JPS58190396A - リバビリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１〕　発明の背景 技術分野 本発明はリバビリン（Ｒｉ　ｂａｖｉｒｉｎ）の酵素的
な製造法に関するものである。

リバビリンの化学名は１−β−Ｄ−リボフラノシルー１
．２．４−トリアゾール−８−カルボキサミドであり、
バイラゾール（ｙｉｒａｚｏｌｅ）とも称され、ＤＮＡ
およびＲＮＡウィルスｅこ対して広範囲で強力な抗ウィ
ルス作用を示す化合物として知られている（アナルズ・
オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ（ＡｎｎＮｅｗ　”ｆｏｒｋＡｃａｄＳｃｉ、）　
２８　％、　　２７２〜２９２　　（１９７７））。

従来技術 従来知られているリバビリンの製造法としては合成法と
微生物の培養による方法がある。

合成法の代表的な方法としては、３−メトキシカルボニ
ル−１，２，４−）リアゾールと１−０−アセチル−２
，８，５−トリー〇−アシルーβ−Ｄ−リボフラノース
を反応させ（溶融法）、得られた１　−（２’、　　８
’、　　５’　−）ジ−０−アシルーβ−Ｄ−リボフラ
ノンル）−８−メトキシカルボニル−１，２，４−トリ
アゾールをアンモニアで処理し、アミド化と脱保護を行
う方法（特開昭４８−４４６９号、特開昭４９−８００
７０号、特開昭４９−８００７１号各公報参照）、前記
と同様の方法においてトリアゾールの３位の置換基とし
てアラルキルオキシ基を用いる方法（特開昭５５−１６
０？’９８号公報参照）、３−メトキンカルボニル−１
，２，４−）リアゾールをトリメチルシリル化し、２．
３．５−）リーＯ−ベンゾイルーβ−Ｄ−リボフラノン
ドのハロゲン化物と反応方法（特開昭４８−４４６９号
、特開昭４９−８６３７２号各公報参照）などが知られ
ている。

このような合成法は、いずれも反応前に原料化合物の活
性基を保護する必要があり、また反応に際してはリボー
スの活性化が必要であったり、高温に加熱する必要があ
る場合もあり、さらに、反応後（こ脱保護およびアミド
化か必要であるなど反応操作が燗雑であるなどの問題が
ある。また、縮合反応の位置選択性はいずれも高くない
。

微生物の培養による方法としては、ブレビバクテリウム
属、コリネバクテリウム属、アースロバフタ−属、ミク
ロコツカス属またはバチルス属に属する微生物を培養し
て増殖させる際に、使用微生物の培養のために必要な炭
素源、窒素源、無機物、その他の栄養物を含有する培地
に、培養開始前または培養中、一時にまたは間歇的に１
，２゜４−トリアゾール−８−カルボキサミドを添加し
、法が知られている（特公昭５４−１７８８０号公報、
日本農芸化学会誌、５０　（９）、４２８〜４８０　（
１９７６）参照）。この方法は後記するように種々の欠
点を有する。なお、この方法は本発明の方法とは構成お
よび効果において全（異なるものてあり、この点に関し
ては、「効果」の項目において本発明の方法と比較しな
がら詳細に説明する。

（１）　　発明の概要 要旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌体処理物
を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に酵素反応ｅこよ
ってリバビリンが生成することを初めて知見し、この知
見に基づいて本発明を完成した。

本発明は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、アースロバフタ−属、ミクロコツカス属またはバチ
ルス属にＭＬ、１，２．４−）ＩＪアゾール−３−カル
ボキサミドとリボース供与体とからリバビリンを生成す
る反応を触媒する酵素系を含有する微生物の培養物、菌
体または菌体処理物と、１，２．４−トリアゾール−３
−カルボキサミドまたはその酸付加塩およびリボース供
与体とを前記微生物の非増殖条件下において水性媒体中
で接触させてリバビリンを生成させ、これを取得するこ
とを特徴とするりバビリンの製造法を提供するものであ
る。

効果 本発明の方法と微生物の培養による従来技術のは、前者
の方法においては微生物を酵素源とみなし、微生物が増
殖しない条件下で反応基質をこれらの微生物の培養物、
菌体または菌体処理物（以、下、これらを総括的に菌体
等と称することもある。

）の触媒作用によって反応させてリバビリンを合成する
のに対し、後者の方法においては微生物の代謝系を利用
する目的で、十分に増殖しうる条件上で微生物を培養し
、培地中（こ添加された前駆体である１、２．４−トリ
アゾール−３−カルポキサミドを代謝させてリボシル化
させる点である。

