JPS60133896A - リバビリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ　）の酵素
的な製造法に関するものである。

リバビリンの化学名は１−β−Ｄ−リゼフラノシ／ｌ／
−１，２，４−）リアゾール−３−カルデキサミドであ
り、バイラゾール（Ｖｉｒａｚｏｌｅ　）とも称され、
ＤＮＡおよびＲＮＡウィルスに対して広範囲で強力な抗
ウィルス作用を示す化合物として知られている（アナル
ズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・ザイ
エンシズ（Ａｎｎ　、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＡｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、）　２８４．２７２〜２９２（１９７７）　）。

従来技術 従来知られているリバビリンの製造法としては合成法、
発酵法および酵素法がある。

合成法の代表的な方法としては、３−メトキシカルボニ
ル−１，２，４−１リアゾールと１−〇−アセチルー２
，３．５−）ソー０−アノルーβ−Ｄ−リゲフラノース
を反応させ（浴融法）、得られた１　−（２’、　３’
−５’−トリー〇−アシルーβ−Ｄ−リゼフラノシル）
−３−メトキシカルボニル−１’　、　２　、４−　）
リアゾールをアンモニアで処理し、アミド化と脱保護を
行う方法（特開昭４８−４４６９号、特開昭４９−８０
０７０号、特開昭４９−８００７１号各公報参照）、前
記と同様の方法においてトリアゾールの３位の置換基と
してアラルキルオキシ基を用いる方法（特開昭５５−１
６０７９３号公報参照）、３−メトキシカル、］］？ニ
ルー１．２．４−トリアゾーをトリメチルシリル化し、
２，３゜５−トリー〇−ベンゾイル〜β−Ｄ−リゼフラ
ノシＦのハロゲン化物と反応させた（シリル化法）後、
アンモニアで処理する方法（特開昭４８−４４６９号、
特開昭４９−８６３７２号各公報参照）などが知られて
いる。このような合成法は、いずれも反応前に原料化合
物の活性基を保獲する必要があり、また反応に際しては
ＩＪ　ｄ−スの活性化が必要であったり、高温に加熱す
る必要がある場合もあり、さらに、反応後に脱保護およ
びアミド化が必要であるなど反応操作か煩雑であるなど
の問題がある。また、縮合反応の位置選択性はいずれも
高くない。

発酵法としては、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
リウム属、アースロパクター属、ミクロコツカス属また
はバチルス属に属する微生物を培養して増殖させる際に
、使用微生物の培養のために必要な炭緊源、窒素源、無
機物、その他の栄養物を含有する培地に、培養開始前ま
たは培養中、一時にまたは間歇的に１　、２　、４−　
ト！Ｊアゾールー３−カＡ／ボキサミドを添加し、培養
開始後２〜８日間という長期間にわたって培養し、培地
中にリバビリンを生成蓄積せしめる方法が知られている
（特公昭５４−１７８３０号公報、日本農芸化学会誌、
皇（９）、４２３〜４３０（１９７６）参照）。この方
法は、しかしながら、次のような欠点を有するものと思
われる。すなわち、■リバビリンの製造は微生物の増殖
中に栄養培地中で行われるので、まず微生物を増殖させ
るために各種の栄養源を含有する培地を調製しなければ
ならず、種菌を植菌する前にこれらの培地を殺菌しなけ
ればならないなど前処理が煩雑である。■リバビリンの
蓄積を目的とする、微生物の増殖を伴う培養は、通常２
０〜４０’Ｃの常温で行われるので、常に雑菌汚染への
配慮が必要であるばかりではな（、このような条件下で
はリバビリン分解活性も存在しているので、生成したり
バビリンも分解され、目的物の収斂が低下する。■培養
を２〜８日間という長期間にわたって行わなければなら
ない。■も釉のヌクレオシド、リバビリンのりん酸化物
、その他の代謝産物が副生じ、培養液からりパピリンを
回収するためには、原料化合物だゆでなく、各種の副生
物とも分離しなげればならず単離精製が煩雑である。■
微生物をリバビリンの製造の反に培養しなければならな
（ゝ。

また、酵素的な製造法としては１，２．４−）リアゾー
ル−３−カルゼキサミドとりゼースー１−りん酸とをｐ
Ｈ５〜９、温度０〜５０℃の条件下でヌクレオシドホス
ホリラーゼの存在下において反応させる方法が知られて
いる（特開昭５０−２９７２０号公報参照）。この方法
も、■リセース供与体として用いられるリセース−１−
りん酸が不安定である上に、入手が容易でない■酵素と
して精製酵素が用いられており、酵素の調製が容易でな
いなどの欠点を有するものと思われる。

発明の概要 要旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌体処理物
を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に酵素反応によっ
てリバビリンを生成させることができることを初めて知
見し、この知見に基づい１本発明を完成した。

すなわち本発明は、１，２．４−１Ｊアゾール−３−カ
ルボキサミドまたはその塩とリボース供与体とをブレビ
バクテリウム・アセチリカムの酵素作用下に該微生物の
非増殖条件下において水性媒体中で反応させてリバビリ
ンを生成させることを特徴とするりパビリンの製造法を
提供するものである。

