CN117417906A - 重组微生物及其在生产核苷中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及重组微生物及其在生产核苷中的应用。本发明提供强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶在提高核苷产量中的新用途,通过强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶,菌株的核苷产量显著提高。本发明还提供一种磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体,该变体能够显著提高菌株的核苷产量,该变体可用于核苷生产菌株的构建以及核苷发酵生产,为核苷生产菌株的选育提供了有效的基因资源和菌株资源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及重组微生物及其在生产核苷中的应用。
背景技术
核苷是一类糖苷的总称,是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成,一般为无色结晶,不溶于普通有机溶剂,易溶于热水,熔点为160~240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷,参与RNA组成,由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷,参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷,它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。
鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域,鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体,而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂,广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域,鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体,如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体,而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体,适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等,此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
腺苷即腺嘌呤核苷,化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤,它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物,属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸,参与心肌能量代谢,同时还参与扩张冠脉血管,增加血流量。腺苷对心血管系统和机体的许多其它系统及组织均具有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外,还是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体,广泛应用于医药等行业。
目前,微生物发酵是生产核苷的主要方法,主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生产菌株的选育与改造过程中,通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种,定向选育核苷高产菌株;或者通过代谢工程手段,有目的性地对菌株进行改造,以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。然而,目前核苷生产菌种的发酵性能仍较差、核苷的产量仍较低,较难满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的第一目的是提供磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的应用。
本发明的第二目的是提供磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶突变体及其相关的生物材料和应用。
本发明的第三目的是提供一种重组微生物及其在生产核苷或核苷衍生物中的应用。
具体地,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高微生物的核苷或核苷衍生物产量或构建用于生产核苷或核苷衍生物的微生物中的应用。
磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶催化5’磷酸核糖-N-甲酰甘氨酸眯(FGARM)生成氨基咪唑核糖肽(AIR),在芽孢杆菌中由purM基因编码。对于磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的序列,本领域技术人员可通过公开的数据库获得,其中一种枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的登录号分别为BSU_06500和BAMF_0644。
现有技术中对于磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的研究和改造较少,多通过改造嘌呤操纵子对该酶进行间接调控,但此时嘌呤操纵子中除该酶以外的其他酶的表达或活性也同时上调。然而,调控嘌呤操纵子通常会导致菌株生长滞后的问题。本发明意外地发现,通过单独强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶,而无需强化嘌呤操纵子中的其他基因,也能够显著提高嘌呤核苷的产量,且不会导致菌株生长滞后问题。因此,强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性可用于提高微生物的核苷或其衍生物的产量或构建用于生产核苷或其衍生物的微生物。
具体地,以上所述的应用包括:通过增强磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性,提高微生物的核苷或核苷衍生物产量。
以上所述的增强磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性可通过以下(1)-(7)中的任意一种或多种方式的组合实现:
(1)通过导入具有磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的质粒而增强;
(2)通过增加染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的拷贝数而增强;
