JPS59143599A - トリアゾ−ルヌクレオシドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ１０発明の背景 技術分野 本発明はトリアゾールヌクレオシドの微生物を利用する
製造法に関するものである。

本発明においてトリアゾールヌクレオシドとは一般式〔
■〕 ○ １ 〔式中、Ｒはアミン基、アルコキシル基またはヒドロキ
ンル基を示す。〕で表わされる化合物であり、式中Ｒか
アミノ基である本発明化合物、すなわち１−β−Ｄ−リ
ボフラノシルー１．２．４−　トリアゾール−３−カル
ボキサミドはりバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ　　）ま
たはヴイラゾール（■１ｒａｚｏｌｅ　）と一般に称さ
れ、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルスに対して広範囲で強力
な抗ウィルス作用を示す化合物として知られている。

従来技術 従来、トリアソールヌクレオシドの代表的な製造法とし
ては化学的な合成法、微生物の培養による方法および酵
素的な合成法か知られている。

合成法としては、３−アルコキンカルボニル−１、２，
４−）リアソールと１−０−アセチル−２，３゜５−ト
リー〇−アノルーβ−Ｄ−リボフラノースを反応させ、
次いて加水分解または／およびアミド化を行う方法（特
開昭４８−４４６９号、特開昭４！ｌｌ−８００７０号
、特開昭４９−８００７１号各公報参照）、前記と同様
の方法においてトリアゾールの３位の置換基としてアラ
ルキルオキン基を用いる方法（特開昭５５−１６０７９
３号公Ｎ　参照）　、８−アルコキンカルボニル−１，
２，４−トリアソールをトリメチルシリル化し、２，８
．５−トリー〇−アシルーβ−Ｄ−リボフラノシドのノ
１０ゲン化物と反応させた後、加水分解また叫／および
アミド化を行う方法（特開昭４８−４４６９号、特開昭
４９−８６８７２号各公報参照）なとか知られている。

このような合成法は、いずれも反応前に原料化合物の活
性基を保護する必要かあり、また反応に際してはりホー
スの活性化か必要であったり、高温に加熱する必要かあ
る場合もあり、さらに、反応後に脱保護、アミド化など
が必要であるなど反応操作か煩雑であるなとの問題かあ
る。また、縮合反応の位置選択性はいずれも高くない。

微生物の培養による方法としては、プレヒバクテリウム
属、コリネバクテリウム属、アースロハクター属、ミク
ロコツカス属またはバチルス属に属する微生物を培養し
て増殖させる際に、使用微生物の培養のために必要な炭
素源、窒素源、無機物、その他の栄養物を含有する培地
に、培養開始前または培養中、一時にまたは間歇的に１
．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミド、１．２
．４−　トリアゾール−３−カルボン酸または１，２．
４−１リアゾール−３−カルボン酸アルキルエステルナ
ト（以下、これらの化合物を「トリアゾール化合物」と
総称することもある。）を添加し、培養開始後でいる（
特公昭５４−１７８８０号公報、日本農芸化学会誌、５
０（９）、４２８〜４．８０　（１９７６）参照〕。

また、酵素的な製造法としては１．２．４−　トリアソ
ール−８−カルボキサミドとりホース−１−りん酸とを
ｐＨ５〜９、温度０〜５０°Ｃの条件下でヌクレオシド
ホスホリラーゼの存在下において反応させる方法か知ら
れている（特開昭５０−２９７２０号公報参照）。この
方法においてはリボース供与体としてリホース−１−り
ん酸が開示されているにすきない。また、酵素源として
動物または微生物より得られるヌクレオシドホスホリラ
ーゼを使用できる旨の記載かあり、微生物としてエシェ
リヒア・コリおよび酵母か例示されているか、具体的に
は子牛牌臓由来のヌクレオシドホスホリラーゼを用いる
方法か示されているにすきす、微生物の酵素については
「活発に代謝するバクテリア又は真菌細胞中に存在」す
る酵素をこれらの微生物を培養することによって利用し
つる可能性が示唆されているにすぎない。本発明の方法
は酵素源として特定の糸状菌または放線菌を用いる点、
およびリボース供与体をヌクレオシド、ヌクレオチドな
とから広く選択できる点て上記方法とは全く異なるもの
である。

