KR870002167B1

KR870002167B1 - 리바비린의 제법

Info

Publication number: KR870002167B1
Application number: KR1019830001834A
Authority: KR
Inventors: 데쓰로오 후지시마; 요시오미 야마모도
Original assignee: 야마사쇼유 가부시기가이샤; 하마구찌 미찌오
Priority date: 1982-04-30
Filing date: 1983-04-29
Publication date: 1987-12-14
Also published as: ES8406090A1; US4614719A; KR840004453A; IL68516A0; EP0093401B1; HU191292B; ES521984A0; IE830992L; IL68516A; DE3368641D1; CA1196591A; EP0093401A1; IE54924B1; AR231308A1

Abstract

내용 없음.

Description

리바비린의 제법

본원 발명은 리바비린(ribavirin)의 제법의 효소적인 제조법에 관한 것이다.

리바비린의 화학명은 1-β-D-리보푸라노실-1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드이며, 바이라졸(virazole)이라고도 불리우며, DNA 및 RNA 바이러스에 대하여 광범위하고 강력한 항바이러스작용을 나타내는 화합물로서 알려져 있다(미합중국 뉴욕 과학학회연보(Annals of the New York Academy of Sciences) 특히 284면, 272-292면 (1977)).

종래 알려져 있는 리바비린의 제조법으로서는 합성법, 발효법 및 효소법이 있다.

합성법의 대표적인 방법으로서는 3-메톡시카르보닐-1, 2, 4-트리아졸과 1-0-아세틸-2, 3, 5-트리-0-아실-β-D리보푸라노스를 반응시키고(용융법), 얻어진 1-(2', 3', 5'-트리-0-아실-β-D-리보푸라노실)-3-메톡시카르보닐-1, 2, 4-트리아졸을 암모니아로 처리하고, 아미드화 및 탈보호를 행하는 방법(일본국 특허공개 제1973-4469호, 제 1974-80070호, 제 1974-80071호 각 공보 참조), 상기와 같은 방법에 있어서 트리아졸의 3위의 치환기로서 아랄킬옥시기를 사용하는 방법(일본국 특허공개 제 1980-160793호 공보 참조), 3-메톡시카르보닐-1, 2, 4-트리아졸을 트리메틸실릴화하여, 2, 3, 5-트리-0-벤조일-β-D리보푸라노시드의 할로겐화물과 반응시킨(실릴화법) 후, 암모니아로 처리하는 방법(일본국 특허공개 제 1973-4469호, 제 1974-86372호 각 공보 참조) 등이 알려져 있다. 이와 같은 합성법은 어느 것도 반응전에 원료화합물의 활성기를 보호할 필요가 있으며, 또 반응에 있어서는 리보스의 활성화가 필요하거나 고온으로 가열할 필요가 있는 경우도 있으며, 또 반응 뒤에 탈보호 및 아미드화가 필요한 등 반응 조작이 번잡하다는 등의 문제가 있다. 또 축합반응의 위치선택성은 어느 방법도 높지 않다.

발효법으로서는 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 미크로콕쿠스(Micrococcus)속, 또는 바실루스(Bacillus)속에 속하는 미생물을 배양하여 중식시킬 때, 사용 미생물의 배양을 위해 필요한 탄소원, 질소원, 무기물, 기타 영양물을 함유한 배지(培地)에 배양개시전 또는 배양중, 일시에 또는 간헐적으로 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드를 첨가하고 배양개시후 2-8일간 배양하며, 배지 중에 리바비린을 생성 및 축적시키는 방법이 알려져 있다(일본국 특허출원공고 제1979-17830호 공보, 일본국 농예화학회지 50(9), 423-430 (1976) 참조), 이 방법은 다음과 같은 문제점이 있다. 즉 (1) 리바비린의 제조는 미생물의 증식중에 영양배지 중에서 행해지므로 우선 미생물의 증식을 위한 각종 영양원을 함유한 배지를 제조할 필요가 있으며, 또 종균을 식균(植菌)하기 전에 이들의 배지를 살균해야만 하는 등의 사전처리가 번거롭다. (2) 리바비린의 축적을 목적으로 하는 미생물의 증식을 수반하는 배양은 일반적으로 20-40℃의 상온에서 행해지므로 항상 잡균오염에의 배려가 필요할 뿐만 아니라, 이러한 조건하에서는 리바비린 분해활성도 존재하고 있으므로, 생성한 리바비린도 분해되어 목적물의 생성율이 저하한다. (3) 배양을 2-8일간의 장기간에 걸쳐서 수행하지 않으면 안된다. (4) 각종 누클레오시드((nucleoside), 리바비린의 인산화물 및 기타 대사산물(代謝産物)이 부산물로서 생성되며, 배양액으로부터 리바비린을 회수하기 위해서는 원료화합물뿐만 아니라 각종 부생물로부터도 분리되어야만 하는 단리(單離)정제가 번거롭다. (5) 미생물은 리바비린의 제조시에 배양되지 않으면 안된다.

또 효소적인 제조법으로서는 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드와 리보스-1-인산을 pH 5-9, 온도 0-50℃의 조건하에서 누클레오시드 포스포릴라제의 존재하에서 반응시키는 방법이 알려져 있다(일본국 특허공개 제 1975-29720호 공보 참조). 이 방법에 있어서는 리보스(ribose) 공여체(供與體)로서 사용되는 리보스-1-인산이 불안정하며 용이하게 입수할 수 없으며, 효소로서는 정제효소가 사용되고 있으며, 효소의 조제가 용이하지 않는 등의 결점이 있다.

본원 발명자들은 미생물의 배양물, 균체 또는 균체처리물을 효소원으로 하고, 미생물의 비증식(非增植)조건하에서 효소반응에 의하여 리바비린을 생성할 수 있다는 사실을 최초로 발견하고, 이 발견에 의하여 본원 발명을 완성했다.

본원 발명은 아래의 군에서 선택된 속에 속하는 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드와 리보스공여체에서 리바비린을 생성하는 반응을 촉매하는 효소계를 함유하는 미생물의 효소작용하에 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 또는 그 염과 리보스공여체를 상기 미생물의 비증식 조건하에 있어서 수성매체중에서 접촉시켜 리바비린을 생성시키며, 이것을 취득하는 것을 특징으로 하는 리바비린의 제조법을 제공하는 것이다.

(1) 브레비박테리움(Brevibacterium)속, (2) 코리네박테리움(Corynebacterium)속, (3) 아스로박터(Arthrobacter)속, (4) 미크로콕쿠스(Micrococcus)속, (5)바실루스(Bacillus)속, (6) 플라보박테리움(Flavobacterium)속, (7) 미크로박테리움(Microbacterium) 속(브로초스릭스(Brochothrix) 속), (8) 크산토모나스(Xanthomonas) 속, (9) 슈도모나스(Pseudomonas) 속(알테로모나스(Alteromonas) 속), (10) 아크로모박터(Achromobacter) 속, (11) 에세리키아(Escherichia) 속, (12) 에어로박터(Aerobacter) 속, (13) 사르시나(Sarcina) 속, (14) 스타필로콕쿠스(Staphylococcus) 속, (15) 박테리움(Bacterium)속, (16) 세라티아(Serratia) 속, (17) 프로테우스(Proteus) 속, (18) 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속, (19) 엔테로박터(Enterobacter) 속, (20) 미코플라나(Mycoplana) 속, (21) 비브리오(Vibrio) 속, (22) 에르위니아(Erwinia) 속, (23) 클레브시엘라(Klebsiella) 속, (24) 에어로모나스(Aeromonas) 속, (25) 미코토룰라(Mycotorula) 속 및 (26) 칸디다(Candida) 속.

