MX2012007487A - Combinacion de biocatalizadores termoestables para la sintesis de nucleosidos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende: a) la secuencia que codifica una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1), b) la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3), c) o ambas; cada una de las secuencias unida operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción de tales fosforilasas en un huésped de expresión adecuado; originándose tales secuencias de la clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEQ ID NO. 8). Además, la presente invención se refiere a un método de transglicosilación entre un nucleósido donante de azúcar y una base aceptora en presencia de iones fosfato, caracterizado porque tal método comprende el uso de una uridina fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix (NC_000854.2), una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus (NC_002754.1), o una combinación de las mismas.

Description

COMBINACION DE BIOC ATALIZADORES TERMOESTABLES PARA LA SINTESIS DE NUCLEOSIDOS Campo de la invención La invención pertenece al campo de la biotecnología.

Antecedentes de la Invención Los (desoxi)nucleósidos son glicosilaminas que consisten en una base de tipo purina o pirimidina unida a un azúcar ribosa o desoxirribosa, siendo las últimas pentosas cíclicas. Algunos ejemplos incluyen: citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina. Los análogos de nucleósidos han sido extensamente usados como agentes antivirales y anticancerosos dados su capacidad para actuar como inhibidores de la transcriptasa inversa o como terminadores de cadenas en la síntesis de ARN o ADN. (1).

Se ha conseguido la síntesis química estereoselectiva de análogos de nucleósidos pero usando reactivos caros o contaminantes (2), e implica procesos con múltiples etapas que pueden suponer un mayor consumo de tiempo. Los procedimientos biocatalíticos ofrecen una excelente alternativa a la síntesis química de nucleósidos ya que las reacciones biocatalizadas son regio- y estereoselectivas y permiten la disminución del contenido de subproductos. De particular interés en los procedimientos biocatalíticos es la reacción de transglicosilación enzimática entre un nucleósido donante de azúcar y una base aceptora mediante enzimas que catalizan las reacciones reversibles generales (3) tal como se representa en Figuras 1 y 2.

Las nucleósido fosforilasas son transferasas ampliamente distribuidas en células de mamífero y bacterias y juegan un papel central en la ruta natural del metabolismo nucleósido. Son bifuncionales. Por un lado, catalizan la separación reversible del enlace glicosídico de los ribo- o desoxirribonucleósidos en presencia de fosfato inorgánico para generar la base y la ribosa o desoxirr¡bosa-1 -fosfato. Estas reacciones enzimáticas que utilizan las purina nucleósido fosforilasas y las pirimidina nucleósido fosforilasas son mostradas en Figura 1. Por otro lado, estas enzimas catalizan la transferencia de pentosas dependiente de fosfato entre bases de purina o pirimidina y nucleósidos, es decir, reacciones de transglicosilación, para producir nucleósidos con diferentes bases. Figura 2 muestra un ejemplo de un solo paso síntesis de proceso "one-pot" usando nucleósido fosforilasas.

Cuando se combinan las purina nucleósido fosforilasas y las pirimidina nucleósido fosforilasas es posible llevar a cabo la transferencia del azúcar de un nucleósido pirimidina donante a bases de purina o pirimidina aceptoras, así como de un nucleósido de purina donante a bases de purina o pirimidina aceptoras, dependiendo del material de inicio utilizado (4). Como consecuencia, nucleósido fosforilasas de diferentes fuentes, especialmente bacterianas, han sido explotadas como herramientas para la síntesis enzimática de análogos de nucleósidos.

En la naturaleza estas enzimas han sido descritos en varias cepas microbianas, particularmente en bacterias termofílicas (es decir, bacterias que se desarrollan a temperaturas entre 45°C y 80°C) que han sido usadas como fuentes de nucleósido fosforilasas en numerosos trabajos encaminados a la obtención de nucleósidos modificados por transglicosilación enzimática. Sin embargo, a pesar de que en estos estudios los rendimientos de los productos objetivos fueron suficientemente elevados, la cantidad o proporción de las actividades enzimáticas necesarias para la transglicosilación no fueron óptimas (5). Requerían una extensión considerable en el tiempo de reacción (hasta varios días) o un incremento de la biomasa bacteriana utilizada para alcanzar el grado de transformación necesario.

Además, cuando se desarrolla un proceso de transglicosilación se plantea otro problema: la difícil solubilización de grandes cantidades de sustratos y productos, muchos de ellos poco solubles en medios acuosos a temperatura ambiente. Aunque este problema podría resolverse utilizando temperaturas más altas, se necesitarían enzimas lo suficientemente estables en estas duras condiciones de reacción.

El grupo Archaea es un grupo de microorganismos de células individuales que son uno de los tres dominios de vida; siendo los otros las Bacteria y Eukarya. Se le llamó inicialmente Archaebacteria bajo el taxón Bacteria, pero ahora se consideran separados y distintos. El dominio archaea se divide actualmente en dos filos principales, Euryarchaeota y Crenarchaeota. Euryarchaeota incluye una mezcla de metanógenos, halófilos extremos, termoacidófilos y varios hipertermófilos. En cambio, Crenarchaeota incluye sólo hipertermófilos, los hipertermófilos son aquellos organismos que se desarrollan en medios extremadamente cálidos, desde 60°C en adelante, óptimamente por encima de 80°C.

Cacciapuoti y colaboradores (6-8) describen dos purina nucleosido fosforilasas (PNPasas) de Archaea termofílica, en particular describen las enzimas 5'-desoxi-5'-metiltioadenosina fosforilasa II (SsMTAPII, EC 2.4.2.28) de Sulfolobus solfataricus y purina nucleosido fosforilasa (PfPNP) de Pyrococccus furiosus. La enzima de Pyrococccus furiosus se denominó inicialmente como MTAPII, pero se renombró como PNP ya que es incapaz de separar la metiltioadenosina . El Sulfolobus solfataricus pertenece a la Crenarchaeota, mientras que el Pyrococccus furiosus pertenece a la Euryarchaeota. El código EC anterior es la nomenclatura convencional de enzimas proporcionado por la International Union of Biochemistry and Molecular Biology que clasifica las enzimas por las reacciones que catalizan.

La mayoría de las enzimas caracterizadas a partir de hipertermófilos son óptimamente activas a temperaturas próximas a la temperatura de crecimiento óptimo del organismo hospedador. Cuando se clonan y expresan en hospedadores mesofílicos como Escherichia coli, las enzimas hipertermofílicas normalmente mantienen sus propiedades térmicas. Algunas veces, las enzimas son óptimamente activas a temperaturas bastante por encima de la temperatura de crecimiento óptimo del organismo hospedador (9). Se ha descrito que otros tipos de enzimas son óptimamente activas de 10°C a 20°C por debajo de la temperatura de crecimiento óptimo del organismo hospedador (10-11). Sin embargo, la 5'-metiltioadenosina fosforilasa de Sulfolobus solfataricus (una enzima hexamérica que contiene seis puentes de disulfuro entre las subunidades), cuando se expresa en un hospedador mesofílico, forma puentes disulfuros incorrectos y es menos estable y menos termofílico que la enzima nativa (12).

