RS49561B - Postupak za enzimsku sintezu triazolo nukleozida primenom termofilnih bakterija - Google Patents

Abstract

Postupak za enzimsku sintezu triazolo neukleozida primenom termofilnih bakterija izolovanih iz geotermalnih izvora, naznačen time, što se reakcijom triazolo derivata sa donorima riboze, u prisustvu biomase termofilnih bakterija Thermothrix ihiopara kao izvora enzima, uz dodatak neorganskih fosfata kao katalizatora i sredstva za fosforilaciju riboze, dobijaju farmaceutski aktivna jedinjenja kod kojih je ribozo grupa vezana za triazol. Prijava sadrži još 1 nezavisan i 7 zavisnih patentnih zahteva. <patent>

Description

1.OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi naenzimalni sintezufannaceutslđh jedinjenja kod kojih

je ribozo grupa vezana za triazol, na primer na sintezu mikleozida, kao Sto su 1,2,4-triazolo nukleozidi. Jedno takvo jedinjenje je lek, ribavirin, u herniji poznato kao1 -

P-D-ribofuranozil-1 ,2,4-triazol-3 -Icarboksamid. Prema tome, pronalazak prema

MKP pripada klasi C 12 P, a deliniično i klasi C 12 D 13/00.

2.DEFINISANI PROBLEM

Prvi cilj pronalaska je primena visoko potentnih termofilnih bakterija kao izvora

neophodnih enzima (fosfatazainukleozid fosforilaza) za dobijanje farmaceutski

aktivnih triazolo nukleozida,naprimer, ribavirina, u visokom prinosu.

Drugi cilj pronalaska je obezbeđenje takvih reakcionih uslova pri kojima

komponente i enzimi lakše stupaju u međusoban kontakt i interakciju u reakcionoj

smeši.

Treći cilj pronalaska je dobijanje poboljšanog postupkafinzimatske reakcije ribozo-

donora sa tirazolom, u cilju dobijanja farmaceutski aktivnog jedinjenja triazolo

nukleozida, kao Sto je, na primer, ribavirin.

Dalje cilj ovog pronalaska je obezbeđenje takvihefikasnihprocesa kojima se

dobijaju farmaceutski aktivna jedinjenja, u visokom prinosu i fannakopejskog

stupnja čistoće.

3. STANJE TEHNIKE

Farmaceutska jedinjenja čija je ribozo grupa vezana za triazol, na primer, triazol

nukleozidi, mogu se dobiti na razne načine. Najpoznatije takvo jedinjenje je

ribavirin, to jest l-p^D-ribofuranozU-l^,4-triazol-3-kariw Najčešće

korišćeni postupcisinteze ribaviirna predstavljaju složene nnnrnAm reakcije za

koje su potrebne brojne hemikalije i koje uključuju blokiranje aktivnih grupa

reaktanata, pre finalne reakcije sinteze, aktiviranje riboze i kasnije deblokiranje i

amidaciju inlermedijera. (Videtikanadskipatentni spis CA 997 756 koji odgovara

američkom patentu US 3 798 209 i US 4 614 712 ).

Nedostaciovih postupaka su onečišćenje dobijenih proizvoda brojnim

intermedijerirna i nus produkitma kao i veliki broj tehnoloških operacija, Sto znatno

poskupljuje proizvodnju.

Proizvodnja ovakvih jedinjenja, uključujući ribavirin, može se takođe izvoditi

putem fermentacije ienzimskcsinteze (videu<*>na primer US patent 4 614 719,3 976

S4S i 4 458 016). Metode fermentacije obuhvataju aerobnu kultivaciju bakterijskih

rodova:Brevibacterium, Corynobacterium, Arthrobacterium, Bacillusi tako dalje,

u periodu od dva do osam dana, u kulturalnom medijumu koji, pored hranjive

podloge, sadrži i 1 ^,4-1xiazol-3-karix)ksainid. Zatim se vrši izolacija finalnog

proizvoda, na primer, ribavirina, akumuliranog u fermentarionoj kulturi.(Videti

takođe Furuva, Alrira et al. Japan Kokai 75, 123,882(CL. C12D, C07D, 29. sep.

