CN104560838A - 应用重组胸苷激酶酶法合成2’-脱氧嘧啶核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以DNA重组技术构建高效表达的胸苷激酶的基因工程菌，并涉及利用该基因工程菌所产的胸苷激酶合成2’-脱氧嘧啶核苷酸的方法。本发明的技术方案包括利用重组DNA技术，构建胸苷激酶的表达载体，并转至大肠杆菌，得到高效表达胸苷激酶的基因工程菌。以该工程菌所产的胸苷激酶作为酶源，由胸苷、2’-脱氧尿苷及2’-脱氧-5-氟尿苷合成相应的2’-脱氧核苷酸。利用本发明的方法，具有简单，高效，对环境友好，适合于工业化生产。

Description

应用重组胸苷激酶酶法合成2’-脱氧嘧啶核苷酸
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胸苷激酶的重组构建及高活力胸苷激酶的制备的方法，以及应用该酶由胸苷酶法合成2’-脱氧嘧啶核苷酸的方法。
背景技术
遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)主要由2’-脱氧核苷酸组成，包括2’-脱氧腺苷酸(dAMP)、2’-脱氧胞苷酸(dCMP)、2’-脱氧鸟苷酸(dGMP)和胸苷酸(TMP)。这些脱氧核苷酸还参与细胞内大量的生化反应，在生命活动中扮演着重要角色。另外，这些脱氧核苷酸还作为合成脱氧核苷三磷酸的起始原料，随着现代分子生物学技术的发展，需求是越来越大。
目前脱氧核苷酸的合成方法主要分为大类：从DNA为原料采取酶法降解或以2’-脱氧核苷为原料采用化学法合成。
酶法降解DNA合成2’-脱氧核苷酸的工艺大体如下(Makoto Hayashi et a1..Food research International，1996，29(8)：751-755；吴汉民等，水产学报，2000，24(3)：275-279)：1)应用5’-磷酸二酯酶或核酸酶P1酶法降解DNA钠盐，得到混合的脱氧核苷酸；2)反应液经活性炭、硅藻土处理脱去蛋白并进一步使用离子交换树脂纯化分离，得到单个的脱氧核苷酸；3)将所得的单个核苷酸结晶干燥后即可得到2’-脱氧核苷酸。本工艺对于制备混合2’-脱氧核苷酸具有一定的实际意义，但是由于四种核苷酸性质较为接近，分离纯化非常麻烦，所得的单个脱氧核苷酸需要反复结晶才能得到较高的纯度，收率较低。且由于近年来，由于海洋环境的恶化，渔业资源严重受到限制，作为提取DNA的鱼白越来越少，产业受到严重限制。
化学法合成2’-脱氧核苷酸的工艺大体如下(Masaharu Y.T.et al..Bull.Chem.Soc.Jpn1969，42：3505-3508)：2’-脱氧核苷在低温下溶于磷酸三乙酯或磷酸三甲酯中，然后缓慢滴入三氯氧磷，反应结束后，加入大量冰块及冰水，破坏掉未反应的三氯氧磷，最后经阴阳离子交换层析分离得到胸苷酸。本方法的优点是反应物浓度较高，反应时间快。但是由于要大量使用有毒的三氯氧磷及磷酸三乙(甲)酯，对环境对及操作人员伤害较大。且反应混合物中混有大量的磷酸盐及氯化钠，不利于后期的分离纯化。
上述文献中所述及的方法，2’-脱氧核苷酸收率低、或分离工艺效率低下、或反应工艺对环境不友好，均不利于大规模制备2’-脱氧核苷酸。
发明内容
本发明的发明人经过广泛的探索，发明了一种制备高活胸苷激酶的方法。然后发明了应用该酶由2’-脱氧核苷合成2’-脱氧核苷酸的方法。
因此，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种构建生产胸苷激酶重组基因工程菌的方法。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种用该重组的基因工程菌产生的胸苷激酶合成2’-脱氧核苷酸的方法，以解决现有技术中存在的2’-脱氧核苷酸的收率低、或分离工艺效率低下、或反应工艺对环境不友好的制备之类的技术缺陷。
本发明的构建胸苷激酶重组工程菌的方法包括如下步骤，1)提取含有胸苷激酶基因片段的基因组，2)设计引物并扩增出目的基因；3)将扩增的目的基因经酶切后插入到合适载体中，构建表达载体；4)将表达载体转入到大肠杆菌，得到重组基因工程菌。