Thermoprotei son una clase hipertermof ílica de la Crenarchaeota. A partir de los genomas secuenciados y disponibles para la clase de Archaea Thermoprotei, se hallaron sólo tres secuencias para purina nucleósido fosforilasa (EC 2.4.2.1) y sólo tres secuencias para uridina fosforilasa (EC 2.4.2.3). Estas seis proteínas han sido ingresados, respectivamente, en UniProtKB/TrEMBL con los números de acceso: A1RW90 (A1 RW90_THEPD), para la proteína hipotética de Thermofilum pendens (cepa Hrk 5); Q97Y30 (Q97Y30_SULSO), para la proteína hipotética de Sulfolobus solfataricus; A3DME1 (A3DME1_STAMF), para la proteína hipotética de Staphylothermus marinus (cepa ATCC 43588 / DSM 3639 / F1); Q9YA34 (Q9YA34_AERPE), para la proteína hipotética de Aeropyrum pernix; A2BJ06 (A2BJ06_HYPBU) para la proteína hipoética de Hyperthermus butylicus (cepa DSM 5456 / JCM 9403); y D9PZN7 (D9PZN7_ACIS3) para la proteína hipotética de Acidilobus saccharovorans (cepa DSM 16705 / VKM B-2471 / 345-15). Todas estas secuencias estaban bajo el estatus de anotación de no revisado, lo que significa que su presencia en el Archaea sólo se ha verificado por ordenador.

Aunque muchos genes se pueden expresar de manera satisfactoria en Escherichia coli con altos rendimientos, varias proteínas de hipertermófilos se expresan de manera escasa o no se expresan, parcialmente debido al uso de codones raros. De hecho, y de acuerdo a nuestro conocimiento, nadie ha sido capaz de expresar ninguno de los genes mencionados anteriormente.

En vista de los prejuicios anteriores, en vista de las dificultades técnicas, los inventores inesperadamente fueron capaces de preparar vectores recombinantes viables y de manera destacada, obtener fosforilasas recombinantes que fueron óptimamente activas a temperaturas superiores a 60°C. Los catalizadores termoestables y químicamente estables de la presente invención son una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1), y una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3), que se origina de la clase Archaea Thermoprotei, en donde la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEC ID No. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEC ID No. 8).

En particular, se ha observado sorprendentemente que las nucleósidos fosforilasas recombinantes derivadas de la Thermoprotei hipertermofílica presentan propiedades de estructura-función únicas como una termoestabilidad mejorada, eficiencia catalítica elevada y actividad enzimáticas óptimas a temperaturas próximas o superiores a 100°C. Estas enzimas recombinantes se pueden utilizar de manera ventajosa para reacciones de transglicosilación, en forma de Usado celular y en forma de crudo o extractos purificados, para la producción industrial de análogos de nucleósido naturales y modificados. En particular, son versátiles ya que pueden catalizar transglicosilaciones en medio acuoso, solventes orgánicos, a temperaturas entre 60°C y 120°C, o en una combinación de estos parámetros, permitiendo la preparación de muchos y diversos tipos de nucleósidos a rendimientos de producción, tiempos de reacción aceptables y utilizando cantidades económicas de las enzimas. De manera destacada, los biocatalizadores descritos en la presente invención se pueden utilizar para reacciones de bioconversión que requieren la presencia de solventes orgánicos, temperaturas por encima de 60°C, o ambos, a efectos de solubilizar los sustratos o los productos de reacción. Estas fosforilasas son ideales en reacciones con sustratos insolubles en agua. Otra ventaja de estas fosforilasas reside en su tolerancia a solventes orgánicos, y en que se pueden reutilizar para varios ciclos de reacción.

De manera más ventajosa, la invención ofrece una combinación de nucleosido fosforilasas de Thermoprotei que es útil para una síntesis one-pot de nucleósidos. Las enzimas se pueden utilizar para producir nucleósidos naturales o análogos en métodos de síntesis de una etapa (one-pot) o dos etapas. En la síntesis de una etapa, se utilizan una pirimidina nucleosido fosforilasa y una purina nucleosido fosforilasa en el mismo lote a efectos de cambiar la base unida al azúcar por otra de elección. En las dos etapas, se utiliza una pirimidina nucleosido fosforilasa para la liberación del azúcar de una pirimidina nucleosido, y a continuación, se aisla el 1 -fosfato-azúcar y posteriormente, en otro recipiente, se une al azúcar utilizando una purina nucleosido fosforilasa.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende: a) la secuencia que codifica una purina nucleosido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1), b) la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3), c) o ambas; cada una de las secuencias unida operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción de tales fosforilasas en un hospedador de expresión adecuado; originándose tales secuencias de la clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEC ID No. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEC ID No. 8).

Además, la presente invención se refiere a un método de transglicosilación entre un nucleósido donante de azúcar y una base aceptora en presencia de iones fosfato, caracterizado porque tal método comprende el uso de una uridina fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix (National Center for Biotechnology Information Reference Sequence: NC_000854.2), una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus (NCBI RefSeq: NC_002754.1 ), o una combinación de las mismas.

Descripción de Figuras Figura 1 muestra un ejemplo de dos reacciones enzimáticas catalizadas por nucleósido fosforilasas. La primera reacción, en la parte superior, es una fosforólisis que tiene lugar a través de un mecanismo SN1 - con oxonio intermediario- para dar a-ribosa-1-fosfato. La segunda reacción ocurre a través de un mecanismo SN2 donde el fosfato es sustituido por una base proporcionando ß-nucleósido (13). En el esquema, la uridina nucleósido fosforilasa cataliza la separación fosforolítica del enlace C-N glicosídico de uridina dando lugar a la ribosa-1 -fosfato y uracilo. La purina nucleósido fosforilasa (adenosina nucleósido fosforilasa) cataliza la separación del enlace glicosídico en presencia de ortofosfato inorgánico (Pi) como segundo sustrato, para generar la base purina y la ribosa(desoxirribosa)-1 -fosfato. Para los sustratos naturales las reacciones son irreversibles.

Figura 2. Esquema de la síntesis en una sola etapa sintética ("one-pot") usando enzimas nucleósido fosforilasas.