1975.); US patent 4 614 719, i članak iz Agric. Biol. M. 50(1), 121-6,1986, u kome

se navodi JP No 29720/1975).

Nedostaci ovih metoda, navedenih u stanju tehnike, su dugotrajni procesi

fermentacije i rad na niskim temperaturama (20-40°C), Sto povećava mogućnost

kontaminacije drugim mikroorganizmima, kao i odvijanje brojnih neželjenih

cnzimskihreakcija koje uzrokuju onečišćenje nus-proizvodima fermentacije, čime

se smanjuje prinos ribavirina i otežava prečišćavanje.

Poznateenzimskcmetode uključuju primenu supstratspecifičnih enzima,(na

primer, fbsfataze, pirimidin i purin nukleozid fbsforilaze), različitih heterotrofhih,

mezofimih mikroorganizama, koji se koriste u reakciji ribozo grupe i triazola, za

proizvodnju triazolo nukleozioda (na primer, ribavirina). U praksi, međutim, ovi

procesi nisu ekonomski opravdani. Enzimi dobijem" iz do sada koriSćenih

mikroorganizama su manje aktivni u dalimenzirnskimprocesima na povišenim

temperarurarna, Sto uslovljava nizak prinos proizvoda. Osim toga, niska

temperatura rasta povećava mogućnost kontaminacije drugim mikroorganizmima,,

Složenost postupka za prečišćavanje supstrata specifičnih enzima, kao i česta

nestabilnost izabranih donora riboze, predstavljaju takođe nedostatke kod primene poznatih metoda (Fujishima et al. US 4 614 719,1986; Yamanaka et al. US 4 458 016,1984; JP 29720/1975; Agric. Biol. Chem. 50(1), 121-6,1976).

Pored prečišćenih specifičnih enzima, korišćene su i modifikovane ćelije različitih

mikroorganizama(osušene mikrobne ćelijesadenatinisam'mmembranama,

imobilisane mikrobne ćelije, ekstrakti mikrobnih ćeUja), kaoirazličite proteinske

frakcije iz mikrobnih ćelija ( US 4 968 606, 1990; US 4 614 719, 1986), Sto

komplikuje proces pripreme biomase, a proces proizvodnje usložnjava.

4. OPISREŠENJA

Prema jednom aspektu pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za

dobijanje farmaceutski aktivnih jedinjenja čija je ribozo grupa vezana za triazol,

tako Sto triazol (na primer l,2,4-triazol-3-karboksamid) reaguje sa donorom ribozo

grupe (kao Sto su ribozo-1-fosfat, pirimidin nukleozidi kao uridin, i citidin, purin

nukleozidi kao Sto su inozin, guanozin i adenozin, pirimidin nukleotidi kao

5'-uridin monofbsfat (5-UMP) i purin nukleotidi kao S'-adenozin monofbsfat

(S'-AMP),u prisustvu termofilnih bakterija, na primer i prvenstvenoThermothrix

thiopara,(takođe nazvanaThermothrbc thiopanu),kao izvora enzima koji

katatizuju reakciju.

Pod pojmom "termofilne bakterije<1>" podrazumevaju se bakterije koje su vijabilne na

višim temperaturama, na primer 90-95°C, Čime je obuhvaćenaiThermothrbc

thioparaćiji je temperaturni opseg rasta od 40-80 °C.

Na bazi podataka o sastavu i temperaturama voda, izabrane su termalne vode iz tri

banje u Srbiji, kao prirodm stariilhatermotllnui mikroorganizama (takvih kao Sto su

Thermothrbc thioparai druge srodne bakterijske vrste, primenjene u našem

pronalasku):

-Jošanićka banja (temperatura vode 62°C-78°C, pH vode 7.5-7.8)

-Vranjska banja (temperatura vode 78°C-80°C, pH voda 7.5)

-Sijarinska banja (temperatura vode 41°C-63°C, pH vode 8.0)

Opis geotermalnog izvora - prirodnog staništa-Jošanićka banja

-Temperatura vode 62-78°C,

-Temperatura stene koju preliva voda je 56-57°C

-pH vode 7.5-7.8

-Mineralni sastav vode [g/l]: Na<+>0.083, Ca"<1>"<*>0.015, Mg<4*>0.0002, HCO3-0.195,

(SCU)2" 0.035, Cl- 0.016 i Koloidi [g/l]: SiOa0.038, AI2O3 f FdOa u tragovima,

-H2S 0.0026[g/l], CO2nema

Opis uzorkovanog biološkog materijala

-Sluzave belićaste naslage bakterija, konćaste, na pojedinim mestima

inkrustrirane sitnozmastim materijalom, na kamenitoj podlozi koju

permanentno obliva topla voda.

