孢子至50ml的TSBY(Oxide胰胨豆汤粉30g、Oxide酵母粉5g、蔗糖103g、蒸馏水1000ml)中，置于30℃摇床培养48小时，离心收集菌体待用。

取适量菌体重悬于5ml SET缓冲液(75mM NaCl、25mM EDTA pH8.0、20mMTris-HCl pH7.5)，加入100μl溶菌酶溶液(50mg/ml)，置于37℃温育约60分钟至溶液成为半透明状。溶菌后加入140μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)混合均匀，然后加入600μl10％SDS，颠倒混匀并置于55℃温育2h，期间偶尔颠倒几次。再加入2ml 5M NaCl，彻底混匀，冷却置于37℃后，加入5ml氯仿，于室温轻轻混匀。12000r/min离心15min，移取上清液至新管，弃去白色中间层。最后加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，约3分钟后用玻棒挑取白色沉淀至含70％乙醇的新管中洗涤，重复2次，空气中干燥，溶解一定量的纯水中。

2.盐霉素产生菌Streptomyces albus XM211基因组文库的构建

选择含有lamada噬菌体cos位点的载体pCC1Fos构建链霉菌(Streptomycesalbus XM211)的基因组文库。采用的试剂盒为EPICENTRE公司生产的CopyControl Fosmid library Production Kit。

具体方法为：提取大片段基因组DNA经脉冲电泳或低电压(30～35V)过夜电泳检测，微量进样器吹打数次，使大部分DNA成为30～45kb大小的片段；利用试剂盒中所提供的试剂，按如括号内比例(8μl End-Repair Buffer，8μl 2.5mMdNTP Mix，8μl 10mM ATP，20μg打断后的DNA，4μl End-Repair Enzyme Mix，余下部分用纯水补足至80μl)配制反应体系，进行充分混匀后室温放置45分钟，以获得平末端、5’-磷酸化的DNA；末端补平后产物以0.7％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳(30V，4℃，15～16小时)，并在两端胶孔加入cosmid DNA control(35kb)作为对照，电泳结束后回收含有35～40kb大小的DNA片段的胶块；称取胶块重量，75℃水浴10～15分钟，迅速转入45℃中并添加适量体积的GElase 50×Buffer及GElaseEnzyme Preparation，反应至少一小时；溶胶后的产物以乙醇沉淀，溶于纯水后将回收产物(即目标基因组DNA)和载体pCC1Fos的分子按10∶1左右配制进行连接；以试剂盒提供的MaxPlax Lamda Packing Extracts对连接产物进行包装，然后转染感受态的E.coli EPI300-T1R细胞，涂布到含有12.5μg/ml的氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养，筛选含有fosmid的克隆。

3.盐霉素产生菌Streptomyces albus XM211基因组文库的筛选

利用PCR法来筛选基因组文库，具体反应程序如下：

第一步，95℃5min；第二步(30个循环)，95℃30s，65℃30s，72℃45s；第三步，72℃5min。采用聚合酶链式反应递缩基因组文库的筛选策略(参考文献：何云龙等，聚合酶式反应递缩基因组文库以克隆抗生素合成基因簇，2009，上海交通大学学报)，首先将每个96孔板的克隆混合培养，提混合黏粒作为模板进行PCR反应，先将阳性信号定位于每个96孔板，同样的方法接着定位于排，最后定位于单个克隆。

4.产生菌Streptomyces albus XM211的接合转移系统

收集生长于ISP4培养基(购买于BD公司)10-12天的Streptomyce salbusXM211新鲜孢子备用。含有oriT的目标质粒必须在辅助质粒pUZ8002的协助下，才能通过接合转移导入到受体链霉菌细胞中。先将待转移到Streptomyces albusXM211中的质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002(由英国John Innes Centre的Bertolt Gust等人构建，参照REDIRECTtechnology：PCR targeting system inSreptomyces Coelicolor，2002)，然后培养含目标质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002过夜培养物按1∶10接种新鲜LB培养基，3h后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子重新悬浮于5ml 0.05M pH8.0的TES缓冲液中，在50℃水浴中热激10min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(Difco酵母膏10％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl20.01M(需配制5M的原液，分开灭菌后加到酵母膏酪蛋白氨基酸溶液中)预萌发2h，离心收集孢子并重新悬浮于适量的LB中，在混合器上振荡打散孢子，按1∶1与大肠杆菌细胞等量混合，均匀涂布于不含抗性的ISP4培养基表面，37℃培养17h-18h后用1ml无菌水含适量抗生素和萘啶酮酸(用来抑制大肠杆菌的生长)来覆盖，置30℃培养7天后即可看到接合子生长。

5.基因终端突变株的构建

将构建的中断载体通过接合转移的方式转至链霉菌(Streptomyces albusXM211)野生型菌株中，生长的接合子纯化后在添加阿泊拉霉素(apramycin)的ISP4平板上接种验证抗性。验证正确后，在未添加阿泊拉霉素的ISP4平板上扩大松弛培养2轮，待孢子生长丰满后(约7天)，收集孢子，然后在添加相应抗生素的ISP4平板上梯度稀释每平板约50-100个单菌落，挑选菌落分别在含阿泊拉霉素的ISP4平板和含硫链丝菌素的ISP4平板上扩大培养，选择在硫链丝菌素平板上未长但在阿泊拉平板上生长良好的菌落，转接到TSBY(含10.3％蔗糖)培养基中提取总DNA，进行PCR验证正确后，突变株进行发酵培养。