(3)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的启动子序列而增强;
(4)通过将强启动子与染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因可操作地连接而增强;
(5)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的RBS序列而增强;
(6)通过改变所述微生物表达的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的氨基酸序列而增强;
(7)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的核苷酸序列而增强。
以上所述的微生物优选为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
其中,芽孢杆菌属细菌包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌;棒状杆菌属细菌包括谷氨酸棒杆菌;埃希氏菌属细菌包括大肠杆菌。
以上所述的应用中,所述核苷优选包括嘌呤核苷。嘌呤核苷包括腺嘌呤核苷(腺苷)、鸟嘌呤核苷(鸟苷)、次黄嘌呤核苷(肌苷)。
以上所述的应用中,所述核苷衍生物包括但不限于次黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸、三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、阿糖腺苷等。
第二方面,本发明提供一种磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体与芽孢杆菌野生型磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶相比,含有第257位脯氨酸突变为赖氨酸的突变。
优选地,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体与芽孢杆菌野生型磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶相比的突变为第257位脯氨酸突变为赖氨酸。
在本发明的一些实施方式中,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1:
MSDAYKNAGVDIEAGYEAVKRMKKHVERTKRLGVMGSLGGFGGMFDLSELPYQKPVLISGTDGVGTKLKLAFSMDKHDTIGVDAVAMCVNDVLAQGAEPLFFLDYLAVGKADPVKIEQIVQGVADGCEQSGSALIGGETAEMPGLYTADEYDIAGFSVGVAEKDEIVTGEHIEEGHLLIGLTSSGLHSNGFSLVRKVLLDDGGLDLDTVYEPFARPLGEELLEPTRIYVKPVLEAVKSGKVDGMAHVTGGGFIENIKRMLPDGLSAEIDHGSWPIPPIFPFLQEHGKLKEEEMFNVFNMGIGFVLAVKEENLTDVIDTLEAQGEKAYLIGRVKHGEGISFGGAALS;
SEQ ID NO.4:
MSEAYKNAGVDIEAGYEAVKRMKKHVERTKRLGVMGSLGGFGGMFDLSELSYQKPVLISGTDGVGTKLKLAFSMDKHDTIGVDAVAMCVNDVLAQGAEPLFFLDYLAVGKADPVKIEQIVQGVAEGCEQSGSALVGGETAEMPGLYTADEYDIAGFSVGVAEKDEIVTGEKIEEGHLLIGLSSSGLHSNGFSLVRKVLLDDAELDLDTTYEPFERPLGEELLEPTRIYVKPVLAAVKSGKIDGMAHVTGGGFIENIKRMLPEGLSAEIDHGSWPIPPIFSFLQEYGKLKEEDMFNVFNMGIGFVLAVKEEHLTDVIGTLESHGEKAYLIGRVKKGEGVTFGGAALS。
以上所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体能够明显提高微生物(尤其是芽孢杆菌属细菌)的核苷生产能力,显著促进核苷(尤其是嘌呤核苷)的产量提升。
第三方面,本发明提供编码以上所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的核酸分子。
根据磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的氨基酸序列和密码子规则,本领域技术人员能够获得编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的核酸分子的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示。
第四方面,本发明提供包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的生物材料。
以上所述的生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。
其中,所述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子。
所述宿主细胞包括微生物细胞,优选为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌。
第五方面,本发明提供以上所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体或所述核酸分子或所述生物材料的以下任一种应用:
(1)在生产核苷或其衍生物中的应用;
(2)在构建用于生产核苷或其衍生物的微生物中的应用。
本发明还提供以上所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体或所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物的核苷产量中的应用。
上述应用中,所述核苷优选包括嘌呤核苷,包括腺嘌呤核苷(腺苷)、鸟嘌呤核苷(鸟苷)、次黄嘌呤核苷(肌苷)。
上述应用中,所述核苷衍生物包括但不限于次黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸、三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、阿糖腺苷等。
上述应用中,所述微生物为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
其中,芽孢杆菌属细菌包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌;棒状杆菌属细菌包括谷氨酸棒杆菌;埃希氏菌属细菌包括大肠杆菌。
第六方面,本发明提供一种重组微生物,所述重组微生物被修饰以使得其磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强。
优选地,所述微生物为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