본원 발명에 있어서, "미생물의 효소작용하에" 라고 하는 것은 이 미생물의 배양물, 균체 또는 균체처리물의 존재하를 의미한다.

본원 발명 방법과 종래의 발효법 및 효소법과의 가장 중요한 차이는 본원 발명에 있어서는 미생물의 배양물, 균체 또는 균체처리물을 효소제로 하여 미생물이 증식하지 않고 효소반응에 최적의 조건하에서 반응기질(基質)인 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스 아미드 또는 그 염과 리보스공여체를 반응시키는 점이다.

본원 발명 방법은 발효법에 비하여, (1) 미생물의 비증식조건, 예를 들면 고온조건하에서 반응을 하는 경우에는 잡균오염이 거의 없으며, 리바비린의 분해반응이 억제되므로 리바비린의 수율저하가 없으며, (2) 효소반응이므로 반응시간이 단축되고, 부생물의 생성도 적으며, 리바비린의 단리정제가 용이하며 (3) 효소원의 반복사용도 연속사용도 가능하며, (4) 효소원의 보전이 가능하며 효소원의 조제 및 사용을 임의의 시간에 할 수 있다는 등의 이점이 있다. 또 효소법에 비하여, (1) 효소원의 조제가 용이하며, (2) 리보스공여체를 누클레오시드(nucleoside), 누클레오티드(nucleotide) 등에서 광범위하게 선택할 수 있고 리보스공여체의 입수가 용이하다는 등의 이점이 있다. 또 본원 발명 방법의 최적의 효소원을 선택하면 종래의 방법에 비하여 훨씬 높은 수율로 리바비린을 제조할 수 있다.

효소원(酵素源)

(1) 사용미생물

본원 발명에 있어서 사용되는 미생물은 그 배양물, 균체 또는 균체처리물이 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드와 리보스공여체의 반응을 촉매하고, 리바비린을 생성하는 효소제를 함유하는 것이며, 구체적으로는 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 아스로박터속, 미크로콕쿠스속, 바실루스속, 플라보박테리움속, 미크로박테리움속(브로초스릭스속), 크산토모나스속, 슈도모나스속(알테로모나스속), 아크로모박터속, 에세리키아속, 에어로박터속, 사르시나속, 스타필로콕쿠스속, 박테리움속, 세라티아속, 프로테우스속, 셀룰로모나스속, 엔테로박터속, 미코플라나속, 비브리오속, 에르위니아속, 클레브시엘라속, 에어로모나스속, 미코토룰라속, 또는 칸디다속에 속하고, 상기의 작용을 가지는 미생물을 들 수 있다. 본원 발명에 있어서는 이와 같은 기본적 성질을 가지는 한 특히 사용 균주의 종류에 한정되는 것은 아니다.

아래에 당업자가 용이하게 입수할 수 있는 균주를 예시한다.

(1-1) 브레비박테리움 아세틸리쿰(Brevibacterium acetylicum) AT-6-7 KAIST 830927-10810, (FERMP-6305, ATCC 39311)

상기 균주는 일본국 공업기술원 미생물공업기술연구소(이하 "FERM"이라 함. Yatabe-machi, Ibaragi, Japan)에서 한국과학기술원(KAIST)에 직송되어 1983년 9월 27일자로 기탁되어 기탁번호로서 KAIST 830927-10810이 부여되어 있다.

(1-2) 브레비박테리움 임페리알레(Brevibacterium imperiale) ATCC 8365

(2-1) 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi) IAM 1038

(3-1) 아스로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus) IFO 12957 (ATCC 11624)

(3-2) 아스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) IFO 12137 (ATCC 8010)

(4-1) 미크로콕쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) ATCC 4698(IAM 1056)

(4-2) 미크로콕쿠스 바리안스(Micrococcus varians) IFO 3765 (ATCC 399)

(4-3) 미크로콕쿠스 로제우스(Micrococcus roseus) IFO 3768 (ATCC 186)

(5-1) 바실루스 주브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 14593

(5-2) 바실루스 세리우스(Bacillus cereus) IAM 1029

(6-1) 플라보박테리움 아르보레센스(Flavobacterium arborescens) IFO 3750 (ATCC 4358)

(6-2) 플라보박테리움 루테센스(Flavobacterium lutescens) IFO 3084 (IAM 1667) (ATCC 25311)

(6-3) 플라보박테리움 루테센스 IFO 3085

(7-1) 미크로박테리움 서모스팍툼(Microbacterium thermosphactum) IFO 12167

(브로초스릭스 서모스팍타(Brochothrix thermosphacta) ATCC 11509)

(8-1) 크산토모나스 오리제(Xanthomonas oryzas oryzae) IFO 3312

(크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) ATCC 21754)

(9-1) 슈도모나스 푸트레파시엔스(Pseudomonas putrefaciens) IFO 3908)

(알테로모나즈 푸트레파시엔스(Alteromonas putrefaciens) ATCC 8071)

(9-2) 슈도모나스 푸트레파시엔스 IFO 3909(알테로모나스 푸트레파시엔스 ATCC 8072)

(9-3) 슈도모나스 푸트레파시엔스 IFO 3910(알테로모나스 푸특레파시엔스 ATCC 8073)

(9-4) 슈도모나스 슈일킬리엔시스(Pseudomonas schuylkilliensis) IAM 1051

(9-5) 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis) IAM 1002

(9-6) 슈도모나스 다쿤헤(Pseudomonas dacunhae) IAM 1089

(10-1) 아크로모박터 파르불루스(Achromobacter parvulus) IFO 13182 (NRRL B-2395)

(10-2) 아크로모박터 제로시스(Achromobacter xerosis) IFO 12668

(11-1) 에세리키아 콜리(Escherichia coli) IFO 3301

(11-2) 에세리키아 콜리 IAM 1268 (ATCC 11303)

(12-1) 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes) IAM 1019

상기 균주는 일본국 FERM에 1982년 5월 24일자로 기탁되어 기탁번호로서 FERM P-6538이 부여되어 있다.

(13-1) 사르시나 마르기나타(Sarcina marginate) IAM 1130

상기 균주는 일본국 FERM에 기탁되어 1982년 5월 24일자로 FERM P-6539가 부여되어 있다.

(14-1) 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) IAM 1011 (ATCC 6538 P)

(14-2) 스타필로콕쿠스 아우레우스 IFO 3060

(15-1) 박테리움 석시니쿰(Bacterium succinicum) IAM 1017

상기 균주는 일본국 FERM에 기탁되어 1982년 5월 24일자로 FERM P-6540이 부여되어 있다.