胸苷激酶的基因序列来源不受限制，各类杆菌为最方便的来源，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)等。在本发明的一个优选的实施例中胸苷酶基因序列来自于大肠杆菌。胸苷激酶因序列可用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据Genebank公布的大肠杆菌中胸苷激酶的tdk基因序列(Genebank编号12930562)设计引物，并用市售的cDNA库或按照本领域的技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。
表达载体选自本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒或载体均可使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法均能用于构建胸苷激酶的表达载体，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选的含有一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如大肠杆菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
优选地，表达载体选自质粒pUC18、pUC19、pBV220、pBR322、pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明一个优选的实施例中所使用的质粒为pET28a(具有卡那霉素抗性，购自Novagen公司)，此质粒可在大肠杆菌中稳定存在，且在IPTG或乳糖诱导下可大量表达胸苷激酶。
包含上述相应DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可用于转化适当的宿主细胞，如大肠杆菌等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞是原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可以用电穿孔的方法进行。
优选地，本发明提供一种胸苷激酶表达基因工程菌E.coli BL21pET28a-TDK(以下简称E.coliTDK)。更优选地，本发明提供一种胸苷激酶表达基因工程菌E.coli BL21pET28a-TDK，其包含表达载体pET28a-TDK，所述的表达载体系将胸苷激酶基因插入质粒pET28a的BamHI和Sac I位点之间获得。
一种制备胸苷激酶的方法，包括如下步骤：
(a)培养大肠杆菌E.coli TDK，和，
(b)从培养物中回收所说的胸苷激酶。
步骤(a)中培养所需的培养基一般包括碳源、氮源、无机盐等。所说的碳源选自葡萄糖、果糖、糊精、蔗糖等，所说的氮源选自玉米浆、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆水解液、尿素等，所说的无机盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、磷酸盐等。
优选的用重组的大肠杆菌E.coliTDK制备胸苷激酶的方法，其特征在于，步骤(a)中培养大肠杆菌E.coli TDK的培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g／L，酵母粉3g／L和氯化钠10g/L，50μg／ml卡那霉素，用2mol／L的氢氧化钠调节pH为7.0(当需要使用固体培养基时只须再入20g琼脂即可)；在有氧条件下培养5-18h，pH控制在5-9之间，培养温度为20-45℃之间，诱导剂为IPTG或乳糖。优选的培养条件为在有氧条件下培养8-12h，pH为6-8，培养温度为30-37℃，诱导剂为乳糖。
本发明一个优选的实施例在培养和诱导胸苷激酶的条件如下：37℃振荡培养3h，加入1mmol／mL乳糖作为诱导剂，继续培养5h。
优选的一种用重组的大肠杆菌E.coli TDK制备胸苷激酶的方法，其特征在于，其中步骤(b)回收所说的胸苷激酶的方法选自(i)离心培养物收集菌体、直接用于酶转化；和(ii)经破碎后用酶液用于酶转化；和(iii)用常规的固定化技术制备固定化酶用于酶转化。
