JPH0231686A - トリフルオロチミジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素反応を利用してトリフルオロチミジンを
製造する方法に関する。より具体的には、酵素触媒によ
るヌクレオシドの塩基交換反応等により、トリフルオロ
チミジンを製造する方法に関する。

［従来の技術］ 本発明の製造対象であるトリフルオロチミジンはヌクレ
オシドの一種で、トリフルオロメチルウラシルのデオキ
シリボシドである。この化合物は低濃度で抗ウイルス性
を示し、角膜炎等のヘルペス性疾患の治療に有用な物質
である。

一方、ヌクレオシドをリボース供与体またはデオキシリ
ボース供与体とし、これを細菌の存在下でピリミジン塩
基と反応させて酵素による塩基交換反応を行ない、ピリ
ミジンリボヌクレオシド類及びピリミジンデオキシリボ
ヌクレオシド類を製造する方法が知られている（特開昭
５６−１０２７９４号公報）。この方法では、細菌とし
てエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属、エル
ビニア（Ｅｒｖｌｎｉａ　）属、クレブシェラ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ）属、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕ
■）属、エンテロバクタ−（ＥｎｔｅｒｏｂａｃＬｅｒ
）属、エーロモナス（＾ｅｒｏｉｏｎａｓ　）属、セラ
チア属、プロテウス（ＰｒｏＬｅｕｓ　）属、キサント
モナス（Ｘａｎｔｈｏ■ｏｎａｓ　）属またはシトロバ
クタ−（Ｃ１ｔｏｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する菌株を
用イテいる。また反応条件としては、水溶液中において
５０〜６５℃の温度範囲が採用されている。

既述のように、トリフルオロチミジンはトリフルオロメ
チルウラシルのデオキシリボシドであるから、原理的に
は上記従来の適用によって製造することが可能である。

しかし、上記の公報にはそのような実施例、特にセラチ
ア属に属する菌体を用いて行なった実施例は記載されて
いないｏまた・原料の塩基としてトリフルオロメチルウ
ラシルを用い、上記の方法により目的とするトリフルオ
ロチミジンを製造したところ、その収率は極めて低いこ
とが明らかになった。

［発明が解決しようとする課題］ 上記事情に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、上
記従来技術を適用してトリフルオロチミジンを製造する
に際し、高収率で目的物を得ることができる方法を提供
することである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは細菌を用いた塩基交換反応により、トリフ
ルオロメチルウラシルとデオキシリボース供与体とから
トリフルオロチミジンを製造する方法について検討を重
ねた結果、細菌としてセラチア属に属する細菌を選択し
、且つ３０〜４５℃という緩和な温度条件を選定するこ
とにより従来にない好収率を達成した。

また、セラチア属に属する細菌の培養菌体から得た酵素
のうち、当該反応に対して活性を有する酵素または該酵
素を固定化させた固定化酵素を用いた場合にも、菌体を
用いた場合と同様に高収率でトリフルオロチミジンが得
られることを見出だした。しかも、固定化酵素を用いた
場合には、連続的に目的化合物を得ることができる。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で用いるセラチア属に属する細菌の例としては、
セラチア・マルセッセンス（５ｅｒｒａｔｉａ１ａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３０５２、セラチア・マル
セッセンスＩＦＯ３０４６、セラチアマルセッセンスＩ
’ＦＯ３７３５、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｃ
ｒｒａｔｉａ　ｌ１ｑｕｅｒａｃｉｃｎｓ　）　　Ｉ　
Ｆ　０１２９７９、セラチア拳すクエファシエンスＡＴ
ＣＣ１１３６７等が挙げられる゛。なかでも、セラチア
・マルセッセンスＩＦＯ３０５２が優れた効果を示す。

これらの細菌の菌体は、例えば次の方法により得られる
。まず、グルコース、マルトース、廃糖蜜、でんぷんの
酸加水分解物または酵素加水分解物などの炭素源、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの窒素源・
酵母エキスＪ麦芽エキス、ペプトン、肉エキスなどの有
機栄養源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、
鉄、マンガンなどの無機イオン等を含む通常の培地で上
記の菌株を培養する。この培養した懸濁液をそのまま用
いることも可能であるが、培養液から遠心分離等の操作
で分離した菌体、或いはこの分離した菌体を更に超音波
等の方法で処理した菌体破砕物を使用してもよい。

