JPS596895A - リバビリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　発明の背景 技術分野 本発明はリバビリン（Ｒｉｂａｖｉ口ｎ）の微生物を利
用する酵素的な製造法に関するものである。

リバビリンの化学名は１−β−Ｄ−リボフラノツルー１
．，２．４−１リアゾ〜ルー３−カルボキサミドであり
、バイラゾール（ｙｉｒａｚｏｌｅ）とも称され、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡウィルスに対して広範囲で強力な抗ウィ
ルス作用を示す化合物として知られている（アナルズ・
オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエン
ンズ（，４ｎｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、４ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、）２８４−、　２７２−２９２　（１９’ｌＴ）参
照）。

従来技術 従来知られているリバビリンの製造法としては合成法、
微生物の培養による方法および酵素的な方法がある。

合成法の代表的な方法としては、８−メトキシカルボニ
ル−１，２，４−トリアゾールと１−〇−アセチルー２
，８．５−トリー０−アシル−β−Ｄ−リボフラノース
を反応させ（溶融法）、得られた１　−（２’、　　８
’、　　５’−トリー〇−アシルーβ−Ｄ−リボフラノ
シル）−３−メトキシカルボニル−１，２，４−トリア
ゾールをアンモニアで処理し、アミド化と脱保護を行う
方法（特開昭４８−４４６９号、特開昭４９−８００７
０号、特開昭４９−８００７１号各公報参照）、前記と
同様の方法においてトリアゾールの８位の置換基として
アラルキルオキシ基を用いる方法（特開昭５５−１６０
７９８号公報参照）、３−メトキシカルボニル−１，２
，４−トリアゾールをトリメチルシリル化し、２．８．
５−）リーＯ−ベンゾイルーβ−Ｄ−リボフラノシドの
ハロゲン化物と反応さぜた（シリル化法）後、アンモニ
アで処理する方法（特開昭４８−４４６９号、特開昭４
９−８６８７２号各公報参照）なとが知られている。

このような合成法は、いずれも反応前に原料化合物の活
性基を保護する必要かあり、また反応に際してはリボー
スの活性化が必要であったり、高温に加熱する必要かあ
る場合もあり、さらに、反応後に脱保護およびアミド化
が必要であるなど反応操作か煩雑であるなどの問題かあ
る。また、縮合反応の位置選択性はいずれも高くない。

微生物の培養による方法としては、ブレビバクテリウム
属、コリネバクテリウム属、アースロバフタ−属、ミク
ロコツカス属またはバチルス属に属する微生物を培養し
て増殖させる際に、使用微生物の培養のために必要な炭
素源、窒素源、無機物、その他の栄養物を含有する培地
に、培養開始前または培養中、一時にまたは間歇的に１
，２゜４−トリアゾール−８−カルボキサミド（以下、
「トリアゾール化合物」と略すこともある。）を添加し
、培養開始後２〜３日間という長期間にわたって培養し
、培地中にリバビリンを生成蓄積せしめる方法が知られ
ている（以下、この方法を「培養による公知方法」とい
うこともある；特公昭５４−１７８８０号公報、日本農
芸化学会誌１５０　（９）、４２８〜４８０　（１９７
６）参照）。