Izolovano je i prečišćeno ukupno sedam morfološki različitih tipova kolonija

termofilnih bakterija. Iztermalnihvoda Jošaničke banje izolovane su četiri

morfološki različita tipa kolonija označena kao J2, J3, J4 iJi ( Thermothrbc

thiopara).Prema Bergey s Manual Detemiinative bacteriologv, 1986). Iz voda

Vranjske banje izolovana su dva tipa kolonija označena kao Vii V2, dok je iz voda

Sijarinske banje izolovana jedna bakterijska kultura, pri čemu su kolonije iz

Vranjske banje vizuelno identične dvema kolonijama iz Jošaničke banje.

Opis postupka rada

I Faza

- Inicijalna kultivacija i revitalizacijabiološkog materijala na čvrstim i tečnim

hranljivim podlogama

- Prečišćavanje mešovite i izolovanje čistih kultura,metodom »išarane ploče«

Ukupno su izolovane 4 kulture -različite vrste bakterija

II Faza

- Provera rasta čistih kultura bakterija na diferencijalnim i selektivnim

podlogama specifičnim za patogene (Endo agar, SS agar, Simons Citratni agar,

Dezoksiholatni agar, Kliglerov dvostruki šećer)

- Provera hemolttičnosti- Kvalitativnitest hemotize na krvnim pločama. Sprovedeni testovi potvrđuju da ni jedna od izolovanih kultura ne pripada grupi patogenih, ni hemolitičnih mikroorganizama, što omogućuje bezbedan rad u inđustrajskim uslovima.

IQ Faza

- Temperaturni skrining rasta izolovanih čistih kultura bakterijana čvrstim hranljivim podlogama, u temperaturnom opsegu od 25-80°C. Ni jedna od izolovanih kultura ne raste na 25°C. Izabrani soj Jiraste u opsegu temperatura

40-73°C, optimum na 60°C.

- Izbor tečne hranljive podloge za rast i razmnožavanje bakterija.Izabrana podloga-fermentacioni medij um sadrži pepton, mesni ekstrakt, NaCl, K2HPO4

NaaSjChi destilovanu vođu.

- Dobijena biomasa ( intaktne, netretirane ćelije) nakon faze efrmentacijekoristi se u enzimskim sintezama triazolonukleozida, kao izvor enzima za dobijanje ciljanih jedinjenja

IV Faza

-Skrining izolovanih termofilnih bakterija u enzimskoj produkciji

triazolonukleozida i izbor najaktivnijeg soja u enzimskoj sintezi ribavirina.

Najproduktivniji je soj obeležen kao J| tako da je izabran za dalji rad i determinaciju.

VFaza Detennlnadja izabrane bakterijske kulture

Orijentacioni testovi(Bojenje po Gramu - Gram negativne štapićaste bakterije, katalaza+)

hđorfoloSke osobine bakterija

- Oblik i veličina ćelija (Bojenje po Gramu,Gram - štapićaste ćelije

0.5-1.0 x 3-5 u neravnomerno obojene crveno od safranina, grupišu se u lance, u starijoj kulturi filamentišu i pojavljuju se i fragmenti, kao i ekstracelulame granule)- Formiranje spora- (inalctivacija vegetativnih ćelija na 100°C i bojenje po Šefer Fultonu, starijih kultura). Nisu prisutne spore.