在本发明的另一方面，提供一种用本发明的基因工程菌制备的重组胸苷激酶转化合成胸苷酸的方法，用上述制备的胸苷激酶：湿菌体、菌体破碎液或者固定化酶在底物(包括胸苷和腺苷三磷酸)浓度为1-100mmol／L、缓冲液浓度在5-200mmol／L、pH在4-11、反应温度为20-60℃、反应时间1-12h转化合成胸苷酸。
本发明所使用的胸苷激酶可以完整的重组菌湿菌体，也可以菌体破碎后的粗酶液，或将此粗酶液固定化包埋后使用。
本发明所使用的底物分为磷酸基的供体和磷酸基的受体，可作为磷酸基供体的可为三磷酸腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸胞苷、三磷酸鸟苷或相应的脱氧核苷三磷酸；可作为磷酸基受体的为胸苷、2’-脱氧尿苷、2’-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷等。
优选的用重组胸苷激酶由胸苷和三磷酸腺苷转化生产胸苷酸的方法：将培养所得的菌体用生理盐水洗涤干净并在超声波下破碎后离心所得上清液作为酶源，控制胸苷和三磷酸腺苷的浓度在1-100mmol／L之间，反应温度为20-60℃，反应时间在1-12h之间。
本发明的酶活分析方法参照文献进行(Phyllis RB.HPLC in Nucleic AcidResearch：Methods and Applications.Boca Raton：CRC Press，1984.)。
脱氧核苷酸类化合物的分析方法采用高效液相色谱法。色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪；Ajilent1200；色谱柱：Hypersil SAX；流动相：0.05mol／L的磷酸钾，pH为3.0；流速为1mL／min；室温；检测波长254nm。
本发明提供了重组胸苷激酶大肠杆菌E.coli TDK，所表达的胸苷激酶的酶活力比野生菌种高30倍以上，用本发明的菌种制备胸苷激酶可以高效酶法合成2’-脱氧嘧啶核苷酸。在本发明的具体实施例中，胸苷酸及其类似物的转化率均可达到85％以上。
以下结合具体实施方式进一步说明本发明，但是不以任何形式限制本发明的范围。基因工程操作如PCR、重组载体构建、感受态细胞制备、转化、酶切等在未有特定说明情况下，均按照本领域技术人员公知的技术如按照<<分子克隆实验指南>>(第三版)(萨姆布鲁克等，科学出版社，2002)或者试剂盒厂家推荐的方法进行。
具体实施方式：
实施例1
重组大肠杆菌的构建按<<分子克隆实验指南>>(第三版)(萨姆布鲁克等，科学出版社，2002)所述进行。
1)携带tdk基因片段的质粒构建
根据Genebank公布的瑞士乳杆菌胸苷激酶的tdk基因序列(Genebank编号12930562)，设计引物如下：
5’引物(Seq ID No.1)：5'-CGGGATCCATGGCACAGCTATATTTC(BamHI)
3’引物(Seq ID No.2)：5’-GCGAGCTCTTAATCGTGGCGATGC(Sac I)
以大肠杆菌的染色体DNA为模板做PCR：95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。从琼脂糖电泳上回收PCR产物和pET-28a载体经限制性酶BamH I和Sac I内切并用T4DNA连接酶连接，得到质粒pET-28a-TDK。
2)转化
按<<分子克隆实验指南>>制备感受态大肠杆菌BL21(DE3)，将上述构建好的pET-28a-TDK转入其中。
转化子涂在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，挑选长出的单菌落，抽取质粒，经酶切测序，证实重组质粒中外源基因序列与Genebank中发表的相应序列tdk完全相同。将此重组菌命名为E.coli BL21pET28a-TDK(简称E.coliTDK)。
实施例2
从斜面上刮取一环E.coliTDK接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养16小时。吸取1mL菌液接种于装有30mL LB+50μg／mL卡那霉素培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养3h，加入0.5mmol／L IPTG或1mmol／L乳糖作为诱导剂，继续培养6h，取1mL发酵液10000r／min离心收集微生物细胞并用生理盐水洗涤三次，菌体加入1mL生理盐水，于超声波下破碎后离心去除沉淀。同时培养E.coli BL21作为对照。胸苷激酶活性检测结见表1。由于IPTG与乳糖诱导效果类似，为减少成本，以下的实施例中均使用乳糖作为诱导剂。