本発明とこの公知方法とは本質的に相異する技術である
。すなわち、本発明の方法においては微生物を酵素源と
みなし、微生物か増殖しない条件下で反応基質をこれら
の微生物の培養物、菌体または菌体処理物（以下、これ
らを総括的に１菌体等、と称することもある。）の触媒
作用によって反応させてリバビリンを合成するのに対し
、培養による公知方法においては微生物の代謝系を利用
する目的で、十分に増殖しうる条件下で微生物を培養し
、培地中に添加された前駆体であるトリアゾール化合物
を代謝させてリボシル化させる点である。したがって、
本発明の方法においては、酵素反応に際して微生物菌体
は休止ないし死滅した状態で使用され、基質溶液へ加え
るべき必須成分は反応基質であるトリアゾール化合物の
みかあるいはこれらに加えて酵素反応に必要な無機物、
補酵素類たけて十分てあり、反応条件は微生物が増殖し
ない条件、たとえば高温度条件か最適なのである。これ
に対して前記の培養による公知方法においては、微生物
は盛んに増殖している状態で使用され、培地成分として
はトリアゾール化合物に加えて使用微生物か十分に生育
しうるような炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源
を含有していなければならず、培養条件は微生物が十分
に生育しうる条件、すなわち比較的低温条件でなければ
ならないのである。また、使用微生物は、本発明の方法
を採用する場合には天然よりの分離菌、公共機関の保存
菌なと通常の微生物から広く選択して使用できるが、前
記の従来技術の方法を採用する場合には、糖源からリボ
ース供与体を生成させる意味でのヌクレオシド生産性を
有することが必要であり、アデニン要求性、６−メルカ
プトグアニン抵抗性など特殊な性質を有する微生物を使
用しなければリバビリンの生産量を増加することはでき
ない。

また、酵素的な製造法としてはトリアゾール化合物とリ
ボース−１−りん酸とをｐＨ５〜９、温度θ〜５０°Ｃ
の条件下でヌクレオシドホスホリラーゼの存在下におい
て反応させる方法が知られている（特開昭５０−２９７
２０号公報参照）。この方法においてはリボース供与体
としてリボース−１−りん酸を反応基質として添加する
ことが示されている。また、酵素源として動物または微
生物より得られるヌクレオシドホスホリラーゼを使用で
きる旨の記載があり、微生物としてエシェリヒア・コリ
および酵母が例示されているが、具体的には子牛肺臓由
来のヌクレオシドホスホリラーゼを用いる方法が示され
ているにすぎず、微生物の酵素については［活発に代謝
するバクテリア又は真菌細胞中に存在−１する酵素をこ
れらの微生物を培養することによって利用しうる可能性
が示唆されているにすきない。この公知方法は、リボー
ス供与体としてリボース−１−りん酸を反応基質溶液に
添加する点および酵素源として記載されている微生物の
種類において本発明の方法とは全く（Ｉｆ）　　発明の
概要 要旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌体処理物
を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に酵素反応によっ
てリバビリンが生成することを初めて知見し、この知見
に基づいて本発明を完成した。

本発明は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、ミクロコツカス属またはバチルス属に属し、１，２
．４−１リアゾール−３−カルボキサミドとリボース供
与体とからりバビリンを生成する反応を触媒する酵素系
を含有する微生物の培養物、菌体または菌体処理物と、
１，２．４−トリアゾール−８−カルボキサミドまたは
その塩とを前記微生物の非増殖条件下において水性媒体
中で接触させてリバビリンを生成させ、これを取得する
ことを特徴とするりバビリンの製造法を提供するもので
ある。

効果 本発明における酵素反応液は組成が単純なので、微生物
の栄養培地に比へて調製が簡便であり、栄養培地のよう
にあらかじめ殺菌する必要もない。

また、微生物の非増殖条件下、たとえば高温条件下で反
応を行う場合には反応液の雑菌汚染がほとんどないたけ
でなく、リバビリンの分解反応が抑制されるのでいった
ん合成されたりバビリンは酵素反応液中に多量に蓄積す
る。本発明の方法は酵素反応なので反応時間が短かく、
副生物の生成もほとんどない。したがって、菌体等と分
離後の反応液中には主に未反応の原料化合物とりパビリ
ンしか存在せず、リバビリンの単離精製が容易である。

さらに、本発明が菌体等の非増殖条件における酵素反応
であることによる副次的効果としては、使用微生物をあ
らかじめ多量に培養して菌体等を適宜な方法で保存して
おけば、必要なときに必要な量を本発明の酵素反応に供
することができるなとの利点がある。