本発明で「酵素作用下に」ということは、使用微生物の
培養物、菌体または菌体処理物の存在下にということを
意味する。

本発明方法と、従来の発酵法とが最も相違する点は、本
発明においては微生物の培養物、菌体または菌体処理物
を酵素剤とし、しかも微生物が増殖しない、酵素反応に
最適な条件下で反応基質である１、２．４−）リアゾー
ル−３−カルボキサミドまたはその塩とリボース供与体
とを反応させる点である。

効果 本発明方法は、発酵法に比べて、■微生物の非増殖条件
、たとえば高温条件下で反応を行う場合には雑菌汚染が
ほとんどな（、リノ々ビリンの分解反応が抑制されるの
でリバビリンの収率低下がない、■酵素反応なので反応
時間が短か（、副生物の生成も少なく、リバビリンの単
離精製が容易である、■酵素源の反復使用も、連続使用
も、連続使用も可能である、■酵素源の保存が可能であ
り、酵素源の調製および使用を任意な時期に行うことが
できるなどの利点がある。また、酵素法に比べて■酵素
源の調製が容易である、■リボース供与体をヌクレオシ
ド、ヌクレオチＰなどから広く選択でき、リボース供与
体の入手が容易であるなどの利点がある。また、本発明
方法の最適の酵素源を選択すれば、従来のこれらの方法
に比べてはるかに尚収率にリバビリンを製造することが
できる。

３、発明の詳細な説明 酵素源／使用微生物 本発明において使用される微生物は、その培養物、菌体
また禮菌体処理物が、１，２．４−１１アゾール−３−
カルボキサミドとリボース供与体との反応を触媒して、
リバビリンを生成する酵素系を含有するものであり、具
体的にはブレビバクテリウム−アセチリカム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙ−１ｉｃｕｍ）　に
属する微生物である。

前記の酵素活性の強い代表的菌株の一つとして、兵庫県
西宮市の甲子園球場の砂より分離されたＡＴ−６−７株
を挙げることができる。この菌株の菌学的性質を以下に
記載する。

Ａ、形態 （１）細胞の形態および大きさ：短稈状、０８〜１．０
　Ｘ　１．０〜１．２　ｔｔｍ （２）胞子の形成：なし く３）ダラム染色性：陽性 Ｂ、各種培地におり°る生育状態 （１）肉汁液体培養（２８℃、４８時間）■集落の形状
：円形（Ｃ４ｒｃｕｌａｒ　）■集落表面の隆起：扁平
状（Ｆｌａｔ　）、平滑（Ｓｍｏｏｔｈ　） ■大きさ＝２〜４ｍｍ ■色：Ｊ＠：黄色ないし桃黄色 （２）肉汁寒天斜面培養（２８℃、４８時間）■生育：
良好 ■生育の形・症状（Ｅｃｈｉｎｕｌａｔｅ　）（３）肉
汁液体培養（２８℃、４８時間）生育：表面に閉環（Ｒ
ｉｎｇ）を形成し、やや沈渣（Ｓｅｄｉｍｅｎｔ　）を
生じる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２ｔＪ’Ｃ１６日間）・
層状（Ｓｔｒａｉｔｉｆｏｒｍ　）に液化する。

（５）リドマスミルク培地（２８℃、４日間）：わずか
に凝固し、ペゾトン化も見られる。

Ｃ１生理的性賀 （１）硝酸塩の還元（２８℃、５日間）：還元性なし。

（２）硫化水素の生成（２８℃、５日間）：生成しな（
１゜ （３）殿粉の加水分解；分解性あり。

（４）カタラーゼ：陽性 （５）インドールの生成・生成しない。

（６）ペプトンおよびアルギニンからのアンモニアの生
成：隘性 （７）メチルレッドテスト：陰性 （８）Ｖ−Ｆｌテスト：陽性 （９）酸素に対する態度：好気的 （１０）０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法に
よる）：Ｆ型（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ　） （月）糖類からの酸の生成 陽性°グルコース、マンノース、フラクトース、マルト
ース、サッカロース、 トレハロース 陰性：アラビノース、キシロース、カラクトース、ラク
トース、ソルビット、 イノジット、グリセリン （１２）生育ｐＨ範囲：　ｐＨ６，０〜９．０（１３）
生育最適温度＝２！５〜３７℃以上の菌学的性質を、パ
ージニーズ・マニュアル・オブ・デイタミネーテイブ・
バクテリオロジ−（＆ｒｅｙ’ｓ　庵ｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ　）第７版（１９５７年）の分類基準により検索した
。

その結果、ＡＴ〜６−７株はほとんど球菌に近い短桿菌
で、ダラム陽性であり、フィラメントを形成せず、炭水
化物より酸を生成することよりブレビバクテリウム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｌｕｍ　）属に属する菌株と同定
し、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ　）　Ａ　Ｔ
　−６−７と命名した。