したかつて、本発明の方法をこおいては、酵素反応に際
して微生物菌体は休止ないし死滅した状態で使用され、
基質溶液の必須成分は反応基質である１、２．４−）リ
アゾール−３−カルボキサミドとリボース供与体のみか
あるいはこれらに加えて酵素反応ｔこ必要な無機物、補
酵素類たけて十分てあり、反応条件は微生物が増殖しな
い条件、たとえば高温度条件か最適なのである。これに
対して前記の従来技術の方ｍＲおいては、微生物は盛ん
に増殖している状態で使用され、培地成分としては１，
２．４−トリアゾール−３−カルボキサミドに加えて使
用微生物が十分ｔこ生育しつるような炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養源を含有していなければならず、
培養条件は微生物か十分（こ生育しうる条件、すなわち
比較的低温条件でなければならないのである。また、使
用微生物は、本発明の方法を採用する場合には天然より
の分離菌、公共機関の保存菌なと通常の微生物から広く
選択して使用できるか、前記の従来技術の方法を採用す
る場合には、糖源からリボース供与体を生成させる意味
でのヌクレオシド生産性を有することが必要であり、ア
デニン要求性、６−メルカプトグアニン抵抗性など特殊
な性質を有する微生物を使用しなければリバビリンの生
産量を増加することはできない。

以上のような構成の相異によって本発明の方法において
は次のような顕著な効果が達成された。

すなわち、本発明における酵素反応液は組成が単純なの
で、微生物の栄養培地に比へて調製が簡便であり、栄養
培地のようにあらかじめ殺菌する必要もない。また、微
生物の非増殖条件下、たとえば高温条件下で反応を行う
場合には反応液の雑菌汚染がほとんどないたけてなく、
リバビリンの分解反応が抑制されるのでいったん合成さ
れたりバビリンは酵素反応液中に多量に蓄積する。本発
明の方法は酵素反応なので反応時間が短かく、副生物の
生成もほとんとない。したがって、菌体等とが容易であ
る。またバッチ方式による菌体等の反復使用も、菌体等
充填カラムによる連続使用も可能である。さらｔこ、本
発明が菌体等の非増殖条件における酵素反応であること
による副次的効果としては、使用微生物をあらかじめ多
量に培養して菌体等を適宜な方法で保存しておけば、必
要なときに必要な量を本発明の酵素反応に供することが
できるなどの利点がある。

以上のような利点を有する本発明（こ対し、従来技術の
培養による方法は次のような欠点を有する。

すなわち、従来技術Ｑこおいてはリバビリンの製造は、
微生物の増殖中に栄養培地中で行われるので、まず微生
物を増殖させるために各種の栄養源を含有する培地を調
製しなければならす、種菌を植菌する前にこれらの培地
を殺菌しなければならないなと前処理が煩雑である。ま
た、リバビリンの蓄積を目的とする、微生物の増殖を伴
う培養は、通常２０〜４０°Ｃの常温で行われるので、
常？こ雑菌汚染への配慮か必要であるばかりではなく、
このような条件下ではりバビリン分解活性も存在してい
るので生成したリバビリンも分解してしまい目的物の収
量を低下させる原因となっていた。従来技術は微生物の
増殖を伴う方法であるため、培養を２〜８日間という長
期間にわたって行わなければならず、各種のヌクレオシ
ド、リバビリンのりん酸化物、その他の代謝産物が副生
ずる。したがって培養液からリバビリンを回収するため
（こは、原料化合物だけでな（、各種の副生物とも分離
しなければならず単離精製が煩雑である。さらｔこ、微
生物はりバビリンの製造の度ｔこ培養しなければならな
い。

（１）　　発明の詳細な説明 使用微生物 本発明において使用される微生物は、その培養物、菌体
または菌体処理物か、１，２．４−）Ｕアゾール−３−
カルボキサミドとリボース供与体との反応を触媒し、リ
バビリンを生成する酵素系を含有するものであり、具体
的ｔこはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｒｎ；以下、「Ｂ」と略すこともある。）属、フリ
ネハクテリウム（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　；以下、「Ｃ１」と
略すこともある。

）属、アースロバクｔｙ　−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ；以下、「Ａ」と略すこともある。）属、ミクロコツ
カス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　；以下、「Ｍ、」と略
すこともある。）属またはバチルｙ、　（ｆ３ａｃｉｌ
ｌｕｓ　；以下Ｊｆ３ａｃ、Ｊ　　と略すこともある。

）属し、前記の酵素活性を有する微生物が挙げられる。

本発明においてはこのような基本的性質を有するもので
ある限り、特に使用菌株の種類に限定されるものではな
い。

前記の酵素活性の強い代表的菌株の一つとして、兵庫県
西宮市の甲子園球場の砂より分離されたＡＴ−６−７株
を挙げることができる。この菌株の菌学的性質を以下に
記載する。