(16-1) 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) IAM 1105

(17-1) 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) IAM 1025

(18-1) 셀룰로모나스 플라비게나(Cellulomonas flavigena) IFO 3753

(18-2) 셀룰로모나스 플라비게나 IFO 12680 (ATCC 486)

(19-1) 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogones) IFO 12010

(19-2) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) ATCC 7256

(20-1) 미코플라나 불라타(Mycoplana bullata) IFO 13290 (ATCC 4278)

(21-1) 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum) IFO 13266 (ATCC 19264)

(22-1) 에르위니아 카로토보라 서브스피시즈 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora) IFO 12380

(23-1) 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) ATCC 8308

(24-1) 에어로모나스 하이드로필라 서브스피시즈 아나에로게네스(Aeromonas hydrophila subsp, anaerogenes) IFO 13282 (ATCC 15467)

(25-1) 미코토룰라 자포니카(Mycotorula japonica) OUT 6226

(26-1) 칸디다 폴리모르파(Candida polymorpha) IFO 0836

상기 균주는 일본국 FERM에 기탁되어 1982년 5월 24일자로 FERM P-6541이 부여되어 있다.

그리고 상기 균주의 기탁번호에 있어서 ATCC를 붙인 번호는 미합중국종균협회(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U. S. A.)에서의 기탁번호를, IFO를 붙인 번호는 일본국 재단법인 발효연구소(Institute for Fermentation, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Oaska, Japan)에서의 기탁번호를, IAM를 붙인 번호는 일본국 도쿄대학 응용미생물연구소(Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Yayoi 1-1-1, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)에서의 기탁번호를, OUT를 붙인 번호는 일본국 오사카대학 공학부(Faculty of Engineering, Osaka University, Yamada-ue, Suita, Japan)에서의 기탁번호를 각각 나타내는 것이다. ATCC번호를 가지고 있는 균주는 미합중국 종균협회 카탈로그 I (American Type Culture Collection, Catalogue of Straine I) 1982년 15판에 기록된 보존균이다. 또 IFO, OUT 및 IAM번호를 지닌 균주는 일본국 미생물 보존균주 목록(JFCC균주 카탈로그) 1979년 제 3 판 또는 오사카발효연구소 카탈로그 1978년 제6판에 기록된 보존균주이다. 이들의 보존균주의 속명 또는 종명은 분류기준의 변경 등에 의하여 변할 수 있지만, 이와 같은 균주일지라도 상기 예시의 균주와 동일 또는 균등의 균학적 성질을 가지는 것은 그 속하는 속명에 상관없이 상기 예시의 균주와 동일하게 간주된다.

또 상기의 균주에서 자외선, X선, γ선의 조사 등의 물리적 처리 또는 니트로소구아니딘 등에 의한 약제처리 등 일반적 변이유도법에 의한 유발돌연변이 또는 자연의 원인에 기인하는 자연돌연변이에 의하 유동된 변이주도, 본원 발명의 목적으로 하는 리바비린 제조에 관여하는 효소활성을 잃어버리지 않는 한 본원 발명에 사용된다.

또 상기한 바와 같이 본원 발명에 바람직하게 사용되는 균주에서 얻어지는 본원 발명의 목적으로 하는 리바비린의 제조에 관여하는 효소계의 유전자가 상기의 속 이외의 미생물에 합성되어 그와 같은 형질을 발현하기에 이르를 경우, 이와 같은 미생물의 배양물, 배양균체 또는 그 처리물을 본원 발명의 목적으로 사용하는 방법은 본원 발명에 포함된다.

상기 여러 균주 중 가장 바람직한 균주는 일본국 효고켄 니시노미야시 고시엔의 야구장의 토양에서 분리된 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7 균주이다. 이 균주는 아래와 같은 세균학적 특성을 가지고 있다.

A. 형 태

(1) 세포의 형태 및 크기 : 단봉상(短棒狀) 0.8-0.1×1.0-1.2㎛

(2) 포자의 형성 : 없음

(3) 그램염색성 : 양성

B. 각종 배지에 있어서의 생육상태

(1) 육즙 한천평판배양(28℃, 48시간)

① 집락(集落)의 형태 : 원형

② 집락표면의 융기 : 편평상(flat), 평활(smooth)

③ 크기 : 2-4mm

④ 색조 : 황색 내지 도황색

(2) 육즙 한천사면(斜面) 배양(28℃, 48시간)

① 생육 : 양호

② 생육의 형상 : 만두형(echinulate)

(3) 육즙액배양(28℃, 48시간)

생육 : 표면에 균환(菌環)을 형성하고 약간의 침사(sediment)를 발생한다.

(4) 육즙 젤라틴 천자(穿刺) 배양(20℃, 6일간) 층상(stratiform)으로 액화한다.

(5) 리트마스밀크(Litmus-milk) 배지(28℃, 4일간) 약간 응고하고 펩톤화도 나타난다.

C. 생리적 성질

(1) 질산염의 환원(28℃, 5일간) : 환원성 없음

(2) 황화수소의 생성(28℃, 5일간) : 생성하지 않는다.

(3) 전분의 가수분해 : 분해성 있음

(4) 카탈라제 : 양성

(5) 인돌의 생성 : 생성하지 않음

(6) 펩톤 및 아르기닌으로부터의 암모니아의생성 : 음성

(7) 메틸레드(Methyl Red) 테스트 : 음성

(8) V-P테스트 : 양성

(9) 산소에 대한 태도 : 호기적

(10) O-F 테스트(Hugh Leifson 법에 의한다) : F형(Fermentation)

(11) 당류로부터의 산의 생성

양성 : 클루코스, 만노스, 프럭토스, 말토스, 사카로스, 트레할로스

음성 : 아라비노스, 크실로스, 갈락토스, 락토스, 소르비톨, 이노시톨, 글리세린

(12) 생육 pH범위 : pH 6.0-9.0

(13) 생육 최적온도 : 25-37℃

이상의 균학적 성질을 베르기의 매뉴얼오브 디터미너티브 박테리올로지(Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology) 제 7 판(1957년)의 분류 기준에 따라 검색하였다. 그 결과 AT-6-7주는 거의 구균에 가까운 단간균(短稈菌)으로 그램양성이고 필라멘트를 형성하지 않고 탄수화물에서 산을 생성함으로써 브레비박테리움 속에 속하는 균주와 동정(同定)하고, 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7이라고 명명하였다.

또 이상의 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7의 동정귀속은 상기 베르기의 매뉴얼 제 7 판에 의한 것이며, 분류기준의 변경 등에 의하여 상이한 분류기준에 따라 이들 균주의 동정귀속이 행해진 경우에는 타종 또는 타속에 속할 수도 있을 수 있지만, 본원 발명에 있어서 상기와 같이 명명된 미생물은 기탁기관에의 기탁 및 상기 균학적성질에 따라 일의적으로 특정될 수 있는 것이다.