ちなみに、培養による公知方法の欠点は次のとおりであ
る。すなわち、公知方法ζこおいてはりバビリンの製造
■は、微生物の増殖中に栄養培地中で行われるので、ま
ず微生物を増殖させるために各種の栄養源を含有する培
地を調製しなければならす、種菌を植菌する前にこれら
の培地を殺菌しなければならないなど前処理か煩雑であ
る。また、リバビリンの蓄積を目的とする、微生物の増
殖を伴う培養は、通常２０〜４０°Ｃの常温で行われる
ので、常に雑菌汚染への配慮か必要であるばかりではな
く、このような条件下ではリバビリン分解活性も存在し
ているので生成したりバビリンも分解してしまい目的物
の収量を低下させる原因となっていた。公知方法は微生
物の増殖を伴う方法であるため、培養を２〜８日間とい
う長期間にわたって行わなければならず、各種のヌクレ
オシド、リバビリンのりん酸化物、その他の代謝産物が
副生ずる。したがって培養液からりバビリンを回収する
ためには、原料化合物だけでなく、各種の副生物とも分
離しなければならず単離精製が煩雑である。さらに、微
生物はリバビリンの製造の度に培養しなければならない
。

（１）　　発明の詳細な説明 使用機イ」・物 本発明において使用される微生物は、その培養物、菌体
または菌体処理物か、１，２．４−１−ＩＪアゾール−
８−カルボキサミドとリボース供与体との反応を触媒ｊ
７、リバビリンを生成する酵素系を含有するものであり
、具体的にはプレビバクテ＋）　ラム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｌｅｒｉｕｍ；以下、１Ｂ」と略すこともある。）属
、コリネバクテリウム（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　；以下、「Ｃ」と略
すこともある。）属、ミクロコツカス（ＭｔＣｒＯＣＯ
ＣＣｕＳ；以下、１Ｍ、」と略すこともある。）属また
はバチルス（ｆ３ａｃｉｌｌｕｓ　；以下、ｒＢ（Ｉｃ
、−１と略すこともある。）属に属し、前記の酵素活性
を有する微生物か挙げられる。本発明においてはこのよ
うな基本的性質を有するものである限り、特に使用菌株
の種類に限定されるものではない。

前記の酵素活性の強い代表的菌株の一つとして、兵庫県
西宮市の甲子園球場の砂より分離されたＡＴ−６−７株
を挙げることかできる。この菌株の菌学的性質を以下に
記載する。

Ａ形態 （１）細胞の形態および大きさ：短桿状、０８〜１、０
　Ｘ　１．０−１．２　μｍ （２）胞子の形成：なし く３）グラム染色性。陽性 Ｂ、各種培地におりる生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（２８°ｃ、４８時間）■集落
の形状：円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ）■集落表面の隆起：
扁平状（Ｆｌａｔ）、平滑（Ｓｍｏｏｔｈ） ■大きさ＝２〜４酊 ■色調；黄色ないし桃黄色 （２）肉汁寒天平板培養（２８°０１４８時間）■生育
：良好 ■生育の形：ｆＰＪ状（Ｅｃｈｉｎｕ！ａｔｅ）（３）
肉ｔ１−液体培養（２８°ｃ、４８時間）生育：表面に
閉環（Ｒｉｎｇ）を形成し、やや沈ｉ　（Ｓｅｄｉｍｅ
ｎｔ）を生シル。