Ａ、形態 （１）細胞の形態および大きさ：短稈状。０．８〜１、
　ＯＸ　　１．　Ｏ〜１．　２　　ｐｍ（２）胞子の形
成：なし く３）ダラム染色性：陽性 Ｂ各種培地Ｅこおける生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（２８°Ｃ１４８時間）■集落
表面の隆起：扁平状（ｐｅａｔ）、平滑（５ｍｏｏｔｈ
） ■大きさ：２〜４朋 ■色調：黄色ないし桃黄色 （２）肉汁寒天斜面培養（２８°Ｃ２４８時間）■生育
：良好 ■生育の形：症状（）ｉ：ｃｈｉｎｕｌａｔｅ）（３）
肉汁液体培養（２８°Ｃ１４８時間）生育：表面に開環
（Ｒｉｎｇ）を形成し、やや沈渣（Ｓｅｄｉｍｅｎｔ）
を生じる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２０６Ｃ，６日間）。

層状（Ｓｔｒａｉｔｉｆｏｒｍ）に液化、する。

（５）リドマスミルク培地（２８°Ｃ，４日間）：わず
かに凝固し、ペプトン化も見られる。

Ｃ１生理的性質 （１）硝酸塩の還元（２８°Ｃ，５日間）：還元性なし
。

（２）硫化水素の生成（２８８Ｃ，５日間）：生成しな
い。

（３）澱粉の加水分解二分解性ありへ （４１カタラーゼ；陽性 （５）インドールの生成：生成しない。

（６１ペプトンおよびアル壽からのアンモニアの生成：
陰性 （７）メチルレッドテスト：陰性 ＋８）　Ｖ　−Ｐテスト：陽性 （９）酸素に対する態度：好気的 ｆｉＱ　Ｏ−Ｆ　テス）　（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ
法による）：Ｆ型（Ｆ６ｒｍｅｎｔｉｏｎ） α１糖類からの−の生成 陽性：クルコース、マンノース、フラクトース、マルト
ース、サッカロース。

トレハロース 陰性：アラビノース、キシロ〜ス、ガラクトース、ソル
ビット、イノンット。

グリセリン α２）生育ｐＨ範囲：ｐＨ６，０〜９００３）生育最適
温度＝２５〜３７°Ｃ 以上のｍ学的性質を、バージニーズ・マニュアル・オブ
・デイタミネーテイブ・ノくクテリオロジ−（ｆ３ｅｒ
￥；’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｆ）ｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ　ｆ３ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第７版（１９
５７年）の分類基準、ｔこより検索した。

その結果、ＡＴ　−６−７株はほとんど球菌に近い短桿
菌で、ダラム陽性であり、フィラメントを形成せず、炭
水化物より酸を生成することよりブレビバクテリウム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株と同定
し、ブレビバクテリウム・アセチリカム（ｆ３ｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）　Ａ　Ｔ
　−６−７と命名した。

なお、以上の菌株の同定帰属はバージニーズ・マニュア
ル・オブ・デイタミネーテイブ・バタテリオロジー第７
版によるものであり、分類基準の変更などをこより、異
なる分類基準やこよってこれらの菌株の同定帰属が行わ
れた場合には、他種あるいは他属（こ属することもあり
得るか、本発明において上記のごとく命名された微生物
は、少なくとも本発明の目的とする酵素を生産し、かつ
前記の菌学的性質もしくはこれと均等の菌学的性質を基
本的をこ有する微生物を包含し、一義的に特定され得る
ものである。

この菌体について、昭和５６年通商産業省告示第１７８
号に従って工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄
託申請を行い、昭和５７年１月１８日付けて受託され、
受託番号として微工研菌寄第６３０５号（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−６８０５）が付与されている。

また、上記菌株以外ｔこ本発明の目的とするリバビリン
製造のための酵素活性が強く、かつ当業者が容易に入手
できる菌株を以下に例示する。

プレビバクテリウ・ム・インペリアレ（Ｂ、　ｉｍｐｅ
ｒｉａｌｅ）ＡＴＣＣ８３６５ コリネバクテリウム・エクイ＜ｃ、　ｅｑｕｉ＞ＩＡＭ
　　　１０８８ バチルス・スブチリス（Ｂａｃ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
ＡＴＣＣ１４５９８ バチルス・セレウ７．　（Ｂａｃ、ｃｅｒｅｕＳ）ＩＡ
Ｍ　　　１０２９ ミクロコツカス・ルテウス（Ｍ、　１ｕｔｅｕｓ）ＡＴ
ＣＣ４６９８ 同　　上　　　　　　　　　　　　ＩＡＭ　　　　　１
０５６ＩＦＯ３７６５ （ＡＴＣＣ３９９） ミクロコツカス・ロゼウス（Ｍ、　ｒＯ３ｅｕｓ）ＩＦ
Ｏ８７６８ ＩＦＯ３７６０ アースロバフタ−争ントレウス（，４Ｃ！ｔｒｅｕｓ）
Ｉ　ＦＯ１２９５７ （ＡＴＣＣ１１６２４） アースロバフタ−・グロビホルミス（，４，ｇｌｏｂｉ
ｆｏｒｍｉｓ）Ｉ　Ｆｏ　　　　１２１８７ （ＡＴＣＣ８０１０） なお、上記菌株の寄託番号ンこおいて、ＡＴＣＣを付し
た番号はアメリカン・タイプ力ルチュアー・コレクソヨ
７　（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　（ｕｌｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）　Ｋおける寄託番号を
、ＩＦＯを付した番号は財団法人　発酵研究所（Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　、　
Ｑｓａｋａ）　ｌこおける寄託番号を、ＩＡＭを付した
番号は東京大学応用微生物研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
ｖｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＴＯｋｙＯ）ｅこおける寄
託番号をそれぞれ示すものであり、これらの菌株は当該
寄託機関の保存菌株リストに収載されている保存菌であ
る。またＩＦＯおよびＩＡＭ番号を付された菌株は日本
微生物保存株目録（Ｊ　Ｆ　Ｃ（、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ
　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）に収載されている保存菌で
ある。