Kulturelne osobine- rast na čvrstim i tečnim hranljivim podlogama

- Izgled kolonija nakon 24h inkubacije na 6& C.Kolonije ovalne, u prečniku 4 - 6mm, blago izdignute iznad podloge

- Površina kolonija- je glatka i sjajna

- Boja kolonija- je tamnije drap

Fiziološke osobine bakterija

- Pokretljivost bakterija +

- pH opseg rasta(6.0-9.0), najbolji rast na 7.2-7.4

- Odnos prema kiseonikufaerobni do nukroaerofilni).

- Auksotrofni rast na mineralnoj podlozi TXBslab rast,filamentozan.

- Miksotrofni rast ( ekstrakt kvasca 0. 05% + neorganska podloga TXB)+,naovoj podlozi uočljiv je rast u obliku končaste mase, kao Sto je i u prirodnom

staniStu.

- Heterotrojhi rast u hranljivom bujonu+

- Rast u podlozi sa NajSjČh +

- Osetljivost na penicilin +

- Likvefakcija želatina +

- Rast u stacionarnoj kulturi - nizak sadržaj O2 -izražena filamentacija bakterija

- Rast u aerisanoj kulturi-prisutne Štapićaste forme bakterija bez fllamenata.

Biokemijske osobine bakterija

- Katalaza +

- Peroksidom +

- KariStenje Šećerafdekstroza+, rafinoza+, manoza-, maltoza+, saharoza+,

laktoza+, sorbitol-, inositol-, galaktoza*,

- Likvefakcija želatina +

- Hemoliza na krvnom agaru -,Sto znači da ne produkuje hemolizine (faktore virulencijeipatogenosti)

- Korištenje NajSjOs +

- Redukcija tiosulfata i sulfata do elementarnog sumpora ( pojava granulo

sumpora)

- Osetljivost na lizozim^

Na osnovu rezultata gore navedenih testova možemo zaključiti da termofilni izolat

obeležen kao Jipripada aerobnim fakultativno hemoliritrofhim bakterijama vrste

Thermothrbc thiopara.

Najznačajnije osobine ispitivanog prirodnog izolata termofilnih bakterija koje ih

svrstavaju u vrstuThermothrbc thioparasu:

-Gram negativne Štapićaste bakterije

-Ćelijski polimorfizam (u aerisanim u<g>lovima prisutne su Štapićaste ćelije, dok je

u stacionarnim uslovima kultivišanja sa slabom aeracijom prisutni uglavnom

dugački filamenti

-Ne sporuliSe.

-Fakultativni hemolitotrofi (za dobijanje energije koristi neorganske supstrate,

kaoiorganske)

-Koristi jedinjenja sumpora (Na^Os) kao izvor energije.

-Temperatura rasta 40-73°C, optimum 60°C

-pH 6.0-8.0

-Osetljive su na penicilin i lizozim

-Produkuju peroksidaze- razgrađuju H2O2

Ispitivanja supokazala da se navedenetermofilnebakterijemogu kultivisati na heterotrofhimpodlogamai koristitikaoizvor enzimafbsfatazai nukleozid fosforilaza,neophodnih za enzimskusintezu triazolonukleozida, naprimer

ribavirina.

Prematome,primenatermofilnihbakterija (na primerThermothrbc thiopara)za dobijanje aktivnih triazolo nukleozida, na primer ribavirina, imaza posledicu mogućnostefikasne cnzimske reakcije napovišenojteniperaturi(50°C-70°C) i

proizvodnju u visokom prinosu. Primena intaktnih, netretiramh ćelija termofilnih

bakterija (naprimerThermothrbc thiopara) obezbeđuje kraći i ekonomičnijipostupak primene aktivne biomase za izvođenje enzimnkereakcije, Stou celini, ima za posledicu visokoefikasan proces proizvodnje.

Izbor ove vrstebakterijainačin pripreme cn zimskog materijala,uzdefinisanjereakcionihparametarakojidovode do liziranja ćelijau tokuprvih satireakcije,teoslobađanje ćelijskihenzimaidirektnog kontakta sasupstratom,povećanebrzinereakcije,boljenstvorljivosti početnog materijala, kaoismanjene mogućnostikontaminacije i limitiranjakonkurentnih reakcija,ucelini obezbeđujevisok prinos ribavirina.