（４）肉汁セラチン穿刺培養（２０’Ｃ，６日間）：層
状（３ｔｒａｉｔｉｆｏｒｍ）　　に液化する。

（５）リドマスミルク培地（２８８Ｃ，４日間）：わず
かに凝固し、ペプトン化も見られる。

Ｃ生理的性質 （１）硝酸塩の還元（２８°Ｃ，５日間）二還元性なし
。

（２）硫化水素の生成（２８°Ｃ，５０間）：生成しな
い。

（３）澱粉の加水分解：分解性あり。

（４）ノＪタラーゼ：陽性 （５）インドールの生成：生成しない。

＋６１ペプトンおよびアルギニンからのアンモニアの生
成：陰性 （７）メチルレッドテスト：陰性 （８１Ｖ−Ｐテスト：陽性 （９）酸素に対する態度：好気的 （１０１０−Ｆ　テｘ　）　（ＩＩｕｇｈ　１ｅｉｆｓ
ｏｎ法による）＝Ｆ型（Ｆｅｒｍｅｎｌｌｏｎ） （１１）糖類からの酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フラクト−ス、マルト
ース、サッカロース。

トレハロース 随性：アラビノース、キシロース、力６ラクト−ス、ソ
ルビット、イノジット。

グリセリン α２）生育ｐＨ範囲：ｐＨ６，０〜９０（１８）生育最
適温度＝２５〜８７６Ｃ以上の菌学的性質を、バージニ
ーズ・マニュアル・オブ・デイタミネーテイブ・バクテ
リウムジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）第７版（１９５７年）の分類基準により検索１−
た。

その結果、Ａ、Ｔ−６−７株はほとんど球菌に近い短桿
菌で、ダラム陽性であり、フィラメントを形成ゼす、炭
水化物より酸を生成することよりプレビバクテリウＡ　
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｅｒｉｕｍ）属に属する菌株と同
定し、ブレビバクテリウム・アセチリカム（ｆ３ｒｅｖ
ｉｂａｃｌｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｔｎ）　Ａ
’ｌ’　−５−７と命名した。

なお、以上の菌株の同定帰属はバージニーズ・マニュア
ル・オブ・デイタミネ゛−テイブ・バクテリオロシー第
７版によるものであり、分類基準の変更なとにより、異
なる分類基準によってこ一一の菌株の同定帰属か行イつ
れた場合には、他種あるいは他用に属することもあり得
るが、本発明において上記のこと（命名さ４１だ微生物
は、少なくとも本発明の［１的とするりバビリンの製造
に関与する酵素を生産し、かつ前記の菌学的性質もしく
はこれと均等の菌学的性質を基本的に有する微生物を包
含し、一義的に特定され得るものである。

この菌株について、昭和５６年通商産業省告示第１７８
号に従って工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄
託申請を行い、昭和５７年１月１８日句けで受託され、
受託番号として微工研菌寄第６３０５号（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−６８０５）が付与されている。

また、上記菌株以外に本発明の目的とするリバビリン製
造のための酵素活性が強く、かつ当業者が容易に入手で
きる菌株を以下に例示する。

ブレビバクテリウム・インペリアレ（Ｂ、　ｉｍｐｅｒ
ｉａｌｅ）ＡＴＣＣ８８６５ コリネバクテリウム・エクイ　（ＣｅｑｕりＩＡＭ　　
　１０８８ バチルス’ズブチＩＪ　ス（Ｂａｃ、　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＡＴＣＣ１４５９８ バチルス・セレウＸ　（Ｂａｃ、ｃｅｒｅｕｓ）ＩＡＭ
　　　１０２９ ミクロコツカス・ルテウス（Ｍ、　１ｕｔｅｕｓ）ＡＴ
ＣＣ４６９８ 同　　上　　　　　　　　　　　ＩＡＭ　　　　　１０
５６ミクロコツカス・ヴアリアンス（Ｍ、　Ｕ（ｌｒｌ
（Ｉｎｓ）ＩＦＯ８７６５ ＡＴＣＣ８９９ ミクロコツカス・ロゼウス（Ｍ、　ｒｏｓｅｕｓ）ＩＦ
Ｏ８７６８ ＡＴＣＣ１８６ ミクロコツカス・カゼオリティカスＣＭ、　ｃａｓｅｏ
ｌｙｌｉｃｕｓ）Ｉ’ＦＯ８７６０ なお、上記菌株の寄託番号において、ＡＴＣＣを付した
番号はアメリカン・タイプヵルチュアー・コレクショ７
　（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　ニオける寄託番号を、Ｉ
ＦＯを付した番号は財団法人　発酵研究所（ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ　ｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、　Ｑｓａ
ｋａ）　　Ｊｃ　＠ける寄託番号を、ＩＡＭを付した番
号は車重大学応用微生物研究所（ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　
ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　
［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ’ｌ’ｏｋｙｏ）におけ
る寄託番号をそれぞれ示すものであり、これらの菌株は
当該寄託機関の保存菌株リストに収載されている保存菌
である。またＩＦＯおよびＩＡＭ番号を付された菌株は
日本微生物保存株目録（Ｊ　Ｆ　ＣＣＣａｔａｌｏｇｕ
ｅ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に収載されている保存菌
である。