また、酵素源としてシュードモナス属、フラボバクテリ
ウム属、アクロモバクタ−属、サルモネラ属、ントロハ
クター属、エソエリヒア属、スポロサルシナ属、アルカ
リ土類金属、エンテロノくり９−属、エーロモナス属、
アースロノ１クター属、ブレビバクテリウム属、セラチ
ア属、エルビニア属、プロテウス属、コリネバクテリウ
ム属、セルロモナス属、キサントモナス属、タレブシエ
ラ属、ミクロコツカス属、バチルス属、ノ＼クテリウム
属、キャンンタ属、勺ツカロミセス属、スタヒロコツカ
ス属、クルチア属、ビブリオ属、マイコプラナ属なとの
細菌または酵母を使用する方法も知られている（特開昭
５７−１４６５９８号公報参興）。

本発明方法は、微生物によるトリアソールヌクレオシド
の製造法において、酵素源の微生物として細菌ないし酵
母を用いる公知方法に対し、特定ものである。

〔■〕　　発明の概要 要旨 本発明者らは、トリアソール化合物とりホース供与体に
作用し、トリアソールヌクレオシドを生成する能力を有
する微生物か細菌および酵母以外の微生物にも多種類分
布していることを知見し、この知見に基づいて本発明を
完成した。

本発明は、ムコール属、ペニシリウム属、フサリウム属
、アスペルギルス属、ゲオトリクム属、ステムフィリウ
ム属、リンーブス属、トリコロマ属、クリオクラシウム
属、アクチノプラネス属、ミクロモノスポラ属、ノカル
ディア属、ストレプトヴエルチシリウム属、ストレプト
スボランギウム属、サーモアクチノマイセス属またはス
トレプトマイセス属に属し、一般式〔Ｉ〕 ○ ｉ 〔式中、Ｒはアミン基、アルコキシル基またはヒドロキ
シル基を示す。〕で表わされるトリアゾール化合物とリ
ボース供与体とから前記一般式〔■〕で表わされるトリ
アソールヌクレオシドを生成する能力を有する微生物の
作用により、前記一般式〔Ｉ〕で表わされるトリアソー
ル化合物またはその塩およびリボース供与体を水性媒体
中で反応させて前記一般式ｒ、　ＩＩ　〕で表わされる
トリアソールヌクレオシドを生成させ、これを取得する
ことを特徴とするトリアソールヌクレオシドの製造法を
提供するものである。

皇−黒 本発明においては微生物の非増殖条件下にお０て、微生
物の培養物、菌体または菌体処理物を酵素源とし、酵素
反応に必要な基質のみを含有する反応液中で反応を行う
こともてきる。このような方法による場合には基質溶液
の調製か簡単であり、反応時間は培養法に比へて短く、
副生物の生成もほとんどなく、反応液からトリアゾール
ヌクレオシドの分離精製か容易であり、菌体等の反復ま
たは連続使用も可能であるなどの利点を有する。また、
非増殖条件下における酵素反応法として高温条件下で反
応を行う場合には、反応速度が増大し、反応液の雑菌汚
染かほとんとないたけてな（、合成されたトリアソール
ヌクレオシドの分解反応も抑制されるなどの効果かある
。

〔■〕　　発明の詳細な説明 使用微生物 本発明において使用される微生物は、前記一般式〔Ｉ〕
で表わされるトリアソール化合物とリボース供与体に作
用して前記一般式〔■〕で表わされるトリアソールヌク
レオシドを生成する能力を有するものである。具体的に
はムコール（凰王；以下、「及」と略す。）属、ペニシ
リウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　；以下、「上」と略
す。）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　；以下、
「上」と略す。〕属、アスペルギルス（、％５ｐｅｒ　
１ｌｌｕｓ　　；以下、「Δ」と略す。）属、’ｙ’　
オ）　！Ｊ　’）　ム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　　；以
下、「Ω」ト略す。）属、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍ
ｐｈｙｌｉｕｍ　；以下、「ｌ」と略す。）属、リゾト
リ：ｌ　ロマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　；以下、「ユ」
　と略す。）属、ブリオフラジウム（Ｑｌｉｏｃｌａｄ
ｉｕｍ　；以下、ｒＧｌｉ、Ｊと略す。）属、アクチノ
プラネス　（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　；以下、「へ
四」と略す。）属、ミクロモノスボ５　（Ｍｉｃｒｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａ　；以下、「Ｍｉｃ、Ｊと略す。）属
、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　；以下、「凡」と
略す。）属、ストレブトウエルチシリウム（３ｔｒｅｐ
ｔｏｖｅｒｔ＋ｃｉｌｌｉｕｍ　　；以下、「二」と略
す。）属、ストレプトスボランギウム　（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　　；以下［Ｓｔｓ、Ｊと略す
。）属、サーモアクチ／フイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ　；以下、「υｒｅ、−Ｊと略丈ン属
、またはストレプトマイセｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　；以下、「Ｓｔｍ、ｊと略す。）属に属し、前記
の作弗を有する微生物か挙げられる。本発明においては
このような基本的性質を有する微生物である限り、使用
微生物は例示の種および菌株に限定されるものではない
。以下に当業者か容易に入手できる公知の菌株で本発明
の方法に使用できるものを例示する。

