CN106282220B - 一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷的方法，包括如下步骤：步骤1)，将磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体；步骤2)，将所述构建的三价基因枯草芽孢杆菌表达载体通过电击转化到枯草芽孢杆菌，并逐步筛选后，获得的菌种合成肌苷的能力提高16.9‑27.8％。本发明可显著提高肌苷合成过程中产物的转化效率，降低终产物对肌苷合成关键酶的反馈抑制，促进枯草芽孢杆菌肌苷合成。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法。

背景技术

肌苷(Inosine)又名次黄嘌呤核苷，是一种多用途的嘌呤核苷，它广泛应用于合成食品增鲜剂IMP。此外，由于它可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的腺三磷水平提高，肌苷还用于心脏病、肝病、白血球减少症、血小板减少症、视神经萎缩和中心性视网膜炎等疾病的治疗，以及预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用，有关肌苷的生产从六十年代以来就开展了大量的研究工作。除此之外，肌苷与锑剂合用可预防血吸虫病药物所因起对心脏和肝脏的副作用，制成肌苷二醛、异丙肌苷、三氮唑核苷等药物对肿瘤和病毒有很好的治疗作用。

1970年肌苷在意大利首次上市，我国1971年即正式生产，对其进行了大量的研究。在生产菌的选育和改造方面，日本味之素(Ajinomoto)公司和武田制药厂都利用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌作为诱变出发菌株，采用物理或化学诱变方法，选育出产苷水平较高的生产菌株。六十年代末至八十年代初，针对细菌体内核苷酸合成途径和调节机理开展了大量研究，并完成了嘌呤核苷生物合成途径操纵子的基因克隆和全序列测定，研究的重点随之转移到利用基因工程的方法构建重组菌。

1982年日本味之素公司首次通过对嘌呤结构类似物抗性基因克隆得到的菌株AJ11836可积累3.1g/L的肌苷。随后得到的AJ11837(Ade-,Arg-,Leu-,8-AGr,SGr/Kmr,8-AGr,SGr)可积累肌苷4.0g/L。之后Miyagawa等人通过基因工程手段对嘌呤核苷生产菌株关键酶进行了一系列修饰改造，通过插入失活SAMP基因减弱了肌苷(鸟苷)发酵过程中的反馈抑制，得到的B.subtilis BM 1051肌苷和鸟苷产率分别提高到9.5g/L和5.0g/L利用含有IMP脱氢酶和氯霉素乙酰转移酶基因的质粒PEX203转化B.subtilis NA-6128，得到了氯霉素抗性的NA-6141可以产生35g/L的肌苷；利用pPA350质粒得到的NA6201不仅具有SAMP合成酶缺失突变，还附加有氯霉素抗性标记，遗传标记非常稳定，肌苷产量可达24.3g/L。

到90年代Miyagawa等人又针对关键酶的启动子进行了一系列改造，通过增强pur操纵子的启动子区域得到了产肌苷14g/L和鸟苷2g/L的工程菌；通过基因工程手段对磷酸核糖焦磷酸合成酶(PPS)的核糖体结合位点或者该酶的启动子进行基因操作使得到的转化子PPS活力提高了2-8倍，积累肌苷14g/L和鸟苷2.5g/L。此外Yamazaki等通过转化促旋酶(DNA gyrase)抑制剂抗性基因得到IMP脱氢酶低表达水平的B.subtilis NA6301可积累22g/L的肌苷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法，针对生产菌中嘌呤核苷合成途径进行深度改造，提高生产菌种合成肌苷的能力。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法，包括如下步骤，

步骤1)，将磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体。

步骤2)，将所述构建的三价基因枯草芽孢杆菌表达载体通过电击转化到枯草芽孢杆菌。

进一步，步骤1)中，所述磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF、氨基咪唑核苷酸羧化酶purK和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

步骤1)中，所述氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因的改造方法是：消除氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因中的721位和961位HindIII酶切位点，422位SacI酶切位点。

步骤1)中，所述腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因的改造方法是：消除腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因中558位NdeI酶切位点。

再，步骤1)构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体的过程中，用于控制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因表达的启动子为鸟苷pur启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

步骤1)构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体的过程中，用于控制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因表达的终止子为葡萄糖酸盐操纵子(gnt)终止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

本发明所述的构建三价基因枯草杆菌表达载体的方法为：在常规克隆载体pUC18中插入氯霉素表达单元，通过T4DNA连接酶将purF基因与改造的purK基因和purB基因分别与鸟苷pur启动子和葡萄糖酸盐操纵子gnt终止子的连接，然后将3个基因的表达单元插入表达载体，构建含有高效表达由purF、改造后的purK和purB基因组成的枯草芽孢杆菌表达载体pUCKFB。