상기 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7균주는 1982년 1월 13일자로 일본국 FERM에 기탁하여 기탁번호 FERM P-6305가 부여되었다. 또한 이 미생물은 상기 일본국 FERM에서 직접 미합중국 종균협회로 송달되어 동 미생물을 보관 위탁해서 1983년 3월 2일 기탁번호 ATCC 39311를 부여받았다. 그리고, 또 이 미생물의 균주는 상기 일본국 FERM에서 직접 한국과학기술원(KAIST)으로 송달하여 보관 위탁되어, 1983년 9월 27일자로 한국과학기술원의 기탁번호 KAIST 830927-10810로서 보관 기탁되어 있다.

상기한 여러 균주중, 생균체에 있어서의 리바비린 생성물이 50% 이상의 균주가 바람직하다. 그와 같은 균주는 아래와 같다.

브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7 KAIST 830927-10810, (FERM P-6305, ATCC 39311)

플라보박테리움 루테센스 IFO 3084 (ATCC 25311)

크산토모나스 오리제 IFO 3312

슈도모나스 푸트레파시엔스 ATCC 8072

아크로모박터 제로시스 IFO 12668

에세리키아콜리 IAM 1268 (ATCC11303)

셀룰로모나스 플라비게나 IFO 12680 (ATCC 486)

이들 가운데 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7이 가장 바람직하다.

(2) 효소원의 조제

[배 양]

본원 발명에 사용하는 효소원을 조제하기 위하여 이들 미생물을 배양하는데 있어서 사용되는 배지 및 배양법은 이들 미생물이 생육하는 한 특히 한정되지 않는다.

배지로서는 이들 미생물이 자화(資化) 가능한 탄소원 및 질소원을 적당량 함유하고, 필요에 따라 무기염, 미량 발육촉진물질, 소포제(消泡劑) 등을 첨가한 것이 사용된다. 구체적으로는 탄소원으로서는 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 리보스, 사카로스, 전분, 전분 가수분해물, 당밀, 폐(廢) 당밀 등의 당류 또는 그 지방산 에스테르 등의 유도체, 보리, 밀기울, 쌀 등의 천연탄수화물, 글리세롤, 만니톨, 메탄올 에탄올 등의 알콜류, 글루콘산, 피루빈산, 아세트산, 구연산 등의 지방산류, 노르말파라핀, 케로신 등의 탄화수소류, 글리신, 글루타민산, 알라닌, 아스파라긴 등의 아미노산류 등, 일반적인 탄소원에서 사용되는 미생물의 자화성을 고려하여 1종 또는 2종 이상을 적당히 선택하여 사용하면 된다. 질소원으로서는 육(肉)엑기스, 펩톤, 효모엑기스, 건조 효모, 대두 가수분해물, 대두분, 밀크 카세인, 카자미노산, 각종 아미노산, 콘스팁 리커, 커튼 시드 밀 내지 그 가수분해물, 피쉬 밀 내지 그 가수분해물, 기타의 동물, 식물, 미생물의 가수분해물 등의 유기질소물질, 암모니아, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 질산나트륨 등의 질산염, 요소 등 무기질 소화합물에서 사용 미생물의 자화성을 고려하고 1종 또는 2종 이상의 적절히 선택하여 사용한다. 또 무기염으로서 미량의 마그네슘, 망간, 철, 아연, 동, 나트슘, 칼슘, 칼륨 등의 인산염, 염산염, 황산염, 탄산염, 질산염, 아세트산염 등의 1종 또는 2종 이상을 적당히 첨가하고, 필요에 따라 식물유, 계면활성제 등의 소포제, 비타민 B₁, B₂, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴, p-아미노 안식향산 등의 미량 발육촉진물질을 첨가해도 된다. 또 영양요구를 동시에 나타내는 미생물을 사용할 경우, 당연히 그 생육을 만족시키는 물질을 배지에 첨가하지 않으면 안된다.

배양은 상기 배지성분을 함유하는 액체 배지 중에 진탕(桭

) 배양, 통기교반배양, 정치(靜置)배양, 연속배양 등의 통상의 배양법에서 사용 미생물에 적합한 배양법을 선택하여 행한다.

배양조건은 사용 미생물 및 배지의 종류에 의하여 적당히 선택하면 되지만, 통상적으로는 배양 개시의 pH를 약 6-8로 조정하고, 약 25-35℃의 온도조건하에서 배양한다. 배양기간은 사용미생물의 생육에 충분히 시간이면 되며, 통상 1-3일간이다.

[효소원의 양태]

본원 발명방법에 있어서 사용되는 효소원은 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드와 리보스공여체에서 리바비린을 생성하는 반응을 촉매하는 효소계를 함유한다.

본원 발명방법에 있어서의 효소반응은 주된 필수효소는 누클레오시드 포스포릴라제이고, 본원 발명에 사용하는 효소원으로서는 본 효소활성을 갖는다는 것이 필수인 것이다. 또 리보스공여체로서 본 효소의 직접의 기질로 되지 않는 것을 사용하는 양태에 있어서는 리보스공여체에서 기질에 유도하는 효소계의 활성을 함유하는 것이 바람직하다. 또 본원 발명 방법의 반응계에 리보스공여체를 첨가하지 않는 양태에 있어서는 리보스공여체를 함유하거나 또는 본원 발명의 효소반응과 병행하여 리보스공여체를 생성할 수 있는 대사계(代謝系)를 함유하는 것의 사용이 필요로 된다.

이상과 같이 미생물을 배양한 후 얻어진 배양물, 배양물에서 원심분리, 침강분리, 응집분리 등의 통상적 방법에 의하여 집균된 생균체 또는 생균체에 적당한 처리를 가하여 얻어지는 균체 처리물을 본원 발명에 있어서의 효소원으로서 사용할 수 있다. 여기서 "배양물"이란 배양 후의 배지와 배양균체가 미분리 상태의 것을 말한다. 또 "균체처리물"이란 건조균체, 세포막, 벽변성(壁變性)균체, 파쇄균체, 고정화균체, 균체추출물, 본원 발명의 목적으로 하는 리바비린의 제조에 관여하는 효소활성을 가진 균체추출물의 단백질 획분(劃分) 또는 그 정제물, 단백질 획분 또는 그 정제물의 고정화합물 등을 가리킨다.

균체처리물을 얻기 위한 방법을 아래에 예시한다. 즉, (1) 생균체에 대하여 예를 들면 동결융해처리, 동결건조처리, 통풍건조처리, 아세톤건조처리, 산성 내지 알카리성하에 있어서의 가온처리, 파쇄처리, 초음파처리, 침투압처리 등의 물리적 처리수단 또는 예를 들면 리조짐(lysozyme), 세포벽 용해효소 등의 효소처리, 톨루엔, 크실렌, 부틸알코올(부탄올) 등의 용매 또는 계면활성제와의 접촉처리 등의 화학적 내지 생물화학적 처리를 단독 또는 조합시켜 행함으로써, 또 (2) 균체추출물에 대하여, 예를 들면 염석(鹽析)처리, 등전점(等電點)침전처리, 유기용매침전처리, 각종 크로마토그래프처리, 투석(透析)처리 등의 효소분리정제수단을 단독 또는 조합시켜 가함으로써, 또 (3) 생균체, 균체추출물 또는 그 정제물에 포괄처리, 가교(架橋)처리, 담체에의 흡착처리 등의 효소 고정화수단을 가함으로써 균체처리물을 얻을 수 있다.

