JPH0419838B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物培養法によるＳ−アデノシル−
Ｌ−メチオニン（以下「SAM」と略称する。）の
製造法に関し、より詳しくはメチオニンとともに
特定の化合物を添加した培地中で酵母を培養し、
SAMを蓄積させ、得られた培養物からSAMを取
得する方法に関する。 SAMは生体内における種々のトランスメチラ
ーゼによるメチル化反応においてメチル基供与体
として作用し、活性型メチオニンとして知られて
いる化合物であり、肝疾患等に対する治療薬とし
ても使用しうる化合物である。 従来微生物培養法によるSAMの製造法とし
てメチオニンを含有する培地中で酵母を培養する
方法が知られている（J.Biol.Chem.、229、1037
（1957）；J.Bacteriol. 121、267（1975）；Amino
Acids（発酵と代謝）、第４号、第95〜98頁（昭
和36年）；特公昭52−17118；特開昭58−28296；
特開昭58−36397；特開昭58−40095；特開昭58−
40096；特開昭58−138393；特開昭58−146274；
特開昭58−146291；特開昭58−152497）。また、
酵母菌体を酵素源として酵素的にSAMを合成
する方法も知られている（特公昭56−25120；特
開昭55−96099；特開昭57−99199）。 の微生物培養法においてメチオニンとともに
各種の添加物を培地中に添加することによつて
SAMの蓄積量が増加することが知られている。
たとえば、ウラシル、チミン、プリンなどの塩基
類；イノシン、グアノシン、キサントシン、ウリ
ジン、シチジン、チミジン、デオキシアデノシン
などのヌクレオシド類；イノシン−5′−モノりん
酸、グアノシン−5′−モノりん酸、キサントシン
−5′−モノりん酸、ウリジン−5′−モノりん酸、
シチジン−5′−モノりん酸、アデノシン−2′−モ
ノりん酸、アデノシン−3′−モノりん酸、デオキ
シアデノシン−5′−モノりん酸、デオキシミジン
−5′−モノりん酸などのヌクレオチド類；リボ核
酸；デオキシリボ核酸などを培地に添加すると
SAMの蓄積量が増加することが知られているが、
これらの物質の添加によるSAM蓄積量の増加は
20〜120％程度にすぎない（特開昭58−40096参
照）。 一方、の酵素法は、酵母を通常の培養法で培
養して得た菌体の処理物を酵素源として使用し、
基質としてメチオニンとアデノシン−5′−三りん
酸（以下「ATP」と略称する。）とを使用して酵
素反応させる方法である。また、ATPに代えて
アデノシン−5′−二りん酸（以下「ADP」と略
称する。）またはアデノシンをATP生成系酵素含
有体とともに使用し、これらのATP前躯体を
ATPに変換して前記のSAM生成系に供する方法
も知られている（特開昭55−96099参照）。これら
の方法は純粋な酵素反応に基づくものであり、
SAMの生成量はいずれかの、基質の添加量に規
制されている点で微生物培養法と異なる。さら
に、ADPまたはアデノシンを使用する場合は
ATP生成系酵素含有体の存在を必要とする点で
も微生物培養法と異なる。 以上のとおり微生物培養法によるSAMの製造
においてアデノシンを培地へ添加することによつ
てSAMの蓄積量が増加することは知られていな
い。 本発明者らは微生物培養法によるSAMの製造
法において培地への添加物について種々検討した
結果、アデノシン（以下「Ado」と略称すること
もある。）がSAMの蓄積に顕著な効果を示すこと
を見出し、本発明を完成するに到つた。 本発明は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン生
産能を有する酵母をメチオニンを含有する培地中
で培養してＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを製
造する方法において、酵母としてハンゼヌラ属、
キヤンデイダ属、ピキア属またはロドトルラ属に
属するＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産能を
有する酵母を使用し、かつ培地中にアデノシンを
30ｍＭ以上の濃度で存在させることを特徴とする
Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造法を提供
するものである。 以下、本発明を具体的に説明する。 本発明において「Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオ
ニン生産能を有する酵母」とはメチオニンを含有
する培地中で培養した際に菌体内および／または
培地中にSAMを蓄積することのできる酵母であ
ればよく、以下の属に属する酵母が例示される。 (1) ハンゼヌラ（Hansenula；以下「H.」と略
す。）属 (2) キヤンデイダ（Candida；以下「C.」と略
す。）属 (3) ピキア（Pichia；以下「P.」と略す。）属 (4) ロドトルラ（Rhodotorula；以下「R.」と略
す。）属 以上の属に属する代表的菌株としては、以下の
菌株が例示される。 (1-1) ハンゼヌラ・アノマラ（H.anomala）
IMA 4213（微工研菌寄第6543号） (1-2) ハンゼヌラ・アノマラ（H.anomala）
IFO 0963 (1-3) ハンゼヌラ・ポリモルフア（H.
