CN104388491B - 提高盐霉素发酵水平的方法 - Google Patents

Abstract

一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉菌DSMZ41398中失活位于SLNWT0868‑SLNWT0920(1,173,724bp‑1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇，减少其对盐霉素生物合成前体物的竞争，实现盐霉素产量的提高。采用本发明的方法，可使盐霉素的发酵终产量提高8倍以上，实验室摇瓶水平达到6.3g/L。

Description

提高盐霉素发酵水平的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种提高盐霉素发酵水平的方法。

技术背景

放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。

盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的。盐霉素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同，为钠钾离子的螯合载体，通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为抗球虫病药物，1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂，自1993年经我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜牧业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目前临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重要性，本申请人的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因簇，2012年完成了其产生菌白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的全基因组测序。通过对基因组进行分析，在其染色体上我们找到了多个活跃的I型聚酮合酶生物合成基因簇，他们和盐霉素分享部分的前体，这暗示着这些基因簇的存在会分散前体物的供应，消弱盐霉素合成的前体供应，进而影响盐霉素的产量。

通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量。在阿维菌素产生菌中中断阿维菌素的生物合成可以大大提高寡霉素的产量，红霉素高产菌株全基因组测序后发现其中多个聚酮合酶生物合成基因簇均发生失活突变。然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过失活其中的活跃I型聚酮合酶生物合成基因簇来改变前体代谢流的流量和流向，使其更多的流向盐霉素的生物合成途径，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种提高盐霉素发酵水平的方法。该方法通过中断一个I型生物合成基因簇，解除前体物供应的竞争、提高盐霉素前体的供应来实现盐霉素的高产。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉素DSMZ41398(Streptomycesalbus DSMZ41398)的染色体1,200,120bp-1,200,750bp位置引入基因突变，导致位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活，使盐霉素在发酵中的产量得以提高；

所述白色链霉素DSMZ41398染色体上1,200,120bp-1,200,750bp的序列如SEQ IDNO.1所示。

所述I型PKS生物合成基因簇失活的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于1,200,120bp-1,200,750bp区域进行失活的同源重组质粒载体I；

第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398中进行同源重组；

第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活的突变株。

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pJTU1278的SpeI/KpnI位点插入来自1,200,120bp-1,200,750bp区域左侧1410的PCR片段SpeI/HindIII和来自1,200,120bp-1,200,750bp区域右侧1352bp的PCR片段HindIII/KpnI。

所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33℃、220转/分钟的转速下培养36～48小时后，转接到种子培养基，于33℃、220转/分钟的转速下培养16～20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。

所述TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；所述种子培养基含有：葡萄糖4％，黄豆饼粉3％，酵母提取物1％，碳酸钙0.2％；所述发酵培养基含有：胚芽粉0.8％，黄豆饼粉0.5％，氯化钾0.22％，氯化钠0.1％，尿素0.16％，酒石酸0.2％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.5％，大豆油15％。

所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3％的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10％的接种量转接于发酵培养基。

本发明的方法可以部分解除前体物供应的竞争、提高盐霉素前体的供应，以此来提高盐霉素发酵，最终盐霉素发酵产量提高了800％以上，最终产量达到6.3g/L，通过本发明的方法可显著提高盐霉素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

本发明所涉及的菌株白色链霉菌DSMZ41398已经在SCI数据库文献《YurkovichME,Tyrakis PA,Hong H,Sun Y,Samborskyy M,Kamiya K,Leadlay PF:A late-stageintermediate in salinomycin biosynthesis is revealed by specific mutation inthe biosynthetic gene cluster..Chembiochem 2012,Jan 2；13(1):66-71》中公开

本发明所涉及的质粒pJTU1278已经在SCI数据库文献《He Y,Wang Z,Bai L,LiangJ,Zhou X,Deng Z:Two pHZ1358derivative vectors for efficient gene knockout inStreptomyces.Journal of Microbiology and Biotechnology 2010,20(4):678-682.》中公开。

附图说明

图1为野生型菌株白色链霉菌DSMZ41398基因失活衍生得到I型聚酮生物合成基因簇中断菌株的示意图；其中的质粒pLQ52将野生型菌株DSMZ41398中的1,200,120bp-1,200,750bp区域失活，得到基因簇中断突变株LCY-2。