Figura 3 muestra el mapa genético del vector de expresión inicial pET102/D-TOPO® antes del clonaje. El vector es de 6315 nucleótidos. Promotor T7: bases 209-225; región para los cebadores del promotor T7: bases 209-228; operador iac. (lacO): bases 228-252; región de unión al ribosoma (RBS): bases 282-288; marco abierto de lectura ("open reading frame", ORF) de la tioredoxina con parche de histidinas ("His-patch-thioredoxin"): bases 298-627; región de hibridación del cebador "TrxFus promotor": bases 607-624; región de reconocimiento de la enteroquinasa (EK): bases 643-657; región 1 de reconocimiento de la TOPO®: bases 670-674; secuencia que sobresale ("overhang"): bases 675-678; región 2 de reconocimiento de la TOPO®: bases 679-683; epítopo V5: bases 700-741; región de polihistidina (6xHis): bases 751-768; región de hibridación del cebador "T7 reverso": bases 822-841; región de terminación de la transcripción T7: bases 783-911; promotor bla: bases 1407-1505; ORF del gen de resistencia a la ampicilina (bla): bases 1506-2366; origen de pBR322: bases 2511-3184; ORF del gen ROP: bases 3552-3743 (hebra complementaria); ORF del gen lacl: bases 5055-6146 (hebra complementaria).

Figura 4. Se muestra el diseño experimental basado en una matriz de Doehlert, donde cinco temperaturas son combinadas con tres valores de pH lo que resulta en siete combinaciones de temperatura y pH.

Figura 5. Gráfico de contorno que muestra el efecto interactivo del pH y la temperatura sobre la actividad UPasa. Los datos fueron analizados estadísticamente con la metodología de superficie de respuesta (RSM), utilizando el programa "Minitab". La enzima se muestra muy termofílica y su actividad se ve incrementada significativamente a la temperatura más alta ensayada (100°C) y se muestra actividad a un pH distinto óptimo alrededor de la neutralidad (6.5 - 7.5), preferiblemente 7.0.

Figura 6. Gráfico de contorno que muestra el efecto interactivo del pH y la temperatura sobre la actividad PNPasa. Los datos fueron analizados estadísticamente con la metodología de superficie de respuesta (RSM), utilizando el programa "Minitab". La enzima se muestra muy termofílica y su actividad se ve incrementada significativamente a la temperatura más alta ensayada (100°C), y se muestra actividad a un pH distinto óptimo alrededor de la neutralidad (6.5 - 7.5).

Figura 7 muestra la secuencia de ADN (SEC ID No. 7) de la región codificante para la purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus, también conocida como gen deoD. Número de acceso en GenBank AE006766.

Figura 8 muestra la secuencia de ADN (SEC ID No. 8) de la región codificante para la pirimidina nucleósido fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix, también conocida como gen udp. Número de acceso en GenBank NC000854.

Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende: a) la secuencia que codifica una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1), b) la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3), c) o ambas; cada una de las secuencias unida operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción de tales fosforilasas en un hospedador de expresión adecuado; originándose tales secuencias de la clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEC ID No. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEC ID No. 8).

Aeropyrum pernix y Sulfolobus solfataricus son Archaea hipertermofílicas capaces de crecer a altas temperaturas, por encima de los 90°C. Las Archaea son organismos que pertenecen a un tercer grupo de organismos diferenciado de eucariotas y procariotas. Se consideran descendientes de organismos primitivos y son organismos especiales que no han evolucionado ni se han adaptado a las condiciones de temperatura ordinarias.

Los enzimas UPasa y PNPase en su medio natural intracelular no permiten la síntesis de nucleósidos o análogos de nucleósidos con un alto rendimiento tal como se desea a nivel industrial. Para superar esta importante limitación, los inventores han usado la tecnología del ADN recombinante para diseñar vectores de expresión que comprenden los genes udp y deoD y los elementos apropiados para sobreexpresar las nucleósido fosforilasas en las células hospedadoras seleccionadas, como bacterias. El vector de expresión diseñado también facilita la solubilización y la purificación de las diferentes fosforilasas.

Los vectores de la presente invención comprenden una secuencia de nucleótidos codificante de las diferentes nucleósido fosforilasas y las secuencias de nucleótidos que permiten a tal vector ser seleccionable y que se replique autónomamente dentro de la célula huésped.

La construcción del vector de expresión recombinante se lleva a cabo usando tecnologías convencionales de ADN recombinante, es decir procedimientos para unir segmentos de ADN en un sistema libre de células.

El termino "vector" se refiere a una molécula de ADN originada a partir de un virus, un plásmido o una célula de un organismo superior dentro de la cual otro fragmento de ADN, con un tamaño apropiado, puede ser integrado (clonado) sin que el vector pierda la capacidad de autoreplicarse. Ejemplos de vectores lo constituyen los plásmidos, los cósmidos, y los cromosomas artificiales de levaduras. Los vectores generalmente son moléculas recombinantes que contienen secuencias de ADN de orígenes diversos. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que además comprende las secuencias reguladoras o controladoras necesarias para permitir la transcripción y la traducción del gen o los genes clonados. En la presente invención pueden utilizarse vectores de ADN lineales o circulares.

Para que el vector utilizado en la presente invención sea seleccionable y replicable autónomamente en células hospedadoras, el vector seleccionado tiene que ser compatible con las células hospedadoras seleccionadas. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos que permite al vector ser seleccionable y capaz de replicarse autónomamente en Escherichia coli es el gen que codifica el promotor T7, que permite a la ARN polimerasa T7 de la cepa seleccionada de Escherichia coli, unirse al promotor. El término "seleccionable" significa que el vector permanece estable en las bacterias descendientes. La selección se consigue mediante condiciones del medio estrictas de acuerdo con la introducción en el vector de un gen marcador seleccionable apropiado cuya expresión permite identificar las células que han sido transformadas con el vector. El gen marcador seleccionable es a menudo un gen de resistencia a un antibiótico. Algunos genes marcadores seleccionables preferidos en esta invención confieren resistencia a la kanamicina, tetraciclina , carbenicilina y más preferiblemente ampicilina.

La presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes mencionados anteriormente, o ambos vectores de expresión recombinantes en la misma célula.

El término "célula huésped" se refiere a una célula transformada con el vector de expresión recombinante que comprende las secuencias de nucleótidos de PNPasa o UPasa. Otro aspecto del vector de ADN recombinante permite a las células hospedadoras producir nucleosido fosforilasas y cuando las condiciones del medio de cultivo sean las adecuadas, tales nucleosido fosforilasas catalizan la obtención de nucleósidos. En una modalidad particular de la invención, los genes de PNPasa y UPasa de Sulfolobus solfataricus y Aeropyrum pernix, respectivamente, son introducidos en el vector de expresión de ADN. Figuras 7 y 8 muestran las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos pertinentes de la invención, concretamente la secuencia de ácidos nucleicos de Sulfolobus solfataricus deoD (SEC.ID.7) y la secuencia de ácidos nucleicos de Aeropyrum pernix udp (SEC.ID.8), respectivamente.

El experto en la técnica seleccionará apropiadamente el sistema de expresión, constituido por un vector inicial y una cepa de célula huésped vector inicial para maximizar la producción de nucleósidos.

En una modalidad, la célula huésped es Escherichia coli.