ムコールφグロボサス （Ｍ、ｇｌｏｂｏｓｕｓ）　　　　Ｉ　ＡＭ　　６１　
１６ムコール・ラセモサス （Ｍ、　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ　）　　　Ａ　ＨＵ　　　
６００２ムコール・ヒエマリスｖａ’ｒトゥンドレ−（
Ｍ、　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｖａｒ、　ｔｏｕｎｄｒａｅ
　）ＡＨＵ　　６００７ ベニシリウム　フリクエンタンス （ア　ｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ　）　Ｉ　Ａ　Ｍ　　７
０８２ペニンリウム・デクムベンス （ｐ、　ｄｅｃｕｍｌ！＋ｅｎｓ　）　　Ｉ　Ａ　Ｍ　
　７２６　。

フザリウム　ンラニ （Ｆ、　５ｏｌａｎｉ）　　　　　Ｉ　Ｆｏ、　　５２
８２フサリウム゛ソラニＶａｒマルチイ （Ｐ、　５ｏｌａｎｉ　ｖａｒ、ｍａｒｔＨ）ｒＦｏ　
　５９００ フザリウム・タラミドスポルム （ｆ？、　ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ　）ＡＩ（Ｕ
　　９５２８ アスペルギルス・オリセー （Ａ、　ｏｒｙｚａｅ　）　　　　Ｉ　Ｆ　Ｏ４８４８
アスペルギルス・ソーヤ （Ａ、　５ｏｊａｅ　）　　　　Ｉ　Ｆ　Ｏ４２７４同
上　　　　ＩＦＯ５２４１ ス アスペルギルス・カルポナリウ閣 （Ａ、　　ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ　）　Ａ　ＨＵ　　
　７０２０ゲ第１・リクム・キャンディダム （（、、ｃａｎｄｉｄｕｍ　）　　ＯＵＴ　　４０２７
ステムフイリウム・ボツリオサムｖａｒ、ボツリチス（
Ｓ、　ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ　ｖａｒ、　ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓ　）ＡＨＵ　　　９１８０ リゾーブス　アルビダス （Ｒ，ａｒｒｈ＋−ｕｓ）　　　　ＡＨＵ　　　　６５
　７３（ＮＲＲＬ　　２５８２　） トリコロマ・フングロバツム （Ｔ、　ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｍ）　Ａ　ＨＵ　　９８
９４グリオクラジウム・デリクエスセンス アクチノプラネス　ミヅウリエンソス （，４ｃｔ、ｍ１ｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）　　Ｉ　Ｆ
　Ｏ１８２４８（ＣＢＳ　　１８８．６４　） ミクロモノスポラ　プルプレア （ｙｉｃ、　ｐｕｒｐｕｒｅａ）　　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１８
１５０（ＮＲＲＬ　　２９５　Ｂ　） ノカルディア・エリトロポリス （Ｎ、　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１
２６８２（ＩＡＭ　　１４８４） ストレブトヴエルチンリウム・　ロセオヴエルチゾラッ
ム（５ｔｖ、　ｒｏｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｍ
　）ＩＦＯ１２８１７ （ＡＴＣＣ，１９８０８ｉ ＣＢＳ　　　５６０．　６８） ストレブトスボランギウム・ロゼラム （Ｓｔｓ、ｒｏｓｅｕｍ）　　　Ｉ　ＦＯ８７７６サー
モアクチ／マイセス・ヴルガリス （７ｈｅ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）　　　Ｉ　Ｆｏ　　
１３６０５ストレプトマイセス・スクレロチアルス（３
ｔｍ、５ｃｌｅｒｏｔｉａｌｕｓ）　〔異名ｃｈａｉｎ
ｉａ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ）ＩＦＯ１２２４６ （ＡＴＣＣ１５２１； ＣＢ　　Ｓ　　　　１　６７．　　６２　　；ＣＢＳ　
　　　６５７．　　７２） ストレプトマイセス・グリセウス （３ｔｍ、ｇｒｉｓｅｕｓ）　　　　Ｉ　　Ｆ　Ｏ１２
８７５（ＡＴＣＣ２８８４５； ＡＴＣＣ２３９２１； ＣＢＳ　　９０５．６８） ストレプトマイセス　オリヴアセウス （Ｓｔｍ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１２８
０５（ＡＴＣＣ８８８５； ＡＴＣＣ１９７９４； ＣＢＳ　　５４６．６８） ストレプトマイセス・フラデイエ （５ｔｍ、ｆｒａｄｉａｅ）　　　　Ｉ　　ＦＯ１２７
７８（ＡＴＣ’Ｃ１０７４５； ＣＢＳ　　４９８．６９； ＩＦｏ　８７１８） ストレプトマイセス・ファエオクロモゲネス（５ｔｍ、
ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２８９８ ＜　ＡＴＣＣｓ　ｓ　ｓ　ｓ　； ＣＢＳ　　９２９．６８； ＩＦＯ８１８０） ストレプトマイセス　オリヴオクロモケネス（５ｔｍ、
　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）ＩＦｏ　　１
８０６７ （ＡＴＣＣ８８８６； ＡＴＣＣ２５４７９； ＣＢＳ　　　８８９．　６９；厘 ＩＦＯ８１７８） なお、上記菌株の寄託番号において、ＩＦＯを付した番
号は財団法人　発酵研究所（１ｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ
　）”ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｑｓａｋａ　）　　ニ
おける寄託番号を、ＩＡＭを付した番号は東京大学応用
微生物研究所（１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆ”ｐｏｋｙｏ　）における寄託番号を、ＯＵＴ
を付した番号は大阪大学工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。

Ｑｓａｋａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　）における寄託
番号を、ＡＨＵを付した番号は北海道大学農学部（Ｆａ
ｃｕｌｔｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　）（ｏｋ
ｋａｉｄｏ　’［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）　　におけ
る寄託番号を、ＡＴＣＣを付した番号はＴｈｅ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　、　ＴＪＳ、　ｌ）ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ
ｆ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ　）における寄託番号をそれ
ぞれ示すものであり、これらの菌株は当該寄託機関の保
存菌株リストに収載されている保存菌である。また、Ｉ
　ＦＯ，０ＵＴＳＡＨＵおよびＩＡＭ番号を付された菌
株は日本微生物保存株目録（ＪＦＣＣＣａｔａｌｏｇｕ
ｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に収載されティる保存
菌株である。これらの保存菌株の属名または種名は分類
基準の変更なとによって変ることもあるが、このような
菌株であっても前記例示の菌株と同一もしくは均等の菌
学的性質を有するものは、その属する属名番こかかわら
ず前記例示の菌株と同一とみなされる。

また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の照射なと
の物理的処理もしくはニトロソグアニジンなどによる薬
剤処理など、一般的変異誘導法による誘発突然変異また
は自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導され
た変異株も、トリアゾールヌクレオシド製造に関与する
酵素活性を失なわない限り、本発明に使用される。

さらに、以上のような本発明に好適に使用される菌株か
ら得られたトリアゾールヌクレオシド製造に関与する酵
素系の遺伝子が前記例示の属以外の微生物に取り込まれ
、そのような形質か発現するに至った場合、このような
微生物を本発明の目的に使用する方法は、本発明に包含
される。

す 本発明に使用される菌体等を得るために前記の微生物を
培養するに際し、使用される培地および培養法は、これ
らの微生物が生育する限り、特に限定されない。

培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素源および
窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、微量発育
促進物質、消泡剤なとを添加したものが使用される。具
体的には、炭素源としては、グルコース、フラクトース
、マルトース、カラクトース、リボース、シュークロー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜なとの糖類も
しくはその脂肪酸エステルなとの誘導体、麦、麦芽エキ
ス、皺、米などの天然炭水化物、グリセロール、マンニ
トール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、
グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸すとの脂肪酸
Ｍ　、ノルマルツメラフイン、ケロシンなとの炭化水素
類、グリシノ、クルタミン酸、クルクミン、アラニン、
アスパラギンなとのアミノ酸類など、一般的な炭素源よ
り゛使用する微生物の資化性を考慮して一種または二種
以上を適宜に選択して４吏用すればよい。窒素源として
は、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆
加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カサミノ酸、各
種アミノ酸、コーンステイープリカー、コツトンシード
ミールないしその加水分解物、フィツシュミールないし
その加水分解物、その他の動物。