[효소반응]

[반응기질]

본원 발명의 효소반응에 있어서의 반응기질은 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 및 리보스공여체이다.

1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드는 유리형(遊離型) 또는 나트륨염 등의 어느 것도 사용할 수 있다.

본원 발명에 있어서 리보스공여체란, 본원 발명의 사용 미생물의 효소원의 작용에 의하여 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드에 D-리보스 잔기(殘基)를 이전할 수 있는 리보스 유도체를 의미하고, 그것으로서 첨가되는 물질 이외에 효소원에 그 균체내 성분으로서 이미 함유하고 있는 물질로서 본원 발명의 반응에 관여하는 효소의 직접의 반응기질 및 본원 발명의 반응조건에 있어서 상기 반응기질에 유도될 수 있는 전구(前鷗)물질도 포함한다. 이와 같은 물질로서는 각종 리보누클레오시드 또는 D-리보스 또는 이들의 각종 인산에스테르를 들 수 있다.

본원 발명의 한 실시양태에서는 리보스공여체를 반응계 외에서 첨가하지 않고, 사용효소원에 함유되는 리보스공여체 또는 효소반응중에 계내에 있어서 생성되는 리보스공여체를 이용하는 방법도 포함되지만, 본원 발명의 바람직한 실시양태는 리보스공여체를 별도 반응계에 첨가하여 이루어지는 것이다.

리보스공여체는 상기와 같이 리보누클레오시드 또는 D-리보스 또는 이들의 각종 인산에스테르의 어느 것도 좋다. 즉 리보누클레오시드는 그 염기부분이 푸린계 또는 피리미딘계의 어떠한 염기이어도 되고, 천연물이거나 화합합성에 의한 것이나 사용할 수 있다. 또 리보누클레오시드 또는 D-리보스의 인산에스테르로서는 2위, 3위 또는 5위 수산기의 어느 것인가 1개소, 2개소 또는 모든 것에 모노인산에스테르잔기, 디인산에스테르잔기, 트리인산에스테르잔기를 가지는 것이어도 된다. 또 이들의 인산에스테르는 유리형이어도 되고, 또 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 트리에틸암모늄 등의 일반적인 알칼리염이어도 된다. 리보스공여체의 구체예로서는 이노신, 아데노신, 구아노신, 크산토신, 우리딘, 시티딘 등의 리보누클레오시드, 5'-이노신산, 5'-아데닐산, 5'-구아닐산, 5'-크산틸산, 5'-우리딜산, 5'-시티딜산, 2'(3')-이노신산, 2'(3')-아데닐산, 2'(3')-구아닐산, 2'(3')-크산틸산, 2'(3')-우리딜산, 2'(3')-시티딜산 등의 리보누클레오티드, D-리보스, D-리보스-1-인산 등을 예시할 수 있다.

[반응기질용액]

본원 발명의 효소반응에 사용되는 기질용액은 기본적으로는 상기 반응기질이 수성매체에 용해 또는 현탁된 수성액이다.

수성액 중에는 상기 반응기질 이외에 필요에 따라서 인산이온공여체, 유기용매, 계면활성제, 금속염류, 보효소(補酵素)류, 산, 염기, 당류 등 효소반응을 촉진하는 물질, 반응기질의 용해성을 향상시키는 물질, 효소와 반응기질의 접촉을 향상시키는 물질, 살균제 등을 함유해도 된다.

수성매체로서는 물 또는 효소반응에 적당한 각종 완충액(인산완충액, 이미다졸-염산완충액, 베로날(Veronal)-염산완충액, 트리스(Tris)-염산완충액 등)을 사용할 수 있으며, 이것은 인산이온공여원을 포함하고 또 필요에 따라 각종 물질을 포함할 수 있다.

본원 발명의 효소반응은 주로 누클레오시드 포스포릴라제의 작용에 의하며, 그러므로 반응계에 인산이온의 존재가 필요하다. 효소반응계에 인산이온이 존재하지 않는 경우에는 인산이온공여체의 첨가가 필요하다.

인산이온공여체로서는 수성매체 중에 인산이온으로 해리(解離)할 수 있는 것의 어느 것을 사용해도 되고, 예를 들면 유리형 인산 그 자체, 무기인산염, 예를 들면 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속, 칼륨, 마그네슘 등의 알칼리토류금속, 암모늄과의 염이 적당하게 사용된다. 또 인산이온 공여체로서는 효소반응액 중에서 인산이온을 유리할 수 있는 게, 예를 들면 리보스공여체의 리보누클레오티드와 포스파타제의 조합 또는 마찬가지로 리보누클레오티드와 누클레오티다제의 조합 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 계에 있어서의 반응에 관여하는 효소는 본원 발명에 사용되는 효소원에 혼재한 것이어도 되고, 별도 첨가된 효소 또는 그 효소활성을 가진 균체 또는 균체처리물 등이어도 된다. 이상과 같은 인산공여계(供與系)는 산소반응에 있어서 계외에서 첨가된 것이라도 효소원이 그 성분으로서 함유하고 있는 것이어도 된다. 즉, 효소원반응에 이용할 수 있는 형태인 한, 상기 물질의 단독 또는 2종 이상을 조합시킨 계를 또는 상기 물질을 함유하는 미생물균체 또는 그 균체처리물을 본원 발명의 효소반응에 있어서 반응액에 별도 첨가해도 좋고 또는 사용 미생물이 균체성분으로서 함유하고 있는 물질을 그대로 이용해도 된다.

유기용매로서는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 아세톤, 메틸에틸케톤, 아세트산에틸, 톨루엔, 테트라히드로푸란, 이옥산, 디메틸술폭시드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 2-메톡시에탄올, 2-에톡시에탄올, 1, 2-디메톡시에탄 등을 예시할 수 있다.

[접촉 방법]

본원 발명의 반응은 상기 효소원과 반응기질을 수성매체 중에서 미생물의 비증식 조건하에 있어서 접촉시킴으로써 달성된다.

접촉방법은 효소원의 형태에 따라서 적당히 선택하면 되지만, 통상적으로 효소원을 반응기질용액에 현탁 또는 용해하고, 바람직한 것은 가온하면서 교반 또는 진탕하는 회분(回分)방식 또는 효소원을 필요에 따라 적당한 담체, 보조제, 흡착제와 혼화하고 또는 이들에 지지시켜 컬럼(column)에 충전하고 반응기질 용액을 통액(通液)하는 컬럼방식 등이 적용된다.