在枯草杆菌中，嘌呤核苷酸的合成，从5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)起，经11个酶催化10步反应生成次黄苷酸(IMP)，再经两个支路分别生成鸟苷酸(GMP)和腺苷酸(AMP)。这11个酶基因位于多顺反子pur操纵子上，其中，磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶(GAPTase；purF)催化是合成代谢的第一步反应，该purF基因表达受到鸟苷酸和腺苷酸的强烈抑制。氨基咪唑核苷酸羧化酶(purK)和腺苷酸琥珀酸裂解酶(purB)处于操纵子的尾部，表达较弱，影响IMP合成。所以，磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF、氨基咪唑核苷酸羧化酶(purK)和腺苷酸琥珀酸裂解酶(purB)是3个肌苷合成关键酶。

本发明所述构建的三价基因枯草芽孢杆菌表达载体pUCKFB通过电击法导入到枯草芽胞杆菌中，所述枯草芽胞杆菌优选为肌苷生产菌种。

本发明能够减少肌苷合成过程中腺苷对肌苷合成产生的反馈抑制，提高肌苷合成中关键酶的表达效率，进而大大提高枯草芽孢杆菌合成肌苷的能力，具体是肌苷产量至少可提高16.9-27.8％。

本发明的有益效果：

1.本发明在枯草杆菌中转入不受腺苷酸抑制的3个肌苷合成关键酶基因后，迅速利用细胞中丰富的底物5-磷酸核糖焦磷酸朝肌苷方向合成，可显著提高肌苷合成过程中产物的转化效率，降低终产物对肌苷合成关键酶的反馈抑制。因此，利用本发明构建的体系可显著提高枯草芽孢杆菌合成肌苷的能力。

2.本发明构建的体系中所有基因可以整合到细菌染色体上，因此，比较稳定。

附图说明

图1为本发明实施例3中构建三价基因枯草杆菌表达载体pUCKFB示意图。

具体实施方式

以下通过实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1构建改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶(purK)基因

提取枯草杆菌基因组DNA。取培养好的细菌培养液1.5mL于离心管中，10000rpm，离心1min，弃上清，收集菌体。在离心管中加入200μL的Tris缓冲液，0.3g石英砂，200μL的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，漩涡振荡3min(注意石英砂不要沾到离心管的管口处，以免离心管的管口盖不紧发生漏液)；加入200μL的TE缓冲液，漩涡振荡混匀；将离心管于13000rpm离心5min，取上清至一个洁净的Eppendorf管中；向上清液中加入20μL的3M NaAC和900μL的无水乙醇，然后置于-20℃静置30min；将离心管于13000rpm离心5min，弃上清；用1mL的70％乙醇洗涤沉淀，13000rpm离心5min，弃上清，自然风干。向离心管中加入50μL的TE缓冲液，然后置于-20℃保藏。

PCR扩增purF、purK和purB三个基因。以抽提获得的枯草杆菌DNA为模板通过PCR扩增来自枯草杆菌purF、purK和purB基因，以purFZ:ATGCTTGCTGAAATCAAAGGCTTAAATGAAGA(SEQ ID NO.1所示)和purFF:TTATTTGGTTAATACTGCTTCTTTTACGTGAGGAA(SEQ ID NO.2所示)扩增purF基因，以purKZ：GTTAGAAAGCAGTGATCAGCTTGTCTAAACAAATCATCTAT(SEQ ID NO.3所示)和purKF：TAACGTTCGATCATTCTGCTTGTCCTCCGTCTCT(SEQ ID NO.4所示)扩增purK基因，以purBZ：ATGATCGAACGTTATTC AAGACCTGAAATG(SEQ ID NO.5所示)和purBF：CTATGCTAAACCTAAACGTTCAAAGATCAGA(SEQ ID NO.6所示)扩增purB基因。扩增条件为：94℃，预热1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25个循环。PCR结束后，DNA柱回收PCR扩增片断。将片段与TA载体连接，高效转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。获得克隆序列测定。

克隆正确的purK基因，利用多位点突变方法(Applied Microbiology andBiotechnology 2006，73，234-240)将其中的721和961位HindIII，422位SacI酶切切点消除。