En una modalidad particular, la Escherichia coli pertenece a la cepa bacteriana BL21. Varios vectores de expresión adecuados para Escherichia coli BL21 son, por ejemplo, los vectores pET, trcHis y pUB (todos ellos de la casa comercial Invitrogen) y los vectores pGEX y GST (de la casa comercial Amersham). También son útiles en esta invención la cepa bacteriana Escherichia coli DH5 alfa, en combinación con los vectores pUC y Escherichia coli 10F' en combinación con los vectores PSL, los vectores PEZZ o los vectores M13 (todos ellos de Amersham).

En una modalidad, la célula huésped se procesa o está en forma de un Usado.

La presente invención se refiere además a un método de transglicosilación entre un nucleósido donante de azúcar y una base aceptora, en presencia de iones fosfato, caracterizado porque tal método comprende el uso de una uridina fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix (NC_000854.2), una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus (NC_002754.1 ), o una combinación de ambas enzimas.

El término "nucleósido donante de azúcar" se refiere a una glicosilamina que consiste en una nucleobase (a menudo referida simplemente como base) unida a un azúcar de ribosa o desoxirribosa a través de una unión beta-glicosídica. Ejemplos de "nucleósidos donantes de azúcar" incluyen, sin limitación, citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina, así como aquellos nucleósidos naturales o modificados que' contienen D-ribosa o 2'-desoxirribosa ; nucleósidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/ó en la 5'; y nucleósidos en los cuales el azúcar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirr¡bosa, 3',5'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 5'-desoxirribosa, 2',5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'-desoxirribosa ó 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.

El término "base aceptora" se refiere a una nucleobase, base nucleótido, base nitrogenada o simplemente base. En la naturaleza, las bases son parte de ADN o ARN. Las nucleobases primarias son citosina, guanina, adenina (ADN y ARN), timina (ADN) y uracil (ARN), abreviadas como C, G, A, T, y U, respectivamente. El término "base aceptora" en la presente invención significa que comprende también nucleobases modificadas y análogas. En el ADN, la base modificada más común es 5-metilcitidina (m5C). En ARN, existen muchas bases modificadas, incluyendo pseudouridina (?), dihidrouridina (D), inosina (I), ribotimidina (rT) y 7-metilguanosina (m7G). La hipoxantina y la xantina son dos de las muchas bases creadas a través de la presencia de mutágenos. Otros ejemplos de bases aceptoras incluyen las bases purina y pirimidinas naturales o sustituidas; las bases de purina sustituidas en una o más de las posiciones 1, 2, 6; bases pirimidinas sustituidas en una o más de las posiciones 3, 5; y purina, 2-azapurina, 8-azapurina, 1-deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6-diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans-zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina, 6-mercaptopurina.

Este método de transglicosilación es útil para la preparación de nucleósidos, análogos de nucleósidos, y particularmente principios farmacéuticos activos (API); que comprenden, contienen o consisten en grupos de nucleósidos, o análogos de los mismos. Entendiendo un API como cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a utilizarse en la fabricación de un producto farmacológico (medicinal) y que, cuando se utiliza en la producción de un fármaco, se convierte en un principio activo del producto farmacológico. Tales sustancias pretenden proporciona actividad farmacológica u otro efecto en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad o afectan en la estructura y función del cuerpo. (Eudralex, Part II del volumen 4 EU Guidelines to Good anufacturing Practice).

La combinación de uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3) y purina nucleósido fosforilasa (PNP; E.C. 2.4.2.1) transfiere de manera eficiente un grupo azúcar desde un nucleósido donante a una base aceptora.

Cuando los nucleosidos de pirimidina se preparan partiendo desde otros nucleosidos de pirimidina y bases pirimidinas como materiales de inicio, entonces el uso de la UPasa sola es suficiente, pero el uso de ambas enzimas, PNPasa y Upasa es preferente porque la PNPasa también puede contribuir a la etapa de fosforólisis. En cambio, cuando se preparan nucleosidos de purina partiendo de otros nucleosidos de purina y bases de purina como materiales de inicio, entonces el uso de tanto PNPasa como UPasa también es preferida. Por otro lado, el uso de ambas enzimas PNPasa y UPasa es mucho más satisfactorio cuando la reacción es de un nucleósido de pirimidina a un nucleósido de purina, por ejemplo, de una uridina a una 2,6 diaminopurina ribósido, cuando se comparan con el uso de cada tipo de enzima por separado.

Preferiblemente el método de tranglicosilación utiliza una combinación de UPasa y PNPasa. Los lisados celulares crudos o las soluciones clarificadas de enzimas crudas se pueden mezclar en diferentes proporciones para obtener un biocatalizador optimizado para una reacción de transglicosilación particular.

En una modalidad, en el método de transglicosilación de la presente invención, la UPasa de Aeropyrum pernix y la PNPasa de Sulfolobus solfataricus son proporcionadas por una célula huésped según cualquiera de las modalidades presentadas antes y en lo sucesivo.

En una modalidad, en el método de transglicosilación de la presente invención, la UPasa, la PNPasa o una combinación de las mismas, se utiliza en forma de lisado.

En una modalidad, el método de transglicosilación comprende las etapas de: (I) cultivo de la célula huésped en un medio de cultivo adecuado; (II) sobreexpresión de UPasa, PNPasa, o de ambas enzimas; (III) opcionalmente preparación de un lisado celular; (IV) adición de un nucleósido donante de azúcar, una base aceptora, e iones fosfato, y (V) recuperación de los nucleósidos a partir de la mezcla de reacción.

En una modalidad particular, el transformante de Escherichia coli que comprende el vector se puede hacer crecer en un medio de cultivo que comprende triptona, extracto de levadura, cloruro de sodio y un antibiótico seleccionado dentro del grupo que consiste en kanamicina, tetraciclina, carbenicilina, y ampicilina, preferiblemente, a 37°C, hasta alcanzar una densidad óptica, medida a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm, de entre 0.5 - 0.8. A continuación, se puede añadir al cultivo isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para alcanzar una concentración final de 100 mg/l y se pueden realizar inducciones a 37°C, durante 6 - 12 horas. Las células pueden ser recuperadas mediante centrifugación a 4°C y los residuos celulares se pueden lisar usando tres ciclos de congelación-descongelación. Las células huésped recombinantes se pueden alterar mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. El lisado celular resultante puede ser usado directamente como biocatalizador o centrifugarse para eliminar los desechos celulares y obtener soluciones enzimáticas crudas clarificadas. El término "biocatalizador", como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier entidad biológica capaz de catalizar la conversión de un sustrato en un producto, en este caso la biotransformación de nucleósidos.