polymorpha） IFO 0799 (1-4) ハンゼヌラ・フアビアニイ（H.fabianii）
IFO 1370 (2-1) キヤンデイダ・ウチリス（C.utilis）
IFO 0988（ATCC 9950） (2-2) キヤンデイダ・マセドニエンシス（C.
macedoniensis） IFO 0960 (3-1) ピキア・メンブランエフアシエンス（P.
membranaefaciens） IFO 0864 (3-2) ピキア・フアリノサ（P.farinosa）
IFO 0193 (3-3) ピキア・モギイ（P.mogii） IFO 0607 (4-1) ロドトルラ・グルチニス（R.glutinis）
IAM 4757（微工研菌寄第1600号） (4-2) ロドトルラ・ルブラ（R.rubra）
IFO 0382 以上の菌株の天然および人工変異株もSAM生
産能を有するものであれば同様に使用することが
できる。 本発明方法は以上のような酵母をメチオニンと
ともにAdoを含有し、これらの微生物が生育でき
る培地中で培養し、菌体内および／または培地中
にSAMを蓄積させ、必要に応じて常法によつて
分離精製することからなる。 培地中に存在させるAdoの濃度は10ｍＭ以上が
好ましいが、30ｍＭ以上の場合より効果的であ
る。 Adoを培養開始時、すなわち植菌時に培地に存
在させる方法がSAMの生産量は多いが、培養開
始後の適当な時期、たとえば１〜２日培養後に添
加してもよく、添加方法は全量を一度に添加する
方法、または適当量を分割してもしくは連続して
添加する方法などを採用することができる。 培地中に存在させるメチオニンの濃度は常法に
従えばよく、特に限定されない。通常５ｍＭ以上
であり、25ｍＭ以上が好ましい。 メチオニンの添加方法はAdoと同様に行えばよ
く、一度に全量を添加する方法、分割添加法また
は連続添加法などのいずれの方法でもよい。 メチオニンはＬ−メチオニンまたはＤ、Ｌ−メ
チオニンが常用される。 使用される培地は以上の物質を存在させる以外
は酵母の培養に使用される通常の培地でよい。す
なわち、炭素源、窒素源、無機塩、以上の物質を
含有する有機栄養源などを適宜に含有する培地で
ある。 以下、培地成分を例示する。 〔炭素源〕 糖類：グルコース、シユークロース、マルトー
ス、フラクトース、ラクトース、澱粉、澱粉加
水分解物、セルロース、セルロース加水分解物
等 アルコール類：メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ブタノール、グリセリン、ソルビトー
ル、高級アルコール等 有機酸類：コハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、
酢酸、プロピオン酸、酪酸、グルコン酸、フマ
ール酸、安息香酸、高級脂肪酸；以上の有機酸
のアルカリ塩等 エステル類： 以上の有機酸と糖類もしくはアル
コール類とのエステル 炭化水素類：炭素数１〜25のアルカン類、アルケ
ン類 〔窒素源〕 アンモニウム塩：硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム等 硝酸塩：硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等 その他：アンモニア水、アンモニアガス、尿素、
アミノ酸、ペプチド、核酸関連物質等 〔無機塩〕 りん酸：りん酸カリウム、りん酸ナトリウム、り
ん酸カルシウム等 カリウム塩：塩化カリウム等 マグネシウム塩：硫酸マグネシウム、塩化マグネ
シウム等 ナトリウム塩：塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム
等 マンガン塩：硫酸マンガン、塩化マンガン等 鉄塩：硫酸鉄、塩化鉄等 銅塩：硫酸銅等 コバルト塩：塩化コバルト等 〔以上の物質を含有する有機栄養源〕 アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、スレオ
ニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、オルニ
チン、プロリン、チロシン等 ペプチド類：ペプトン、カザミノ酸、グリシルグ
リシン、グリシルグリシルグリシン、アラニル
アラニン、アラニルグリシン等 核酸関連物質：ウラシル、シトシン、チミン、ア
デニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチ
ン、プリン；前記塩基類とリボースまたはデオ
キシリボースからなるヌクレオシド類；前記ヌ
クレオシドの2′、3′、5′位のいずれか１個所以
上の水酸基におけるモノりん酸、ジりん酸もし
くはトリりん酸エステル；リボ核酸；デオキシ