I, na kraju,postupkom prema pronalasku se obezbeđujuprocesi kojimasedobij aju

proizvodi farmaceutskog stepena čistoće primenljivi u različitim farmaceutskim

oblicima.

Različiti načiniizvođenja * n- rim* Vr>.sinteze prema pronalasku, prikazani su nasledećim šemama (a), (b), (c), (d),(e)i (f).

Prema jednom od navedenih načina izvođenja procesa ili postupaka sinteze,

pronalazak se može koristiti za dobijanje ribavirina.U tom smislu, enzimatska

sinteza ribavirina obuhvata reakciju 1,2,4-triazol-3-karboksamida(TCA) sa jednim od brojnihdonora riboze (na primeriprvenstveno,uridinom),prvenstvenou

koncentraciji nešto većoj od ekvimolarne količine TCA (na primer 1,2:1),u

prisustvukatalizatora, na primer, kalij um dihidrogen fosfata, koji delujeikaoizvor

fosfata neophodnih u biohemijskom procesu fosforilacije riboze. Izvor enzimakoji

se koristiureakcionoj smeši su prvenstveno intaktne ćelije termofilnih bakterija

Thermothrbc thiopara,koje ne proliferišu u reakcionim uslovima nego lizirajuu

prvim satima enzimske reakcije. Liziranje ćelija omogućava da se reakcija obavlja

upravcuenzimskesinteze, na primer ribavirina, kroz neposredan kontaktenzimaili

enzimskog materijala sa supstratom. Umesto složenih rnetaboličlđh procesa koriste

se žive ćelije pri kojima bi se sinteza ribavirina odvijala u drugačijim uslovima.

Upostupku pripreme aktivne biomase za primenu u jednom odnačinaizvođenja

pronalaska, terrnofilne bakterijeThermothrbc thiopara se kuMvišu usterilnoj

hranljivoj podlozi koja ima sledeće sastojke [g/L]: pepton 5, mesni ekstrakt 3,

natrijum hlorid5,kalijum dihidrogen fosfat 0.3, natrijum uosulfat pentahidrat0.03 idestilovana voda. Glavna kultura sepripremainokulacijom seed kultureuhranljivu podlogu istog sastava, posle čega sevršiinkubacija 18 sati na 50°C,uzaeracijui

kontinuirano mešanje pri 100 o/min. Posle završene inkubacije, ćelije se odvojeod

hranljive podloge centrifugiranjem pri 2700 o/min. Supernatant se odvaja, a talog

koji sadrži vlažnu biomasu ćelija se sakuplja, resuspendujeuvodii uvodi u

reakcionu smešu.

Prema ovom načinu izvođenja pronalaska, koncentracija vlažne biomaseu

reakcionoj smeši je 50-60mg/ml. Pogodni donori ribozeuenzimatskojsintezi su

pirimidinski nukleotidi takvi kao S'-uridin monofbsfat (5'-UMP), purinski

nukleotidi kao S'-adenozin monofbsfat (5'-AMP), pirimidin nukleozidi kao uridin

(koji je poželjan)i ciudin,purinski nukleozidi takvi kaoinozin,guanozini

adenozin.

Reakcija enzimatske sinteze se obavlja pri pH vrednosti reakcione smeše

prvenstvenouopsegu od 5 do 9 na temperaturi prvenstveno 50-70°C, u toku 1-48

časova.

Po završetku enzimatske reakcije, aktivna supstanca, na primer, ribavirin, se izoluje

i prečisti odvajanjem od nus-produkatai rezidualnih količina reaktanata.Ova

izolacija se izvodi postepenim taloženjem na bazi različitih rastvorljivosti

proizvoda, nus-produkataipočetnog materijala u reakcionoj sredini (mada se mogu

koristitii drugipostupci izolacijeiprečišćavanja koji su poznati stručnjacimaizte

oblasti), te zatim hromatografijom na kolonama, na primer sa odgovarajućim

jonoizmenjivačkim smolama. Uridin, uracil, TCA, S'-uridin monofbsfati

neorganski fosfati uklanjaju se na jakoj anjonskoj izmenjivačkoj smoli, naprimer Cl"oblika. Na jakoj katjonskoj jonoizmenjivačkoj smoli, na primerH<*>oblika, uklanjaju se tragovi nečistoća u katjonskom obliku (K<+>, NH4<+>, teški metali,itd.).

