JP5819315B2 - ヌクレオシド合成のための耐熱性生物触媒組合せ - Google Patents
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Description
大腸菌deoDの構築
スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPアーゼ)配列はGenBankで受託番号AE006766として見出された。この遺伝子を、2単位のPlationum Pfx酵素(Invitrogen)、1mM MgSO4および1×酵素増幅バッファー、200μM dNTPおよび0.3μMの各プライマーを、スルホロブス・ソルファタリカスP2由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3’(スルホロブス・ソルファタリカスdeoDフォワード;配列番号1)および5’-aatcagttttaagaatcttaaggtaat-3’(スルホロブス・ソルファタリカスdeoDリバース;配列番号2)[15]とともに用いてPCRにより増幅した。PCR反応は、初期変性工程94℃で30分、その後、変性工程94℃で1分、アニーリング/伸長工程60℃で1.5分および68℃で1分の温度サイクル36回で行った。36サイクルの後、サンプルを68℃に10分、最後に4℃に曝した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからDNAバンドを精製した(S.N.A.P.(商標)UV−Freeゲル精製キット、Invitrogen)。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するpUC18ベクター[17]のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
大腸菌udpの構築
アエロピルム・ペルニクスのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ(UPアーゼ)配列はGenBankで受託番号NC_000854.2として見出された。この遺伝子を、2単位のPlationum Pfx酵素(Invitrogen)、1mM MgSO4および1×酵素増幅バッファー、200μM dNTPおよび0.3μMの各プライマーを、アエロピルム・ペルニクスK1由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtggcccgctacgttctcctc-3’(アエロピルム・ペルニクスudpフォワード;配列番号3)および5’-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3’(アエロピルム・ペルニクス リバース;配列番号4)[16]とともに用いてPCRにより増幅した。PCR反応は初期変性工程94℃で30分、その後、変性工程94℃で1分、アニーリング/伸長工程60℃で1.5分および68℃で1分の温度サイクル36回で行った。36サイクルの後、サンプルを68℃に10分、最後に4℃に曝した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからDNAバンドを精製した(S.N.A.P.(商標)UV−Freeゲル精製キット、Invitrogen)。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するpUC18ベクター[17]のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
pET102/D−TOPO(商標)ベクターへのクローニングおよび細胞の形質転換
アエロピルム・ペルニクスudp遺伝子配列およびスルホロブス・ソルファタリカスdeoD遺伝子配列を含むDNA断片を、プラスミド複製のためのpBR322ori、アンピシリン耐性遺伝子、T7 RNAポリメラーゼの結合が可能なT7プロモーター、イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)が存在しない場合に発現の阻害を可能等するlacオペレーター、RNAの翻訳のためのリボソーム結合部位、融合タンパク質の溶解度を高めるためのHisパッチ−チオレドキシン、ならびに融合タンパク質の検出および精製のためのポリヒスチジンタグ(6xHis)を含んでなるpET102/D−TOPO(商標)ベクター(pET102 Directional TOPO(商標)発現キット、Invitrogen)にクローニングした(図3)。このベクターを熱ショックにより、異種遺伝子の調節発現に用いられる市販株である大腸菌BL21(pET102 Directional TOPO(商標)発現キット、Invitrogen)に導入した。これはT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を含んでなり、これにより、この株はIPTGによる組換えタンパク質の過剰発現のためのT7プロモーターを含んでなるpETベクターの使用に適合するようになる。
組換え株の発酵
本発明が関連する組換え株をそれぞれ、アンピシリンを添加したトリプチケースソイ(toripticase soy)固体培地、pH=7にてバッチ様式で培養した。この培養物の1コロニーを、Lab−lemcoパウダー10g/l、ペプトン10g/lおよびNaCl 5g/lを含有する栄養ブロスn°2(Oxoid)に、200mg/lアンピシリンを添加したものに通した。これを37℃で激しく振盪しながら(200rpm)インキュベートした。発現プラスミドを保持する大腸菌株を600nmでの光学密度が0.6となるまで増殖させた後、IPTG(最大100mg/l)を加え、さらに8時間培養を続けた。発酵が完了したところで培養培地を遠心分離し、細胞ペレットを30mMのpH7リン酸バッファーで洗浄した。得られたバイオマスを使用するまで−20℃で保存した。
UPアーゼおよびPNPアーゼの部分精製(細胞溶解液の調製)