リボ核酸等 ポリアルキレンジアミン類：トリメチレンジアミ
ン、プトレツシン、スペルミン、スペルミジン
等 ビタミン類：ビオチン、パントテン酸等 天然物由来物質：酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、コーンステイープリカー、大豆粉、米ぬ
か、麦芽、大豆蛋白加水分解物、カゼイン加水
分解物等 １，２，４−トリアゾール類：３−アミノ−１，
２，４−トリアゾール、４−アミノ−１，２，
４−トリアゾール等 培養は通気撹拌培養、振盪培養などによつて好
気的条件下で行なうのが好ましく、酸素の供給が
不足するとアルコール発酵に傾き、菌体収量が減
少するので好ましくない。糖濃度は５〜20％程度
が適当である。 培養に際しては、培養前もしくは培養中に培地
の液性をPH２以上、好ましくはPH３〜８に調節
し、培養温度を15〜45℃、好ましくは20〜40℃に
調節すればよい。 かくして培養１〜10日後には菌体内および／ま
たは培地中にSAMが生成蓄積するので、必要に
応じてこれを常法により分離精製することができ
る。 常法による分離精製法を例示する。 菌体内のSAMは過塩素酸、酢酸エステル、ギ
酸エステル、塩酸、硫酸などの抽出剤によつて抽
出した後、炭酸水素カリウムなどによつて中和
し、強酸性カチオン交換樹脂、、弱酸性カチオン
交換樹脂またはキレート樹脂に接触させてSAM
を吸着し、次いで硫酸、塩酸などの酸性物質溶液
により溶出し、溶出液に有機溶媒またはりんタン
グステン酸、ピクリン酸等を加えてSAMを沈澱
させることができる。また、SAMは硫酸塩、ヌ
クレオシド硫酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、
これらの複塩もしくはこれらを含有する安定化組
成物として回収してもよい。 かかる本発明によれば、Adoが培地に存在しな
い場合と比較してSAMの蓄積量を５倍程度まで
増加することができ、その結果として不純物の含
有量を減少することができ、高純度のSAMを効
率よく製造することを可能にする。 以下、実施例によつて本発明をより具体的に説
明する。 なお、実施例においてSAMの分析は下記の方
法により高速液体クロマトグラフイーによつて行
つた。 装置：島津高速液体クラマトグラフLC−3A型
（(株)島津製作所製） カラム：マイクロ・ボンダパツク
（μBONDAPAK）C₁₈、4.6mm×250mm（日本ウ
オーターズリミテツド社製） 溶出剤：５％アセトニトリルを含む20ｍＭトリス
一塩酸緩衝液（PH7.5） 流速：１ml／分 測定波長：260nｍ カラム操作温度：室温 実施例 １ シユークロース10％、酵母エキス1.5％、ポリ
ペプトン1.0％、尿素1.5％、りん酸一カリウム0.5
％、りん酸二カリウム0.3％、硫酸マグネシウム
0.05％および塩化カルシウム0.05％を含む培地
（尿素は別殺菌する。）にハンゼヌラ・アノマラ
IAM 4213（微工研菌寄第6543号）を植菌し、28
℃、22時間前培養した。上記培地２にＬ−メチ
オニン50ｍＭおよびAdo50ｍＭとなるように各物
質を添加し、この培地に酵母前培養液を200mlを
植菌し、28℃、５日間通気撹拌培養を行つた。 培養液を遠心分離して得た菌体を水洗後、この
菌体に1.5N過塩素酸２を加えて室温で２時間
撹拌抽出した後、遠心分離した。上澄液に炭酸水
素カリウムを加えて中和し、生成した沈澱を除去
後、得られた上澄液を高速液体クロマトグラフイ
ーで分析したところSAM3.53ｇを含有していた。 なお、同一の菌株をAdo無添加培地で同様に培
養したところSAMの生産量は0.94ｇであつた。 【表】 実施例 ２ 第１表に示す菌株を実施例１と同様に50ｍ
MAdo添加培地１で培養し、SAMの生産量
（菌体内）を測定した結果を第１表に示す。 実施例 ３ 実施例１と同じ菌株をAdo添加量を０〜50ｍＭ
まで変化させた他は実施例１と同様に培養し、菌
体内SAM量を分析して第２表に示した。 【表】 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産能を有
   する酵母をメチオニンを含有する培地中で培養し
   てＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを製造する方
   法において、酵母としてハンゼヌラ
   （Hansenula）属、キヤンデイダ（Candida）属、
   ピキア（Pichia）属またはロドトルラ
   （Rhodotorula）属に属するＳ−アデノシル−Ｌ
   −メチオニン生産能を有する酵母を使用し、かつ
   培地中にアデノシンを30ｍＭ以上の濃度で存在さ
   せることを特徴とするＳ−アデノシル−Ｌ−メチ
   オニンの製造法。