En otra modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre nucleósidos naturales o modificados que contienen D-ribosa y 2'-desoxirribos; nucleósidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/o en la 5'; y nucleósidos en los cuales el azúcar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirribosa, 3',5'-didesoxirribosa, 2', 3'-didesoxirribosa, 5'-desoxirribosa, 2',5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'-desoxirribosa, 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, la base aceptora se selecciona de entre las bases de purina y pirimidinas naturales o sustituidas; bases de purina sustituidas en las posiciones 1, 2, 6, ó una combinación de las mismas, del anillo purina; bases pirimidinas sustituidas en las posiciones 3,5, o una combinación de las mismas, del anillo de pirimidinas; por ejemplo, purina, 2-azapurina, 8-azapurina, 1-deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6-diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans-zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina, 6-mercaptopurina.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el análogo de nucleósido resultante es un principio farmacéutico activo (API) tal como se conoce en la técnica.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención tal método se lleva a cabo entre 60 y 100°C.

En una modalidad, el método de tranglicosilación de la presente invención se lleva a cabo en medios acuosos o en un sistema de co-solventes polares apróticos.

En una modalidad, el sistema de co-solventes polares apróticos es seleccionado entre dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, dimetilformamida, o cualquier combinación de ellos.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante del azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es la 2,6-diaminopurina.

En una modalidad, la presente invención proporciona una síntesis enzimática de nucleósidos one-pot utilizando uridina o 2'-desoxiuridina como dadores de grupos de azúcar, ya que la enzima UPasa recombinante de la presente invención es la más específica para estos sustratos. Sin embargo, esta enzima se puede utilizar con cualquier donante de grupos azúcar porque no discrimina entre uridina, 2'-desoxiurid¡na, y otros nucleósidos de pirimidina, como desafortunadamente ocurre en muchos organismos inferiores, tales como B. stearothermophilus [14].

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 5-fluorouracilo.

En una modalidad, en el método de transglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 5-trifluorometiluracilo.

En una modalidad, en el método de trang licosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es frans-zeatina.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 2-cloro-6-metilaminopurina.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 6-dimetilaminopurina.

En una modalidad, en el método de tranglicosilación de la presente invención, el nucleósido donante de azúcar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 6-mercaptopurina.

El término "nucleósido fosforilasa termoestable", se refiere a enzimas que son estables al calor, resistentes al calor y que retienen suficiente actividad nucleósido fosforilasa como para llevar a cabo otras reacciones sin desnaturalizarse irreversiblemente (inactivarse) cuando se someten a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para realizar las reacciones de transglicosilación.

Los ejemplos siguientes tienen el propósito de ilustrar la presente invención sin constituir una limitación del campo de aplicación de la misma.

Ejemplos.

Como se ha indicado anteriormente, las reacciones de transglicosilación de acuerdo a la presente invención se llevaron a cabo utilizando las enzimas UPasa y PNPasa obtenidas a partir de células huésped productoras de estas enzimas. Tales células son preferiblemente células de Escherichia coli modificada genéticamente capaces de expresar cantidades considerables de UPasa o PNPasa. Cómo se obtienen tales células, los enzimas y sus características, así como la producción de algunos análogos de nucleósidos se muestran en los ejemplos que se acompañan expuestos a continuación.

Ejemplo 1 ; Construcción de la deoD de Escherichia coli; La secuencia de la Purina Nucleósido Fosforilasa (PNPas) de Sulfolobus solfataricus fue encontrada en la base de datos GenBank, con el número de acceso AE006766. El gen fue amplificado por PCR utilizando 2 unidades de la enzima Platinum Pfx (Invitrogen), utilizando 1mM Mg2S04 y 1x amortiguador de amplificación de enzima, 200 µ? dNTPs y 0.3 µ? de cada cebador con los oligonucleótidos 5'-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3' (Sulfolobus solfataricus deoD promotor; SEC ID No. 1) y 5'-aatcagttttaagaatcttaaggtaat-3' (Sulfolobus solfataricus deoD reverso; SEC ID No. 2) de Sulfolobus solfataricus P2 (15). La reacción de PCR fue llevada a cabo con una primer etapa de desnaturalización a 94°C durante 30 min, seguida de 36 ciclos de temperatura de un paso de desnaturalización a 94°C durante 1 min y un paso de hibridación / extensión a 60°C durante 1.5 min y a 68°C durante 10 min. Después de los 36 ciclos, la muestra se sometió a 68°C durante 10 minutos y finalmente a 4°C. El producto PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN fue purificada del gel (SNAP UV-Free Gel Purificación Kit, Invitrogen). Los fragmentos amplificados fueron clonados en la región polienlazadora del vector pUC18 que lleva un gen de resistencia a la ampicilina (17). La región clonada fue secuenciada completamente y se halló que era completamente idéntica a las secuencias de la base de datos.

Ejemplo 2; Construcción de udp de Escherichia coli; La secuencia de la Pirimidina Nucleósido Fosforilasa (UPasa) of Aeropyrum pernix fue encontrada en la base de datos GenBank, con el número de acceso NC_000854.2. El gen fue amplificado por PCR utilizando 2 unidades de la enzima Platinum Pfx (Invitrogen), 1 mM g2S04 y 1x amortiguador de amplificación de enzima, 200 µ? dNTPs y 0.3 µ? de cada cebador con los oligonucleótidos 5'-caccgtggcccgctacgttctcctc-3' (Aeropyrum pernix udp promotor; SEC ID No. 3) y 5'-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3' (Aeropyrum pernix reverso; SEC ID No. 4) de Aeropyrum pernix K1 (16). La reacción de PCR fue llevada a cabo con una primer etapa de desnaturalización a 94°C durante 30 min, seguido de 36 ciclos de temperatura de una etapa de desnaturalización a 94°C durante 1 min y una etapa de hibridación / extensión a 60°C durante 1.5 min y 68°C durante 10 min. Después de los 36 ciclos, la muestra se sometió a 68°C durante 10 minutos y por último, a 4°C. El producto PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN fue purificada del gel (SNAP UV-Free Gel Purificación Kit, Invitrogen). El fragmento amplificado se clonó en la región polienlazadora del vector pUC18 que lleva el gen de resistencia a la ampicilina (17). La región clonada fue secuenciada completamente y se halló que era completamente idéntica a las secuencias de la base de datos.

Ejemplo 3; Clonación en el vector pET102/D-TOPO® y transformación de las células; Los fragmentos de ADN que contienen las secuencias de los genes deoD de Sulfolobus sulfactaricus y los genes udp de Aeropyrum pernix fueron clonadas en el vector pET102/D-TOPO® vector (pET102 Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen) que comprende el origen de replicación del plásmido pBR322, un gen de resistencia a ampicilina, un promotor T7 que permite la unión de la RNA polimerasa T7, un operador Lac que permite la inhibición de la expresión cuando el isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) no está presente, un sitio de unión al ribosoma para la traducción de ARN, un parche de His-tioredoxina para incrementar la solubilidad de las proteínas de fusión y una etiqueta de polihistidina (6xHis) para la detección y purificación de las proteínas de fusión (ver figura 3). El vector fue introducido por choque térmico en Escherichia coli BL21 (pET102 Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen), una cepa comercial para la expresión regulada de genes heterólogos. Comprende el gen que codifica la RNA polimerasa T7 que hace que la cepa sea compatible con el uso de vectores pET que comprenden el promotor T7 para la sobreexpresión de proteínas recombinantes con IPTG.