植物、微生物の加水分解物なとの有機窒素化合物、アン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、すん酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウ
ムなどの硝酸塩、尿素など無機窒素化合物より使用微生
物の資化性を考慮し、一種または二種以上を適宜に選択
して使用する。さらに、無機塩としてマグネシウム、マ
ンカン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カル／ラム、カリ
ウムなとのりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩
、酢酸塩なとの一種または二種以上を適宜添加し、必要
に応じて植物油、界面活性剤なとの消泡剤、ビタミンＢ
１．　　Ｂ２、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、
ｐ−アミノ安息香酸などの微量発育促進物質を添加して
もよい。また、栄養要求を同時に示す微生物を使用する
場合、当然その生育を満足させる物質を培地に添加しな
ければならない。

培養の方法は特に限定されないか、通常前記培地成分を
含有する液体培地中で振盪培養、通気撹拌培養、静置培
養、連続培養などの通常の培養法より使用微生物に適し
た培養法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいか、菌体等の取得を目的とする場合、通常
は培養開始のｐＨを約６〜８に調整し、約２５〜３５°
Ｃの温度条件下で培養を行う。

培養期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく
、通常１〜５日間である。

なお、以上のような菌体等を得るための微生物の培養の
際に、培地中にトリアゾール化合物およびリボース供与
体を存在させて、これらの反応基質に微生物を作用させ
てもよい。

酵素源 本発明の方法を実施するに際しては前記の菌体等を酵素
源として使用し、これと反応基質溶液を接触させて反応
を行うが、以下にこのような酵素源の使用形態および製
造法を示す。

すなわち、以上のように微生物を培養し、得られた培養
物、培養物から遠心分離、゛沈降分離、凝集分離、濾過
（加圧濾過、真空濾過なとを含む。）などの通常の方法
によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処理を
施して得られる菌体処理物を本発明における酵素源とし
て使用できる。ここで、培養物とは培養後の培地と培養
菌体か未分離の状態のものをいう。また、菌体処理物と
は、乾燥菌体、細胞膜・壁変性菌体、破砕菌体、固定化
菌体、菌体抽出物、トリアソールヌクレオシドの製造に
関与する酵素活性を有する菌体抽出物の蛋白質画分もし
くはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製物の固定
化物なとを指称する。

菌体処理物を得るための方法を以下に例示する。

すなわち、■生菌体に対し、たとえば凍結融解処理、凍
結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸性な
いしアルカリ性下における加温処理、磨砕処理、超音波
処理、浸透圧差処理なとの物理的処理手段、もしくはた
とえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、
トルエン、キシレン、ブチルアルコール（ブタノール）
なとの溶媒もしくは界面活性剤との接触処理などの化学
的ないし生物化学的処理を単独もしくは組み合せて施す
ことにより、また、■菌体抽出物に対し、たとえば塩析
処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、各種クロマ
トグラフ処理、透析処理などの酵素分離精製手段を単独
もしくは組み合せて施すことにより、さらに、■生菌体
、菌体抽出物もしくはその精製物に包括処理、架橋処理
、担体への吸着処理なとの酵素固定化手段を単独もしく
は適宜をこ組み合せて施すことにより菌体処理物を得る
ことかできる。

反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は、一般式〔Ｉ　〕
で表わされるトリアゾール化合物およびリボース供与体
である。

一般式〔Ｉ〕で表わされるトリアゾール化合物は遊離型
またはナトリウム塩などのアルカリ塩のいずれも使用で
きる。

リボース供与体としては、リボヌクレオシドもしくはＤ
−リボースまたはこれらの各種りん酸エステルなどのリ
ボース誘導体から、使用する酵素源の微生物の種類に応
じて適宜に選択して使用することかできる。さらに、こ
のようなりホース誘導体以外の糖類てあって、使用する
微生物に代謝されてリボース誘導体に導かれうるものは
本発明においてリボース供与体とみなされる。なお、こ
れらのりホース供与体は必すしも反応基質溶液中に添加
する必要はなく、菌体等の中にその本来の成分として含
有されているものを利用してもよい。