422位SacI酶切位点突变引物：422Z：ATTGAAACAGGCAGTACAGGAACTCAG(SEQ IDNO.7所示)；422F CTGAGTTCCTGTACTGCCTGTTTCAAT(SEQ ID NO.8所示)。

721位HindIII酶切位点突变引物：721Z:GCTGCTGATCTCGCAGT TAAGCTAGC(SEQ IDNO.9所示)；721F:GCTAGCTTAACTGC GAGATCAGCAGC(SEQ ID NO.10所示)。

961位HindIII酶切位点突变引物：961Z:GTGAATCTTCTCGGCGATGAAGTGAAACTTG(SEQID NO.11所示)；961F:CAAGTTTCACTTCATCGCCGAGAAGATTCAC(SEQ ID NO.12所示)。

克隆正确的purB基因，利用定点突变方法将558位NdeI酶切位点消除。

558位NdeI酶切位点突变引物：558Z：GAAAGATTTCCGGTGCTGTCGGCACGTATGC(SEQ IDNO.13所示)；558F：GCATACGTGCCGACAGCACCGGAAATCTTT C(SEQ ID NO.14所示)。

实施例2合成pur启动子和gnt终止子

以基因合成方法(Nucleic Acids Research,2004,32,e98)获取鸟苷生产菌的pur操纵子中的启动子和葡萄糖酸盐操纵子(gnt)的终止子。

Pur启动子合成的引物为：

Pur1:GAAAATGGGTCAATTCAGATCGTTCCGTGCGGGAAAAAAATCGTATTTGAAGGGAAAT(SEQID NO.15所示)

Pur2:ACAAAAATTCATTCTACTAATGTTCGTGTT TTAGATCAATTTCCCTTCAAATACGATT(SEQID NO.16所示)

Pur3:TTAGTAGAATGAATTTTTGTATCGTTCGATAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTT(SEQID NO.17所示)

Pur4:TATATGAGGTCGTGTTTTGATTTCATGTTTATCTTAACAACGGACATGGATAATGTCA(SEQID NO.18所示)

Pur5:TCAAAACACGACCTCATATAATCTTGGGAATATGGCCCATAAGTTTCTACCCGGCAAC(SEQID NO.19所示)

Pur6:TTTATCGATCACTTTCCTGCATAGTCCGGCAATTTACGGTTGCCGGGTAGAAACTTAT(SEQID NO.20所示)

Pur7:GCAGGAAAGTGATCGATAAAACTGACATGGATATATCGCAGAAGCGAACGACTGACGA(SEQID NO.21所示)

Pur8:TTATGAGGAAGCAATACAAACCGGGCATGGTACATGTATCGTCAGTCGTTCGCTTCTG(SEQID NO.22所示)

Pur9:TTTGTATTGCTTCCTCATAAGTGCAATGCAGAGCGGGTATTTTTTATTTTCTGAAAAC(SEQID NO.23所示)

Pur10:TCTGTTCCCCACCTTCTAATGCTTTTGTTTTCAGAAAATA AAAAAT(SEQ ID NO.24所示)

利用PCR进行鸟苷pur启动子的扩增，在100μl反应体系中，Pur2-Pur9共8个引物的添加量为2ng，外侧引物Pur1和Pur10添加量为30ng，扩增条件为：94℃，预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，获得质粒T1，将质粒T1高效转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。获得阳性克隆，测定鸟苷pur启动子序列如SEQ ID NO.25所示。

以基因合成方法(Nucleic Acids Research,2004,32,e98)获取枯草芽孢杆菌葡萄糖酸盐操纵子(gnt)的终止子。

葡萄糖酸盐操纵子的终止子合成的引物为：

Gnt1：ACCCAAGCTTAATTAATTAAGTAACCTGTATTAAAAACACCGTCAGTTTCAACTGAACCG(SEQID NO.26所示)

Gnt2：GCTCTAGACTTCTGTTGTTTGGGATAGAAGAAAAAAACACGGTTCAGTTGAAACTGACGG(SEQID NO.27所示)

利用PCR进行葡萄糖酸盐操纵子(gnt)的终止子的扩增，在100μl反应体系中，引物Gnt1和Gnt2添加量为30ng，扩增条件为：94℃，预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，获得质粒T2，将质粒T2高效转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。获得阳性克隆，测定葡萄糖酸盐操纵子(gnt)的终止子序列为如SEQ ID NO.28所示。

实施例3构建purF、purK和purB三价基因枯草芽孢杆菌表达载体

质粒T1的pur启动子和质粒T2葡萄糖酸盐操纵子(gnt)通过定向克隆组装到大肠杆菌常规克隆载体pBSK上，将改造的purF、purK和purB基因通过双酶切后定向插入启动子和终止子之间，分别用双酶切将含有启动子和终止子的3个基因表达单元从克隆载体中切下，回收目的DNA片段，通过T4DNA连接酶将3个目的片段依次与枯草杆菌表达载体pUC18se质粒连接，酶切鉴定和序列测定表明三个基因全部组装到一起，构建成三价基因枯草芽孢杆菌表达载体pUCKFB。

