CN103540603B - 金核霉素的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金核霉素的生物合成基因簇及其应用，所述基因簇包括金核霉素生物合成的4个基因，包括anmB、anmC、anmD和anmE。本发明所提供的基因簇及其编码的蛋白可用于合成金核霉素。本发明还提供包含所述基因或基因簇的表达载体或宿主细胞，及其在医药、工业或农业等方面的应用。<pb pnum="1" />
Description
技术领域
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域。具体地说，本发明涉及金核霉素的生物合成基因簇及其应用。
背景技术
金核霉素(aureonuclemycin)是1987年从金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureusvar.suzhoueusis n.var Yen et al，中国微生物菌种保藏管理委员会编号CGMCCNo.0122；中国专利申请CN87100250)的发酵产物中分离得到的。作为一种优质的农用抗生素，金核霉素得到了广泛的应用。
金核霉素及其结构类似物的化学合成已经由Nicholas J.Newcombe与SatoshiIchikawa等人作过深入研究，经过一个核心的由SmI2催化的Aldol反应形成C-糖苷键，实现金核霉素骨架结构的形成，然后经过多步反应实现环化和立体结构控制，生成终产物。化学合成经历的步骤繁琐，试剂复杂昂贵，并且合成过程中立体控制困难。SatoshiIchikawa等人合成herbicidinB过程中，开始得到的产物并不是目标产物herbicidinB，而是它的异构体，他们经过分析后，改变了策略才成功的得到了herbicidinB，但是产量很低，不能做为工农业生产用途。
上海市农药研究所，经过二十年的努力，通过“试差法”，改变、调整发酵参数，摸索出了适合金核霉素生产的发酵条件，使金核霉素的产量得到了很大提高。但是仍然满足不了农业应用方面对金核霉素大量且质优价廉的要求；通过对其发酵液的HPLC检测，发现在发酵条件下，发酵液中除了金核霉素作为主要产物外，还有一种占很大比例的副产物5-脱氧次黄嘌呤核苷，将它的结构与金核霉素对比，发现其骨架结构与金核霉素具有很大的相似性，而且由于该副产物总是伴随着金核霉素的产生而产生。然而，迄今为止本领域尚未揭示金核霉素合成基因簇。
因此，本领域急需了解金核霉素生物合成相关的基因或基因簇，以便研究金核霉素的生物合成途径，进而通过基因工程和代谢工程手段提高金核霉素产量。
发明内容
本发明的目的就是提供涉及金核霉素的生物合成基因簇，及其克隆、功能研究和应用。
在第一方面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因的集合，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。
在一优选例中，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和
所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在第二方面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因簇，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为：
1)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位碱基所示，编码的蛋白为腺苷高半胱氨酸水解酶，长度为556个氨基酸；
2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第6957-8057位碱基所示，编码的蛋白为脱氢酶，长度为366个氨基酸；
3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第8054-9172位碱基所示，编码的蛋白为氧化还原酶，长度为372个氨基酸；和
4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第9169-10434位碱基所示，编码的蛋白为radical SAM相关蛋白，长度为421个氨基酸。
在第三方面，本发明提供本发明第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇所编码的编码蛋白。
在一优选例中，所述的编码蛋白为AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。
在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇，或第三方面所述的编码蛋白的用途，其用于合成抗生素金核霉素、金核霉素的药学上可接受的盐及类似物。