Los vectores recombinantes resultantes fueron analizados por restricción de ADN con 10 unidades de la enzima Hindlll. El clon positivo fue secuenciado utilizando los cebadores de secuenciación TrxFus directo 5' TTCCTCGACGCTAACCTG , 3' (SEC.ID. No.: 5) y T7 inverso 5' TAGTTATTGCTCAGGGGTGG 3' (SEC.ID. No.: 6).

Ejemplo 4; Fermentación de las cepas recombinantes: Las cepas recombinantes a las que se refiere la presente invención fueron cultivadas, por separado, en discontinuo, a pH 7, en medios líquidos a base de triptona de soja suplementados con ampicilina. Se pasó una colonia del cultivo en un caldo de nutrientes No. 2 (Oxoide) que contenía Lab-lemco powder 10 g/l, peptona 10 g/l y NaCI 5 g/l, suplementado con 200 mg/l ampicilina. Se incubó a 37°C, en condiciones de agitación vigorosa (200 rpm). Las cepas de Escherichia coli que albergaban el plásmido de expresión se desarrollaron hasta una densidad óptica de 0.6 a 600 nm, entonces se adicionó IPTG (concentración final: 100 mg/l) y se dejó el cultivo en las mismas condiciones de incubación otras 8 horas. Cuando se ha completado la fermentación, el medio de cultivo fue centrifugado y el sedimento celular lavado con solución amortiguador fosfato 30 mM-pH 7. La biomasa obtenida fue conservada a -20°C hasta el momento de su uso.

Ejemplo 5; Purificación parcial de UPasa y PNPasa (preparación de Usado celular); Para una purificación parcial de la proteína, la pasta celular, separada mediante centrifugación o mediante microfiltración de un cultivo de la cepa recombinante que expresa la enzima UPasa o PNPasa, se alteró adicionando 160 mg de lisozima y luego incubación (1 hora, 0°C), seguido de tres ciclos de congelación-descongelación instantáneos (-80°C / 37°C) y a una etapa final para reducir la viscosidad consistente en la adición de 1,000 unidades de desoxirribonucleasa I.

Ejemplo 6; Determinación de la actividad enzimática de la enzima Upasa; 100 microlitros del lisado celular centrifugado, que comprende una suspensión de células que expresan UPasa, diluidos 1:100 (volumen/volumen) con amortiguador fosfato de potasio (pH 7), se añadieron a 800 microlitros de una solución de uridina 75 m en amortiguador fosfato 100 mM a pH 7.0, se preincubaron a 30°C. Después de 5 minutos, la reacción de fosforólisis se detuvo mediante la adición de 1 mi de HCI 2N. De la mezcla de reacción se tomó una alícuota y se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), usando una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de 250 x 4.6 mm. La elución se llevó a cabo usando una solución 4% metanol-agua. La actividad enzimática del lisado celular se expresó en unidades por mi (pmoles de uracilo x min"1 x mi"1) y se calculó en relación a soluciones patrón de uracilo eluídas en las mismas condiciones. Se recuperaron aproximadamente 590 unidades por mi de lisado celular centrifugado.

Ejemplo 7; Determinación de la actividad enzimática de la enzima PNPasa; 100 microlitros del lisado celular centrifugado, que comprende una suspensión de células que expresan PNPasa, diluidos 1:100 (volumen/volumen) con amortiguador fosfato de potasio (pH 7), se añadieron a 800 microlitros de una solución de ¡nosina 60 mM en amortiguador fosfato 100 mM a pH 7.0, se preincubaron a 30°C. Después de exactamente 10 minutos, la reacción de fosforólisis se detuvo mediante la adición de 1 mi de HCI 2N. De la mezcla de reacción se tomó una alícuota y se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), usando una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de 250 x 4.6 mm. La elución se llevó a cabo usando una solución 4% metanol-agua. La actividad enzimática del lisado celular se expresó en unidades por mi (pinoles de hipoxantina x min" x mi"1) y se calculó en relación a soluciones patrón de hipoxantina eluídas en las mismas condiciones. Se recuperaron aproximadamente 310 unidades por mi de lisado celular centrifugado.

Ejemplo 8; Determinación de la actividad catalítica de transglicosilación; Para la determinación de la actividad catalítica de transglicosilación se preparó la mezcla de lisados celulares que contenían UPasa y PNPasa mezclando los lisados para tener una proporción de actividad enzimática UPasa:PNPasa de aproximadamente 1:1, determinado en los ejemplos 6 y 7. La reacción de transglicosilación se llevó a cabo a escala analítica en las siguientes condiciones: 250 microlitros de lisados celulares (equivalentes a 14 unidades de cada actividad enzimática de UPasa y PNPasa) son adicionados a 10 mi de una solución que tenía la siguiente composición: 4 mM de ?-ß-D-ribofuranosiluracilo (nucleósido de uridina), 4 mM adenina, amortiguador fosfato 30 mM pH 7, controlada termostáticamente a 60°C. Después de 1.5 horas a 60°C, la reacción se detuvo diluyendo la mezcla 1:5 y enfriando en un baño de hielo. El porcentaje de bioconversión de la base adenina a 9-ß-?-ribofuranosiladenina (nucleósido de adenosina) se determinó analizando una alícuota de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), usando una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de 250 x 4.6 mm y elusión con una solución 4% metanol-agua . La actividad catalítica de tranglicosilación se expresó en unidades por mi"1 (pmoles de Ara-A en 1.5 horas mi"1 de una mezcla de lisados celulares) o en unidades g" de resina húmeda (pmoles de D-ribofuranosiladenina formados en 1.5 horas mi de lisados celulares) y se calculó en relación a soluciones patrón de D-ribofuranosiladenina eluídas mediante HPLC en las mismas condiciones. Bajo estas condiciones, aproximadamente un 55% de nucleósido de adenosina fueron formados (aproximadamente 9 unidades por mi de lisado celular).

Ejem pío 9; Efecto de la temperatura y el pH sobre las actividades de las nucleósido fosforilasas; La influencia del pH y la temperatura sobre la acción de las nucleósido fosforilasas fue investigada mediante "diseños de métodos de experimentos". Diferentes temperaturas fueron combinadas con diferentes valores de pH para encontrar las condiciones que resulten en la maximización de las actividades enzimáticas. El dominio experimental se definió en el intervalo de temperaturas de 80°C - 100°C y el de pH 5.5 - 8.5. Como se muestra en Figura 4, cinco temperaturas fueron combinadas con tres valores de pH de acuerdo con la "Matriz Doehlert", resultando 7 combinaciones de temperatura y pH. Los sustratos fueron incubados en las soluciones de reacción seleccionadas y temperatura sin enzima y a continuación se añadió la enzima y se incubó en las condiciones seleccionadas. Las muestras se procesaron como se ha descrito anteriormente para la determinación de la actividad enzimática de las enzimas PNPasa o UPasa. Los valores de actividad fueron expresados en porcentajes de los valores máximos encontrados (100%). En Figuras 5 y 6, respectivamente, se muestran los resultados.