Ribavirin farmaceutske čistoće se eluira sa vodom, a zatim kristaiise iz

koncenlrovanog i ohlađenog eluata, uz naknadni dodatak etanola, u prinosu od 80-90%.

Uticaj prirode donora riboze na prinos ribavirina dat je u Tabeli 1.

Postupakenzimatske sinteze ribavirina, prema jednom načinu izvođenja

pronalaska, prikazanje na sledećoj reakcionoj šemi:

Šema (g)-Postupak enzimske sinteze ribavirina

Uticaj temperature inkubacije reakcione sme&e na prinoa ribavirina iz uridina kao

donora riboze i 1.2.4-triazol-3-karboksamida. dat ie u Tabeli 2.

Uticaj koncentracije kalijum dihidrogen fosfata (KH2PO4) na prinos ribavirina iz uridina kao donora riboze i l,2,4-triazol-3-karboksamida dat je u Tabeli 3.

KaoSto je prikazano na šemi (g), enzimi izThermothrbc thioparaprvenstveno se

koriste u sintezi ribavirina iz uridina i 1,2,4-triazolJ.karboksamida. Uridin i

neorganski fosfati se prevode u ribozo-1-fosfat i uracil pomoću pirimidin nukleozid

fosforilaze. Istovremena degradacija uridina do uracila i riboze, katalizovana

nukleozidazama, limitirana je u izabranim uslovima enzimatske reakcije. Konačno,

purin nukleozid fosforilaze katalizuju reakciju ribozo-1-fosfata i l,2,4-triazol-3-

karboksamida do dobijanja ribavirina i neorganskog fosfata.

Prema tome, jasno je da primena termofilnih bakterija kao izvora enzima za

enzimsku sintezu triazolo nukleozida, kao što su 1,2,4-triazolo nukleozidi (a

posebno ribavirin), omogućava izvođenje reakcije na povišenoj temperaturi, koja

obezbeđuje stabilnost i povećanu aktivnost enzima i poboljšava rastvorljivost TCA.

Ekonomičnost postupka je obezbeđena redukovanjem vremena pripreme aktivne

biomase, povećanom efikasnošćuenzimatskereakcije putem boljeg kontakta

supstrata i enzima oslobođenih iz lizi ranih ćelija, skraćenim procesom

denarurisanja i separacije ćelijsldh proteina i skraćenjem procesa hromatografskog

prečišćavanja, uz izbor odgovarajućih jonoizmenjivačkih smola. Pripremanje

biomase i izvođenjeenzimskesinteze pri povišenim temperaturama sprečavaju

kontaminaciju drugimmikroorganizmimaVeći prinosi i kodenzimatskereakcije

(procenat konverzije) i u procesu izolacije finalnog proizvoda nisu samo rezultat

rada na višim temperaturama, već i izbora odgovarajućeg donora riboze, molamog

odnosa reaktanata i katalizatora, izbora odgovarajuće količine vlažne biomase,

izbora pH reakcije i definisanja optimalnih uslova izolacije i prečišćavanja Pošto

se liziranje bakterija odvija tokom reakcije, nema problema ni sa inaktivisanjem

ćelija posle završene enzimatske reakcije.

U daljem tekstu postupak će biti ilustrovan sledećim primerima enzimatske sinteze

ribavirina

Primer 1.

BakterijeThermothrbc thioparase inokulišu sa agarizovane podloge u sterilnu

hranljivu podlogu koja sadrži sledeće sastojke [g/L]: pepton 5, mesni ekstrakt 3,

natrijum hlorid S, kalijum dihidrogen fosfat 0.3 i natrijum tiosulfat pentabidrat 0.03

(kao dodatni izvor energije)idestilovanu vodu,pričemu je pH7,0.Zasejana

podloga se inkubira 18 sati, na 50°C, uz aeracijuimesanje od 100 o/min. Po

završetku procesa kuravnacije-fermentacije, kojim se dobij a potrebna količina

aktivne biomase, bakterijski talog se izdvaja cenbafugoanjem pri 2700o/min,

resuspenduje u destilovanoj vodi i hornogenizuje.