なお、ＡＴ−６−７株の同定帰属はパージニーズ・マニ
ュアル・オブ・ディクミネーティブ・バクテリオロジー
第７版によるものであり、分類基準の変更などにより、
異なる分類基準によってこの菌株の同定帰属が行われた
場合には、他種あるいは他属に属することもあり得るが
、本発明において上記のごとく命名された微生物は、寄
託機関への寄託および前記の菌学的性質に基づいて、一
義的に特定され得るものである。

この菌株につぃ℃、昭和５６年通商産業省告示第１７８
号に従つ℃工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄
託申請を行い、昭和５７年１月１３日付けで受託され、
受託番号として微工研菌寄第６３０５号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−６３０５）が付与されている。

また、前記の菌株から、紫外線、ｘｓ、γ線の照射など
の物理的処理もしくはニトロソグアニジンなどによる薬
剤処理など、一般的変異誘導法による誘発突然変異また
は自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導され
た変異株も、本発明の目的とするリバビリン製造に関与
する酵素活性を失なわない限り、本発明に使用される。

さらに、以上のような本発明に好適に使用される菌株か
ら得られた本発明の目的とするリバビリン製造に関与す
る酵素系の遺伝子がブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、アースロパクター属、ミクロコツカス属ま
たはバチルス属以外の微生物に取り込まれてそのような
形質が発現するに至った場合、このような微生物の培養
物、培養菌体またはその処理物を本発明の目的に使用す
る方法は、本発明に包含される。

酵素源の調製／培養 本発明に使用する酵素源を調製するために、これらの微
生物を培養するに際しては、使用される培地および培養
法は、これらの微生物が生育する限り、特に限定されな
い。

培地としてはこれらの微生物か資化可能な炭素源および
窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、微量発育
促進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。具
体的には、炭素源としては、グルコース、フラクトース
、マルトース、カラクトース、リゼース、サッカロース
、殿粉、殿粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もし
くはその脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、鎌、米など
の天然炭水化物、グリセロール、マンニトール、メタノ
ール、エタノールなどのアルコール類、グルコン酸、ピ
ルビン酸、酢酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパ
ラフィン、ケロシンなどの炭化水素類、グリシン、グル
タミン酸、グルタミン、アラニン、アスパラギンなとの
アミノ酸類など、一般的な炭素源より使用する微生物の
資化性を考慮して一種または二種以上を適宜に選択し℃
使用すれはよい。窒素源としては、肉エキス、ペノトン
、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
イーシリカ−、コツトンシードミールないしその加水分
解物、フィツシュミールないしその加水分解物、その他
の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合
物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸
ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など無機窒素化合物より
使用微生物の資化性を考慮し、一種または二種以上を適
宜に選択して使用する。さらに、無機塩として微量のマ
グネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カ
ルシウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩、
炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種または二種以上を適
宜添加し、必要に応じて植物油、界面活性剤などの消泡
剤、ビタミンＢ１、Ｂ２、ニコチン酸、ノ伎トテン酸、
ビオチン、ｐ−アミノ安息香酸などの微量発育促進物質
を添加してもよい。また、栄養俄求を同時に示す微生物
を使用する場合、当然その生育を満足させる物質を培地
に添加しなければならな（・。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養
、通気攪拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培養
法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいが、通常は培養開始のｐＨを約６〜８に調
整し、約２５〜３５°Ｃの温度条件下で培養を行う。培
養期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく、
通常１〜３日間である。

酵素源の態様 不発明方法において使用される酵素源は、１゜２．４−
１−リアゾール−３−カルボキサミドとリボース供与体
とからリバビリンを生成する反応を触媒する酵素系を含
有するものである。

本発明方法における酵素反応の王たる必須酵素はヌクレ
オシドホスホリラーゼであり、本発明に使用する酵素源
としては本酵素活性を有することが必須である。さらに
リボース供与体として本酵素の直接の基質とならないも
のを使用する態様におい℃は、す前−ス供与体から基質
に導（酵素系の活性を富有するものであることが好まし
い。

以上のように微生物を培養した後、得られた培養物、培
養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離などの通常の方
法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処理
を施して得られる菌体処理物を本発明における酵素源と
して使用できる。ここで、培養物とは培養後の培地と培
養菌体が未分離の状態のものをいう。また、菌体処理物
とは、乾燥菌体、細胞膜および／または葉質性菌体、破
砕菌体、固定化菌体、菌体抽出物、本発明の目的とする
リバビリンの製造に関与する酵素活性を有する菌体抽出
物の蛋白質画分もしくはその精製物、蛋白質画分もしく
はその精製物の固定化物などを相称する。

菌体処理物を得るための方法を以下に例示する。

すなわち、■生菌体に対し、たとえば凍結融解処理、凍
結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸性な
いしアルカリ性下における加温処理、磨砕処理、超音波
処理、浸透圧差処理などの物理的処理手段、もしくはた
とえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、
トルエン、キシレン、ブーｆ−／Ｌ／アルコール（ブタ
ノール）などの溶媒もしくは界面活性剤との接触処理な
どの化学的ないし生物化学的処理を単独もしくは組み合
せて施すことにより、また、■菌体抽出物に対し、たと
えば塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、各
種クロマトグラフ処理、透析処理などの酵素分離精製手
段を単独もしくは組み合せて施すことにより、さらに、
■生菌体、菌体抽出物もしくはその精製物に包括処理、
架橋処理、担体への吸着処理フ（どの酵素固定化手段を
施すことにより菌体処理物を得ることができる。