其中,芽孢杆菌属细菌包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌;棒状杆菌属细菌包括谷氨酸棒杆菌;埃希氏菌属细菌包括大肠杆菌。
具体地,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强通过以下(1)-(7)中的任意一种或多种方式的组合实现:
(1)通过导入具有磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的质粒而增强;
(2)通过增加染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的拷贝数而增强;
(3)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的启动子序列而增强;
(4)通过将强启动子与染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因可操作地连接而增强;
(5)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的RBS序列而增强;
(6)通过改变所述微生物表达的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的氨基酸序列而增强;
(7)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的核苷酸序列而增强。
在本发明的一些实施方式中,所述重组微生物被修饰以表达所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体。在微生物中表达所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体能够显著提高磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的活性,进而促进核苷的合成和积累。
在本发明的一些实施方式中,所述重组微生物被修饰以使得染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的启动子替换为较原始启动子活性更强的启动子。通过强启动子替换使得磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的转录水平显著提高,进而促进核苷的合成和积累。
在本发明的一些实施方式中,所述较磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶编码基因的原始启动子活性更强的启动子为P43启动子。P43启动子的序列可为SEQ ID NO.7所示的序列。
SEQ ID NO.7:
tgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacac。
在本发明的一些实施方式中,所述重组微生物被修饰以使得其染色体上含有至少2个拷贝的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因。通过增加磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶编码基因的拷贝数可显著提高该基因的表达水平,进而促进核苷的合成和积累。
在本发明的一些实施方式中,以上所述的重组微生物还包含以下修饰中的一种或多种:
(1)upp基因失活;
(2)guaA基因的表达和/或编码蛋白的酶活性增强;guaC基因的表达和/或编码蛋白的酶活性减弱或失活。
其中,guaA基因编码蛋白的酶活性增强可通过对guaA基因进行突变使得其编码蛋白产生V234I突变实现,guaC基因编码蛋白的酶活性减弱或失活可通过对guaC基因进行突变使得其编码蛋白的第8位谷氨酸突变为终止密码子实现。
其中,上述(1)和/或(2)的修饰可在解淀粉芽孢杆菌ATCC23350中进行。
在本发明的一些实施方式中,以上所述的重组微生物还包含以下修饰中的一种或多种:
(1)upp基因失活;
(2)对甘氨酰胺核苷酸合成酶基因purD进行突变使其编码蛋白的第116位脯氨酸突变为亮氨酸;
(3)对转录调节子基因purR进行突变使其编码蛋白的第65位丙氨酸突变为天冬氨酸;
(4)对肌苷酸脱氢酶基因guaB进行突变使其编码蛋白的第279位甘氨酸突变为精氨酸。
其中,上述(1)~(4)的修饰中的一种或多种可在枯草芽孢杆菌B.subtilis168中进行。
在本发明的一些实施方式中,所述重组微生物为以B.subtilis A5(B.subtilisA5的构建方法参见专利CN110257315B)为出发菌株,对其进行修饰使得其中磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强。
在本发明的一些实施方式中,所述重组微生物为以解淀粉芽孢杆菌B.a 836(B.a836的构建方法参见专利申请CN112574934A)为出发菌株,对其进行修饰使得其中磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强。
在本发明的一些实施方式中提供一种解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌,其表达磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的氨基酸序列发生变化,和/或在磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶编码基因的起始密码子前插入较原始启动子更强的启动子,和/或在染色体异位增加磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶编码基因的拷贝数,使得所述菌株产生核苷的能力较未修饰的菌株相比增强。
第七方面,本发明提供以上所述的重组微生物在生产核苷或选育用于生产核苷的微生物中的应用。
第八方面,本发明提供一种发酵生产核苷的方法,所述方法包括:培养以上所述的重组微生物获得培养物,从所述培养物中收集核苷或其衍生物。
在本发明的一些实施方式中,所述方法包括:将所述重组芽孢杆菌接种于种子培养基中进行种子培养,得到种子液,将种子液接种于发酵培养基中培养,得到发酵液,从发酵液中分离提取核苷或其衍生物。
第九方面,本发明提供一种提高核苷或其衍生物的产量的方法,所述方法包括:修饰核苷或其衍生物的生产菌株以使得其中的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强。
本发明的有益效果在于:本发明提供强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶在提高核苷产量中的新用途,通过强化磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶,菌株的核苷产量显著提高。
本发明通过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶,使PurM蛋白的表达或活性增强,使得微生物能够更高效、快速地生产鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸或次黄嘌呤核苷,获得了能够高效生产核苷的重组微生物。