Ureakcionu smesu čija je pH 6.5, koja sadrži 120 mM uridina, 100 mM TCA,i 50

mM KH2PO4, unosi se biomasa bakterija koju čine netrctiranc intaktne ćelije

Thermothrbc thiopara, tako da je konačna koncentracija vlažne biomase bakterija

58 mg/ml reakcione smele. Reakciona smeša se inkubira 24 sata na 60°C,uz

kontmuirano mesanje. Po završenoj inkubaciji, reakciona smeša se centrifugira, a

talog uklanja. Supernatant se podvrgavatenničkoj obradizagrevanjem 20 minuta

na 90°C, radi inaktivacije enzimaidenaturacije proteina. Tako dobijen supernatant

se koncentruje uz vakuum do koricenlTacije uracila od 30-40 mg/ml, pri čemu se

istaložiiotkloni veći deo rezidualne količine uracila, TCA,idelimičnozaostala

količina uridina. Posle podešavanja pH rastvora na 9.0, izdvaja se najveći deo

neorgansltih fosfata. pH dobijenog supematanta se podešava na 11.5iprenosi na

j onoizmenj ivačku kolonu napunjenu jakom anjonskom smolom, sa

trimetilamonijumfunkrionalnomgrupom, oblika Cl". Ribavirin se eluira sa kolone

vodom, dok rezidualne količine uridina, uracila, TCA, uridin monofosfata i

neorganslrih fosfata zaostaju na koloni. Vodeni eluat se propušta krozkatjonsku

jonoizmenjivačku smolu (funkcionalna grupa sumporna kiselina), oblika H*, pri

čemu tragovi nečistoća u katjonskom obliku zaostaju na koloni. Ribavirin

farmnceirtske čistoće kristališe iz koncetrovanog i ohlađenog chiata, uznaknadno

dodati etanol, u prinosu od 80-90%.

Primer 2

Prethodno opisane te"""fifa« bakterije, detenninisane kao vrstaThermothrbc

thiopara,inokuliSu se sa čvrste agarizovane podloge, u sterilnuhranljivupodlogučijije pH 7.0,ikultivišu 24 sata na 60°C ("stajaća kultura"). Dobijem primarni seed

se preseje u svežu hranjivu podlogu i kultiviše u istim uslovima 24 sata, pri čemu se

dobije selamdarni seed. Glavna kultura se priprema presejavanjem sekundarnog

seeda (inokuluma) u svežu podlogu i kultiviše 18 san' (fermentacija) u istim

uslovima. Bakterije se zatim istalože centrifugiranjem na 2700 o/min, a dobijeni

talog se resuspenduje u destilovanoj vodi i hornogenizuje. Reakciona smeša se

hornogenizujeiinkubira 24 časa, na 45°C. Prinos ribavirina je 14,9 mM (46,6%).

Primer 3

BakterijeThermothrbc thioparainokulišu se (sa čvrste agarizovane podloge)u

sterilnu hranljivu podlogu obogaćenu sa 30 ppm NaaSjGj. Posle 24 časa aerobne

kultivacije na 50°C, uz mesanje pri 100 o/min dobijen je primarni seed. Primarni

seed se preseje u svežu hranljivu podlogu istog sastavaikultiviše tokom 24 časau

istim uslovima kaoiprimami, pri čemu se dobija sekundarni seed. Presejavanjem

sekundarnog seeda u svežu hranljivu podloguiinkubacijom tokom18časova (procesfermentacije)pod istim uslovima, pripremljena je glavna kultura. Bakterije

sepotoni istalože c^trifu<g>iranjem na 2700 o/min, a dobijeni talog se resuspenduje

u redestUovanoj vodi i hornogenizuje. U reakdonu smešu, zapitonine 10ml, koja

sadrži 100 mM TCA, 120 mM donora riboze (navedenih u Tabeli 1.) i 25 mM

KH2PO4, pri pH 6.5, dodaje se prethodno pripremljena vlažna biomasa bakterija

Thermothrbc thiopara.Smeša se hornogenizuje, a zatim inkubira tokom 24 časa na

60°C.