反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は１，２゜４−トリ
アゾール−３−カルボキサミドおよびリボース供与体で
ある。

１．２．４−）リアゾール−３−カルボキサミドは遊離
型またはナトリウム塩などの塩のいずれも使用できる。

リボース供与体としてはり？ヌクレオシドもしくはＤ−
リボースまたはこれらの各種りん酸エステルのいずれで
もよい。すなわち、リセヌクレオシトはその塩基部分が
プリン系またはピリミジン系のいかなる塩基であっても
よく、天然物由来であれ化学合成によるものであれ使用
することができる。また、す前ヌクレオシドもしくはＤ
−リボースの糖部水酸基は非置換のものであってもある
いは２位、３位もしくは５位水酸基のいずれが一個所、
二個所もしくは全てにモノりん酸エステル残基、ジりん
酸エステル残基、トリりん酸エステル残基含有するもの
であってもよい。また、これらのりん酸エステルは遊離
型であってもよ（、またナトリウム、カリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、アンモニウム、トリエチルアンモ
ニウムなどの一般的なアルカリ塩であってもよい。リボ
ース供与体の具体例としてはイノシン、アデノシン、グ
アノシン、キサントシン、ウリジン、シチジンなどのり
前ヌクレオシド、５’−イノ’／７酸、５’−アデニル
酸、５′−グアニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウ
リジル酸、５′−シチジル酸、２’　（３’）−イノシ
ン酸、２’（３’）−アデニル酸、２’（３’）−グア
ニル酸、２’（３’）−キサンチル酸、２’（３’）−
ウリジル酸、２／（３／）−シチジル酸などのりゼヌク
レオチド、Ｄ−リボース、Ｄ−リボース−１−りん酸な
どが例示される。

反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基本的には
前記の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性
液である。

水性液中には前記の反応基質のほかに、必要に応じてり
ん酸イオン供与体、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類補
酵素類、酸、塩基、糖類なと酵素反応を促進する物質、
反応基質の溶解性を向上させる物質、酵素と反応基質の
接触を向上させる物質等を含有していてもよい。

水性媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩衝
液（りん酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ペロナ
ール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）を用いる
ことができる。

本発明の酵素反応は主にヌクレオシドホスホリラーゼの
作用に基づくものであり、それ故反応系にりん酸イオン
の存在が必要である。酵素反応系にりん酸イオンが存在
しない場合は、りん酸イオン供与体の添加が必要である
。

りん酸イオン供与体としては、水性媒体中でりん酸イオ
ンに解離しうるもののいずれを用いてもよく、たとえば
遊離型りん酸そのもの、無機りん酸塩、たとえばナトリ
ウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグ
ネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩
が好適に使用される。また、りん酸イオン供与体として
は、酵素反応液中でりん酸イオンを遊離しうる系、たと
えばリボース供与体のりゼヌタレオチドとホスファター
ゼの組み合せ、同じ（ヌクレオチドとヌクレオチダーゼ
の組み合せなどを利用することができる。このよ５な系
における反応に関与する酵素は、本発明に使用される酵
素源に混在するものであってもよ（、別途添加された酵
素、またはその酵素活性を有する菌体もしくは菌体処理
物等であってもよい。以上のようなりん酸供与糸は、酸
素反応に際して系外から添加されたものでも、酵素源が
その成分として含有しているものであってもよい。すな
わち、酵素反応に利用しうる形態である限り、上記の物
質の単独もしくは二種以上を組合せた系を、または上記
の物質を含有する微生物菌体もしくはその菌体処理物を
、本発明の酵素反応に際して反応液に別途添加してもよ
（、あるいは使用微生物が菌体成分として含有している
これらの物質をその′ｆ、ま利用してもよい。

有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタノール、
プロパツール、シタノール、ペンタノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒ
Ｐロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメ
チルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、２−メトキ
シエタノール、２−エトキシエタノール、１，２−ジメ
トキシエタンなどが例示される。

接触方法 不発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを水性媒体
中で微生物の非増殖条件下において接触させることによ
１；１４ｇされる。

接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択すればよ
い力へ通常、酵素源を反応基質溶液に懸濁もしくは溶解
し、好ましくは加温しながら攪拌もしくは振盪するパン
チ方式、または酵素源を必要に応じて適当な担体、助剤
、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラム
に充填し、反応基質溶液を通液するカラム方式などが適
用される。