タンパク質の部分精製については、酵素UPアーゼまたはPNPアーゼを発現する組換え株の培養物から遠心分離または精密濾過により分離した細胞ペーストを、リゾチーム160mgを添加して0℃で1時間インキュベートした後に、超急速凍結−解凍サイクル(−80℃/37℃)を行い、最後にデオキシリボヌクレアーゼI 1,000単位を加えて粘度を下げることによって破砕した。
UPアーゼ酵素の酵素活性の測定
UPアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、pH7.0のリン酸カリウムバッファーで1:100(容量/容量)に希釈した遠心分離済み細胞溶解液100マイクロリットルを、30℃でプレインキュベートしたpH7.0の100mMリン酸バッファー中75mMのウリジン溶液800マイクロリットルに加えた。5分後に1mlの2N HClを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、250×4.6mmのサイズのKromasil 100−5C18(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分析した。溶出は4%メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性を、ml当たりの単位(ウラシルのμモル/分/ml)で表し、同じ条件で溶出した標準ウラシル溶液に対して比例計算した。およそ590単位/mlの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
PNPアーゼ酵素の酵素活性の測定
PNPアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、pH7.0のリン酸カリウムバッファーで1:100(容量/容量)に希釈した遠心分離済み細胞溶解液100マイクロリットルを、30℃でプレインキュベートしたpH7.0の100mMリン酸バッファー中60mMのイノシン溶液800マイクロリットルに加えた。正確に10分後に1mlの2N HClを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、250×4.6mmのサイズのKromasil 100−5C18(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分析した。溶出は4%メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性をml当たりの単位(ヒポキサンチンのμモル/分/ml)で表し、同じ条件で溶出した標準ヒポキサンチン溶液に対して比例計算した。およそ310単位/mlの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
トランスグリコシル化触媒活性の測定
トランスグリコシル化触媒活性の測定については、実施例6および7の場合と同様に測定したUPアーゼ:PNPアーゼ酵素活性比が約1:1となるように溶解液を混合することにより、UPアーゼおよびPNPアーゼの双方を含有する細胞溶解液の混合物を作製した。トランスグリコシル化反応は以下の条件において分析的規模で行った:250μlの細胞溶解液(UPアーゼおよびPNPアーゼ各酵素活性14単位に相当)を、以下の組成:4mM 1−β−D−リボフラノシルウラシル(ウリジンヌクレオシド)、4mMアデニン塩基、30mMリン酸カリウムバッファーpH7を有する10mlの溶液に加え、サーモスタットで60℃に制御した。60℃で1.5時間後、混合物を1:5希釈し、氷冷することにより反応を停止させた。アデニン塩基の9−β−D−リボフラノシルアデニン(アデノシンヌクレオシド)の生物変換のパーセンテージは、反応混合物のアリコートを、250×4.6mmのサイズのKromasil 100−5C18(Akzo Nobel)カラムを用い、4%メタノール−水溶液で溶出する高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析することにより測定した。トランスグリコシル化触媒活性を、単位/ml(1.5時間で形成されたAra−Aのμモル/細胞溶解液混合物ml)または単位/湿潤樹脂g(1.5時間で形成されたD−リボフラノシルアデニンのμモル/細胞溶解液ml)で表し、同じ条件でHPLCにより溶出された標準的なD−リボフラノシルアデニン溶液に対して比例計算した。これらの条件下で、約55パーセントのアデノシンヌクレオシドが形成された(およそ9単位/細胞溶解液ml)。
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に対する温度およびpHの効果
ヌクレオシドホスホリラーゼの性能に対するpHおよび温度の影響を、「実験計画法」を用いて検討した。最大酵素活性が得られる条件を確認するために種々の温度と種々のpH値を組み合わせた。実験範囲を80℃〜100℃およびpH5.5〜8.5の間と定義した。図4に示されるように、「Doehlertマトリックス」に従って5つの温度を3つのpHと組み合わせて、温度とpHの7つの組合せとした。基質を選択された反応溶液および温度で酵素を伴わずにインキュベートした後、酵素を加え、選択された条件でインキュベートした。これらのサンプルをPNPアーゼまたはUPアーゼ酵素の酵素活性を測定するために上記のように処理した。活性値は対応する観測最大値(100%)に対するパーセンテージとして表した。結果はそれぞれ図5および6に示す。
耐熱性
酵素の耐熱性は80℃でアッセイした。pH7.0〜7.2のリン酸カリウムバッファーで1:100または1:1000容量/容量希釈した、UPアーゼまたは/およびPNPアーゼ発現細胞の懸濁液(細胞溶解液)100〜200マイクロリットルの間の酵素アリコートを調製した。これらの生物触媒を80℃で種々の時間インキュベートした。加熱後、これらの溶液をすぐに氷上で保持し、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定は実施例6および7に記載のようにして行った。80℃で10時間後にヌクレオシドホスホリラーゼ活性の失活は見られなかった。