また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の照射など
の物理的処理もしくはニトロソグアニジンなど（こよる
薬剤処理など、一般的変異誘導法による誘発突然変異ま
たは自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導さ
れた変異株も、本発明の目的とするりバビリン製造に関
与する酵素活性を失なわない限り、本発明に使用される
。

さらに、以上のような本発明に好適ｔこ使用される菌株
から得られた本発明の目的とするリバビリン製造に関与
する酵素系の遺伝子かブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、アースロバフタ−属、ミクロコツカス属
またはバチルス属以外の微生物に取り込まれ、そのよう
な形質が発現するに至った場合、このような微生物の培
養物、培養菌体またはその処理物を本発明の目的に使用
する方法は、本発明ｔこ包含される。

漉１ 本発明ｔこ使用する菌体等を調製するために、これらの
微生物を培養するに際しては、使用される培地および培
養法は、これらの微生物が生育する限り、特（こ限定さ
れない。

培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素源および
窒素源を適当量含有し、必要に応して無機塩、微量発育
促進物質、消泡剤なとを添加したものか使用される。具
体的ｅこは、炭素源としては、ル グルコース、フラクトース、マチドース、ガラクトース
、リボース、サッカロース、澱粉、澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜なとの糖類もしくはその脂肪酸エステルなと
の誘導体、麦、皺、米なとの天然炭水化物、グリセロー
ル、マンニトール、メタノール、エタノールなとのアル
コール類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸な
との脂肪酸類、ノルマルパラフィン、ケロシンなどの炭
化水素類、グリシノ、グルタミン酸、グルタミン、アラ
ニン、アスパラギンなどのアミノ酸類など、一般的な炭
素源より使用する微生物の資化性を考慮して一種または
二種以上を適宜に選択して使用すればよい。窒素源とし
ては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大
豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カザミノ酸、
各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コットンンー
ドミールないしその加水分解物、フィツシュミールない
しその加水分解物、その他の動物、植物、微生物の加水
分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、すん酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなとの硝酸塩、尿
素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮し
、一種または二種以上を適宜に選択して使用する。さら
（・こ、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、
鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カリウムな酢
酸塩などの一種または二種以上を適宜添加し、必要ｔこ
応じて植物油、界面活性剤などの消泡剤、ビタミンＢｌ
、Ｂ２．ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、ｐ−ア
ミ７安息香酸なとの微量発育促進物質を添加してもよい
。また、栄養要求を同時に示す微生物を使用する場合、
当然その生育を満足させる物質を培地に添加しなければ
ならない。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養
、通気撹拌培養、静置培養、連続培養なとの通常の培養
法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいが、通常は培養開始のｐＨを約６〜８ｔこ
調整し、約２５〜３５°Ｃの温度条件下で培養を行う。

培養期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく
、通常１〜３日間である。

酵素源 以上のようｔこ微生物を培養した後、得られた培養物、
培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離などの通常の
方法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処
理を施して得られる菌体処理いう。また、菌体処理物と
は、乾燥菌体、細胞膜・壁変性菌体、破砕菌体、固定化
菌体、菌体抽出物、本発明の目的とするリバビリンの製
造に関与する酵素活性を有する菌体抽出物の蛋白質画分
もしくはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製物の
固定化物などを指称する。

菌体処理物を得るための方法を以下に例示する。

すなわち、■生菌体に対し、たとえば凍結融解処理、凍
結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸性な
いしアルカリ性下における加温処理、磨砕処理、超音波
処理、浸透圧差処理なとの物理的処理手段、もしくはた
とえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、
トルエン、キシレン、ブチルアルコ＃の溶媒もしくは界
面活性剤との接触処理などの化学的ないし生物化学的処
理を単独もしくは組み合せて施すことｔこより、また、
■菌体抽出物に対し、たとえば塩析処理、等電点沈澱処
理、有機溶媒沈澱処理、各種クロマトグラフ処理、透析
処理などの酵素分離精製手段を単独もしくは組み合せて
施すことにより、さらに、■生菌体、菌体抽出物もしく
はその精製物に包括処理、架橋処理、担体への吸着処理
などの酵素固定化手段を施すことにより菌体処理物を得
ることかできる。