6.盐霉素的发酵

将20％甘油保存的Streptomyces albus XM211孢子接种到种瓶培养基(葡萄糖4％；黄豆饼粉3％；酵母粉1％；碳酸钙0.2％；PH自然)，培养温度32～34℃，摇床转速220rpm，培养24-36小时。以10％的接种量将种子接种至50ml发酵培养基中(250ml三角瓶)(葡萄糖3％；水解酪蛋白1％；氯化钠0.2％；氯化钾0.2％；硫酸铵0.5％；磷酸氢二钾0.02％；硫酸镁0.01％；氯化钙0.01％；碳酸钙0.5％，PH 6.5～7.0)，32～34℃，220rpm培养5天。

7.盐霉素的分离纯化

将50ml发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，室温超声15分钟。取上清，30℃减压蒸干乙酸乙酯，然后用1ml甲醇溶解，-70℃保存。

8.盐霉素分析

色谱-质谱联用(LC/MS)检测发酵产物使用的是安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSD Trap system。LC的条件：色谱柱为agilent Eclipse XDB-C18(3μm，4.6×150mm)，流动相为Merck HPLC级乙腈∶水∶乙酸＝90∶10∶0.2(V/V)，流速为0.1ml/min，检测波长为210nm，柱温为25℃。质谱检测是在离子井的正离子模式下进行。干燥气流为10l/min，喷雾器压力为50psi。干燥气温为325℃。多级质谱断裂分析轰击电压在1.0-1.8V之间。

实施例1克隆盐霉素的生物合成基因片断

根据已报道的聚醚类生物合成基因簇中的环氧化酶氨基酸保守序列设计简并性引物：

SEQ ID NO.32(Epo-110-F-2)：5’-GTS ACC GTS RTS GAV CGN GA-3’；

SEQ ID NO.33(Epo-1030-R-1)：5’-GCT CAT SCC RTG SCC GT-3’

其中，S＝C/G，R＝A/G，N＝次黄嘌呤。

实施例2盐霉素生物合成基因簇的克隆、分析

以实施例1获得的环氧化酶基因片段为探针sln1-F/R从Streptomyces albusXM211的基因组文库约3000个克隆中筛选，分离得到的12个黏粒。选择其中一个黏粒12H8进行亚克隆测序，得到的多个序列信息符合预期，对其进行全长测序。

在此基础上经染色体步移并测序得到了4个黏粒12H8，25E8，10B8，6G11以及19H1上3.58kb以及7.93kb的序列，涵盖了染色体约128kb的区域(图2A)。

生物信息学分析该序列包含了49个开放读码框(图2B)，其中包含了合成盐霉素必需的所有聚酮合成酶基因(PKS)，修饰基因(modification)，部分调节基因(regulation)和转运相关基因(transporter)。此外，用于筛选基因组文库的探针sln1-4也在图2A中标明。

1、负责盐霉素生物合成的结构基因共17个：slnA1，slnA2，slnA3，slnA4，slnA5，slnA6，slnA6，slnA7，slnA8，slnA9，slnBI，slnBII，slnBIII，slnC，slnDI，slnDII，slnE，slnF；

2、负责盐霉素生物合成的调节基因1个：slnR；

3、抗生素转运相关基因2个：slnTI，slnTII；

4、其它基因共10个：slnM，orf11，orf12，orf13，orf14，orf15，orf16，orf17，orf18，orf19。

盐霉素生物合成基因簇整体序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3环氧化酶基因sln C的中断

为验证克隆到的区域与盐霉素的生物合成相关，将利用简并性引物筛选到的第一个Fosmid 12H8中的1.416bp区域(环氧化酶基因内部)进行替换。

由于aac(3)IV(阿伯拉霉素抗性基因)基因插入到slnC基因内部，所以使用引物JCY16-F/R，Streptomyces albus XM21野生型菌株基因组DNA扩增出1.55kb的PCR扩增片段，而突变株JCY16扩增出1.50kb的片段，利用扩增片段内部的SacI限制性酶切位点进行酶切验证，得到的结果也符合预期，即野生型菌株得到0.55kb和0.99kb两个片段，而突变株得到0.62kb，0.75kb和0.13kb三个片段(图3B)。

HPLC检测发酵产物的结果说明，Streptomyces albus XM211野生型菌株能产生盐霉素的特征性峰，而JCY16突变株则没有，将slnC重新回补到突变株JCY16中又能回复盐霉素特征性峰的产生(图3C)，从而证实得到的fosmid包含的环氧化酶基因与盐霉素的生物合成直接相关。

实施例4.盐霉素的生物合成途径

通过盐霉素基因簇上每个基因的生物信息学分析以及相关PKS的研究报道，本发明人推测盐霉素的生物合成途径可能经历以下几个过程(推导的盐霉素生物合成途径示意图如图4所示)：

盐霉素的生物合成由SlnA1加载乙酸起始单位开始，后经过了I型聚酮合酶(SlnA1-A9)催化的14步缩合反应，其中5步以malonyl-CoA为底物形成乙酸单元，6步以methylmalonyl-CoA为底物形成丙酸单元，以及3步ethylmalonyl-CoA为底物形成丁酸单元，最终延伸形成聚酮长链。形成的聚酮长链经过未知脱水酶，环氧化酶SlnC，环氧化水解酶，细胞色素P450单加氧酶等酶对其进行修饰并释放形成盐霉素(图4)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。