在另一优选例中，所述的合成包括生物合成、催化合成、固定化酶合成。
在第五方面，本发明提供一种载体，所述载体含有第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或含有第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
在一优选例中，所述表达载体上含有多拷贝的金核霉素生物合成基因的集合，或多拷贝的金核霉素生物合成基因簇。
在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体。
在另一优选例中，所述的载体包括质粒、或粘粒。
在第六方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，含有第五方面所述的载体或染色体上整合有单拷贝或多拷贝的外源的第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或单拷贝或多拷贝的第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括链霉菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括金色链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌和天蓝色链霉菌。更佳地，所述宿主细胞来自金色链霉菌苏州变种或变铅青链霉菌TK64。
在第七方面，本发明提供一种产生金核霉素的方法，包括步骤：培养第六方面所述的宿主细胞，从而表达金核霉素；以及从培养体系中分离金核霉素。
在第八方面，本发明提供一种金色链霉菌，所述金色链霉菌是金色链霉菌苏州变种(CGMCC No.0122)的突变株，所述突变株中金核霉素生物合成基因簇中的一个或多个基因失活，从而不产生金核霉素。
在另一优选例中，所述失活的基因选自anmB、anmC，anmD或anmE。
在另一优选例中，所述的失活包括中断失活、缺失失活、插入失活。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了金核霉素的化学结构。
图2显示了基因组文库黏粒的PCR筛选电泳图。各泳道如下：
M:分子量标准；
1：包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒2H-2；
2：包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒17C-10。
图3显示了金核霉素生物合成基因簇的基因分布图。
图4显示了金核霉素产生菌及基因敲除突变株的发酵产物分析。自上而下分别是金核霉素产生菌野生型菌株(WT)、anmA同框敲除突变株(△anmA)、anmB同框敲除突变株(△anmB)、anmC同框敲除突变株(△anmC)、anmD同框敲除突变株(△anmD)、anmE同框敲除突变株(△anmE)、anmG同框敲除突变株(△anmG)的发酵产物HPLC分析，及野生型中金核霉素的质谱图(LC-MS)。
图5显示了金核霉素生物合成基因簇在变铅青链霉菌(S.lividans)TK64中异源表达的发酵产物分析。图A为异源表达突变株S.lividans B-E的发酵产物HPLC图，图B为异源表达宿主菌野生型菌株S.lividans TK64的发酵产物HPLC图，图C为S.lividans B-E的发酵产物中金核霉素的质谱图(LC-MS)。
图6显示了同框敲除双交换质粒构建方法示意图。
图7显示了同框敲除突变株基因型PCR验证电泳图。从上到下分别是anmA同框敲除突变株(△anmA)、anmB同框敲除突变株(△anmB)、anmC同框敲除突变株(△anmC)、anmD同框敲除突变株(△anmD)、anmE同框敲除突变株(△anmE)和anmG同框敲除突变株(△anmG)的基因型PCR验证电泳图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从金核霉素产生菌金色链霉菌苏州变种(CGMCC No.0122)中鉴定并分离出金核霉素的生物合成基因簇，所述整个基因簇共包含4个基因，即anmB、anmC，anmD和anmE。此外，本发明人还构建了含金核霉素的生物合成基因簇(或基因)的载体和工程菌，并成功进行了金核霉素异源表达。在此基础上完成了本发明。
金核霉素
金核霉素是一种核苷类抗生素，于1987年从金色链霉菌苏州变种的发酵产物中分离得到，其由一分子腺苷与一分子葡萄糖缩合、环化而成(图1)，化学结构类似于日本三共株式会社发表的除草素Herbicdins。
金核霉素具有良好的抗菌活性，对黄单胞杆菌(Xanthomonas)引起的植物细菌病害,如柑橘溃疡病、水稻细菌性条斑病，特别是水稻白叶枯病(Xanthomonas Oryzae)有很好的治疗效果，同时金核霉素还具有使病斑叶复绿的功能。因此，金核霉素作为优质的农用抗生素得到广泛应用。