有機共溶媒は反応に慣用され、単離される酵素は比較的高濃度の共溶媒の条件下で生存できなければならない。実験はメタノール(プロトン性極性溶媒)およびジメチルスルホキシド(非プロトン性の極性溶媒)などの有機溶媒の存在下で実施した。本発明のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素は有機溶媒に耐性があり、5および10容量%の有機溶媒を含有するバッファー溶液中で活性を示した。
一般的な生物変換手順
ワンポットトランスグリコシル化反応は、反応試験内で穏やかに攪拌しながら、選択した反応温度およびpHで行った。用いた細胞溶解液混合物の触媒的トランスグリコシル化活性は約12単位/mlであった(実施例8で測定した通り)。PNPアーゼ:UPアーゼ活性比が1:1となるように調製した細胞溶解液混合物を用いてヌクレオシドを作製した。
1)2’−デオキシリボース−1−リン酸またはリボース−1−リン酸供与体として働く天然2’−デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシド
2)糖の1位に結合している第二の天然または合成プリン塩基またはピリミジン塩基、
2,6−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
プリンヌクレオシドの製造は、これらの塩基の水性媒体中での溶解度が低いためにより困難である。本発明では、本発明者らは、この問題を解決するために酵素競合特性を用いた。本発明者らが用いた戦略は、これらの基質の溶解度を高めるための有機共溶媒および/または高温の使用を包含した。
アッセイは60℃にて、5および10%の非プロトン性二極性共溶媒中で行い、12単位/mlの細胞溶解液を、下記組成:
1. 15mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
2. 5mM2,6−ジアミノプリン、および
3. 30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
の基質溶液を含み、サーモスタットで60℃に保持した150mlの溶液に加えた。
共溶媒を用いない2,6−ジアミノプリンヌクレオシドの製造は、このプリン塩基の水溶解度が限定されているために80℃を超える温度でのみ行うことができた。アッセイは種々の温度(80、90および100℃)で行った。12単位/mlの細胞溶解液を、下記組成:
1. 15mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
2. 5mM2,6−ジアミノプリン、および
3. 30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
の基質溶液を含み、サーモスタットで選択された温度に保持した150mlの溶液に加えた。
他のヌクレオシドの製造
トランスグリコシル化反応を種々の受容塩基を用いて行った。これらの反応は、80℃で種々の時間、プリン塩基の場合には共溶媒として10%DMSOを用い、また、ピリミジン受容塩基の場合には共溶媒を用いずに行った。生物変換のパーセンテージを受容塩基の初期濃度に対して比例計算し、反応混合物のHPLC分析により測定した。
約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1mlの触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
7.5mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
2.5mMトリフルオロメチルウラシル、および
20mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
5−フルオロウラシルヌクレオシドは上記のように製造した。約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1ml触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
7.5mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
2.5mM5−フルオロウラシル、および
30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
トランス−ゼアチンヌクレオシドは上記のように製造した。約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1ml触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
7.5mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
2.5mMトランス−ゼアチン、および
30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
2−クロロ−6−メチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1ml触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
15mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
5mM2−クロロ−6−メチルアミノプリン、および
30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
6−ジメチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1ml触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
15mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
5mM6−ジメチルアミノプリン、および
30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