反応基質および酵素源の濃度もしくは添加量反応に際し
、反応液の基質濃度は特に制限されるものではなく、反
応温度における使用水性媒体に対する基質の飽和濃度以
下の基質濃度が通常採用されるが、反応基質溶液に添加
された前記の有機溶媒、界面活性剤などにより基質濃度
を増大させることもできる。また、反応液中に飽和濃度
以上の基質を懸濁状態で存在させ、反応の進行に従って
各基質を溶解させることもできる。また、基質を反応中
に逐次添加して、その濃度を適当レスルに保つこともで
きる。基質を溶解させる場合、基質濃度は１，２．４４
リアゾール−３−カルゼキサミドまたはその塩について
は通常５〜２００鯛程度、好ましくは１０〜１００　ｍ
Ｍ程度である。リゼース供与体については、これを別途
添加する場合は通常５〜３００　ｍＭ程度、好ましくは
１０〜１５０鯛程度である。

酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形態、反応効
率、経済性などを考慮し、当業者が予備実験等によって
容易に決定できるものであるが、通常パンチ方式の場合
、たとえば生（湿）菌体であれば１０〜１５０　ｍｇ／
ｍ１基質溶液程度、乾燥菌体であれば２〜３０ｍｇ／／
ｍ１基質浴液程度であればよ（、カラム方式においては
パッチ方式に準じて適当な量を設定することができる。

反応条件 本発明の反応の条件は、菌体等を非増殖条件下、すなわ
ち休止もしくは死滅菌体の状態で反応に供すること以外
は特に限定されない。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物が増殖できない温度範囲（ただ
し、本発明の反応に関与する酵素が失活しない温度範囲
である。）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかじ
め前記のとおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理
することによって微生物を増殖できない状態にした後、
反応に供する方法、反応に際して、たとえばトルエンな
どの使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に
添加する方法などを単独にあるいは組み合せて採用すれ
ばよいが、特に反応温度を操作する方法が最も効果的で
簡便である。

本発明の反応において反応温度は上記のとおり重要な条
件であり、本発明を特徴づけるものである。反応は３７
〜８０℃の範囲において進行するが、実用性を考慮すれ
ば４０〜７０°Ｃの範囲が好ましい。

なお、最適の温度条件は反応基質の種類によって異るが
、当業者であれば予備実験などにより容易に決定するこ
とができる。

４０℃以上の温度範囲で酵素反応を行うことにより使用
微生物の生育は大部分抑制される。・たとえは、後記実
施例１と同一の微生物の生菌体を使用し、２８〜６０℃
の各所定温良でそれぞれ実施例１と同様に反応させたと
きの１．２．４−）リアゾール−３−カルゼキサミドか
らのリバビリンの生成率（チ）と反応後の使用微生物の
生存率（％）との関係を示すと下記第１表のとおりであ
る。なお、微生物の生存率は反応開始前の微生物の生菌
数／ｍｌ　に対する反応後の生菌数／　ｍ　ｌ　の百分
率である。

第１表 以上のとおり、本反応は使用微生物の非増殖条件下、す
なわち、大部分の微生物が休止もしくは死滅する条件下
で行われなければならない。

さらに、本発明において反応温度を前記の範囲に設定す
ることにより、酵素反応速度を増大させるだけでなく、
生成したリバビリンの分解反応を抑制することが実験に
より確認された。−例として、実施例１と同一の微生物
の生菌体の懸濁液１ｍｌを２０ｍ１ｉｉリノゝビリン浴
液１ｍｌ　に加えて２８〜６０℃の各所定温度でか時間
インキュベートしたときのりパビリンの残存率（Ｌｆｂ
）を第２表に示す。

以上の結果からも３７°Ｃ以上の反応温度か好適である
ことが確認できる。

反応基質溶液の液性は、通常ｐＨ４〜１Ｏ１好ましくは
ｐＨ６〜８の範囲に保たれればよく、反応中にｐＨが変
動するときは、塩酸、硫酸、りん酸などの酸または水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモ
ニアガスなどのアルカリを用いて好ましいｐｉ（範囲に
補正すればよい。

反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確認しなが
ら決定すればよいが、通常パッチ方式では２〜４５時間
程度、好ましくは２４〜３６時間程度反応させればよく
、カラム方式ではパッチ方式に準じて適当な条件を設定
して反応させればよい。

分離精製 反応後、必要に応じて菌体等を濾過、遠心分離または凝
集分離などの常法によって分離除去し、リバビリンの分
離精製工程に供する。

リバビリンの分離積装は、公知の方法またはこれを応用
して行えばよく、たとえばイオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー
、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配
、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、
冷却、有機溶媒添加など俗解度の差を利用する方法など
の一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。

分析 本発明の実施例等において＋）ｄビリンおよび１゜２．
４−）１Ｊ７：、／”−ルー３−カルデキサミドの分析
は高速液体クロマトグラフィーによって行った。

以下に示す装置および条件で分析すると、リノ々ビリン
は保持時間３．５０分付近に、１，２．４−）リアゾー
ル−３−カルデキサミドは保持時間２．６５分付近に溶
出され、検量線よりそれぞれの量を算出できる。