表1
胸苷激酶活性*
E.coliBL21 43.6
E.coliNTD(IPTG诱导) 1439.2
E.coliNTD(乳糖诱导) 1399.8
注：酶活单位为U／mg protein
实施例3
胸苷激酶酶液制备见实施例2。
称取0.03mL胸苷激酶酶液，加入含有底物20mmol／L的三磷酸腺苷和胸苷、5mM的MgCl2，50mmol／L pH8.0的Tris-HCl缓冲液1mL中，40℃反应2h，100℃水浴加热5min终止反应，离心取上清液，HPLC检测产物胸苷酸，转化率为88.6％。而加入相同体积的由E.coli BL21制备的酶液的反应中，未检测到胸苷酸。
实施例4
反应配方同实施例3，但是加入的底物为三磷酸腺苷和2’-脱氧尿苷。反应结束后经检测2’-脱氧-尿苷酸的转化率为87.2％，而对照未检测到产物。
实施例5
反应配方同实施例3，但是加入的底物为三磷酸腺苷和2’-脱氧-5-氟尿苷，反应结束后经检测2’-脱氧-5-尿苷酸的转化率为85.7％，而对照未检测到产物。

Claims (8)

1.一种胸苷激酶表达基因工程菌E.coli BL21pET28a-TDK,其包含表达载体pET28a-TDK,所述的表达载体系将胸苷激酶基因插入质粒pET28a的BamH I和Sac I位点之间获得。
2.一种制备胸苷激酶的方法，包括如下步骤：
(a)培养根据权利要求1的工程菌，和，
(b)从培养物中回收所说的胸苷激酶，其中，
步骤(a)中培养所需的培养基包括碳源、氮源、无机盐，所说的碳源选自葡萄糖、果糖、糊精、蔗糖，所说的氮源选自玉米浆、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆水解液、尿素，所说的无机盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、磷酸盐；
步骤(b)回收所说的胸苷激酶的方法选自(i)离心培养物收集菌体、直接用于酶转化；和(ii)经破碎后用酶液用于酶转化；和(iii)用常规的固定化技术制备固定化酶用于酶转化。
3.一种制备胸苷激酶的方法，包括如下步骤：
(1)培养根据权利要求1的工程菌，和，
(2)从培养物中回收所说的胸苷激酶，其中；
步骤(1)中培养大肠杆菌E.coli TDK的培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g／L，酵母粉3g／L和氯化钠10g／L，50μg／ml卡那霉素，用2mol／L的氢氧化钠调节pH为7.0；在有氧条件下培养5-16h，pH控制在5-9之间，培养温度为20-45℃之间，诱导剂为IPTG或乳糖；
步骤(b)回收所说的胸苷激酶的方法选自(i)离心培养物收集菌体、直接用于酶转化；和(ii)经破碎后用酶液用于酶转化；和(iii)用常规的固定化技术制备固定化酶用于酶转化。
4.根据权利要求3的制备胸苷激酶的方法，其特征在于，培养8-12h，pH为6-8，培养温度为30-37℃，诱导剂为乳糖。
5.根据权利要求4的制备胸苷激酶的方法，其特征在于，在有氧条件下、37℃培养3h，加入1mmol／mL乳糖作为诱导剂，继续培养6h。
6.一种用重组胸苷酶转化合成脱氧核苷酸的方法，其特征在于用根据权利要求2-5任一所述的方法制备的胸苷激酶：湿菌体、菌体破碎液或者固定化酶在磷酸基团供体和脱氧嘧啶核苷受体浓度为1-100mmol／L、缓冲液浓度在5-200mmol／L、pH在4-11、反应温度为20-60℃、反应时间1-12h转化合成脱氧核苷酸。
7.根据权利要求6所述的用重组胸苷激酶转化合成脱氧核苷酸的方法，其特征在于磷酸基团供体的选自三磷酸腺苷、三磷酸胞苷、三磷酸尿苷、三磷酸鸟苷，脱氧核苷受体选自胸苷、2’-脱氧尿苷、5-氟-2’-脱氧尿苷。
8.根据权利要求7所述的用重组胸苷激酶转化合成脱氧核苷酸的方法，其特征在于磷酸基团供体的选自三磷酸腺苷，脱氧核苷受体选自胸苷、2’-脱氧尿苷、5-氟-2’-脱氧尿苷。
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