また、このような菌体成分としてのリボース供与体か酵
素反応によって消費されて減少した場合には系外から添
加すればよい。

系外より添加される好適なリボース供与体を以下に例示
する。すなわち、リボヌクレオシドはその塩基部分かプ
リン系またはピリミジン系のいがなる塩基であってもよ
く、天然物°由来であれ化学合成によるものであれ使用
することができる。また、リボヌクレオシドもしくはＤ
−リボースの糖部水酸基は非置換のものであってもある
いは２位、８位もしくは５位水酸基のいずれが一個所、
二個所もしくは全てがモノりん酸エステル、ジりん酸エ
ステル、トリりん酸エステルのようなりん酸エステル化
されたものであってもよい。また、これらのりん酸エス
テルは遊離型であってもよく、またナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、トリエ
チルアンモニウムなどの一般的なアルカリ塩であっても
よい。リボース供与体の具体例としてはイノシン、アデ
ノ７ン、グアノツン、キサントノン、ウリジン、ノチ／
ン、５′−イノシン酸、５′−アデニル酸、５′−ファ
ニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジル酸、５′
−シチジル酸、２’＋８つ一イノノン酸、２’＋３つ−
アデニル酸、２’（３’ｌ−ファニル酸、２’＋ｇ＋−
・キサンチル酸、２′（３つ−ウリジル酸、２’（８’
ｌ−シチジル酸、Ｄ−リボース、Ｄ−リボース−１−り
ん酸なとか例示される。また、リボース誘導体に代謝さ
れうる糖類としてはグルコース、シュークロースなどか
例示される。

反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基本的には
前記の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性
液である。

水性液中には少なくとも前記のトリアゾール化合物の一
種または二種以上および前記のりホース供与体の一種ま
たは二種以上を含有し、これらの反応基質のほかに、り
ん酸イオーン供与系、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類
、補酵素類、酸、塩基、糖類なと酵素反応を促進する物
質、妨害酵素活性を阻害する物質、反応基質の溶解性を
向上させる物質、酵素と反応基質の接触を向上させる物
質等を含有していてもよい。また、使用微生物が資化し
うる前記のような培地成分を含有していてもよい。

水性媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩衝
液（りん酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ペロナ
ール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液なと）を用いる
ことかできる。

りん酸イオン供与系としては、水性媒体中でりん酸イオ
ンに解離しつるもののいずれを用いてもよく、たとえば
遊離型りん酸そのもの、無機りん酸塩、たとえばナトリ
ウム、カリウムなとのアルカリ金属、カルシウム、マグ
ネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩
か好適に使用される。また、りん酸イオン供与系として
は、酵素反応の基質溶液中でりん酸イオンを遊離しうる
系、たとえは各種りん酸エステル誘導体とホスファター
セの組み合せ、ヌクレオチドとヌクレオチダーゼの組み
合せ、核酸塩基およびリポース−１−りん酸とホスポリ
ラーセの組み合せなとを利用することかできる。

以上のようなりん酸供与系は酵素反応に際して系外から
添加されたものであってもよく、使用微生物の成分とし
て含有されているものであってもよい。すなわち、酵素
反応に利用しつる形態である限り、上記の物質の単独も
しくは二種以上を組み合せた系を、または上記の物質を
含有する微生物菌体もしくはその菌体処理物を本発明の
酵素反応に際して反応液に別途添加してもよく、使用微
生物の菌体成分として含有されているこれらの物質をそ
のまま利用してもよい。

有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタノール、
プロパツール、メタノール、ペンタノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒ
ドロフラン、ノオキサン、／メチルスルホキッド、ジメ
チルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、２−メトキ
ンエタノール、２−エトキソエタノール、１，２−ジメ
トキシエタンなどが例示される。

接触方法 本発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを水性媒体
中で接触させることにより達成される。

接触方法は、酵素源の形態に応して適宜に選択すれはよ
いか、通常、酵素源を反応基質溶液に懸濁もしくは溶解
し、好ましくは加温しなから撹拌もしくは振盪するノ＼
ツチ方式、または酵素源を必要に応して適当な担体、助
剤、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラ
ムに充填し、反応基質溶液を通液するカラム方式なとか
適用される。なお、バッチ方式の場合には反応後、菌体
等を濾過（加圧濾過、真空濾過なとを含む。）、遠心分
離、沈降分離、凝集分離なと通常の方法によって集菌し
、反応基質溶液と接触させることによって繰り返し使用
することかできる。カラム方式の場合は、菌体等の分離
操作は必要なし）か、同様に繰り返し、もしくは連続的
に酵素反応１こ使用す５ことがてきる。また、前記した
よう（こ、使用微生物の培養に際し、培地中に反応基質
を添加し、酵素源と反応基質を反応させる方法も本発明
ｉこ採用しつる。