[반응기질 및 효소원의 농도 또는 첨가량]

반응에 있어서 반응액의 기질농도는 특히 제한되는 것은 아니고 반응온도에 있어서의 사용 수성매체에 대한 기질의 포화농도 이하의 기질농도가 통상 채용되지만, 반응기질용액에 첨가된 상기 유기용매, 계면 활성제 등에 의하여 기질농도를 증대시킬 수 있다. 또 반응액 중에 포화농도 이상의 기질을 현탁상태로 존재시켜 반응진행에 따라서 각 기질을 용해시킬 수 있다. 또 기질을 반응 중에 점차 첨가하여 그 농도를 적당레벨로 유지할 수도 있다. 각 기질을 용해시킬 경우, 기질농도는 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 또는 염에 대하여는 통상 5-200mM 정도, 바람직한 것은 10-100mM 정도이다. 리보스공여체에 대하여는 이것을 별도 첨가하는 경우는 통상 5-300 mM 정도, 바람직한 것은 10-150mM 정도이다.

효소원의 사용량은 미생물의 종류, 그 사용형태, 반응효율, 경제성을 고려하고, 당업자가 예비실험 등에 의하여 용이하게 결정할 수 있는 것이지만, 통상 회분방식의 경우, 예를 들면 생(습)균체이면 10-150mg/㎖ 기질용액 정도, 건조균체이면 2-30mg/㎖ 기질용액정도이면 되고, 컬럼방식에 있어서는 회분방식에 준하여 적당량을 설정할 수 있다.

[반응조건]

본원 발명의 반응조건은 균체 등을 비증식 조건하, 즉 휴지(休止) 또는 사멸균체의 상태로 반응에 제공하는 이외에는 특히 한정되지 않는다.

미생물의 비증식 조건하에서 반응에 제공하는 방법으로서는 효소반응온도를 사용 미생물이 증식할 수 없는 온도범위(다만, 본원 발명의 반응에 관여하는 효소가 활동을 잃어버리지 않는 온도범위이다)로 설정하는 방법, 사용 미생물균체를 미리 상기와 같이 물리적·화학적 내지 생물화학적으로 처리함으로써 미생물을 증식할 수 없는 상태로 한 뒤 반응에 제공하는 방법, 반응에 있어서 예를 들면 톨루엔 등의 미생물의 증식을 저해하는 물질을 반응기질용액에 첨가하는 방법 등을 단독 또는 조합시켜서 채용하면 되지만, 특히 반응온도를 조작하는 방법이 가장 효과적이고 간편하다.

본원 발명의 반응에 있어서 반응온도는 상기와 같이 중요한 조건이며, 본원 발명의 특징을 이루는 것이다. 반응은 37-80℃의 범위에 있어서 진행하지만, 실용성을 고려하면 40-70℃의 범위가 바람직하다. 그리고 최적온도조건은 반응기질의 종류에 의하여 다르지만 당업자이면 예비실험 등에 의하여 용이하게 결정할 수 있다.

40℃ 이상의 온도범위에서 효소반응을 행함으로써 사용미생물이 생육은 대부분 억제된다. 예를 들면 후술하는 실시예 1과 동일한 미생물의 생균체를 사용하고, 28-60℃의 각 소정온도로 각각 반응시켰을 때의 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드로부터의 리바비린의 생성율(%)과 반응 후의 사용미생물의 생존율(%)와의 관계를 나타내면 다음의 제 1 표와 같다. 또 미생물의 생존율은 반응개시 전의 미생물의 생균수/㎖에 대한 반응 후의 생균수/㎖에 백분율이다.

[제 1 표]

이상과 같이 본 반응은 사용 미생물의 비증식조건하, 즉 대부분의 미생물이 휴지 또는 사멸하는 조건하에서 행해지지 않으면 안된다.

또, 본원 발명에 있어서 반응온도를 상기 범위로 설정함으로써 리바비린 생성 효소반응속도를 증대시킬 뿐만 아니라, 생성한 리바비린의 분해반응을 억제하는 것이 실험에 의하여 확인되었다. 일례로서 실시예 1과 동일한 미생물의 생균체의 현탁액 1㎖을 20mM 리바비린용액 1㎖에 가하여 28-60℃의 각 소정온도로 20시간 인큐베이트했을 때의 리바비린의 잔존율(%)을 제 2 표에 나타낸다.

[제 2 표]

이상의 결과에서도 45℃ 이상의 반응온도가 적당하다는 것을 확인할 수 있다.

반응기질용액의 액성은 통상 pH 4-10, 바람직한 것은 pH 6-8의 범위로 유지하면 되고, 반응중에 pH가 변동할 때는 염산, 황산, 인산 등의 산 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아수, 암모니아가스 등의 알칼리를 사용하여 바람직한 pH범위로 보정하면 된다.

반응시간은 반응기질의 목적물에의 반환율을 확인하면서 결정하면 되지만, 통상 회분방식에서는 2-45시간 정도, 바림작한 것은 24-36시간 정도 반응시키면 되고, 컬럼방식에서는 회분방식에 준하여 적당한 조건을 설정하여 반응시키면 된다.

[분리 및 정제]

반응 후, 필요에 따라서 균체 등을 여과, 원심분리 또는 응집분리 등의 방법에 의하여 분리 제거하고 리바비린의 분리정제공정에 제공한다.

리바비린의 분리정제는 공지방법 또는 이것을 응용하여 행하면 되고, 예를 들면 이온교환크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 분배크로마토그래피, 겔여과법 등 각종 크로마토그래피, 향류(向流)분배, 향류추출 등 2액상간의 분배를 이용하는 방법, 농축, 냉각, 유기용매첨가 등 용해도의 차를 이용하는 방법등의 일반적인 분리정제법을 단독으로 또는 적당히 조합하여 행하면 된다.

[분 석]

본원 발명의 실시예 등에 있어서 리바비린 및 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드의 분석은 고속 액체크로마토그래피에 의하여 행하였다. 아래에 나타내는 장치 및 조건으로 분석하면, 리바비린은 유지시간 3.50분 부근에서 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드는 유지시간 2.65분 부근에서 용출되고 검량선(檢量線)에서 각기의 양을 산출할 수 있다.

장 치 : 시마즈 고속액체 크로마토그래프 LC-3A형(주식회사 시마즈제작소제)

컬 럼 : 마이크로-본다팍(μ-BONDAPAK) C₁₈, 4.6mm×250mm(일본국 워터스 리미티드사제)

용출제 : 2% 아세트니트릴을 함유한 20mM 트리스 염산완충액(pH 7.5)

유 속 : 1㎖/분

측정파장 : 225nm

컬럼조작온도 : 실온

이하 실시예로서 본원 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들은 어느 것이나 실시예를 설명하는 것으로 본원 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

브레비박테리움 아세틸리쿰AT-6-7을 분말부이온(bouillon)(일본국 교쿠토제약공업(주)제) 2%수용액(이하 이 배지를 2% 부이온배지라고 함) 5미터에 식균하고, 28℃, 24시간 진탕 배양하였다.

배양 종료 후, 원심분리에 의하여 집균하고, 세척 후 살균수를 가하여 250㎖의 균체 현탁액을 얻었다. 66.7mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 66.7mM 이노신 및 100mM인산-칼륨을 함유하는 수용액 750㎖에 상기 균체 현탁액 250㎖을 가하여 60℃, 24시간 반응시켰다(리바비린의 생성율 74.88%).