また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の照射など
の物理的処理もしくはニトロソグアニジンなどによる薬
剤処理など、一般的変異誘導法による誘発突然変異また
は自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導され
た変異株も、本発明の目的とするりバビリンの製造に関
与する酵素活性を失なわない限り、本発明に使用される
。

さらに、以上のような本発明に好適に使用される菌株か
ら得られた本発明の目的とするリバビリン製造に関与す
る酵素系の遺伝子がブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、ミクロコツカス属またはバチルス属以外の
微生物に取り込まれ、そのような形質が発現するに至っ
た場合、このような微生物の培養物、培養菌体またはそ
の処理物を本発明の目的に使用する方法は、本発明１こ
包含される。

培養 本発明に使用する菌体等を調製するために、これらの微
生物を培養するに際しては、使用される培地および培養
法は、これらの微生物が生育する限り、特に限定されな
い。

培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素源および
窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、微量発育
促進物質、消泡剤などを添加したものか使用１される。

具体的には、炭素源としては、グルコース、フラクト−
ス、マルトース、カラクトース、リボース、サッカロー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類も
しくはその脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、皺、米な
どの天然炭水出物、グリセロール、マンニトール、メタ
ノール、エタノールなどのアルコール類、グルコン酸、
ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマル
パラフィン、ケロシンなどの炭化水素類、グリシン、グ
ルタミン酸、グルタミン、アラニン、アスパラギンなど
のアミノ酸類など、一般的な炭素源より使用する微生物
の資化性を考慮して一種または二種以上を適宜１こ選択
して使用すればよい。窒素源としては、肉エキス、ペプ
トン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉
、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミン酸、コーン
ステイープリカー、コットンンードミールないしその加
水分解物、フィツシュミールないしその加水分解物、そ
の他の動物、植物、微生物の加水分解物なとの有機窒素
化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、すん酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウムなとのアンモニウム塩、
硝酸ナトリウムなとの硝酸塩、尿素など無機窒素化合物
より使用微生物の資化性を考慮し、一種または二種以上
を適宜に選択して使用する。さらに、無機塩として微量
のマグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム
、カルシウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫酸
塩、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種または二種以上
を適宜添加し、必要に応じて植物浦、界面活性剤などの
消泡剤、ビタミンＢ１１Ｂ２、ニコチン酸、パントテン
酸、ビオチン、ｐ−アミノ安息香酸などの微量発育促進
物質を添加してもよい。また、栄養要求を同時に示す微
生物を使用する場合、当然その生育を満足させる物質を
培地に添加しなければならない。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養
、通気撹拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培養
法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいか、通常は培養開始のｐＨを約６〜８に調
整し、約２５〜８５℃の温度条件下で培養を行う。培養
期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく、通
常１〜８日間である。

酵素源 以上のように微生物を培養した後、得られた培養物、培
養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離なとの通常の方
法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処理
を施して得られる菌体処理物を本発明における酵素源と
して使用できる。ここで、培養物とは培養後の培地と培
養菌体が未分離の状態のものをいう。また、菌体処理物
とは、乾燥菌体、細胞膜・壁装性菌体、破砕菌体、固定
化菌体、菌体抽出物、本発明の目的とするリバビリンの
製造に関与する酵素活性を有する菌体抽出物の蛋白質画
分もしくはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製物
の固定化物なとを指称する。