金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen et al)
金色链霉菌(Streptomyces aureus)是链霉菌是一种，其孢子丝呈紧密螺旋形，有的菌株柔曲、松敞螺旋形；其孢子呈球形、卵圆形，表面光滑。而金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen et al)是属于金色链霉菌类群，其气生菌丝呈螺旋状，一般在2-6圈左右；孢子呈球形或卵形，大小不均，孢子表明光滑；不能在纤维素上生长。
一种产生金核霉素的金色链霉菌苏州变种可获自中国微生物菌种保藏管理委员会，编号CGMCC No.0122。
金核霉素生物合成基因的集合
本发明所述的金核霉素生物合成基因的集合(set)，表示由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、编码AnmE蛋白的基因构成的基因集合。
如本文所用，“本发明多肽”或“本发明蛋白”可互换使用，指金核霉素生物合成相关蛋白，包括AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白。
本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域(如非必要区域)改变(添加、缺失或取代)少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如适当替换氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，就本领域普通技术人员而言，能够实施这种替换或改变并且仍获得具有所需生物活性的多肽。
因此，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽：(a)氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。其中，一个或多个包括1-50个，较佳地1-20，更佳地1-10个，最佳地1-5个。
在本发明中，本发明的“多肽”包括与氨基酸序列如SEQ ID NO:3-6所示的多肽相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异的多肽可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
| 初始残基 | 代表性的取代残基 | 优选的取代残基 |
| Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
| Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
| His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
| Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
| Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
载体
本文所用的术语“载体”包括能使插入/目的基因进入宿主细胞表达的克隆载体以及其他载体。表达载体可包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。
在具体的实施方式中，本发明表达载体含有本发明的金核霉素生物合成基因的集合，或含有本发明的金核霉素生物合成基因簇。
在优选的实施方式中，本发明的表达载体上含有多拷贝的本发明的金核霉素生物合成基因的集合，或多拷贝的本发明金核霉素生物合成基因簇。
宿主细胞
本文所用的术语“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，包含外源性目的基因并能使之表达的细胞。例如，宿主细胞可以是原核宿主细胞(例如，大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌)、真核宿主细胞(例如，酵母)、植物细胞等等。
在具体的实施方式中，本发明的宿主细胞宜包含本发明的表达载体，或染色体上整合有单拷贝或多拷贝的外源的金核霉素生物合成基因的集合，或单拷贝或多拷贝的金核霉素生物合成基因簇。
在优选的实施方式中，本发明的宿主细胞包括链霉菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
在优选的实施方式中，本发明的宿主细胞包括(但并不限于)：金色链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌(Streptomyces albus)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
优选地，本发明的工程菌是通过金色链霉菌苏州变种或变铅青链霉菌TK64进行基因工程改造而获得。
金核霉素基因簇中结构基因失活的金色链霉菌苏州变种