本发明提供了一种磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体,该变体能够显著提高菌株的核苷生产能力,有效促进菌株的核苷产量的提升,该变体可用于核苷生产菌株的构建以及核苷发酵生产,提高核苷的生产效率,为核苷生产菌株的选育提供了有效的基因资源和菌株资源。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中涉及的引物名称及引物序列如表1所示。
表1本发明实施例中使用的引物名称及序列信息
实施例1解淀粉芽孢杆菌中purMP257K点突变菌株构建
以解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株基因组为模板,使用purM257-1f/purM257-1r,purM257-2f/purM257-2r引物对,利用pfu高保真DNA聚合酶扩增获得purM基因的上、下游同源臂。获得片段进行胶回收并融合,扩增获得purMP257K全长片段,进行胶回收(purMP257K对应的ORF框的核苷酸序列见SEQ ID NO.2,氨基酸序列见SEQ ID NO.1)。将pKSU质粒(pKSU质粒由南开大学王淑芳教授惠赠,参见A markerless gene replacement method forB.amyloliquefaciens LL3 and its use in genome reduction and improvement ofpoly-γ-glutamic acid production[J],Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(21):8963-8973.Zhang W,Gao W,Feng J,et al DOI:10.1007/s00253-014-5824-2)使用XbaI/PstI进行双酶切并进行胶回收。使用组装试剂盒将酶切后的线性化质粒及purMP257K片段进行组装,并转化至TransT1感受态中,后期进行鉴定筛选获得重组质粒pKSU-purMP257K。转化至B.a 836(该菌株已在专利申请CN112574934A中公开,构建方法参见专利申请CN112574934A)菌株中,用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子,将获得的转化子接到5ml LB液体培养基中,42℃200rpm培养12h并传一代,稀释涂布至含5μg/mL氯霉素的LB平板获得一次重组子;将一次重组子接到5ml LB液体培养基中,42℃200rpm培养12h并传一代,稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子,筛选获得purMP257K点突变菌株,命名为B.a 8351。
同时为了验证purMP257K中所含突变位点的有效性,将重组质粒pKSU-purMP257K转化至野生型解淀粉芽孢杆菌DSM7中,筛选方法参考上述B.a 8351的筛选方法,最终得到在DSM7基因组中进行purMP257K点突变的菌株,命名为B.a 8371。
实施例2解淀粉芽孢杆菌中purM启动子强化菌株构建
以解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株基因组为模板,使用P43-purM-1f/P43-purM-1r,P43-purM-3f/P43-purM-3r引物对,pfu高保真DNA聚合酶扩增获得上下游同源臂。使用P43-F/P43-R,以PBE43质粒(PBE43质粒为全基因合成,参考文献Effects of overexpression ofkey enzyme genes on guanosine accumulation in Bacillus amyloliquefaciens)为模板,扩增获得P43启动子片段(P43启动子序列如SEQ ID NO.7所示)。以上述获得的三个片段为模板,P43-purM-1f/P43-purM-3r为引物,将三片段进行融合PCR,获得全长片段P43-purM,进行胶回收,按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-P43-purM,并将其转化至B.a 836菌株中,按照实施例1的筛选方法进行筛选,获得在purM基因的起始密码子上游插入P43启动子的菌株,命名为B.a 8352。
实施例3解淀粉芽孢杆菌中purM二拷贝菌株构建
以DSM7菌株基因组为模板,使用pckA2nd-1f/purM2nd-1r,purM257-2f/purM2nd-3r,purM2nd-4f/pckA2nd-3r引物对,pfu高保真DNA聚合酶扩增获得片段1、3、4;以B.a8352菌株为模板,使用P43-F/purM257-1r引物扩增片段2;以上述四个片段为模板,pckA2nd-1f/pckA2nd-3r为引物进行融合PCR获得P43-purMP257K2nd全长片段,进行胶回收,按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-P43-purMP257K2nd,并将其转化至B.a836菌株中,按照实施例1的方法进行筛选,获得在染色体上额外插入一个拷贝purM(该拷贝的启动子为P43)的菌株,命名为B.a 8353。
实施例4枯草芽孢杆菌中purMP257K点突变菌株构建
在腺苷生产菌株B.subtilis A5(菌株B.subtilis A5的构建方法参见专利CN110257315B)中引入purMP257K突变,具体方法如下:
以B.subtilis A5菌株基因组为模板,使用A5purM-1f/A5purM-1r,A5purM-2f/A5purM-2r引物对扩增左右同源臂,胶回收并融合,获得A5purMP257K全长片段(purMP257K对应的ORF框的核苷酸序列见SEQ ID NO.3,氨基酸序列见SEQ ID NO.4)。按照实施例1中的构建方式获得重组质粒pKSU-A5purMP257K。转化至B.subtilis A5菌株中,筛选获得在B.subtilisA5基因组中进行purMP257K点突变的菌株,命名为B.subtilis A0015。
同时,为了验证该突变位点的有效性,将重组质粒pKSU-A5purMP257K转化至枯草芽孢杆菌野生型菌株168中,筛选获得在B.subtilis 168基因组中进行purMP257K点突变的菌株,命名为B.subtilis A0016。
实施例5枯草芽孢杆菌中purM启动子强化菌株构建
为确定purM强化是否能提高腺苷产量,将一株腺苷生产菌株B.subtilis A5(菌株B.subtilis A5的构建方法参见专利CN110257315B)中的purM使用P43启动子进行强化。
以B.subtilis A5菌株基因组为模板,使用A5P43-purM-1f/A5P43-purM-1r,A5P43-purM-3f/A5P43-purM-3r引物对扩增左右同源臂,胶回收后,以上述左右同源片段及实施例2中的P43片段为模板,使用A5P43-purM-1f/引物进行融合获得A5P43-purM全长片段(对应的purM ORF框的核苷酸序列见SEQ ID NO.5,氨基酸序列见SEQ ID NO.6)。按照实施例1中的构建方式获得重组质粒pKSU-A5P43-purM。转化至B.subtilis A5菌株中,筛选获得启动子强化菌株,命名为B.subtilis A0015。