图2为基因簇中断菌株盐霉素合成基因slnA3转录变化示意图；

图3为基因簇中断菌株发酵前体胞内前体浓度变化示意图；

图4为基因簇中断菌株与野生型菌株的盐霉素发酵产量示意图。

具体实施方法

以下实例将结合附图对本发明进一步作说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例

步骤一：质粒pLQ52的构建

以白色链霉菌DSMZ41398的基因组DNA为模板，分别使用两组引物LCY-2-L-F/LCY-2-L-R、LCY-2-R-F/LCY-2-R-R通过PCR扩增得到中断区域(1,200,120bp-1,200,750bp)左侧1.41kb的同源臂及右侧1.35kb的同源臂，通过基因测序确认同源臂的正确性；在质粒pJTU1278的SpeI/KpnI位点插入来自中断区域(1,200,120bp-1,200,750bp)左侧1.41kbPCR片段(SpeI/HindIII)和中断区域(1,200,120bp-1,200,750bp)右侧1.35kb PCR片段(HindIII/KpnI)；通过上述方法得到用于基因簇失活的质粒pLQ52。在37摄氏度水浴条件下，采用SpeI，HindIII和KpnI三种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到1.35kb和1.41kb的两条目标条带，表明质粒构建正确。

步骤二：将用于和染色体发生重组的质粒pLQ52导入野生型菌株DSMZ41398，并筛选得到1,200,120bp-1,200,750bp区域缺失突变株，此突变株表征位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活。

图1示意了1,200,120bp-1,200,750bp区域缺失的过程。具体操作如下：将已构建完成用于基因缺失的质粒pLQ52转化进入宿主ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取ET12567于含有Amp，Kan和Chl三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养2.5小时，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备野生型菌株DSMZ41398的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后再冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养3小时。将预萌发的孢子液与之前制备的宿主菌ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10：1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养17小时后取出平板，分别取Thio和萘啶酮酸两种抗生素的储存液40μL和12μL加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落结合子长出，采用LCY-2-C-F/LCY-2-C-R为引物，通过菌丝体PCR和抗性验证的方法验证结合子正确后划线接种至SFM平板，30℃培养至产孢，收集孢子后按稀释10⁷～10⁸后接种至SFM平板培养2～3天可得到单菌。继续采用LCY-2-C-F/LCY-2-C-R为引物，通过菌丝体PCR的方法对单菌落筛选得到1,200,120bp-1,200,750bp区域缺失突变株,此突变株即为位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活。

上述步骤二中所用到的引物序列如表1所示

表1

用于中断的左右同源臂制备PCR反应体系和条件是：DNA模板30ng，引物(左同源臂LCY-2-LF/LCY-2-LR，右同源臂LCY-2-RF/LCY-2-RR)30pmol，50％DMSO3μL，25mM Mg²⁺2μL，缓冲液3μL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；68摄氏度1分30秒；循环30次；68摄氏度10分钟。

基因簇中断的结合转移子和突变株筛选时的PCR体系和条件是：DNA模板10～100ng，引物(LCY-2-CF/LCY-2-CR)30pmol，50％DMSO 3μL，缓冲液3μL，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30μL，；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；72摄氏度1分钟；循环30次；72摄氏度10分钟。

步骤三，基因簇中断菌株的发酵培养

TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；种子培养基含有：葡萄糖4％、黄豆饼粉3％、酵母提取物1％、碳酸钙0.2％；发酵培养基含有：胚芽粉0.8％、黄豆饼粉0.5％、氯化钾0.22％、氯化钠0.1％、尿素0.16％、酒石酸0.2％、硫酸镁0.01％、磷酸氢二钾0.01％、碳酸钙0.5％、大豆油15％。

步骤四，基因簇中断菌株LCY-2中SlnA3的mRNA转录水平的测定

用于RNA提取的样品一般都保存在Redzoll溶液中。RNA提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4℃ 12000转/min的条件下进行。取已经破碎处理的样品500μL加入100μL氯仿涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100μL无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱(赛百盛)中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液(Washing buffer，赛百盛)漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60μL DEPC处理过的水，离心2min，将RNA样品从离心柱上洗脱下来。用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和OD260/280，提取后的RNA样品-80℃保存。RNA样品的消化反应体系可参照表2.2配制，反应体系置于37℃孵育4小时后每个反应体系加入5μL 50mMEDTA后65℃加热10min即可终止消化，消化好的RNA样品-80℃保存。RNA经过逆转录后就得到cDNA，可用于后续的基因转录分析。