反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は１．２．４−トリ
アゾール−３−カルボキサミドおよびリボース供与体で
ある。

１、２．４−　トリアゾール−３−カルボキサミドは遊
離型または酸付加塩のいずれも使用できる。酸ルホン酸
なととの塩または無機酸、１１ば塩酸、硫酸、りん酸、
よう化水素酸なととの塩が挙げられる。

リボース供与体としてはりボヌクレオシドもしくはＤ−
リボースまたはこれらの各種りん酸エステルであればい
ずれも使用できる。すなわち、リボヌクレオシドはその
塩基部分がプリン系またはピリミジン系のいかなる塩基
であってもよく、天然物由来であれ化学合成によるもの
であれ使用することができる。また、リボヌクレオシド
もしくはＤ−リボースの糖部水酸基は非置換のものであ
ってもあるいは２位、３位もしくは５位水酸基のいずれ
か一個所、二個所もしくは全てがモノりん酸エステル、
ジりん酸エステル、トリりん酸エステルのようなりん酸
エステル化されたものであってもよい。また、これらの
りん酸エステルは遊離型であってもよく、またナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウ
ム、トリエチルアンモニウムなどの一般的なアルカリ塩
であってもよい。リボース供与体の具体例としてはイノ
シン、アデノシン、グアノシン、キサントシン、ウリジ
ン、ンチジン、５′−イノシン酸、５′−アデニル酸、
５’−１’アニル酸、５′−キサンチル酸、５’−ウリ
ジル酸、５′−シチジル酸、２’（８’ｌ−イノシン酸
、２’　（８’ｌ−アデニル酸、２’　（８’ｌ−グア
ニル酸、２’　＋８’ｌ−主反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基本的には
前基の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性
液である。

水性液中には前記の反応基質のほかに、りん酸イオン供
与体、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類補酵素類、酸、
塩基、糖類など酵素反応を促進する物質、反応基質の溶
解性を向上させる物質、酵素と反応基質の接触を向上さ
せる物質等を含有していてもよい。

水性溶媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩
衝液（りん酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ベロ
ナール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）を用い
ることかできる。

りん酸イオン供与体としては、水性媒体中でりん酸イオ
ンに解離しうるもののいずれを用いてもよく、たとえば
遊離型りん酸そのもの、無機りん酸塩、たとえばナトリ
ウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグ
ネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩
が好適に使用される。また、りん酸イオン供与体として
は、酵素反応の基質溶液中でりん酸イオンを遊離しうる
系、たとえば各種りん酸エステル誘導体とホスファター
ゼの組み合せ、ヌクレオチドとヌクレオチダーゼの組み
合せ、核酸塩基およびリボース−１−りん酸とホスホリ
ラーゼの組み合せなどを利用することができる。このよ
うな系における酵素源としては、本発明に使用される微
生物に由来するものであってもよく、別途添加された酵
素、またはその酵素活性を有する菌体もしくは菌体処理
物等であってもよい。

有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタノール、
プロパツール、フタ７−ル、ペンタノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、ンメチルスルホキンド、ジメ
チルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、２−メトキ
ンエタノール、２−エトキシエタノール、１．２−ジメ
トキンエタンなどが例示される。

、／ ／″ ／ ／″ ／ ／′ ／′ 接触方法 本発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを水性媒体
中で微生物の非増殖条件下において接触させることによ
り達成される。

接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択すればよ
いが、通常、酵素源を反応基質溶液に懸濁もしくは溶解
し、好ましくは加温しながら撹拌もしくは振盪するバッ
チ方式、または酵素源を必要に応じて適当な担体、助剤
、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラム
に充填し、反応基質溶液を通液するカラム方式などが適
用される。

反応基質および酵素源の濃度もしくは添加量反応に際し
、反応液の基質濃度は特に制限されるものではなく、反
応温度における使用水性媒体に対する各基質の飽和濃度
以下の基質濃度か通常採用されるか、反応基質溶液に添
加された前記の有機溶媒、界面活性剤なとにより基質濃
度を増大させることもてきる。また、反応液中に飽和濃
度以上の各基質を懸濁状管て存在させ、反応の進行にを
溶解させる場合、基質濃度は１．２．４−　）リアゾー
ル−３−カルボキサミドまたは酸付加塩については通常
５〜１００　ｍＭ程度、好ましくは１０〜５０　ｍＭ程
度であり、リボース供与体については通常５〜１５０ｍ
Ｍ程度、好ましくは１０〜１００ｍＭ程度である。

酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形態、反応効
率、経済性などを考慮し、当業者か予備実験等によって
容易に決定できるものであるか、通常バッチ方式の場合
、たとえば生（鼎菌体であれば１０〜１５０１１１９／
ｙｎｉ基質溶液程度、乾燥菌体であれば２〜８０　Ｑ／
ｌｌ　基質溶液程度であればよ（、カラム方式において
はバッチ方式に準して適当な量を設定することかできる
。

反応条件 本発明の反応の条件は、菌体等を非増殖条件下、すなわ
ち休止もしくは死滅菌体の状態で反応に供すること以外
は特に限定されない。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物が増殖できない温度範囲（たた
し、本発明の反応に関与する酵素が失活しない温度範囲
である。）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかじ
め前記のとおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理
することによって微生物を増殖できない状態にした後、
反応に供する方法、反応に際して、たとえばトルエンな
どの使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に
添加する方法なとを単独にあるいは組み合せて採用すれ
ばよいが、特に反応温度を操作する方法が最も効果的で
簡便である。

本発明の反応において反応温度は上記のとおり重要な条
件であり、本発明を特徴づけるものである。反応は２８
〜８０°Ｃの範囲において進行するか、実用性を考慮す
れば４５〜７０°Ｃの範囲が好ましく、特に５５〜６５
°Ｃが最適である。

上記のような温度範囲で酵素反応を行うことにより使用
微生物の生育は大部分抑制される。−４は、後記実施例
１と同一の微生物の生菌体を使用し、２８〜６０°Ｃの
各所定温度でそれぞれ実施例１と同様に反応させたとき
の１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミドから
のリバビリンの生成率圀と反応後の使用微生物の生存率
□□□との関係を示すと下記第１表のとおりである。な
お、微生物の生存率は反応開始前の微生物の生菌数／　
ｍｌに対する反応後の生菌数／　ｍｌの百分率である。

第１表 以上のとおり、本反応は使用微生物の非増殖条件下、す
なわち、大部分の微生物が休止もしくは死滅する条件下
で行われなけれはならない。

さらに、本発明において反応温度をｏｆＩ記の範囲に設
定することにより、酵素反応速度を増大させるたけてな
く、生成したリバビリンの分解反応を抑制することが実
験により確認された。−例として、実施例１と同一の微
生物の生菌体の懸濁液１ｍｌを２０　ｍＭリバビリン溶
液１　ｍｌに加えて２８〜６０°Ｃの各所定温度で２０
時間インキュベートしたときのりバビリンの残存率□□
□を第２表に示す。

第２表 以上の結果からも４５°Ｃ以上の反応温度が好適である
ことが確認できる。

反応基質溶液の液性は、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは
ｐＨ６〜８の範囲に保たれればよく、反応中に吐が変動
するときは、塩酸、硫酸、りん酸なとの酸または水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモニ
アガスなどのアル反応時間は、反応基質の目的物への変
換率を確認しながら決定すればよいが、通常バッチ方式
では２〜４５時間程度、好ましくは２４〜３６時間程度
反応させればよく、カラム方式ではバッチ方式に準じて
適当な条件を設定して反応させればよい。

分離精製 反応後、必要に応じて菌体等を濾過、遠心分離または凝
集分離なとの常法によって分離除去し、リバビリンの分
離精製工程に供する。

リバビリン、の分離精製は、公知の方法またはこれを応
用して行えばよ（、たとえばイオン交換クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分
配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮
、冷却、何機溶媒添加など溶解度の差を（り用する方法
なとの一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜ζこ
組み合せて行えばよい。

分析 本発明の実施例等においてリバビリンおよび１゜２、４
−　トリアゾール−３−カルボキサミドの分析は高速液
体クロマトグラフィーによって行った。

以下に示す装置および条件で分析すると、リバビリンは
保持時間３．５０分付近に、１．２．４−　トＩＪアゾ
ールー３−カルボキサミドは保持時間２．６５分付近に
溶出され、検量線よりそれぞれの量を算出てきる。

装置：島津高速液体りロマトグラフＬＣ−３Ａ型（■島
津製作所製） カラム二マイクロ・ボンダパック（μＢＯＮＤＡＰＡＫ
　）Ｃ１ｇ、４．６龍ｘ２５０ｍｍ（日本ウォーターズ
リミテッド社製）溶出剤＝２９６アセトニトリルを含む
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） 流速：１ｇ／／分 測定波長：　２２５　ｎｍ カラム操作温度：室温 〔，１１）　　実施例 −”−−−−含尤 以下、実施例をもって本発明をより具体的に葵明するが
、これらはいずれも実施の一態様を示すものであって、
本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ ブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴ−６−７を粉末
ブイヨン（極東製薬工業■製）２９６水溶液５ｅに植菌
し、２８°Ｃ１２４時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離によって集菌し、洗滌後、殺菌水
を加えて２５０　ｄの菌体懸濁液を得た。