一方、本発明における酵素としては、菌体破砕物を遠心
分離して得られる上清、該上清から塩析等で得られる活
性画分またはアセトン処理菌体等を用いることができる
。このうち、菌体破砕物を遠心分離して得られる上清か
最も有効である。これら酵素を固定化して用いる場合、
固定化の方法としてはイオン交換樹脂に吸着させる吸着
法、アルギン酸カルシウム等のゲルまたはゲルタールア
ルデヒドで架橋したゲルによる包括固定化法が用いられ
る。なかでも、弱陰イオン交換樹脂による吸着法が好ま
しい。

本発明で用いるデオキシリボース供与体としては、２゛
−デオキシアデノシン、２′−デオキシイノシン、２″
−デオキシグアノシン、チミジン、２′−デオキシウリ
ジンで示される２゛−デオキシリボヌクレオシド、並び
に２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸等が挙
げられる。これらのデオキシリボース供与体は、トリフ
ルオロメチルウラシルに対して１〜１０倍モル、好まし
くは２〜５倍モル用いる。

通常、反応は水溶液中で行なう。デオキシリボース供与
体が２′−デオキシリボヌクレオシドの場合は、１〜５
０ミリモルのリン酸を添加することが好ましい。

反応温度を３０〜４５℃としたのは、高温では収率が著
しく低下するからである。また、本発明の原料であるト
リフルオロメチルウラシル及び生成物であるトリフルオ
ロチミジンは何れも化学的に不安定であるため、緩和な
条件が望ましいからである。

反応時間は３〜２０時間が好ましく・長時間の反応は生
成したトリフルオロチミジンか不安定であるため好まし
くない。反応終了後、菌体または酵素を分離し、生成し
たトリフルオロチミジンを樹脂吸着または晶析等の操作
により単離、精製する。

固定化酵素を用いて反応を行なう場合は、固定化酵素を
カラムに充填し、これにトリフルオロメチルウラシル、
デオキシリボース供与体及び必要に応じてリン酸を溶解
した基質水溶液を通液する。

基質水溶液の濃度は、使用するトリフルオロメチルウラ
シルの量によって決まる。通常は、トリフルオロメチル
ウラシルとして０．３重量％以下が用いられる。通液速
度は、希釈率として１Ｏｈ−”以下、好ましくは３ｈ−
１以下が適している。この希釈率の単位は、１時間あた
りカラム容積の何倍量で通液するかを表わしている。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例１゜ ５００ｍ１のエルシンマイヤーフラスコ中に、グルコー
ス１ｇ−／旧、ペプトンＩｇ／ｄｉ、酵母エキス０．５
ｇ／旧、食塩０．５　ｇ　／ｄｌ　（Ｐｌ＋　７．０）
を含む液体培地１００ｍ１を仕込んだ。オートクレーブ
で滅菌した後、セラチア・マルセ・ソセンスＩＦＯ３０
５２を白金耳で１回接種し、３０℃で２４時間培養した
。培養終了後、遠心分離により菌体を培養液から分離し
た。

次いで、これを生理食塩水で洗浄した後、５ｍＭリン酸
緩衝液（Ｐ１１７．Ｑ）中に懸濁した（２５■湿菌／　
ｍｌ　）。この懸濁液にトリフルオロメチルウラシル０
．１ｇ／ｄｉ及びチミジン０．５ｇ／ｄｌを加え、反応
温度４５℃で６時間反応させた。反応終了後、反応液を
高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、トリフル
オロチミジンの生成量は８９■／ｄｉであった。トリフ
ルオロメチルウラシルからの収率は５４．１％であった
。

実施例２ １ＯＮのジャー型醗酵装置に実施例１と同じ液体培地６
ｇを仕込み、セラチア・マルセツセンスＩＦ０　３０５
２を接種し、３０℃で２４時間培養した。次いで、実施
例１と同様の操作を行うことにより、　１２６■／旧の
トリフルオロチミジンを得た。

トリフルオロメチルウラシルからの収率は７８．６％で
ある。

実施例３ 実施例１のチミジンの代わりに、２′−デオキシグアノ
シンを用いた。それ以外は実施例１と同様の操作を行っ
たところ、７２１ｇ／ｄ＋のトリフルオロチミジン−が
得られた。トリフルオロメチルウラシルからの収率は４
３．８％である。

実施例４ 実施例１のチミジンの代わりに２′−デオキシアデノシ
ンを用いた。それ以外は実施例１と同様の操作を行った
ところ、７３■／ｄｌのトリフルオロチミジンが得られ
た。トリフルオロメチルウラシルからの収率は４４．４
％である。