本发明还提供一种金色链霉菌，所述金色链霉菌是金色链霉菌苏州变种的突变株，所述突变株中本发明的金核霉素生物合成基因的集合中的一个或多个基因失活，或本发明的金核霉素生物合成基因簇中的一个或多个基因失活，从而所述突变株不产生金核霉素。
在具体的实施方式中，所述失活的一个或多个基因选自anmB、anmC，anmD或anmE。
本发明提供的金核霉素生物合成基因簇中一个或多个结构基因被失活的金色链霉菌苏州变种的突变株，可作为验证金核霉素基因簇中基因功能的模型或对照菌株，和/或用于外源表达金核霉素的宿主细胞。
本发明的应用及优点
金核霉素作为一种核苷类抗生素，其生物活性、作用机制和生物合成路线有其独特的地方，这些机制的阐明对于发现新的药物作用靶点、作用机制有重要意义。在对其生物合成机制有着充分理解的基础上，有助于通过对生物合成途径的合理化遗传修饰，来构建金核霉素的高产菌株或获得更具应用价值的结构类似物。
本发明以链霉菌来源的金核霉素为目标分子，从克隆其在金色链霉菌苏州变种中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法验证其负责金核霉素的生物合成。期望通过体内基因操作，异源表达等方法，研究金核霉素的生物合成机理，提高其发酵产量。这有利于合理修饰金核霉素的生物合成途径，以便获得结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型金核霉素结构类似化合物。
本发明的金核霉素生物合成基因簇的应用，包括(但并不限于)：
(1)可利用本发明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法或利用包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交从其它微生物中得到金核霉素生物合成基因的同源基因；
(2)构建包含本发明所提供的基因簇核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的质粒，以用于研究或生产目的；
(3)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段，可以通过中断金核霉素生物合成的一个或几个步骤或者引入其它同源基因而得到新的金核霉素的前体或衍生物；
(4)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因，可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其它更高的生物活性或产量的酶。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等；
(5)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径；
(6)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等；
(7)本发明所提供的具有金核霉素合成相关蛋白可用于抗体的制备；
(8)对于本发明所提供的氨基酸序列或部分序列，可对多肽进行改造，以便获得去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或提高产量或优化蛋白动力学特征；
(9)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可以用来调节金核霉素或其衍生物的产量；
(10)本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。
总之，本发明所提供的包含金核霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息有助于阐明与理解金核霉素及相关抗生素家族生物合成的分子机理。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989或Hopwood等人,1985年,Genetic manipulation of Streptomyces:ALaboratory Manual,John Innes Foundation,Norwich,UK)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1.金核霉素生物合成基因簇的克隆
(1)金色链霉菌苏州变种基因组DNA的提取：
将100μL金色链霉菌苏州变种(CGMCC No.0122)孢子悬液接种到3mL TSB(TSB30g，1L)液体培养基中，30℃，250rpm，振荡培养约24-36hr，达到对数生长期后期。取1mL接种到50mL TSB中(含5mM MgCl2,0.5%甘氨酸)，30℃，250rpm培养，约24-36hr后达到稳定生长期前期，呈微黄浑浊，并有大量菌丝悬浮物。将菌液于4℃，3500rpm，离心10min收集菌丝，用裂解缓冲液洗涤两次，得到菌丝约2-4mL。