Prinosi ribavirina dati su u Tabeli 1.

Claims (9)

1. Postupak za enzimsku sintezu triazolo nukleozida prirnenom termofilnih bakterija izolovanih iz geotermalnih izvora, naznačen time,Stose reakcijom triazolo derivata sa donorima riboze,uprisustvu biomase termofilnih bakterijaThermothrbc thioparakao izvora enzima, uz dodatak neorganslđh fosfata kao katalizatoraisredstva za fbsforilaciju riboze, dobijaju farmaceutski aktivna jedinjenja kod kojih je ribozo grupa vezana za triazol.

2. Postupak prema zahtevu1.,naznačen time, Sto je dobijeno farmaceutski aktivno jedinjenje ribavirin.

3. Postupak prema svim premoćnim zahleviam, naznačen time, Sto se kao triazolo derivati koristi 1,2,4-triazolo derivat, prvenstveno, l,2,4-triazol-3-karboksamid

4. Postupak prema svim prethodnim zahtevima, naznačen time, Sto se kao donori riboze koriste r<i>bozo-1-fosfat, pirimidinskiipurinski nukleozidi, pirimidinskiipurinski nukleotidi.

5. Postupak prema svim prethodnim zahtevima, naznačen time, Sto se kao katalizatoriizvor neorganskog fosfata koristi alkalni fosfat, prvenstveno kalijum dihidrogen fosfat

6. Postupak za enzimsku sintezu ribavirina, prirnenom termofilnih bakterija dobijenih kultivacijomuhranljivoj podlozi -fermentacijom, n«*n«fen time, Sto dolazi do reakcije između donora riboze i 1,2,4,-triazol-3-karboksamida, pri čemu je donor riboze prisutan u količini većoj od ekvimolame u odnosu na l,2,4,-tirazol-3-karboksamid, uz katalititičko delovanje kalijum dihidrogen fosfata u koncentraciji od 25-100 mM u odnosu na 100 mM 1,2,4, triazol-3-karboksamida,iučešće termostabilnih fosfataza, pirimidin-nukleozidipurinntiukleozid fosforilaza,izintaktnih ćelija termofilnih bakterijaThermothrbc thioparakoje, u uslovima reakcije ne proliferišu, pri pH 5-9 i na temperaturi50°C-70°C,u toku 1-48 časova, pri čemu je koncentracija vlažne biomase bakterija u reakcionoj smeši 50-60 mg/ml, posle čega se dobijeni ribavirin izolujeiprečišćava separacijom nus-produkatairezidualnih količina reaktanata, na bazi različitih rastvorljivosti komponenata u reakcionom medij umu, te hromatografij om na kolonama sa jonoizmenjivačkim smolama, dok se ribavirin kristališe dodatkom etanoiaukoncentrovan i ohlađen eluat.

7. Postupak prema zahtevu 6., naznačen time, Sto se kao donori riboze koriste:pirimidinski nukleozidi kao Sto je uridinipirimidinski nukleotid5<*->uridinmonofosfat

8. Postupak prema prethodnim zahtevima,naznačen time.Sto prečišćavanje reakcione smeSe posle enzimske sinteze i izolacija triazolo nukleozida obuhvataju uklanjanje zaostalog liziranog čelijskog materijala i proteina termalnom obradom 20 min, na 90°C, separatno taloženje rezidualnih količina reaktanata i nus-proizvoda iz prethodno koncentrovanog supematanta uz vakura, posle Čega se supernatant koji sadrži 90 g/L ribavirina, čiji je pH podešen na 11.5, hromatografski prečiSćava na prethodno regenerisanim kolonama sa jonoizmenjivačkim smolama, a celokupna količina ribavirina se eluira vodom.

9. Postupak prema zahtevu 8.,naznačen time,Sto se za punjenje kolona koriste jaka anjonska jonoizmenjivačka smola sa funkcionalnom trimetilamonijum grupom. Cl' oblika i jaka katjonska jonoizmenjivačka smola sa funkcionalnom grupom sumporne kiseline, H* oblika.