리바비린 생성율이란 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드에서 리바비린으로의 전환율(%)을 말한다.

반응액을 원심분리하여 균체를 제거한 후, 양이온 교환수지(H⁺형)를 통과시켜, 이 통과 수세액을 활성탄컬럼에 흡착시켰다. 활성탄 컬럼에서 에탄올-암모니아용액으로 리바비린을 용출하고 용출액의 에탄올을 제거한 후, 음이온 교환수지를 통과시켜, 통과수세액을 감압농축하여 50㎖로 하고 냉각하였다. 냉각 후 석출한 결정을 분리하고 건조하여 리바비린의 결정 6.5g을 얻었다.

[비교예]

실시예 1과 동일한 균주를 사용하여 일본국 특허출원공고 제1979-17830호 공보의 실시예 1과 같은 방법에 의하여 미생물의 증식 중에 원료 트리아졸화합물을 첨가하여 리바비린의 제조를 시도하였다. 즉, 상기 균주를 글루코스 130g, 인산-칼륨 1g, 인산 2갈륨 3g, 황산마그네슘 1g, 염화칼슘 0.1g, 황산철 10mg, 황산아연 5mg, 황산망간 10mg, 비타민B₁5mg, 판토텐산칼슘 10mg, 시스틴 20mg, 비오틴 30㎍, 육엑기스 10g, 황산암모늄 2g 및 요소 2g(별도 살균)을 1리터 중에 함유하는 조성으로, pH 7.6으로 조정한 배지 10㎖에 식균하고, 12시간마다 암모니아수로 pH 7.2로 조정하면서 28℃에서 진탕 배향하였다. 배양개시 후 24시간 후에 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드를 2mg/㎖농도로 첨가하고, 또 4일간 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상증액을 분석하였는데 리바비린의 생성은 전혀 인정되지 않았다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 균주를 실시예 1과 같이 배양하고(다만 배양액은 각 10㎖로 하였다), 배양 후, 원심분리에 의하여 집균하고, 각 1㎖의 살균수를 가하여 균체현탁액을 얻었다.

이 균체현탁액에 20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM의 제 3표에 나타낸 각종 리보스공여체 및 25mM 인산-칼륨을 함유하는 수용액(pH 7.0) 각 1㎖를 첨가하고, 60℃, 24시간 반응시켰다.

[제 3 표]

반응 종료 후 원심분리에 의하여 균을 제거하고 상증액을 분석하였던 바 리바비린의 생성율은 제 3 표와 같다.

[실시예 3]

2% 부이욘 배지 각 100㎖에 실시예 1과 동일한 균주를 식균하고 28℃, 22시간 진탕 배양하여 배양균체를 얻고, 이어서 아래의 처리를 행하여 균체처리물 현탁액을 얻었다.

1) 아세톤 건조균체 :

생균체에 50㎖의 아세톤을 가하고 15분간 방치하며, 원심분리하여 얻은 균체에 다시 50㎖의 아세톤을 가하며 같은 처리를 행한 후, 진공 건조하여 건조균체를 얻었다. 이것에 물을 가하여 균체처리물 현탁액 10㎖을 얻었다.

2) 동결융해균체 :

생균체를 -80℃에서 하루밤 동결 후 해동하고, 물을 가하여 균체처리물 현탁액 10㎖을 얻었다.

3) 침투압차 처리균체 :

생균체에 100㎖의 포화식염수를 가하고 하루밤을 빙냉각 후 원심분리에 의하여 상증액을 버리고, 분리균체에 물을 가하여 균체처리물 현탁액 10㎖을 얻었다.

4) 초음파 처리균체 :

생균체에 물을 가하여 10㎖로 하고, 출력전압 1.6KV로 20분간 초음파처리를 행하였다.

이상의 균체처리물 현탁액 각 10㎖ 및 실시예 1과 같이 해서 얻은 무처리 균체현탁액 10㎖에 20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM 이노신 및 25mM 인산 1칼륨을 포함하는 수용액(pH 7.0)으로 이루어진 반응기질용액 각 10㎖을 가하고 60℃, 24시간 반응 후 리바비린의 생성율을 분석한 결과는 제 4 표와 같다.

[제 4 표]

[실시예 4]

2% 부이욘 배지 25㎖에 실시예 1과 동일한 균주를 식균하고, 28℃, 24시간 진탕 배양 후 집균하고

[제 5 표]

물을 가하여 각 2.5㎖의 균체현탁액을 조재하였다. 이것에 실시예 3과 같은 반응기질용액 각 2.5㎖을 가하고, 28-70℃의 각 온도(제 5 표)에서 20시간 반응 후, 리바비린의 생성율을 분석한 결과는 제 5 표와 같다.

[실시예 5]

실시예 1과 동일한 균주를 사용하고 실시예 4와 같이 제조한 균체현탁액 각 2.5㎖에 아래의 반응기 질용액(A) 또는 (B) 각 2.5㎖을 가하고, 60℃, 20시간 반응 후, 리바비린의 생성율을 분석한 결과는 제 6 표와 같다.

반응기질용액(A) : 20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 및 20mM 이노신

반응기질용액(B) : 상기 반응기질용액(A)과 같은 양의 각 기질에 25mM 인산 1칼륨을 가한다.

[제 6 표]

[실시예 6]

실시예 5와 같은 균체현탁액 2.5㎖에 실시예 5의 반응기질용액(B) 2.5㎖을 가하고, 60℃, 20시간 반응 후 균체를 분리하였다. 이 분리균체에 물 10㎖을 가하여 다음 회의 반응에 사용하며, 상기와 같은 반응을 10회 반복하였다. 제 1 회의 리바비린 생성율을 100으로 했을 때의 각 회의 반응의 상대 생성율을 제 7 표에 나타낸다.

[제 7 표]

[실시예 7]

2% 부이욘 배지 1리터에 실시예 1과 같은 균주를 식균하고 30℃, 22시간 진탕 배양한 후 원심분리에 의하여 생균체를 얻었다.

이 생균체에 A액[1N-염산 24㎖, 트리스 3.425g, TEMED (N, N, N', N'-테르라메틸에틸렌디아민) 0.23㎖을 물에 용해하여 100㎖로 희석한 수용액] 20㎖, B액[아크릴아미드 30g, BIS (N, N-메틸렌비스(아크릴아미드)) 0.8g을 물에 용해하여 100㎖로 한 수용액] 20㎖ 및 C액[과황산암모늄 0.3g을 물에 용해하여 200㎖로 한 수용액] 40㎖을 가하여 방치하고 균체를 고정화하였다. 고정화 후 호모지나이저(homogenizer)로 세편화(細片化)하고, 180㎖의 고정화균체를 얻었다.

이 고정화균체 10㎖에 20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM 이노신 및 25mM 인산 L칼륨을 함유하는 반응기질용액 20㎖(pH 7.0)을 가하고, 60℃, 24시간 반응하고 반응액을 분석하였던 바 62.89%의 리바비린이 생성되어 있었다. 또 생균체를 사용하여 동일조건으로 반응을 행하였던 바 리바비린의 생성율은 65.44%였다.