向1mL菌丝中加入10mLSET裂解缓冲液(含溶菌酶5mg/mL)，涡旋至均一，37℃水浴温育30min-60min。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL，用裂解缓冲液新鲜配制)、混匀后加入0.6ml 10%的SDS，轻轻颠倒混匀后迅速放入70℃水浴，温育2hr，其间间隔一段时间轻轻摇一下，使其均匀，最后体系呈澄清状态。置冰上冷却，加入2.5mL 5MKAc，冰上冷却15min。加入10mL饱和酚，混匀，10mL氯仿，混匀，10000rpm，4℃离心20min。用预先灭菌破口的枪头将水相轻轻吸出置于新的50mL离心管，加等当量的CHCl3/异戊醇(体积比24：1)抽提，10000rpm，4℃离心10min。用预先灭菌破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，DNA析出后，将其置于新的离心管，加入5mL 70%乙醇洗涤，将液体慢慢倾出，然后加5mL TE溶解，加RNA聚合酶A使其终浓度为50μg/mL，37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，CHCl3/异戊醇(体积比24：1)抽提两次，向水相中加入0.1体积的3M NaAc，0.6体积的异丙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将DNA移至新的离心管，加入1mL 70%乙醇洗涤后，加入1mL无水乙醇洗涤，将乙醇吸出后，超净台中吹干，溶于适当体积的TE(pH 8.0)中。
(2)金色链霉菌苏州变种基因组文库的构建
菌种的复苏：将市售的FOSMID文库构建试剂盒(购自Epicentre生物技术公司)，按厂商的说明书进行宿主菌EPI300的复苏。在准备包装的前一天，从保存的平板上挑取单克隆于含10mM硫酸镁的50ml LB中，37℃过夜培养。
插入片段的制备：Fosmid DNA文库插入片段的大小在40kb左右，其制备可以使用注射器通过反复的吸取和推出来实现，每50次用电泳检查一次效果，直至片段大小合乎要求(10%左右的片段在36kb的对照(control)DNA附近)。此步骤中，基因组总DNA的用量最少在2.5μg以上。
目标片段的蔗糖梯度分离及回收：取蔗糖梯度离心管(体积10ml，直径约1cm)一只，加入6ml 40%蔗糖，然后小心在其顶部加入6ml 10%蔗糖，制成蔗糖梯度。把待分离的已打碎的总DNA样品加在12ml的蔗糖梯度上。回收总DNA，加1/10体积的氯化钠，2.5倍体积乙醇沉淀，洗涤，抽干后溶于ddH2O。电泳并定量。
插入片段末端补平、分离及回收：由于插入片段是以平端连入载体的，因此，需要用End-Repair Enzyme处理插入片段，使其成为平末端且5’-磷酸化的DNA片段，然后进行连接。
DNA片段连至载体：以10:1(载体:片段)的比例进行连接反应。连接产物存于-20℃。
包装：以复苏的EPI300为种子，以10%的接种量，接入10mM硫酸镁的50ml LB中，37℃培养至OD600=0.8-1.0，冰上放置(最长可放置72h)。以10μl连接产物/1管MaxPlax Lambda Packaging Extracts的比例，冰上融化MaxPlax Lambda PackagingExtracts。取1.5ml灭菌eppendorf管，置于冰上，从每支MaxPlax Lambda PackagingExtracts取25μl(总量的一半)加到eppendorf管中，并迅速将剩下的25μl MaxPlaxLambda Packaging Extracts冻存于-70℃。将“DNA片段连接至载体”步骤中的10μl连接产物加入到含25μl MaxPlax Lambda Packaging Extracts的eppendorf管中，置于冰上。混匀，短暂离心，将液体甩至管底。30℃温浴90min。将每支MaxPlax Lambda PackagingExtracts剩下并冻存的25μl MaxPlax Lambda Packaging Extracts迅速加入至含反应物的eppendorf管中，混匀。30℃温育90min。向每支eppendorf管中加入稀释缓冲液至终体积为1ml.，轻轻混匀后。向每支加入25μl氯仿，轻轻混匀后保存于4℃。
滴度测定：按照下述比例稀释包装DNA(PDB：噬菌体稀释缓冲液)
A)1:102稀释，将10ul的包装噬菌体加入990ul PDB。
B)1:104稀释，将10ul的1:102稀释液加入990ul PDB。
C)1:105稀释，将100ul的1:104稀释液加入900ul PDB。
D)1:106稀释，将100ul的1:105稀释液加入900ul PDB。
取1.5ml灭菌eppendorf管，向其中加入中EPI300各100μl，并向各管中分别加入10μl上述A)、B)、C)、D)中的稀释液，37℃温育20min。将转染好的菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜。克隆计数，计算滴度。