反応基質および酵素源の濃度もしくは添加量反応に際し
、反応液の基質濃度は特１こ制限されるものではなく、
反応温度における使用水性媒体に対する各基質の飽和濃
度以下の基質濃度力Ｓ通常採用されるか、反応基質溶液
に添加された前記の有機溶媒、界面活性剤なとにより基
質濃度を増大させることもてきる。また、反応液中齋こ
飽和濃度以上の各基質を懸濁状態で存在させ、反応の進
行に従って各基質を溶解させることもてきる。また、各
基質を反応中に逐次添加し、適当濃度（こ保つこともて
きる。各基質を添加し、溶解させる場合、基質濃度はト
リアゾール化合物またはその塩齋こついては通常５〜２
００　ｍ１ｙｌ程度、好ましく番よ１０〜１００　ｍＭ
程度であり、リポース供与体については通常０〜８００
　ｍＭ程度、好ましくは１〜１５０　ｍＭ程度である。

酵素源の使用量は微−生物５μ種類、その使用形態、反
応効率、経済−性なとを考慮し、当業者か予備実ｒ等Ｅ
よって容易に決定できるものであるか、通常ハツチ方式
の場合、たとえば生（瀾菌体であれは１０〜１５０　ｍ
ｆ　／　ｍｌ基質溶液程度、乾燥菌体であれば２〜８０
ｍｇ／ｍｅ基質溶液程度であれはよく、カラム方式にお
いてはバッチ方式に準して適当な量を設定することかで
きる。

反応条件 本発明の反応の条件は１９反応基質か菌体等の作用によ
って反応し、効率よくトリアゾールヌクレオシドか生成
する条件であれば使用微生物の非増殖条件下であれ増殖
条件下であれ特に限定されない。しかしながら、使用微
生物の非増殖条件下における反応か特に効率か良い。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物が増殖できない温度範囲（たた
し、本発明の反応に関与する酵素か失活しない温度範囲
である。）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかし
め前記のとおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理
することによって微生物を増殖できない状態にした後、
反応に供する方法、反応に際して、たとえばトルエンな
どの使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に
添加する方法なとを単独にあるいは組み合せて採用すれ
ばよいか、特に反応温度を操作する方法が最も効果的で
簡便である。

本発明の反応は２８〜８０°Ｃの範囲において進行する
か、実用性を考慮すれば３７〜７０°Ｃの範囲が好まし
く、特に４０〜６５°Ｃか最適である。

なお、３７°Ｃ以上の温度においては、反応によって生
成したトリアゾールヌクレオシドか反応液中に存在する
菌体等の作用によって分解する反応か抑制されるのでト
リアゾールヌクレオシドの生成効率か良い。

反応基質溶液の液性は、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは
ｐＨ６〜８の範囲に保たれればよく、反応中にｐＨか変
動するときは、塩酸、硫酸、りん酸なとの酸または水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモ
ニアカスなとのアルカリを用いて好ましいｐＨ範囲に補
正すれはよい。

反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確認しなか
ら決定すれはよいが、通常ハツチ方式では２〜４５時間
程度、好ましくは２４〜３６時間程度反応させればよく
、カラム方式ではハツチ方式に準して適当な条件を設定
して反応させれはよい。

分離精製 反応後、必要に応じて菌体等を濾過１．４または凝集分
離などの常法によって分離除去し、トリアゾールヌクレ
オシドの分離精製工程に供する。

トリアゾールヌクレオシドの分離精製は、公知の方法ま
たはこれを応用して行えばよく、たとえばイオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロ
マトグラフィー、ゲル濾過法なと各種のクロマトグラフ
ィー、向流分配、向流抽出なと二液相間の分配を利用す
る方法、濃縮。

冷却、有機溶媒添加なと溶解度の差を利用する方法なと
の一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。

分析 本発明の実施例においてリバビリンおよび１，２゜４−
トリアゾール−３−カルボキサミドの分析は高速液体ク
ロマトグラフィーによって行った。以下に示す装置およ
び条件で分析すると、リバビリンは保持時間３５０分付
近に、１．２．４−トリアソール−３−カルボキサミド
は保持時間２．６５分付近に溶出され、検量線よりそれ
ぞれの量を算出てきる。

装置：島津高速液体りロマトグラフＬＣ−８Ａ型（■島
津製作所製） カラム二マイクロ　ボンダパック（μＢＱＮＤＡＰＡＫ
）ＣＩＢ、４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ（日本ウォータース
リミテット社製）溶出剤：２９６アセトニトリルを含む
２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） 流速：１ｍｌ／分 測定波長：　２２５　ｎｍ カラム操作温度：室温 〔■〕実施例 以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明するか
、これらはいずれも実施の一態様を示すものであって、
本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ グルコース５０９／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、肉エキス２
．５’ｊ／ｌ、硫酸マクネ／ウム（７水塩）ｏ５ｑ／ｌ
、硫酸第一鉄（７水塩）０．５９／ｌ、ＩＭりん酸緩衝
液（ｐＨ６，０）　５０ｍｌ／ｌを含んだ液体培地１０
０　ｍｌを５００πを容坂ロコルヘンに入れ、殺菌した
。この培地に第１表に示す糸状菌の各菌株をそれぞれ１
白金耳ずつ接種し、２８°Ｃで４日間振盪培養した。得
られた培養液より菌体を分離採取し、脱塩水で２回洗浄
後、ＩＭりん酸緩衝液（ｐＨ６，０）　８０ｙｎｌに懸
濁し、ポモゲナイザーで毎分１０，０００回転、５分間
処理し、菌体懸濁液とした。