装置：高滓高速液体りロマトグラフＬＣ−３Ａ氾（■島
津製作所製→ カラム：マイクロ・ゼンダノにツク（μＢＯＮＤＡＰＡ
Ｋ　）Ｃ１８，４，６ｍｍ　Ｘ　２５０ｍｍ （日本ウォーターズリミテッド社製） 溶出剤＝２％アセトニトリルを含む２０ｍＭ）！Ｊスス
−酸緩衝液（ｐＨ７，５） 流速：　１　ｍｌ　７分 測定波長：　２２５　ｎｍ カラム操作温匿：室温 実　験　例 以下、実験例をもって本発明をより具体的に説明するが
、これらはいずれも実施の一態様を示すものであって、
本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ ブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴ−６−７を粉末
ブイヨン（極東製薬工業■製）２％水溶液５リツトルに
植菌し、２８’Ｃ１２４時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離によって集菌し、洗滌後、殺菌水
を加えて２５０　ｍｌ　の菌体懸濁液を得た。

６６．７ｍＭ１　、２　、４−　）リアゾール−３−カ
ルデキサミド、６６．７　ｍＭイノシンおよび１００　
ｍＭ　りん酸−カリウムを含む水溶液（ｐＨ７，０）　
７５０　ｍｌに前記菌体懸濁液２５０　ｍｌ　を加え、
６０℃で調時間反応させた（リバビリン生成率７４．８
８　％　）。

反応液を遠心分離して菌体を除去した後、カチオン交換
樹脂（Ｗ′型）を通過させ、この通過水洗液を活性炭に
吸着させた。活性炭カラムよりエタノール−アンモニア
溶液でリバビリンを溶出し、溶出液のエタノールを除去
した後、アニオン交換樹脂を通過させ、通過水洗液を減
圧濃縮して５０ｍｌとし、冷却した。冷却後、析出した
結晶を分離し、乾燥してリバビリンの結晶６．５ｇを得
た。

比較例 実施例１と同一の菌株を使用し、特公昭５４−１７８３
０号公報の実施例１と同様の方法で微生物の増殖中に原
料トリアゾール化合物を添加してリバビリンの製造を試
みた。すなわち、前記菌株をグルコース１３０ｇ、りん
酸−カリウムＩｇｓ　りん酸二カリウム３ｇ、ｋｍマグ
ネシウム１ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、硫酸鉄１０ｍ
ｇ、硫酸亜鉛５ｍｇ、硫酸マンガン１．０ｍｇ、ビタミ
ンＢ１５　ｍｇ、ノξントテン酸カルシウム］Ｏｍｇ、
シスチンＺＪｍｇ、ビオチン（２）μｇ１肉エキス１０
ｇ、ａ酸アンモニウム２ｇおよび尿素２ｇ（別殺菌）を
１リツトル中に含有する組成で、ｐＨ７，６に調整した
培地１０ｍ１　に植菌し、１２時間毎にアンモニア水で
ｐＨ７，２に調整しつつ路℃で振盪培養した。培養開始
Ｕ時間後に１．２．４−）リアゾール−３−カルボキサ
ミドを２　ｍｇ／ｆｎｌ濃度で添加し、さらに４日間培
養した。

培養液を遠心分離した後、上澄液を分析したが、リバビ
リンの生成は全く認められなかった。

実施例２ 実施例１と同一の菌株を実施例１と同様に培養しくただ
し、培養液は各１０ｍ１　とした。）、培養後、遠心分
離によって集菌し、各１ｍｌ　の殺菌水を加えて菌体懸
濁液を得た。

この菌体懸濁液に２０ｍＭ１，２．４　）リアゾール−
３−カルボキサミド、２１ＪｍＭの第３表に示す各種リ
ボース供与体および２５ｍＭりん酸−カリウムを含む水
溶液（ｐＨ７，０）各１ｍｌを添加し、６０”Ｃで冴時
間反応させた。反応終了後、遠心分離によって除菌し、
上澄液を分析したところ、リバビリンの生成率は第３表
に示すとおりであった。

なお、リバビリン生成率とは、１，２．４−）リアゾー
ル−３−カルボキサミＦからりパビリンへの転換率（＠
をいう。

第３表 実施例３ ２チ粉末ブイヨン培地各１００　ｍｌ　に実施例１と同
一の菌株を植菌し、公℃、２２時間振盪培養し、培養菌
体を得、次いで以下の処理を行って、菌体処理物懸濁液
を得た。

１）アセトン乾燥菌体：生菌体に５０ｍ１　のアセトン
を加え、１５分間放置し、遠心分離して得た菌体にさら
に５０　ｍ　ｌのアセトンを加え、同様の処理を行った
後、真空乾燥して乾燥菌体を得た。

これに水を加えて菌体処理物懸濁液１０ｍ１　を得た。

２）凍結融解菌体・生菌体を一８ｏ　’ｃで一晩凍結後
、解凍し、水を加えて菌体処理物懸濁液１０　ｍ　ｌを
得た。

３）浸透圧差処理菌体：生菌体に１００　ｍｌ　の飽和
食塩水を加え、−晩水冷後、遠心分離によって上澄液を
捨て、分離菌体に水を加えて菌体処理物懸濁液１０ｍ１
　を得た。