转染与保存：根据滴度确定的稀释比例将得到的包装DNA稀释，此时可以加入甘油至终浓度20%，然后将包装DNA作为初级文库冻存于-70℃；或者进行转染，并将转染后得到的克隆用合适体积的LB洗下后加入甘油(终浓度20%)，冻存于-70℃。
(3)PCR方法筛选金色链霉菌苏州变种基因组文库
本发明人对金核霉素产生菌金色链霉菌苏州变种进行全基因组序列测定。从金核霉素的化学结构上分析，它是由一分子腺苷与一分子葡萄糖缩合、衍生而成，根据生物合成途径的逆向分析，本发明人设计了以下引物：ACGTCGTCGTCTGGGACC(SEQID NO:9)和GAGAGGAACACGACCACG(SEQ ID NO:10)，采用PCR方法筛选基因组文库。PCR结束后，1%琼脂糖电泳检查结果。将筛选得到的多个黏粒经过测序验证后，确定包含金核霉素生物合成所需要的基因，其中两个命名为17C-10和2H-2(图2)。
发明人分析了上述粘粒中序列，发现17C-10包含金核霉素生物合成基因簇的10,216bp连续核苷酸序列，其GC含量为71.3%，共包含了7个开放式读码框(openreading frame,orf)。各个基因功能的分析结果见表1。
表1：金核霉素生物合成基因簇以及边界基因的功能
实施例2.基因敲除方法验证基因簇与金核霉素生物合成相关
根据基因编码蛋白的功能分析，金核霉素的生物合成基因簇被确定为从基因anmB到anmE(图3)，涵盖染色体5.100kb的区域，包含4个合成相关基因。
本发明人通过对金色链霉菌苏州变种中的基因(anmB-anmE)以及边界基因(anmA和anmG)的同框敲除实验(参照实施例3)，证实了此基因簇的正确性。
anmA编码一个磷酸水解酶，同框敲除后得到突变株ΔanmA，该突变株不影响金核霉素的产生；
anmB编码一个腺苷高半胱氨酸水解酶，同框敲除后得到突变株ΔanmB，该突变株中金核霉素不再产生；
anmC编码一个脱氢酶，同框敲除后得到突变株ΔanmC，该突变株中金核霉素不再产生；
anmD编码一个氧化还原酶，同框敲除后得到突变株ΔanmD，该突变株中金核霉素不再产生；
anmE编码一个与radical SAM相关的蛋白，同框敲除后得到突变株ΔanmE，该突变株中金核霉素不再产生；
anmG编码一个未知蛋白，同框敲除后得到突变株ΔanmG，该突变株不影响金核霉素的产生(图4)。
此外，anmF同框敲除后得到突变株ΔanmF，该突变株不影响金核霉素的产生(未示出)。
由此可以确定，基因anmA、基因anmF和基因anmG与金核霉素的生物合成无关，而基因anmB-anmE与金核霉素的生物合成相关。
实施例3.金核霉素产生菌中同框敲除突变株的构建
(1)金核霉素产生菌属间接合转移系统的建立：
接合转移供体菌的制备：从经过转化的大肠杆菌培养平板上挑取单菌落接到含2-3mL LB的试管(加入适当抗生素)中37℃震荡培养过夜，吸取1mL菌液接到50mLLB中，置于37℃摇床250rpm中培养至OD600为0.4-0.45。将菌液离心，用等体积的LB洗涤两次，收集于1.5mL试管中，然后用1mL的LB重悬，作为供体菌。
接合转移受体菌的制备：-80℃、20%甘油保存的金核霉素产生菌的孢子悬液用TES缓冲液洗涤两次，再用500μL TES缓冲液重悬，50℃热休克10分钟，然后加入500μL TSB，混匀，30℃温育2-5小时，6000rpm离心2min，弃上清收集细胞，然后用500μL LB重悬做为受体菌。
接合转移：取100μL受体菌和100μL供体菌混合，然后等量接种到接合转移培养板上，30℃培养16-20小时。加入3mL的无菌H2O，用推棒轻刮，直到表面全部疏水，用枪吸干水分。然后加盖1mL含有阿泊拉霉素(50μg/mL)和萘啶酮酸(50μg/mL)的无菌水，30℃培养3-5天。
(2)双交换同框敲除质粒的构建
采用如图6所示的方法，构建各个基因的双交换同框敲除质粒。各基因敲除质粒构建的PCR引物如表2所示。
各基因敲除质粒中用于双交换的同源臂均是以金核霉素产生菌的基因组DNA为模板，通过PCR扩增后，利用引物上设计的酶切位点(表2中下划线标示)连入到克隆载体上，酶切和测序验证正确后再利用两端的酶切位点酶切出来，两片段同时连入到链霉菌常规载体pKC1139(链霉菌常用穿梭载体，温敏性复制子，见CN200910199530.2)中，得到最终同框敲除质粒。
表2:同框敲除质粒构建引物及验证引物
(3)双交换同框敲除突变株的获得
将鉴定正确的同框敲除质粒转入大肠杆菌中，进行大肠杆菌与金核霉素产生菌间的属间接合转移，得到的接合子接入含Am(25μg/mL)的YEME中，于30℃振荡培养，菌落培养较浓后涂布到含Am(50μg/mL)的MS平板上，于37℃整合，在温度为37℃时，未发生重组的细胞没有Am的抗性，生长被抑制，而发生了重组的细胞则能正常生长。接下来将在37℃下整合好的接合子转入到不含抗生素的YEME中，诱导使其在没有压力的环境下发生双交换，转接三到四次，随后取0.1μl菌液涂布到MS平板上，待其长出单克隆后，将单克隆挑出，每个克隆分别接种到含Am(50ug/ml)和不含抗生素的MS平板上，30℃继续培养24hr，挑选出在无抗的培养基上正常生长，而在含Am的平板上不生长的菌落，即为双交换突变株。双交换突变株经PCR验证基因型后，既可进行发酵验证金核霉素的产生是否被中断。