菌体処理物を得るための方法を以下に例示する。

しアルカリ性下１こおける加温処理、磨砕処理、超音波
処理、浸透圧差処理などの物理的処理手段、もしくはた
とえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、
トルエン、キシレン、ブチルアルコール（ブタノール）
などの溶媒もしくは界面活性剤との接触処理などの化学
的ないし生物化学的処理を単独もしくは組み合せて施す
ことにより、また、■菌体抽出物に対し、たとえば塩析
処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、各種クロマ
トグラフ処理、透析処理などの酵素分離精製手段を単独
もしくは組み合せて施すことにより、さらに、■生菌体
、菌体抽出物もしくはその精製物番こ包括処理、架橋処
理、担体への吸着処理などの酵素固定化手段を施すこと
により菌体処理物を得ることかできる。

反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は１．２．４−トリ
アゾール−８−カルボキサミドおよびリボース供与体で
ある。

１、２．４−　）リアゾール−３−カルボキサミドは遊
離型またはすトリウム塩などの塩のいずれも使用できる
。

本発明においてリボース供与体とは、本発明の使用微生
物の菌体等の作用により、１．２．４−　トＩＪアゾー
ルー８−カルボキサミドにＤ−リボース残基を転移しう
るリボース誘導体であり、酵素源として使用する菌体等
にその菌体内成分として概に含まれている物質であって
、本発明の反応に関与する酵素の直接の反応基質のみな
らず本発明の反応条件において上記反応基質に誘導され
つる物質をも包含する。このような物質としては各種の
りボヌクレオシドもしくはＤ−リボースまたはこれらの
各種りん酸エステルが挙げられる。

本発明は、前記のとおりリボース供与体を反応系外より
添加することなく、使用微生物の菌体内成分として含ま
れるこれらの物質を利用する点に一つの特徴を有するも
のである。

反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基本的には
前記の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性
液である。

水性液中には少なくとも前記のトリアゾール化合物を添
加し、これらの反応基質のほかに、りん酸イオン供与系
、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類、補酵素類、酸、塩
基、糖類など酵素反応を促進する物質、妨害酵素活性を
阻害する物質、反応基質の溶解性を向上させる物質、酵
素と反応基質の接触を向上させる物質等を含有していて
もよい。

水性媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩衝
液（りん酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ベロナ
ール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）を用いる
ことができる。

りん酸イオン供与系としては、水性媒体中でりん酸イオ
ンに解離しうるもののいずれを用いてもよく、たとえば
遊離型りん酸そのもの、無機りん酸塩、たとえばナトリ
ウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグ
ネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩
が好適に使用される。また、りん酸イオン供与系として
は、酵素反応の基質溶液中でりん酸イオンを遊離しつる
系、たとえば各種りん酸エステル誘導体とホスファター
ゼの組み合せ、ヌクレオチドとヌクレオチダーゼの組み
合せ、核酸塩基およびリボース−１−りん酸とホス小す
ラーゼの組み合せなどを利用することができる。

以上のようなりん酸供与系は酵素反応に際して系外から
添加されたものであってもよく、使用微生物が菌体成分
として含有しているものであってもよい。すなわち、酵
素反応に利用しうる形態である限り、上記の物質の単独
もしくは二種以上を組み合せた系を、または上記の物質
を含有する微生物菌体もしくはその菌体処理物を本発明
の酵素反応に際して反応液に別途添加してもよく、使用
微生物か菌体成分として含有しているこれらの物質をそ
のまま利用してもよい。

有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタノール、
プロパツール、ブタノール、ペンタノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメ
チルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、２−メトキ
シエタノール、２−エトキシエタノール、１，２−ジメ
トキシエタンなどが例示される。