６６、７　ｍＭ　１，２．４−　）リアゾール−３−カ
ルボキサミド、６６．７ｍＭイノシンおよび１００　ｍ
Ｍりん酸−カリウムを含む水溶液（＋）Ｈ７，０）７５
０ｇｆに前記菌体懸濁液２５０　ｍｌを加え、６０℃、
２４ン交換樹脂（Ｈ＋型）を通過させ、この通過水洗液
を活性炭に吸着させた。活性炭カラムよりエタノール−
アンモニア、容液てリフ１ビリンを溶出し、溶出液のエ
タノールを除去した後、アニオン交換樹脂を通過させ、
通過水洗液を減圧濃縮して５０　ｍｌとし、冷却した。

冷却後、析出した結晶を分離し、乾燥してリバビリンの
結晶６．５ｇを得た。

比較例 実施例１と同一の菌株を使用し、特公昭５４−１７８８
０号公報の実施例１と同様の方法で微生物の増殖中に原
料トリアゾール化合物を添加してリバビリンの製造を試
みた。すなわち、前記菌株をグルコース１３０ｇ、りん
酸−カリウム１９、りん酸二カリウム８Ｑ、硫酸マグネ
シウム１ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、硫酸鉄１０ｍｆ
ｉ、硫酸亜鉛５　ｍｇ、硫酸マンガン１１０１Ｒ、ビタ
ミ７Ｂ１５Ｗ９゜パントテン酸カルシウム１０ＪＩｇ、
／メチン２０１Ｒ９、ビオチン３０μ９、肉エキス１０
９、硫酸アンモニウム２ｇおよび尿素２ｇ（別殺菌）を
１１中に含有する組成で、ｐＨ７，６に調整した培地１
０ｇｔに植菌し、１２時間毎にアンモニア水てｐＨ７，
２に調整しつつ２８°Ｃて振盪培養した。培養開始２４
時間後に１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミ
ドを２　Ｑ／ｍｅ濃度で添加し、さらに４日間培養した
。

培養液を遠心分離した後、上澄液を分析したが、実施例
２ 実施例１と同一の菌株を実施例１と同様に培養しくたた
し、培養液は各１０府／とじた。）、培養後、遠心分離
によって集菌し、各１　ｍｌの殺菌水を加えて菌体懸濁
液を得た。

この菌体懸濁液に２０　ｍＭ　　１，２．４−　）リア
ゾール−３−カルボキサミド、２０ｍＭの第３表に示す
各種リボース供与体および２５　ｍＭ　りん酸−カリウ
ムを含む水溶液（ｐＨ７，０）各１　ｔｘｔを添加し、
６０°Ｃ１２４時間反応した。反応終了後、遠心分離に
よって除菌し、上澄液を分析したところリバビリンの生
成率は第３表に示すとおりてあった。

／ ／′ 第３表 実施例３ 第４表に示す各菌株を実施例１と同しブイヨン培地各５
０　ｙｇｌに植菌し、２８°Ｃ８２４時間振盪培養後、
遠心分離によって集菌し、殺菌水を加えて菌体懸濁液３
５肩ｔを得た。

２０１１１Ｍ　１．２．４−トリアソール−３−カルボ
キサミド、２０　ｍＭイノンフンよび２５　ｍＭ　りん
酸−カリウムを含む水溶液（ｐＨ７，０）各５　ａ＋ｔ
に前記菌体懸濁液各５　ｍｌを加え、６０°０．２４時
間反応した。反応終了後、リバビリン生成率を分析した
ところ第４表に示すとおりてあった。

第４表 実施例４ ２％粉末ブイヨン培地各１００　ｍｌに実施例１と同一
の菌株を植菌し、２８℃、２２時間振盪培養し、培養菌
体を得、次いで以下の処理を行い菌体処理物懸濁液を得
た。

１）アセトン乾燥菌体：生菌体に５０　ｍｌのアセトン
を加え、１５分間放置し、遠心分離して得た菌体にさら
に５０　ｍｌのアセトンを加え、同様の処理を行った後
、真空乾燥して乾燥菌体を得た。

これに水を加えて菌体処理物懸濁液１０　ｙｓｌを得た
。

２）凍結融解菌体：生菌体を一８０°Ｃて一晩凍結後、
解凍し、水を加えて菌体処理物懸濁液１０ｇ／を得た。

３）浸透圧差処理菌体；生菌体に１００　ｙｓｌの飽和
食塩水を加え、−晩水冷後、遠心分離によって上澄液を
捨て、分離菌体に水を加えて菌体処理物ｇＦ！濁液ｌＯ
肩ｔを得た。