上記菌体懸濁液８　ｍｌを２０　ｍＭ　１．２．４−ト
リアゾール−３−カルボキサミド、８０ｍＭ５’−ウリ
ジル酸および２５　ｍＭりん酸−カリウムを含む水溶液
（ｐＨ７，０）　１ｍｌに加え、４５°Ｃて２４時間反
応した。反応終了後、菌体を分離し、上澄液を分析した
ところリバビリンの生成率は第１表に示すとおりてあっ
た。同様に５′−ウリジル酸に代えて２５　ｍＭイノシ
ンを用い６０°Ｃて２４時間反応を行った結果も第１表
に示す。なお、表中において、５′−ウリツル酸をＵＭ
Ｐ、イノシンをＩｃ、と略称する。以下の実施例におけ
る表中においても同様とする。

第１表 実施例　２ 酵素源として使用される放射菌の菌株の種類によって下
記の液体培地から使用培地を選択し、各液体培地１０　
ａｔを振盪用試験管に入れ、殺菌した。

この培地に、第２表に示す放射菌の各菌株をそれぞれ接
種し、２８°Ｃで２日間振盪培養した。得られた培養液
より菌体を分離し、水１　ｍｌに懸濁させ、菌体懸濁液
とした。

孕 各懸濁を用いて、実施例１と同様にして５′−ウリジル
酸（８０ｍＭ）、イｚシン（２５ｍＭ）またはウリジン
（２０ｍＭ　）をリホース供与体とし、ウリジル酸また
はウリジンを使用する場合は４５０Ｃ、イノシンを使用
する場合は６０°Ｃで３日間反応させ、反応終了後、菌
体を分離し、上澄液を分析したところリバビリンの生成
率は第２表に示したとおりであった。なお、表中におい
て、ウリジンはＵＳ　と略称する。蝋瞭・東ｌｌ―・・
・・・冑−・Φ・―また、各培地の培地組成は次のとお
りである。

酵母エキス４ｇ／４、麦芽エキス１０Ｑ／ｌ、グルコー
ス４ｇ／召、Ｉ）Ｈ７，８ 〔培地　Ｂ〕 酵母エキスＩＱ／ｌ、肉エキスＩＱ／ｌ、カセイン加水
分解物２ｇ／４、グルコース１０　ｇ／４１）Ｈ７，８ 〔培地　Ｃ〕 酵母エキス１’；ｉ／ｌ、肉エキス１９／ｌ、カセイン
加水分解物２９　／　ｅ　、マルトース１０ｇ／β、１
）Ｈ７，８ 〔培地　Ｄ〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ムコール属、ペニシリウム属、フｆｌＪ’７ムＪＦＫ、
   アスペルギルス属、ゲオトリクム属、ステムフィリウム
   属、リゾープス属、トリコロマ属、・・・・１・・・ｌ
   ＩＩ−・・＠１＃＠１ｌｌ１１・・・・・燗ゆグリオク
   ランラム属、アクチノプラネス属、ミクロ七ノスボラ属
   、ノカルディア属、ストレブトヴエルチンリウム属、ス
   トレプトスボランギウム属、サーモアクチノマイセス属
   またはストレプトマイセス属に属し、一般式〔Ｉ〕 １ 〔式中、Ｒはアミノ基、アルコキシル基またはヒドロキ
   シル基を示す。〕′て表わされるトリアゾール化合物と
   リボース供与体とから一般式〔■〕○ ］１ 〔式中、Ｒは前記と同意義である。〕で表わされるトリ
   アゾールヌクレオシドを生成する能力を有する微生物の
   作用により、前記一般式〔Ｉ〕で表わされるトリアゾー
   ル化合物またはその塩とりホース供与体とを水性媒体中
   で反応させて前記一般式ＣＩＩ、ｌて表わされるトリア
   ゾールヌクレオシドを生成させ、これを取得することを
   特徴とするトリアゾールヌクレオシドの製造法。