各基因同框敲除突变株的PCR验证引物如表2所示。各基因敲除突变株的基因型PCR验证如图7所示。
实施例4.以变铅青链霉菌TK64为宿主的异源表达突变株的获得
从经过转化的大肠杆菌培养平板上挑取单菌落接到含2-3mL LB的试管(阿泊拉霉素=50μg/mL)中37℃震荡培养过夜，吸取1mL菌液接到50mL LB中，置于37℃摇床250rpm中培养至OD600为0.4-0.45。将菌液离心，用等体积的LB洗涤两次，收集于1.5mL试管中，然后用1mL的LB重悬，作为供体菌。从-80℃冰箱中取出于20%甘油保存的lividans TK64的孢子悬液用TES缓冲液洗涤两次，再用500μL TES缓冲液重悬，50℃热休克10分钟，然后加入500μL TSB，混匀，30℃温育2-5小时，6000rpm离心2min，弃上清收集细胞，然后用500μL LB重悬做为受体菌。取100μL受体菌和100μL供体菌混合，然后等量接种到接合转移培养板上，30℃培养16-20小时。加入3mL无菌水，用推棒轻刮，直到表面全部疏水，用枪吸干水分。然后加1mL含有阿泊拉霉素(50μg/mL)和萘啶酮酸(50μg/mL)的H2O，30℃培养3-5天挑取接合子。
将获得的接合子接种到液体培养基TSB(阿泊拉霉素=25μg/mL，萘啶酮酸=25μg/mL)中，30℃振荡约28hr。取出100μL涂布在MS(阿泊拉霉素=50μg/mL)，30℃培养7天，收孢子，保存于-80℃；取出100μL菌液接种于在TSB(阿泊拉霉素=25μg/mL，5mM氯化酶，0.5%甘氨酸)中，30℃振荡培养2天，用于抽提突变菌株的基因组总DNA，采用PCR方法验证其基因型。
实施例5.金核霉素产生菌及其突变株、异源表达突变株的发酵、产物分离与检测
将金核霉素产生菌及其突变株、异源表达突变株的孢子涂布于斜面培养基(可溶性淀粉：2％，KNO3：0.1％，K2HPO4：0.05%，MgSO4：0.05%，NaCl：0.05%，FeSO4：0.001%，琼脂：20%)培养，28℃，恒温箱40小时，然后接种1CM2大小带有菌落的斜面培养基于50mL发酵培养基(葡萄糖：5%，玉米淀粉：2%，黄豆饼粉：1%，花生饼粉：1%，硝酸铵：0.6%，NaCl：0.3%，PH：7.2，CaCO3：0.6%)中，于28℃，250rpm摇床培养96小时。将发酵液合并，转移到离心管中，3800rpm，离心15min，弃去菌丝沉淀。上层清液可以于取1mL置于离心管中，经12000rpm离心后，取上清直接用来HPLC和LC-MS检测。
取发酵液提取物溶液20μL进样，检测波长：UV=260nm；流动相条件：流速=1mL/min；A流动相=H2O(含10mM磷酸二氢钾)；B流动相=甲醇；洗脱条件：0-6min4%B;8-10min 20%B;12-15min4%B，洗脱时间为15min。
实施例6 仅包含基因anmB-anmE的异源表达质粒实现在异源宿主中合成金核霉素
构建仅含有基因anmB-anmE的异源表达质粒：合成引物B-For:TAAAAGCTTATCGGGTCAATGCCAAGTCG(SEQ ID NO:11)和E-Rev:TAATCTAGAGCCCAGTAGAGGA GGGAGAAGG(SEQ ID NO:12)，以常规方法抽提的金色链霉菌苏州变种(CGMCC No.0122)的基因组DNA模板，进行PCR扩增，得到的6.3kb扩增片段。该扩增片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO.1第4646-10971位。
扩增片段用HindIII+XbaI酶切，与红霉素启动子片段(EcoRI+HIndIII酶切，SEQ IDNO:49)，一起连入常规载体pSET152(EcoRI+XbaI酶切)(基因组整合型的链霉菌常用穿梭载体，见CN200810224533.2或CN200910056338.8)，得到异源表达质粒pL WT-B-E。经过酶切、测序验证正确后，将质粒通过实施例4中属间接合转移的方法导入常规的变铅青链霉菌TK64(Streptomyces lividans TK64)(见CN91108629.3、CN200910144213.0、US5,232,845等)中，经阿泊拉霉素抗性筛选，得到异源表达突变株S.lividans B-E。突变株通过基因型验证正确后，参照实施例5中的发酵和检测方法进行表型分析，通过LC-MS检测证明在突变株中产生金核霉素，其与金核霉素的报道分子量一致，而对照变铅青链霉菌TK64菌株不产生金核霉素。
结果表明，仅包含金核霉素生物合成基因簇基因anmB-anmE的异源表达质粒pLWT-B-E可以在变铅青链霉菌TK64中表达并产生金核霉素(图5)，直接证明了所述基因簇负责金核霉素的生物合成。