Ejemplo 10; Termoestabilidad; La termoestabilidad de las enzimas fue estudiada a 80°C. Se prepararon alícuotas de la enzima entre 100 y 200 microlitros de una suspensión de células (lisado celular) que expresaban UPasa y / o PNPasa, diluidos 1:100 ó 1:1000 (volumen/volumen) usando amortiguador fosfato, pH 7.0 - 7.2. Los biocatalizadores fueron incubados a 80°C varios intervalos de tiempo. Después de calentar, las soluciones se colocaron inmediatamente en hielo y se realizó la medición de las actividades de nucleósido fosforilasas tal como se describe en los ejemplos 6 y 7. No se observó pérdida de las actividades de las nucleósido fosforilasas después de 10 horas a 80°C.

Efectos de los solventes sobre la actividad de nucleósido fosforilasas; Los co-solventes orgánicos son con frecuencia utilizados en reacciones y las enzimas aisladas deben ser capaces de sobrevivir en condiciones de concentraciones relativamente elevadas de co-solventes. Los experimentos fueron llevados a cabo en reacciones con la presencia de solventes orgánicos como el metanol (solvente polar prótico) y dimetilsulfóxido (solvente polar aprótico). Las nucleósido fosforilasas de la presente invención fueron resistentes a los solventes orgánicos mostrando actividad en una solución amortiguador que contenía 5 y 10% (volumen/volumen) de solvente orgánico.

Tabla 1. Estabilidad de la enzima PNPasa en solventes orgánicos; La actividad relativa del lisado celular que comprende la enzima PNPase fue determinada usando el ensayo estándar descrito en el ejemplo 7 a dos concentraciones de los solventes orgánicos y su actividad relativa se comparó con la actividad de los lisados celulares que comprenden la enzima PNPasa sin solventes orgánicos. DMSO: dimetilsulfóxido; MeOH: metanol. Tabla 2. Estabilidad de la enzima UPasa en solventes orgánicos; b|_a actividad relativa del Usado celular que comprende la enzima UPasa fue determinada usando el ensayo estándar descrito en el ejemplo 6 a dos concentraciones de los solventes orgánicos y su actividad relativa se comparó con la actividad de los Usados que comprenden la enzima UPasa sin solventes orgánicos. DMSO: dimetilsulfóxido; MeOH: metanol.

Ejemplo 11 ; Procedimientos generales de bioconversión; Las reacciones de transglicosilación en una sola etapa ("one-pot") fueron realizadas a temperaturas y pH de reacción seleccionados, en recipientes de reacción con agitación moderada. La actividad catalítica de transglicosilación de la mezcla de Usados celulares utilizados era de aproximadamente 12 unidades por mi (determinadas como se describe en el ejemplo 8). Los nucleósidos fueron preparados usando una mezcla del Usado celular preparado para obtener una proporción de actividad PNPasa:UPasa de 1:1.

Los sustratos fueron: 1) 2'-desoxirribonucleósidos o ribonucleósidos naturales que actúan como donantes de 2'-desoxirribosa-1 -fosfato o ribosa-1- fosfato; 2) Una base purina o pirimidina natural o sintética secundaria, que está unida a la posición 1 del azúcar.

Al final de las reacciones, la mezcla se centrifugó y se filtró usando un dispositivo Amicon U Itrafiltration (membrana YM-3) y los productos de reacción fueron separados de acuerdo al protocolo que describe el fabricante. Los biocatalizadores pueden ser reciclados en reacciones consecutivas (normalmente entre 3-5 reacciones) adicionando mezclas, de reacción frescas. Las soluciones filtradas se monitorizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente. Los rendimientos de bioconversión fueron calculados en función de la concentración inicial del análogo de la base.

Ejemplo 12; Preparación de nucleósidos de 2,6-diaminopurina; La preparación de nucleósidos de purinas se dificulta debido a la baja solubilidad de estas bases en medios acuosos. En la presente invención, los inventores usaron las propiedades competitivas de las enzimas para resolver este problema. La estrategia usada por los inventores comprendía el uso de co-solventes orgánicos y/o altas temperaturas para incrementar la solubilidad de los sustratos. 12.1 Preparación de nucleósidos de 2,6-diaminopurina usando co-solventes.

Los ensayos fueron realizados usando concentraciones de 5 y 10% de co-solventes dipolares apróticos a 60°C; se añadieron 12 unidades/ml de Usado celular a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 60°C y que tenía la siguiente composición de soluciones sustrato: 1. 15 mM uridina/2'-desoxiuridina, 2. 5 mM 2,6-diaminopurina, y 3. 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Después de 5 horas, la mezcla de reacción se filtró por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y se recuperó el filtrado. En Tabla 3, se muestran los rendimientos de producción de nucleósidos de 2,6-diaminopurina preparados en presencia de cosolventes. Los nucleósidos de 2,6-diaminopurina (ribósido de 2,6-diaminopurina o desoxiribósido de 2,5-diaminopurina) resultantes se analizaron mediante HPLC. En estas reacciones, los productos se obtuvieron en rendimientos elevados (sobre el 80%).

Tabla 3. Rendimientos de la producción de nucleósidos de 2,6-diaminopurina utilizando co-solventes a diferentes concentraciones (%) a 60°C.

THF: Tetrahidrofurano; DMSO:dímetilsulfóxido 12.2. Preparación de nucleosidos de 2,6-Diaminopurina sin el uso de co-solventes La preparación de nucleosidos de 2,6-diaminopurina sin usar co-solventes solo pudo ser realizada a temperaturas por encima de los 80°C debido a la baja solubilidad en agua de esta base purina. Los ensayos fueron realizados a diferentes temperaturas (80, 90 y 100°C). Para ello 12 unidades/ml de lisado celular fueron adicionadas a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a temperatura seleccionada y que tenía la siguiente composición de soluciones de sustrato: 4. 15 mM uridina/2'-desoxiuridina, 5. 5 mM 2,6-diaminopurina, y 6. 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Después de 5 horas, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y se recuperó el filtrado. En Tabla 3, se muestran los rendimientos de producción de nucleósidos de 2,6-diaminopurina preparados en presencia de cosolventes. Los nucleósidos de 2,6-diaminopurina (ribósido de 2,6-diaminopurina o desoxiribósido de 2,5-diaminopurina) resultantes se analizaron mediante HPLC. En Tabla 4 se muestran los rendimientos de producción de nucleósidos de 2,6-diaminopurina preparados en ausencia de solventes orgánicos. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue de alrededor del 80% en todas las temperaturas ensayadas.

Tabla 4. Rendimientos de la producción de nucleósidos de 2,6-diaminopurina a diferentes temperaturas sin co-solventes orgánicos.