接触方法 本発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを水性媒体
中で接触させることにより達成される。

接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択すればよ
いが、通常、酵素源を反応基質溶液に懸濁もしくは溶解
し、好ましくは加温しながら撹拌もしくは振盪するバッ
チ方式、または酵素源を必要に応じて適当な担体、助剤
、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラム
に充填し、反応基質溶液を通液するカラム方式などが適
用される。

反応に際し、反応液の基質濃度は特に制限されるもので
はな（、反応温度におりる使用水性媒体に対する一基質
の飽和濃度以下の基質濃度が通常採用されるが、反応基
質溶液に添加されたー前記の有機溶媒、界面活性剤なと
により基質濃度を増大させることもできる。また、反応
液中に飽和濃度以上の曹基質を懸濁状態で存在させ、反
応の進行に従って一基質を溶解させることもできる。ま
た、−基質を反応中１こ逐次添加し、適当濃度に保つこ
ともできぢ。１Ｍ質を添加し、溶解させる場合、基質濃
度は１．２．４−１−リアゾール−８−カルボキサミド
またはその塩については通常５〜２００ｍＭ程度、好ま
しくは１０〜１００　ｍＭ程度である。

酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形態、反応効
率、経済性などを考慮し、当業者が予備実験等によって
容易に決定できるものであるが、通常バッチ方式の場合
、たとえば生園菌体であれば１０〜１５０１ｎｆ／／ｍ
ｌ基質溶液程度、乾燥菌体であれば２〜８０１Ｍｌ／ｖ
ｔｔ基質溶液程度基質溶液上（、カラム方式においては
バッチ方式に準じて適当な量を設定することかできる。

ス（−４作 本発明の反応の条件は、菌体等を非増殖条件下、すなわ
ち休止もしくは死滅菌体の状態で反応に供すること以外
は特に限定されない。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物が増殖できない温度範囲（たた
し、本発明の反応に関与する酵素が失活しない温度範囲
である。）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかじ
め前記のとおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理
することによって微生物を増殖できない状態にした後、
反応に供する方法、反応に際して、たとえばトルエンな
どの使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に
添加する方法などを単独にあるいは組み合せて採用すれ
ばよいが、特に反応温度を操作する方法が最も効果的で
簡便である。

本発明の反応１こおいて反応温度は上記のとおり重要な
条件であり、本発明を特徴づりる要件の一つである。反
応は２８〜８０°Ｃの範囲において進行するが、実用性
を考慮すれば３７〜７０°Ｃの範囲が好ましい。なお、
最適の温度条件は他の反応条件によって異るが、当業者
であれば予備実験などにより、容易に決定することがで
きる。

上記のような温度範囲で酵素反応を行うことにより使用
微生物の生育は大部分抑制される。なお、３７°Ｃ以上
の温度においては、反応によって生成したリバビリンが
反応液中に存在する菌体等の作用によって分解する反応
が抑制されるのでリバビリンの生成効率が良い。

反応基質溶液の液性は、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは
ｐＨ６〜８の範囲に保たれればよく、反応中にｐＨが変
動するときは、塩酸、硫酸、りん酸などの酸または水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモ
ニアガスなとのアルカリを用いて好ましいｐＨ範囲に補
正すればよい。

反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確認しなが
ら決定すればよいか、通常バッチ方式では２〜４５時間
程度、好ましくは２４〜８６時間程度反応させればよく
、カラム方式ではバッチ方式に準じて適当な条件を設定
して反応させればよい。

分離精製 反応後、必要Ｉこ応して菌体等を濾過、遠心分離または
凝集分離なとの常法によって分離除去し、リバビリンの
分離精製工程に供する。

リバビリンの分離精製は、公知の方法またはこれを応用
して行えばよく、たとえばイオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー
、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配
、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、
冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法など
の一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。