实施例7 增加金色链霉菌苏州变种中金核霉素生物合成基因簇的拷贝数使得金核霉素的产量提高
将上述(2)中构建的质粒pLWT-B-E，通过实施例3(1)中的属间接合转移的方法导入到金色链霉菌苏州变种中，得到金核霉素生物合成基因簇(基因anmB-anmE)的拷贝数增加了一倍的菌株。参照实施例5中的发酵和检测方法，与金色链霉菌苏州变种野生型的发酵液进行发酵产量比对。通过检测证明在导入金核霉素生物合成基因簇的菌株中产生金核霉素，其与金核霉素的报道分子量一致，而该菌株中金核霉素的产量明显高于对照菌株中的产量。
结果表明，增加了金核霉素生物合成基因簇拷贝数的金色链霉菌苏州变种，其金核霉素的发酵产量得到了提高。
实施例8 仅包含基因anmB-anmE的异源表达质粒实现在异源宿主中合成金核霉素
重复实施例6，不同点在于，将4个基因anmB、anmC、anmD和anmE的表达盒分别放置在2个表达载体上(片段(a)anmB-anmC的表达盒位于一个载体；而片段(b)anmD-anmE位于另一载体)，同时将二个表达载体转入变铅青链霉菌TK64。通过检测证明在导入二个表达载体的菌株中产生金核霉素，其与金核霉素的报道分子量一致，而对照菌株中不产生金核霉素。
结果表明，即使4个基因不位于同一载体，只要宿主细胞包含金核霉素生物合成相关的四个基因anmB、anmC、anmD和anmE的各自表达盒，就可在变铅青链霉菌TK64中表达相应蛋白并产生金核霉素。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种金核霉素生物合成基因的组合物，其特征在于，所述基因组合物由编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的AnmB蛋白的基因、编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的AnmC蛋白的基因、编码氨基酸序列如SEQID NO:5所示的AnmD蛋白的基因、编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的AnmE蛋白的基因构成。
2.一种金核霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列为SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为：
1)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位碱基所示，编码的蛋白为腺苷高半胱氨酸水解酶，长度为556个氨基酸；
2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第6957-8057位碱基所示，编码的蛋白为脱氢酶，长度为366个氨基酸；
3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第8054-9172位碱基所示，编码的蛋白为氧化还原酶，长度为372个氨基酸；和
4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第9169-10434位碱基所示，编码的蛋白为radical SAM相关蛋白，其长度为421个氨基酸。
3.如权利要求2所述的金核霉素生物合成基因簇所编码的编码蛋白。
4.如权利要求3所述的编码蛋白，其特征在于，所述的编码蛋白为AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。
5.如权利要求1所述的金核霉素生物合成基因的组合物，或权利要求2所述的金核霉素生物合成基因簇，或权利要求3或4所述的编码蛋白的用途，其特征在于，用于合成抗生素金核霉素、金核霉素的药学上可接受的盐。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的金核霉素生物合成基因的组合物，或含有权利要求2所述的金核霉素生物合成基因簇。
7.一种重组的宿主细胞，其特征在于，含有权利要求6所述的载体或染色体上整合有单拷贝或多拷贝的外源的权利要求1所述的金核霉素生物合成基因的组合物，或单拷贝或多拷贝的权利要求2所述的金核霉素生物合成基因簇。
8.一种产生金核霉素的方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达金核霉素；以及从培养体系中分离金核霉素。
9.一种金色链霉菌，其特征在于，所述金色链霉菌是从中国微生物菌种保藏管理委员会获得的编号为CGMCC No.0122的金色链霉菌苏州变种的突变株，所述突变株中核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示的金核霉素生物合成基因簇中的一个或多个基因失活，从而不产生金核霉素。
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