6−メルカプトプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約12単位/細胞溶解液mlのトランスグリコシル化活性を有する1ml触媒(細胞溶解液)を、下記組成:
15mMウリジン/2’−デオキシウリジン、
5mM6−メルカプトプリン、および
30mMリン酸カリウムバッファー、pH7
を含み、サーモスタットで80℃に保持した150mlの溶液に加えた。
Claims (13)
- プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPアーゼ、E.C.2.4.2.1)をコードする配列単独、またはPNPアーゼをコードする配列とウリジンホスホリラーゼ(UPアーゼE.C.2.4.2.3)をコードする配列とを含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する1以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、PNPアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり(配列番号7)、UPアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来であり(配列番号8)、前記好適な発現宿主が大腸菌であることを特徴とする、組換え発現ベクター。
- 好適な発現宿主が大腸菌のBL21細菌株である、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項1または2に記載の組換え発現ベクターを含んでなる、大腸菌宿主細胞。
- 請求項3に記載の宿主細胞を溶解することによって得られる、溶解液。
- リン酸イオンの存在下でのβ−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖と結合した核酸塩基と、核酸塩基または修飾された核酸塩基との間のトランスグリコシル化方法であって、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPアーゼ)(配列番号7)単独、またはスルホロブス・ソルファタリカスのPNPアーゼとアエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ(UPアーゼ)(配列番号8)との使用を含んでなり、これらホスホリラーゼが請求項1または2に記載の組換え発現ベクターにより生産される方法。
- アエロピルム・ペルニクスのUPアーゼおよびスルホロブス・ソルファタリカスのPNPアーゼが、請求項3に記載の宿主細胞により提供される、請求項5に記載のトランスグリコシル化方法。
- 得られる製品が、活性医薬成分(API)またはその中間体である、請求項5または6に記載のトランスグリコシル化方法。
- β−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖と結合した核酸塩基が、D−リボースまたは2’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシド;2’位、3’位および/または5’位が修飾されたリボース基を含むヌクレオシド;および糖がβ−D−アラビノース、α−L−キシロース、3’−デオキシリボース、3’,5’−ジデオキシリボース、2’,3’−ジデオキシリボース、5’−デオキシリボース、2’,5’−ジデオキシリボース、2’−アミノ−2’−デオキシリボース、3’−アミノ−3’−デオキシリボース、または2’−フルオロ−2’−デオキシリボースであるヌクレオシドから選択される、請求項5〜7のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
- 核酸塩基または修飾された核酸塩基が、天然または置換されたピリミジンおよびプリン塩基;1位、2位、6位の1箇所以上で置換されたプリン塩基;3位、5位の1箇所以上で置換されたピリミジン塩基;およびプリン、2−アザプリン、8−アザプリン、1−デアザプリン(イミダゾピリジン)、3−デアザプリン、7−デアザプリン、2,6−ジアミノプリン、5−フルオロウラシル、5−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、2−クロロ−6−メチルアミノプリン、6−ジメチルアミノプリン、6−メルカプトプリンから選択される、請求項5〜8のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
- 60〜100℃の間で行われる、請求項5〜9のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
- 水性媒体中、または非プロトン性極性共溶媒系で行われる、請求項5〜10のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
- 非プロトン性極性共溶媒系が、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、2−メチルテトラヒドロフランおよびジメチルホルムアミドから選択される、請求項11に記載のトランスグリコシル化方法。
- β−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖と結合した核酸塩基が、ウリジンおよび2’−デオキシウリジンから選択され、核酸塩基または修飾された核酸塩基が、2,6−ジアミノプリン、5−フルオロウラシル、5−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、2−クロロ−6−メチルアミノプリン、6−ジメチルアミノプリンおよび6−メルカプトプリンから選択される、請求項5〜12のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
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