[실시예 8]

제 8 표의 각 균주를 2% 부이욘 배지 각 50㎖에 식균하고 28℃, 24시간 진탕 배양 후 원심분리에 의하여 집균하고, 살균수를 가하여 균체현탁액 각 5㎖을 얻었다.

20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM 이노신 및 25mM 인산 1칼륨을 포함하는 수용액(pH 7.0) 각 5㎖에 상기 균체현탁액 각 5㎖을 가하고, 60℃, 24시간 반응시켰다. 반응종료 후 리바비린 생성율을 분석한 결과는 제 8 표와 같다.

[제 8 표]

[실시예 9]

제 9 표의 각 균주를 2% 분말 부이욘 배지 각 50㎖에 식균하고, 28℃, 24시간 진탕 배양 후 원심분리에 의하여 집균하고 살균수를 가하여 균체현탁액 각 5㎖을 얻었다.

20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM 이노신 및 25mM 인산 1칼륨을 함유하는 수용액(pH 7.0) 각 5㎖에 상기 균체현탁액 각 5㎖을 가하고, 60℃, 20시간 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리에 의하여 균체를 제거하고 리바비린 생성율을 분석하였던 바 제 9 표와 같다.

[제 9 표]

[실시예 10]

슈도모나스 푸트레파시엔스(알테로모나스 푸트레파시엔스) ATCC 8072를 실시예 9와 같이 배양하고 (다만, 배양액은 각 10㎖로 하였다), 배양 후 원심분리에 의하여 집균하고, 각 1㎖의 살균수를 가하여 균체현탁액을 얻었다.

이 균체현탁액에 20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 20mM의 제10표의 각종 리보스공여체 및 25mM 인산 1 칼륨을 함유하는 수용액(pH 7.0) 각 1㎖을 첨가하고 60℃, 20시간 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리에 의하여 균을 제거하고 상증액을 분석하였던 바 리바비린의 생성율은 제10표와 같다.

[제 10 표]

[실시예 11]

스타필로콕쿠스 아우레우스 IAM 1011 및 플라보박테리움 아르보레센스 IFO 3750을 사용하고, 리보스공여체로서 제11표에 나타낸 누클레오티드를 사용한 이외에는 실시예 10과 동일한 방법으로 반응을 행하고 제11표의 결과를 얻었다.

[제 11 표]

[실시예 12]

플라보박테리움 루테센스 IFO 3084를 2% 분말 부이욘 배지 2리터에 식균하고, 28℃, 22시간 진탕배양하였다.

배양 종료 후 원심분리에 의하여 집균하고, 세척 후 살균수를 가하여 200㎖의 균체현탁액을 얻었다.

50mM 1, 2, 4-트리아졸-2-카르복스아미드, 75mM 이노신 및 50mM 인산 1칼륨을 함유하는 수용액 800㎖에 상기 균체 현탁액을 가하고, 60℃, 24시간 반응시켰던 바, 리바비린 생성율은 72.55%이었다.

반응액을 원심 분리하고 균체를 제거한 후 250㎖로 감압농축하고 냉각했다. 생성한 히폭산딘 및 이노신을 제거 후, 양이온 교환수지(H⁺형)를 통과시켜 이 통과 수세액을 활성탄에 흡착시켰다. 활성탄 컬럼에서 에탄올·암모니아용액으로 리바비린을 용출하고 용출액의 에탄올을 제거한 후 음이온 교환수지를 통과시켜 통과 수세액을 감압농축하여 25㎖로 하고 냉각시켰다. 냉각 후, 석출(析出)한 결정을 분리 건조하고 리바비린의 결정 6.6g을 얻었다.

[실시예 13]

제12표의 각 균주를 2% 분말 부이욘 배지 각 100㎖에 식균하고, 30℃, 22시간 진탕 배양 후 집균하고 각각에 물을 가하여 균체현탁액 각 10㎖을 얻었다.

20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드, 30mM 우리딜산나트륨 및 25mM 인산 1칼륨을 함유하는 수용액(pH 7.0) 각 10㎖에 상기 균체현탁액을 가하고, 45℃, 23시간 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리에 의하여 균체를 제거하고, 리바비린 생성율을 분석하였던 바 제12표와 같다.

[제 12 표]

[실시예 14]

제13표의 각 균주를 2% 분말 부이욘 배지 각 50㎖에 식균하고, 28℃, 24시간 진탕 배양 후 원심분리에 의하여 집균하고, 살균수를 가하여 균체현탁액 각 5㎖을 얻었다.

[제 13 표]

20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 및 25mM 인산 1칼륨을 함유하는 수용액(pH 7.0) 각 10㎖에 상기 균체현탁액 각 5㎖을 가하여 45℃, 24시간 반응시켰다. 반응 종료 후 리바비린 생성율을 분석하였던 바 제13표와 같다.

[실시예 15]

1.5% 효모엑기스 배지(pH 7.5) 5리터에 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7(KAIST 830927-10810(FERM P-6305, ATCC 39311)의 전 배양액 250㎖를 식균하고, 28℃, 24시간 배양하였다. 배양액에서 원심분리에 의하여 균체를 얻고, 500㎖의 균체현탁액으로 하였다.

20mM 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 및 25mM 인산 1칼륨을 함유하는 용액(pH 7.0) 500㎖에 상기 균체현탁액 500㎖를 가하고, 45℃, 24시간 반응하였다. 이 반응액의 리바비린 생성율은 24.38%였다.

균체 제거액을 양이온 교환수지(H⁺형) 처리하여 미반응의 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드를 제거 후 활성탄에 리바비린 용액을 흡착하였다. 2% 암모니아를 함유하는 50% 에틸알코올 용액으로 리바비린을 용출 후 에탄올을 유거하고, 음이온 교환수지(염기형)을 통과시켰다. 통과액을 농축하고, 리바비린의 결정 475mg을 얻었다.

Claims

1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드와 리보스 공여체에서 리바비린을 생성하는 반응을 촉매하는 효소제를 함유하는 브레비박테리움 아세틸리쿰 AT-6-7(KAIST 830927-10810, FERM P-6305, ATCC 39311)의 효소작용하에 1, 2, 4-트리아졸-3-카르복스아미드 또는 그 염과 리보스 공여체와를 상기 미생물의 비증식 조건하에 있어서 수성매체 중에서 접촉시켜 리바비린을 생성하여, 상기 매체로부터 생성된 리바비린을 회수하는 것을 특징으로 하는 리바비린의 제법.

제 1 항에 있어서, 리보스 공여체가 그 자체로서 상기 효소반응에 첨가되는 리바비린의 제법.

제 1 항에 있어서, 리보스 공여체가 사용효소원의 함유성분으로서 또는 반응계내의 생성물로서 효소반응하여 초래되는 리바비린의 제법.

제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한항에 있어서, 리보스 공여체가 리보누클레오시드, D-리보스 및 이들의 인산에스테르로 이루어지는 그룹에서 선택되는 리바비린의 제법.