取cDNA样品用DEPC处理水稀释至合适的浓度，配制qRT-PCR体系(2×SYBRGreen缓冲液10μL，引物(看家基因hrdB引物hrdB-RT-F/hrdB-RT-R，目标基因slnA3引物slnA3-RT-F/slnA3-RT-R)20pmol，cDNA 5μL，加DEPC水至体积20μL)，离心去掉溶液中的气泡之后使用ABI公司7500型快速RT-PCR仪测定样品Ct值。采用hrdB作为看家基因测定slnA3的转录水平。收集的数据使用2^-ΔΔCT法进行处理。一般对照组样品的基因转录水平设参比为1，实验组样品基因转录与之比较即得到实验组基因转录改变的倍数。

测定基因转录水平时使用的引物序列如表2所示

表2

图2为基因簇缺失菌株LCY-2与野生型菌株DSMZ41398的盐霉素生物合成结构基因SlnA3的转录分析结果。结果表明该基因簇(1,173,724bp-1,276,916bp)缺失后，SlnA3的转录水平基本保持不变，说明竞争基因簇的中断引起的盐霉素产量提高，并非由于盐霉素基因簇转录水平提高引起的。

步骤五，基因簇中断菌株LCY-2中前体物浓度的测定

收集24h的发酵产物，取1ml发酵液高速离心用无菌水洗涤两次，再用1ml无菌水重新悬浮，均匀分成2份。其中一份经超声破碎后高速离心取100ul，另一份直接离心取100ul上清。两份样品用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析仪测定蛋白质浓度，用蛋白质的量来表征菌体生物量。其余发酵液全部高速离心之后用无菌水洗涤两次，加入1ml的萃取液(甲醇：乙腈：0.1％乙酸水＝45:45:10)重新悬浮，高速震荡破碎15分钟，间歇性的置于冰上冷却。15分钟之后高速离心取上清，经过0.22um的有机相滤膜过滤之后可以用LC-MS/MS检测。

前体物辅酶A的检测使用的是LC-MS/MS的正离子模式下的多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring mode，MRM mode)，分别选择的母分子和子分子分子量如下：丙二酰辅酶A(854>347)，甲基丙二酰辅酶A(868>361)，乙基丙二酰辅酶A(882>375)。色谱柱的参数：Agilent TC-C18,4.6×250mm,5μm；流动相流速为0.5ml/min；流动相：20mmol/L的乙酸铵水溶液(溶液A)和20mmol/L的乙酸铵甲醇溶液(溶液B)；流动相变化：25％溶液B5分钟，随后在10分钟内均匀达到100％溶液B，保持100％溶液B 5分钟，再瞬时降到25％溶液B重平衡10min。

图3为基因簇缺失菌株LCY-2与野生型菌株DSMZ41398的前体物定量结果。结果表明当此竞争基因簇中断之后，在发酵前期胞内游离的前体物丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A都有明显的积累，而乙基丙二酰辅酶A变化不大。

步骤六，利用HPLC检测盐霉素的发酵产量

使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定210nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent TC-C18,4.6×250mm,5μm；流动相流速为1mL/min；流动相：8％(v/v)的2％的乙酸水溶液和92％(v/v)的HPLC级乙腈。柱温：室温。

图4为基因簇缺失菌株LCY-2与野生型菌株DSMZ41398盐霉素发酵水平检测。结果表明此竞争基因簇缺失之后，盐霉素的发酵水平有显著的提高，和出发菌株相比盐霉素的发酵产量提高约800％，终产量达到6.3g/L。

Claims (2)

1.一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉素DSMZ41398(Streptomycesalbus DSMZ41398)的染色体1,200,120bp-1,200,750bp位置引入基因突变，导致位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活，使盐霉素在发酵中的产量得以提高；

所述白色链霉素DSMZ41398染色体上1,200,120bp-1,200,750bp的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述I型PKS生物合成基因簇失活的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于1,200,120bp-1,200,750bp区域进行失活的同源重组质粒载体I；

第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398中进行同源重组；

第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活的突变株；

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pJTU1278的SpeI/KpnI位点插入来自1,200,120bp-1,200,750bp区域左侧1410的PCR片段SpeI/HindIII和来自1,200,120bp-1,200,750bp区域右侧1352bp的PCR片段HindIII/KpnI；

所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33℃、220转/分钟的转速下培养36～48小时后，转接到种子培养基，于33℃、220转/分钟的转速下培养16～20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天，所述TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；所述种子培养基含有：葡萄糖4％，黄豆饼粉3％，酵母提取物1％，碳酸钙0.2％；所述发酵培养基含有：胚芽粉0.8％，黄豆饼粉0.5％，氯化钾0.22％，氯化钠0.1％，尿素0.16％，酒石酸0.2％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.5％，大豆油15％。

2.根据权利要求1所述提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3％的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10％的接种量转接于发酵培养基。