４）超音波処理菌体＝生菌体に水を加えて１０１／とじ
、出力電圧１．６　Ｋ　Ｖて２０分間超音波処理を以上
の菌体処理物懸濁戒名１０　ｔｇｌおよび実施例１と同
様にして得た無処理菌体懸濁液１０　ｍｌに実施例３と
同一の反応基質溶液各１０ｇ／を加え、６０’Ｃ，２４
時間反応後、リバビリンの生成率を分析したところ第５
表に示すとおりてあった。

第５表 実施例５ ２％ブイヨン培地２５　ｖｌに実施例１と同一の菌株を
植菌し、２８℃、２４時間振盪培養し、培養！／を加え
、２８〜７０°Ｃの各温度（第６表）て２０時間反応後
、リバビリンの生成率を分析したところ第６表に示すと
おりてあった。

第６表 実施例６ 実施例１と同一の菌株を使用し、実施例５と同様に調製
した菌体懸濁戒名２．５肩ｌに以下の反応基質溶液ＬＡ
＋またはｆＢｌ各２．５　ｍｌを加え、６０°Ｃｌ２Ｏ
時間反応後、リバビリンの生成率を分析したところ第７
表に示すとおりてあった。

反応基質溶液（Ａｌ　：　２０　ｍＭ　１，２．４−　
トリアソール−３−カルボキサミドおよび２０　ｍＭイ
ノンフ ン応基質溶液（Ｂ）二上記反応基質溶液ｉＡｌと同量の
各基質に２５ｍＭりん酸−カリウムを加える。

第７表 実施例７ 実施例６と同し菌体懸濁液２．５　ｍｌに実施例６の反
応基質溶液（Ｂ）　２．５　ｙｎｌを加え、６０°Ｃ２
２０時間反応後、菌体を分離した。この分離菌体に水１
ＯＮｔを加えて次回の反応に使用し、上記と同様の反応
を１０回繰り返した。第１回のリバビリン生成率を１０
０としたときの各回の反応の相対生成率を第８表に示す
。

第８表 実施例８ ２％ブイヨン培地１１に実施例１と同一の菌株を植菌し
、３０°Ｃ２２２時間振盪培養した後、遠心分離によっ
て生菌体を得た。

この生菌体にＡ液〔ｌＮ−塩酸２４ｇ／、トリス８．４
２５　ＱｌＴＥＭＥＤ　（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミン）　０．２８　ＩＩ／を溶解し
て水で１００ｇｔに稀釈した水溶液〕２０肩ｔ、　Ｂ液
〔アクリルアミド８．Ｏｑ、ＢＩＳ（Ｎ、Ｎ−メチレン
ビス（アクリルアミド））０．８９を水に溶解して１０
０　ｍｌとした水溶液’）　２０　ｍｌおよびＣ液〔過
硫酸アンモニウム０．３ｇを水に溶解して２００　ｍｌ
とした水溶液）　４０　ｄを加えて放置し、菌体を固定
化した。固定化後ホモジナイザーで細片化し、１８０　
ｍｌの固定化菌体を得た。

この固定化菌体１０　ｗ（に２０　ｍＭ　１，２．４−
　）リアゾール−３−カルボキサミド、２０ｍＭイノシ
ンおよび２５ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶液２０
珂／（ｐＨ７，０）を加え、６０°Ｃ１２４時間反応し
、反応液を分析したところ６２．８９％のリバビリンが
生成していた。なお、生菌体を使用して同一条件で反応
を行ったところリバビリンの生成率は６５．４４％であ
った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ブレビバクテリウム属、コリネバタテリウム属、ア
   ースロバフタ−属、ミクロコツカス属またはバチルス属
   シこ属し、１，２．４−トリアゾール−８−カルボキサ
   ミドとリボース供与体とからリバビリンを生成する反応
   を触媒する酵素系を含有する微生物の培養物、菌体また
   は菌体処理物と、１．２．４−トリアゾール−３−カル
   ボキサミドまたはその酸付加塩およびリボース供与体と
   を前記微生物の非増殖条件下において水性媒体中で接触
   させてリバビリンを生成させ、これを取得することを特
   徴とするりバビリンの製造法。 ２）酵素反応を微生物の非増殖条件下ｔこおいて行う方
   法が、反応液を微生物の増殖できない温度条件ｔこ保持
   して反応を行う方法、微生物菌体をあらかしめ該微生物
   が休止もしくは死滅する方法によって処理し、これを用
   いて反応を行う方法、および反応液ｔこ微生物の増殖を
   阻害する物質を添加して反応を行う方法からなる群より
   選ばれた一種の方法または二種以上を組み合せた方法で
   ある特許請求の範囲第１項記載のリバビリンの製造法。 ３）微生物の非増殖条件が、４５〜７０°Ｃの温度条件
   である特許請求の範囲第１または２項記載のリバビリン
   の製造法。