Ejemplo 13; Preparación de otros nucleósidos; Las reacciones de tranglicosilacion fueron llevadas a cabo usando varias bases aceptoras. Las reacciones se llevaron a cabo a 80°C durante varios periodos de tiempo con un 10% de DMSO como co-solvente para las bases de purina y sin co-solventes para las bases pirimidinas. El porcentaje de bioconversión fue calculado en relación a la concentración inicial de la base aceptora y fue determinada mediante HPLC de la mezcla de reacción . 13.1 Preparación de nucleósidos de trifluorometiluracilo; Un mililitro de catalizador (Usado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de Usado celular, fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: 7.5 mM uridina/2'-desoxiurid¡na, - 2.5 mM trifluorometiluracilo, y 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Después de 3 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue superior al 60%. Los nucleósidos de trifluorometiluracilo resultantes (trifluorometiluridina o 2'-desoxitrifluorometiluridina) fueron analizados mediante HPLC. 13.2 Preparación de nucleósidos de 5-fluoruracilo; Se prepararon nucleósidos de 5-fluorouracilo tal como se ha descrito previamente. Un mililitro de catalizador (Usado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: - 7.5 mM uridina/2'-desoxiuridina, 2.5 mM 5-fluorouracilo y - 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Después de 3 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue superior al 50%. Los nucleósidos de 5-fluorouracilo resultantes (5-fluorouridina y 5-fluoro-2'-desoxiuridina) fueron analizados mediante HPLC. 13.3 Preparación de nucleósidos de Trans-Zeatina; Se prepararon nucleósidos de írans-zeatina tal como se ha descrito previamente. Un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: 7.5 mM uridina/2'-Desoxiuridina, 2.5 mM írans-zeatina y 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7. Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como cosolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Después de 5 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversion de la reacción fue superior al 80%. Los nucleósidos de frans-zeatina resultantes (ribósido de trans-zeatina y desoxiribósido de frans-zeatina) fueron analizados mediante HPLC. 13.4 Preparación de nucleósidos de 2-cloro-6-metilaminopurina; Se prepararon nucleósidos de 2-cloro-6-metilaminopurina tal como se ha descrito previamente. Un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: 15 mM uridina/2'-desoxiuridina, 5 mM 2-cloro-6-metilaminopurina y 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7. Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como cosolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Después de 5 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue superior al 80%. Los nucleósidos de 2-cloro-6-met¡lam¡nopurina resultantes (ribósido de 2-cloro-6-metilaminopurina y desoxiribósido de 2-cloro-6-metilaminopurina) fueron analizados mediante HPLC. 13.5 Preparación de nucleósidos de 6-dimetilaminopurina; Se prepararon nucleósidos de 6-dimetilaminopurina tal como se ha descrito previamente. Un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: - 15 mM uridina/2'-desox¡ur¡dina, 5 mM 6-dimetilaminopurina y - 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como cosolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Después de 5 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue superior al 80%. Los nucleósidos de 6-dimetilaminopurina resultantes (ribósido de 6-dimetilaminopurina y desoxiribósido de 6-dimetilaminopurina) fueron analizados mediante HPLC. 13.6 Preparación de nucleósidos de 6-mercaptopurina; Se prepararon nucleósidos de 6-mercaptopurina tal como se ha descrito previamente. Un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilación de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular fue adicionado a 150 mi de una solución mantenida termostáticamente a 80°C y que tenía la siguiente composición: - 15 mM uridina/2'-desoxiuridina, 5 mM 6-mercaptopurina y - 30 mM amortiguador fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DIVISO al 10% (v/v) como cosolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Después de 5 horas a 80°C, la mezcla de reacción fue filtrada por centrifugación a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de corte de 3000 Da y el filtrado se recuperó. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue superior al 50%. Los nucleósidos de 6-mercaptopurina resultantes (ribósido de 6-mercaptopurina y desoxiribósido de 6-mercaptopurina) fueron analizados mediante HPLC.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en este documento se incorporan en la presente por referencia en su totalidad y además se incorporan individualmente por referencia.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Vector de expresión recombinante que comprende: a) la secuencia que codifica una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1), b) la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3), c) o ambas; cada una de las secuencias unida operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción de tales fosforilasas en un huésped de expresión adecuado; originándose tales secuencias de clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEC ID No. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEC ID No. 8) y en que tal huésped de expresión adecuado es E. coli.

2. El vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tal huésped de expresión adecuado es la cepa bacteriana BL21 de E. coli.

3. La célula huésped E. coli que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo a la reivindicación 1.

4. Un lisado obtenido mediante un lisado de la célula huésped de acuerdo a la reivindicación 3.

5. Método de transglicosilación entre una nucleobase unida a un azúcar ribosa o desoxirribosa a través de un enlace beta-glicosídico y una nucleobase o nucleobase modificada en presencia de iones fosfato, caracterizado porque tal método comprende el uso de una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO. 7) sola o con una uridina fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix (SEQ ID NO. 8), caracterizado porque tales fosforilasas son producidas por el vector de expresión recombinante de acuerdo a la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

6. Método de transglicosilación de acuerdo a la reivindicación 5, en donde la UPasa de Aeropyrum pernix y la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus son proporcionadas por una célula huésped de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

7. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde los productos obtenidos son ingredientes farmacéuticos activos (API) o intermedios de los mismos.

8. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde la nucleobase unida a un azúcar ribosa o desoxirribosa a través de un enlace beta-glicosídico se selecciona entre nucleósidos naturales o modificados que contienen D-ribosa o 2 '-desoxirribosa; nucleósidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/o 5'; y nucleósidos en los cuales el azúcar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirribosa, 3', 5'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 5'-desoxirribosa, 2', 5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'-desoxirribosa o 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.

9. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde la nucleobase o nucleobase modificada se selecciona entre bases pirimidinas y purinas naturales o sustituidas; las bases purinas sustituidas en una o más de las posiciones 1, 2, 6; bases pirimidinas sustituidas en una o más de las posiciones 3,5; y purina, 2-azapurina, 8-azapurina, 1 -deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6-diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, írans-zeatina , 2-cloro-6-metilaminopurina , 6-dimetilaminopurina, 6-mercapto purina.

10. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde tal método se lleva a cabo entre 60°C y 100°C.

11. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde tal método se lleva a cabo en medio acuoso o en un sistema de co-solventes polares apróticos.

12. Método de transglicosilación de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el sistema de co-solventes polares apróticos se selecciona entre dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, 2- metil tetrahidrofurano, y dimetilformamida.

13. Método de transglicosilación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5-12, en donde la nucleobase unida a un azúcar ribosa o desoxirribosa a través de un enlace beta-glicosídico se selecciona ente uridina y 2'-desoxiuridina y la nucleobase o nucleobase modificada se selecciona entre 2,6 diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina y 6 mercaptopurina.