实施例6枯草芽孢杆菌中purM二拷贝启动子强化菌株构建
以B.subtilis A0004基因组为模板,A5purM2nd-1f/A5purM2nd-1r,P43-F/A5purM2nd-3r,A5purM2nd-4f/A5purM2nd-4r引物对分别扩增出3个片段,以上述3个片段胶收产物为模板,使用A5purM2nd-1f/A5purM2nd-4r引物扩增出A5purM2nd全长片段,按照实施例1中方法构建出重组质粒pKSU-A5P43purM2nd,并转化至B.subtilis A0004,筛选在染色体上额外插入一个拷贝purM(该拷贝的启动子为P43)的菌株,命名为B.subtilis A0005。
实施例7突变菌株产嘌呤核苷的性能验证
对实施例1-6构建的突变菌株进行发酵实验,验证其生产嘌呤核苷的性能,具体如下:
1、将甘油中保存的各菌种于37℃过夜培养划出单克隆。
2、挑单菌落接种至30mL种子培养基(g/L:葡萄糖20,酵母粉5,玉米浆干粉5,磷酸二氢钾3,硫酸镁0.5,硫酸亚铁0.02,硫酸锰0.01,pH 7.0~7.2,121℃下灭菌20min。110rpm37℃培养7~8h)。
3、按10%v/v接种量转接至30mL发酵培养基(g/L:葡萄糖120,酵母粉3.5,磷酸二氢钾3,硫酸铵25,硫酸锰0.01,硫酸镁5,谷氨酸钠10,玉米浆干粉15,碳酸钙25,pH 7.0~7.2,121℃下灭菌20min)中,摇床转速130rpm,35℃发酵培养,B.subtilis A5、B.subtilisA0004、B.subtilis A0005和B.subtilis A0015菌株以及B.subtilis168、B.subtilisA0016菌株发酵48h,B.a 836、B.a 8351、B.a 8352和B.a 8353菌株以及DSM7、B.a 8371菌株发酵70h。
4、使用液相色谱仪对发酵液中产苷进行检测(表2)
表2突变菌株摇瓶发酵产鸟苷、肌苷及腺苷评估结果(三次重复均值)
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高微生物的核苷或核苷衍生物产量或构建用于生产核苷或核苷衍生物的微生物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,通过增强磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性,提高微生物的核苷或核苷衍生物产量;
优选地,所述微生物为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
3.一种磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体,其特征在于,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体与芽孢杆菌野生型磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶相比,含有第257位的脯氨酸突变为赖氨酸的突变;
优选地,所述磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.4所示。
4.核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求3所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体。
5.生物材料,其特征在于,所述生物材料包含权利要求4所述的核酸分子或表达权利要求3所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体。
6.权利要求3所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料的以下任一种应用:
(1)在生产核苷或其衍生物中的应用;
(2)在构建用于生产核苷或其衍生物的微生物中的应用;
优选地,所述微生物为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
7.重组微生物,其特征在于,所述重组微生物被修饰以使得其磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的表达和/或酶活性增强;
优选地,所述微生物为芽孢杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
8.根据权利要求7所述的重组微生物,其特征在于,所述表达和/或酶活性增强通过以下(1)-(7)中的任意一种或多种方式的组合实现:
(1)通过导入具有磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的质粒而增强;
(2)通过增加染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的拷贝数而增强;
(3)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的启动子序列而增强;
(4)通过将强启动子与染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因可操作地连接而增强;
(5)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的RBS序列而增强;
(6)通过改变所述微生物表达的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的氨基酸序列而增强;
(7)通过改变染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的核苷酸序列而增强。
9.根据权利要求7或8所述的重组微生物,其特征在于,所述重组微生物被修饰以表达权利要求3所述的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶变体,
或者,所述重组微生物被修饰以使得染色体上磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因的启动子替换为较原始启动子活性更强的启动子,
或者,所述重组微生物被修饰以使得其染色体上含有至少2个拷贝的磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶的编码基因。
10.一种发酵生产核苷或核苷衍生物的方法,其特征在于,所述方法包括:培养权利要求7~9任一项所述的重组微生物获得培养物,从所述培养物中收集核苷或核苷衍生物。
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Legal Events
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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