分析 本発明の実施例においてリバビリンおよび１，２゜４−
トリアゾール−３−カルボキサミドの分析は高速液体ク
ロマトグラフィーによって行った。以下に示す装置およ
び条件で分析すると、リバビリンは保持時間８．５０分
イ」近に、１．２．４−１−リアゾール−３−カルボキ
サミドは保持時間２６５分付近に溶出され、検量線より
それぞれの量を算出できる。

装置：島津高速液体クロマトグラフＬ　Ｃ−８Ａ型（■
島津製作所製） カラム二マイクロ　ボンダパック（μＢＯＮＤＡＰＡＫ
　）Ｃ１ｇ、　４．６朋Ｘ　２５０ｆｆｉｌ！　（日本
ウォーターズリミテッド社製）溶出剤；２％アセトニト
リルを含む２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） 流速：１＊ｔ／分 測定波長：　２２５　ｎｍ カラム操作温度：室温 〔■〕実施例 以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明するが
、これらはいずれも実施の一態様を示すものであって、
本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ 第１表に示す各菌株を粉末ブイヨン（極東製薬工業■製
）２％水溶液各５０　ｍｌに植菌し、２８°Ｃ１２４時
間振盪培養後、遠心分離によって集菌し、殺菌水を加え
て菌体懸濁液各５　ｍｌを得た。

２０　ｍＭ　１．２．４−　トリアゾール−８−カルボ
キサミドおよび２５　ｍＭりん酸−カリウムを含む水溶
液（ｐＨ７，０）各５　ｍｌに前記菌体懸濁液各５　ｍ
ｌを加え４５°Ｃ１２４時間反応した。反応終了後、リ
バビリン生成率を分析したところ第１表に示すとおりで
あった。

第１表 実施例 １．５％酵母エキス培地（Ｔ）Ｈ７，５）５Ａにブレビ
バクテリウム・アセチリカムＡＴ−６−７（微工研菌寄
第６３０５号）の前培養液２５０　ｍｌを植菌し、２８
６Ｃ５２４時間培養した。培養液より遠心分離によって
菌体を得、５００ｍ１の菌体懸濁液とした。

２０　ｍＭ　１，２．４−　トリアゾール−８−カルボ
キサミドおよび２５　ｍＭりん酸−カリウムを含有する
溶液（１）Ｈ７，０）　５００ｍ１に前記菌体懸濁液５
００　ｙｒｔを加え、４５°Ｃ１２４時間反応した。こ
の反応液のリバビリン生成率は２４．８８％であった。

菌体除去液を陽イオン交換樹脂（水素型）処理して、未
反応の１．２．４−１−リアゾール−８−カルボキサミ
ドを除去後、活性炭にリバビリン溶液を吸着した。２％
アンモニアを含む５０％エチルアルコール溶液でリバビ
リンを溶出後アルコールを溜去し、陰イオン交換樹脂（
塩基型）を通過させた。通過液を濃縮し、リバビリンの
結晶４７５　ｔａｇを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
   ミクロコツカス属またはバチルス属に属し、１．２．４
   −１リアゾール−３−カルボキサミドとリボース供与体
   とからりバビリンを生成する反応を触媒する酵素系を含
   有する微生物の培養物、物の非増殖条件下において水性
   媒体中で接触させてリバビリンを生成させ、これを取得
   することを特徴とするリバビリンの製造法。　 ２）酵素反応を微生物の非増殖条件下において行う方法
   が、反応液を微生物の増殖できない温度条件に保持して
   反応を行う方法、微生物菌体をあらかじめ該微生物が休
   止もしくは死滅する方法によって処理し、これを用いて
   反応を行う方法、および反応液に微生物の増殖を阻害す
   る物質を添加して反応を行う方法からなる群より選はれ
   た一種の方法または二種以上を組み合せた方法である特
   許請求の範囲第１項記載のリバビリンの製造法。 ８）微生物の非増殖条件が、３７〜７０°Ｃの温度条件
   である特許請求の範囲第１または２項記載のりバビリン
   の製造法。