４）超音波処理菌体：生菌体に水を加えて１０ｍ１とし
、出力電圧１，６ＫＶで２０分間超音波処理を行った。

以上の菌体処理物懸濁液各１０　ｍ　ｌおよび実施例１
と同様にして得た無処理菌体懸濁液１０　ｍ　ｌに加ｍ
Ｍ　１　、２　、４−　）リアゾール−３−カルボキサ
ミｌ’、２０ｍＭイノシンおよび２５ｍＭりん酸−カリ
ラムを含む反応基質溶液（ｐＩ（７，０）各１０ｍ１　
を加え、６０℃、別時間反応後、リバビリンの生成率を
分析したところ第４表に示すとおりであった。

実施例４ ２％ブイヨン培地２５　ｍ　ｌ　に実施例１と同一の菌
株を植菌し、羽℃、勢時間振盪培養し、培養後、集菌し
、水を加えて各２．５ｍｌ　の菌体懸濁液を調製した。

これに実施例３と同じ反応基質溶液各２．５ｍｌを加え
、２８〜７０℃の各温度（第５表）で加時間反応後、リ
バビリンの生成率を分析したところ第５表に示すとおり
であった。

第５表 実施例５ 実施例１と同一の菌株を使用し、実施例４と同様に調製
した菌体懸濁液％２．５ｍｌ　に以下の反応基質溶液（
Ａ）または（Ｂ）各２．５ｍｌ　を加え、６０℃、加時
間反応後、リバビリンの生成率を分析したところ第６表
に示すとおりであった。

反応基質溶液（Ａ）：２ＤｍＭ　１　、２　、４−トリ
アゾール−３−カルゼキサミドおよび２ｆ）　ｍ　Ｍイ
ノフッ反応基質溶液（Ｂト上記反応基質溶液（Ａ）と四
黛の各基質に２５ｍＭりん酸−カリウムを加える。

実施例６ 実施例５と同じ菌体懸濁液２．５ｍｌに実施例５の反応
基質溶液（Ｂ）２．５ｍｌを加え、６０　’Ｃで２０時
間反応後、菌体を分離した。この分離菌体に水］、Ｏｍ
ｌを加えて次回の反応に使用し、上記と同様の反応を１
０回繰り返した。第１回のリバビリン生成率を１００と
したときの各回の反応の相対生成率を第７第７表 実施例７ ２％ブイヨン培地１リツトルに実施例１と同一の菌株を
植菌し、（資）℃、２２時間撮盪培養した後、遠心分離
によって生菌体を得た。

この生菌体にＡ液［１Ｎ−塩酸２４ｍ１　、）リス３．
４２５　ｇ、ＴＥＭＥＤ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−テト
ラメチレンジアミン）０゜２３　ｍｌを溶解して水で１
００　ｍｌに希釈した水溶液）２０ｍｌ　、　Ｂ液〔ア
クリルアミド３０ｇ、ＢＩＳ（Ｎ、Ｎ−メチレンビス（
アクリルアミド）　）　０．８　ｇを水に溶解して１０
０　ｍｌ　とした水泗液１２Ｌ）　ｍ　ｌ　およびＣ淋
ｒ禍硫酔アンモニウム０．３ｇを水に溶解して２００　
ｍｌ　とした水溶液〕４０ｍ１　を加えて放置し、菌体
を固定化した。固定化後ホモジナイザーで細片化し、１
．８０ｍ１　の固定化菌体を得た。

この固定化菌体１０ｍ１　に２０ｍＭ１，２．４−トリ
アゾール−３−カルボキサミド、２１Ｊｍｌ　イノシン
および２５ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶液２０ｍ
１　（ｐＨ７，０）を加え、６０℃、Ｕ時間反応し、反
応液を分析したところ６２．８９　％のリバビリンが生
成していた。なお、生菌体を使用して同一条件で反応を
行ったところりパビリンの生成率は６５．４４係であっ
た。

実施例８ ブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴ−６−同一条件
で培養し、同一条件で酵素反応に供して、リバビリンの
生成量（生成率）を比較した。

すなわち、１．５％酵母エキス培地（ｐＨ７，０）各９
ｍｌに両菌株を植菌し、２８’Ｃで１日振盪培養した。

４０ｍＭ　１　、２　、４−）リアゾール−３−カルボ
キサミド、６０ｍＭ　５’−ウリジル酸二ナトリウムお
よび８ｍＭりん酸−カリウムを含有する溶液１０ｍ１に
前記培養液より遠心分離によって集菌した菌体を加え、
４５℃で加時間反応させた。

反応後、遠心分離によって肉体を除去し、反応液を関連
液体クロマトグラフィーによつ℃分析したところ、結果
は第８表に示す通りであった。

第８表 実施例９ ＡＴ−６−７株とＡＴＣＣ６８７１株とを実施例８と同
様に各１００　ｍｌ　培養し、遠心分離によって集菌し
て、菌体を得た。

この菌体を、４０ｍＭ１，２．４−）リアゾール−３−
カルボキサミド、６０ｍＭウリジンおよび開−りん酸−
カリウムを含有する溶液１００　ｍｌ　に加えて、４５
℃でか時間反応させた。