实施例4pUCKFB表达载体电击转化枯草杆菌

挑取枯草杆菌单菌落在100mL LB培养基中37℃恒温培养约6h，至OD600＝0.4-0.5，菌液冰上放置10min，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml洗涤缓冲液(0.5M蔗糖，0.1mM MgCl2,0.1mM maleic acid(pH6.5))洗涤2次。加入1mL悬浮缓冲液(0.3M蔗糖，1mM CaCl2,1mM柠檬酸钠(pH6.0))悬浮细菌，转到1.5ml离心管。

取70μl枯草杆菌感受态细胞，加入2μl表达载体pUCKFB。混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂布在含10μg/mL氯霉素固体LB培养基中，37℃培养24-48h。挑取3个抗性菌落进行鉴定。经过5轮稀释涂板，获得氯霉素抗性稳定菌株，分别为pUCKFB-1，pUCKFB-2，pUCKFB-3。

实施例5改造菌种摇瓶发酵检测

种子培养基(g/L)：葡萄糖20、尿素8、蛋白胨10、酵母膏10、玉米浆6、氯化钾5、腺嘌呤0.025，pH 7.0。

种子培养：用30mL无菌水洗涤活化斜面，吸取2mL菌液于40mL种子培养基(500mL三角瓶)中，旋转式摇床220r/min，34℃恒温培养约6h。

发酵培养基(g/L)：工业葡萄糖130、酵母粉16、硫酸铵10、玉米浆6、磷酸二氢钾3、硫酸镁1、pH6.5。

发酵培养：吸取2mL菌液于40mL发酵培养基(500mL三角瓶)中，旋转式摇床220r/min，34℃恒温培养约72h。

肌苷浓度测定：

纸层析法：发酵完毕后，用4000r/m转速离心10min，用微量进样器在3号滤纸上点样，硫酸铵作展开剂，展层5-10h，烘干，用紫外分析仪找出肌苷斑点，剪下斑点后，用0.001mM HCl侵泡2h，紫外分光光度计检测260nm波长的紫外吸光值。以Sigma标准品定量发酵液中肌苷含量。

HPLC法(高效液相色谱仪型号Agilent 1100，色谱柱C18反相柱，柱长4.0mm×250mm)，色谱条件：流动相为5g/L的KH2PO，波长为254nm，流速为1.2mL/min。

经过摇瓶发酵后，对肌苷产量检测，检测结果表明：将肌苷关键酶基因purF、改造后的purK和purB一起导入到肌苷生产菌株后，肌苷产量提高16.9-27.8％，具体结果参见表1。

表1

Claims (4)

1.一种提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)，将磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体；

构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体时，通过T4 DNA连接酶将purF基因与改造的purK基因和purB基因分别与鸟苷pur启动子和葡萄糖酸盐操纵子gnt终止子的连接，然后将3个基因的表达单元插入表达载体；

其中，所述氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因的改造方法是：消除氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因中的721位和961位HindIII酶切位点、422位SacI酶切位点；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因的改造方法是：消除腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因中558位NdeI酶切位点；所述磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因、氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因来自枯草芽孢杆菌；用于控制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因表达的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.25所示；

步骤2)，将所述构建的三价基因枯草芽孢杆菌表达载体通过电击转化到枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌合成肌苷能力的方法，其特征在于，步骤1)构建三价基因枯草芽孢杆菌表达载体的过程中，用于控制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因表达的终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

3.如权利要求1或2所述的构建三价基因枯草杆菌表达载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：在克隆载体pUC18中插入氯霉素表达单元，通过T4 DNA连接酶将磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因分别与鸟苷pur启动子和葡萄糖酸盐操纵子gnt终止子的连接，然后将上述3个基因的表达单元插入表达载体，构建含有高效表达由磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶purF基因与改造的氨基咪唑核苷酸羧化酶purK和腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因组成的枯草芽孢杆菌表达载体pUCKFB；

其中，所述氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因的改造方法是：消除氨基咪唑核苷酸羧化酶purK基因中的721位和961位HindIII酶切位点、422位SacI酶切位点；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因的改造方法是：消除腺苷酸琥珀酸裂解酶purB基因中558位NdeI酶切位点；所述鸟苷pur启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

4.根据权利要求3所述的构建三价基因枯草杆菌表达载体的方法，其特征在于，所述葡萄糖酸盐操纵子gnt终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

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