実施例５ 反応温度を３０℃、４０℃、５０℃及び６０℃とした点
を除き、実施例１と同様の操作を行った。各温度の反応
において、トリフルオロメチルウラシルからトリフルオ
ロチミジンへの収率は第１表に示す通りであった。

第１表 第２表 実施例６ 実施例１と同じ菌体処理物を、５０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ＰＨ７，５）に懸濁しく２５■湿菌／ｍｌ）た。

これにトリフルオロメチルウラシル０．１ｇ　／旧及び
２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸０．５．
　／旧を加え、反応温度を各々３０℃、４０℃、５０℃
及び６０℃として１６時間反応させた。反応終了後、実
施例１と同様の方法で分析した。各反応温度において、
トリフルオロメチルウラシルからのトリフルオロチミジ
ンの収率は第２表に示す通り−（あった。

実施例７ ３ＩＩのコブ付フラスコ中に、グルコースｌｏｇ／ｇ１
ペプトンＬｕｇ／Ｉ、酵母エキス５ｇ／Ｉ、食塩５　ｇ
　／　ＩＩを含む液体培地１ｊ！　　（ＰＨ７，０）を
仕込み、オートクレーブで滅菌した。これとは別に、予
め上記と同一組成の液体培地１００ｍ１を用い、セラチ
アφマルセッセンスＩＦＯ３０５２を５００ｍ１コブ付
フラスコで３０℃、ｔｅ時時間色う培養しておいた。こ
の培養液５ｍｌを前記滅菌済みの液体培地に接種し、３
０℃で１６時間培養した。培養終了後、遠心分離により
分離した湿菌体８ｇを１５ｍ　Ｍリン酸緩衝液１６ｍ１
　（ＰＨ７，０）中に懸濁させた。これに５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸酢酸えて水冷下で超音波破砕し、更に
遠心分離して得られた上清を粗酵素液とした。

次いで・直径１６ｍのカラムに弱陰イオン交換樹脂（ト
ヨノ＜−ル　ＤＥＡＥ　　６５０Ｍ）２０ａｌを充填し
・これに上記粗酵素液２０ｍ１を接触させて交換樹脂に
酵素を十分に吸着させた後、３．７ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で十分洗浄した。

上記のようにして酵素を吸着させた弱陰イオン交換樹脂
のカラムを３５℃に保ちながら、３．７ｍＭリン酸緩衝
液（ＰＨ７，０）に溶解した基質溶液（チミジン７．５
ｇ／Ｎ　、　）リフルオロメチルウラシル２．０ｇ／＃
）を、１０ｍ１／ｈｒの流速で５１７時間連続して通液
した。通液終了後、得られた流出液を合わせて高速液体
クロマトグラフィーで分析した。

その結果、仕込んだトリフルオロメチルウラシルからト
リフルオロチミジンへの収率は８５％であった。

［発明の効果］ 以上詳述したように、本発明によればセラチア属の細菌
、セラチア属の細菌の培養菌体から得られる反応活性を
有する酵素、または固定化酵素ヲ用いることにより、緩
和な反応条件でトリフルオロメチルウラシル及びデオキ
シリボース供与体からトリフルオロチミジンを高収率か
つ連続的に得ることができる。

出願人代理人　弁理士　鈴・江武彦

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する細菌の
   存在下で、トリフルオロメチルウラシルと２′−デオキ
   シアデノシン、２′−デオキシイノシン、２′−デオキ
   シグアノシン、チミジン、２′−デオキシウリジン及び
   ２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸からなる
   群から選ばれたデオキシリボース供与体とを、３０〜４
   ５℃の温度範囲内で反応させることを特徴とするトリフ
   ルオロチミジンの製造方法。
2. （２）セラチア属に属する細菌の培養菌体から得られた
   酵素であって、トリフルオロメチルウラシルとデオキシ
   リボース供与体との反応に活性を有する酵素またはその
   酵素を固定化した固定化酵素を用い、３０〜４５℃の温
   度範囲において、トリフルオロメチルウラシルと２′−
   デオキシアデノシン、２′−デオキシイノシン、２′−
   デオキシグアノシン、チミジン、２′−デオキシウリジ
   ン及び２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸か
   らなる群から選ばれたデオキシリボース供与体とを反応
   させることを特徴とするトリフルオロチミジンの製造方
   法。