反応後、リバビリンの生成率を測定したところ、ＡＴ−
６−７株の場合は８６．０４％であり、ＡＴＣＣ６８７
１株の場合は２．：３０％であった。

実施例１Ｏ 実施例８と同様の方法で得たＡＴ−６−７株およびＡＴ
ＣＣ６８７１株のそれぞれの菌体（培養液かｍｌ　分）
を、４ｍＭ１，２．４　）リアゾール−３−カルボキサ
ミド、４ｍＭウリジンおよび５ｍＭりん酸−カリウムを
含有する浴液（基質溶液Ａ）ならびに４ｍＭ　１　、２
　、４−）リアゾール−３−カルボキサミド、４　ｍＭ
　５’−ウリジル酸二ナトリウムおよび１　ｍＭ　りん
酸−カリウムを含有する浴液（基質溶液Ｂ）のそれぞれ
に加えて、別時間反応させた。なお、反応はＡＴ−６−
７菌の場合は４５℃で、ＡＴＣＣ６８７１株の場合は６
０°Ｃで、行なつナー °反応後、リバビリンの生成率を測定したところ、第９
表に示すとおりであった。

第９表 実施例１１ 実施例８と同様の方法でＡＴ−６−７株とＡＴＣＣ６８
７１株を培養して得た菌体（培養液５ｍ１分）に水を加
えて菌体懸濁液０．５ｍｌを得た。

１７．８ｍＭ１　、２　、４−　）リアゾール−３−カ
ルボキサミド、８１．９　ｍ１Ｖｉウリジンおよび５８
．８　ｍＭりん酸−カリウムを含む溶液（ｐＨ７，０）
　０．５　ｍｌに上記菌体懸濁液０．５ｍｌ　を加えて
、ω℃で１０時間反応させた。

反応後、反応液中のリバビリンの生成量を測定１１、リ
パビリ７（７−）ａ−ｈｖ’＊＆質出＋　ｆ−３−ｒ：
Ｌ、ｍ１ｎ表に示す通りであった。

第１０表 実施例１２ 第１１表に示すブレビバクテリウム・アセチリカムの各
イ■菌株を実施例８と同様の方法で培養し、培養液を遠
心分離して、菌体（各培養液４ｍ１分）を得た。

４０ｍＭ１，２．４−）リアゾール−３−カルボキサミ
ド、６０ｍＭ　５’−ウリジル酸二ナトリウムおよび１
０ｍＭりん酸−カリウムを含有する％　故４　ｍｌに上
記も菌体を加え、４５℃で２２時間反応させ、反応後、
リバビリンの生成率を測定したところ、第１１表に示す
通りであった。

第１】表 実施例１３ リゼース供与体として（イ）ｍＭのイノシンを使用し、
反応温度を６０℃とするほかは実施例１２と同一の操作
を行って、第１２表の結果を得た。

第１２表 参考例 ＡＴ−６−７株およびＡＴＣＣ６８７１株のホスファタ
ーゼ活性を比較するために、各菌株の菌体懸濁液を５′
−ウリジル酸二ナトリウム溶液に加えて反応させ、ウリ
ジンへの転換率を測定した。なお、菌体懸濁液は実施例
８と同様に培養して得た菌体（培養液９ｍ１分）を水１
　ｍｌに懸濁させて調製し、基質溶液としては６　ｍＭ
　５’−ウリジル酸二ナトリ−ウムを含有する水溶液９
ｍｌ　を使用した。反応は４５℃で行ない、０．５〜２
４時間の各時間において転換率を測定（した。転換率の
測定は、高速液体クロマトグラフィーによって行なった
。結果は、第１３表に示す通りであった。

第１３表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．１，２．４−）リアゾール−３−カルデキサミドま
   たはその塩とリボース供与体とをブレビバクテリウム・
   アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔ
   ｙｌｉｃｕｍ　）の酵素作用下に該微生物の非増殖条件
   下において水性媒体中で反応させてリバビリンを生成さ
   せることを特徴とする、リバビリンの製造法。 ２、ブレビバクテリウム・アセチリカムが、ブレビバク
   テリウム・アセチリカムＡＴ−６−７（微工研凶蚕第６
   ３０５号）である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３酵素反応を微生物の非増殖条件下において行う方法が
   、反応液を微生物の増殖できない温度条件に保持して反
   応を行う方法、微生物菌体をあらかじめ該微生物が休止
   もしくは死滅する方法によって処理し、これを用いて反
   応を行う方法、および反応液に微生物の増殖を阻害する
   物質を添加して反応を行う方法からなる群より選ばれた
   一種の方法または二種以上を組み合せた方法である、特
   許請求の範囲第１〜２項のいずれか１項に記載のリバビ
   リンの製造法。 ４、微生物の非増殖条件が、３７〜７０’Ｃの温度条件
   である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれが１項に記
   載のリバビリンの製造法。