JPS6336755B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化酵母を用いるアデノシン−5′−
トリリン酸の製法に関する。 アデノシン−5′−トリリン酸（以下、単に
ATPと略称する）は生体内における吸エルゴン
的生合成反応にエネルギーあるいはリン酸供与体
として関与するリン酸化合物であつて、脳血管障
害や筋萎縮症の治療薬等の医薬用途のほか、生化
学的試薬としても重要視されているものである。 従来、ATPの製造法としては、アデノシン−
5′−モノリン酸（以下、単にAMPと略称する）
からの化学的合成法による他、ATP生合成系の
酵素をもつ酵母や細菌等の微生物菌体あるいは該
微生物菌体から抽出された該酵素を利用する方法
等多数知られている。 例えば (1) アデノシンまたはAMPから酵素的にATPを
製造する場合、あらかじめ酵母を界面活性剤ま
たはトルエンで処理する方法（特公昭46−
20759号、米国特許第2606899号、同第2700038
号および西ドイツ特許第703400号）や、アセト
ン乾燥、凍結乾燥もしくは風乾等乾燥処理する
方法〔特開昭50−42093号、J.Ferment.
Technol.45、511〜529（1967）〕 (2) アデノシンまたはAMP、リン酸供与体およ
び糖源を含む反応液にミクロバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属細菌菌体もしくはそ
の処理物を酵素的に作用させる方法（特公昭48
−15635号） (3) アデニンまたはその誘導体の存在する培地
に、界面活性剤の存在または非存在下にADP
およびATP生成能を有するミクロコツカス属
またはブレビバクテリウム属細菌を培養して
ATPを生成蓄積させる方法（特公昭46−28827
号、特公昭49−28996号） (4) AMPまたはADPにポリリン酸と微生物菌体
より抽出されたポリリン酸キナーゼおよびアデ
ニル酸キナーゼを加えて反応させる方法（特公
昭53−5752号）等が報告されている。しかしな
がら、これらの方法において第１法はATP合
成反応に先立ち、酵母菌体の膜透過性を向上せ
しめるため、該菌体を界面活性剤またはトルエ
ン処理するかあるいは乾燥処理する如きはん雑
な前処理を必要とし、また第２法は細菌菌体ま
たはその処理物を利用する方法ではあるが、こ
の方法もやはり菌体の膜透過性を増すため反応
に先立ち菌体に上記と同様のはん雑な前処理を
必要とするものである。さらに、第３法は発酵
法による方法であるが、一般的に発酵法による
場合は培養管理あるいは装置の面で問題がある
と共に、生成したATPの単離操作がはん雑で
あり、また、更に、第４法は使用する酵素を、
微生物菌体から抽出する如きはん雑な手間を要
すると共に、抽出操作を通じて該酵素活性が低
下乃至失活する等の難点がある。そしてこれら
の方法のうち微生物菌体を利用する方法におい
てはATP生成系の酵素と共に、その分解系の
酵素も併存するためATPの蓄積量を増大せし
め得ない難点もある。これに対し最近、ATP
を酵素的に製造するにあたり、ATP生成系の
酵素をもつ微生物菌体を固定化することにより
ATPを効率よく製造しようとする方法も提案
されている。例えばアセトン乾燥酵母を光硬化
性樹脂エチレングリコール・ヒドロキシエチル
アクリレートに固定化し、これをアデノシン、
グルコース、リン酸カリウム緩衝液および硫酸
マグネシウムを含む溶液に作用させる方法
（M.Asada et al.Agric.Biol.Chem.43 1773
（1979））、あるいは乾燥パン酵母を、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノエチルメタクリレートとアクリ
ル酸とを、更に架橋剤としてポリエチレングリ
コールジメタクリレートを使用し共重合させて
なるゲル担体に固定化し、この固定化酵母をグ
ルコース、無機リン酸およびアデノシンに作用
させる方法（日本農芸化学会昭和55年度大会講
演要旨集、第19頁）等であるが、これらの方法
で用いる固定化酵母は、乾燥酵母であるので前
記と同様の難点がある。 上記に対して、本発明者等は種々研究を重ねた
結果、サツカロミセス属に属し解糖系活性を有す
る酵母菌体をそのままポリアクリルアミドゲルに
固定化すれば、意外にも該酵母菌体をあらかじめ
前処理を行なわなくても膜透過性が著しく改善さ
れること、菌体内に併存するATP分解系の酵素
が失活することおよび解糖系活性が殆んど低下し
ないことを見い出した。 かかる知見に基づく本発明は、サツカロミセス
属に属し解糖系活性を有する酵母（以下、単に酵
母と云う）菌体のけん濁液中でアクリル酸アミド
単量体を重合反応させ、かくして得られた固定化
酵母をATP前駆物質、解糖系基質、マグネシウ
ムイオンおよびリン酸供与体に作用させることを
特徴とするATPの製法である。 本発明において、ポリアクリルアミドに固定化
される酵母としては、特に限定されないが、とり
わけ解糖系活性の強い、例えばサツカロミセス・
セレビジアエIF02044、サツカロミセス・カール
スベルゲンシスIF01859の如きパン酵母乃至ビー
ル酵母を好適に用いることができる。 該酵母菌体をポリアクリルアミドゲルに固定化
するには、文献公知の固定化法をいずれも採用し
て行なうことができ、例えば、まず上記した如き
解糖系活性を有する酵母を、炭素源としてグルコ
ース、シユークロース、グリセロールの如き糖
類、クエン酸、コハク酸の如き有機酸を約0.5％
〜約２％、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムの如き無機窒素化合物、ペプトン、
酵母エキス、肉エキスの如き有機窒素化合物を約
0.5％〜約２％をそれぞれ含有し、更にリン酸化
合物、硫酸マグネシウム、硫酸マンガンなどを適
当に含有する培地に培養し、ついで増殖した酵母
菌体を遠心分離等の適当な方法によつて集菌した
のち生理食塩水で洗浄して酵母菌体を取得する。
この酵母菌体0.5〜0.8ｇ／mlの水けん濁液にアク
リルアミド単量体を酵母菌体に対して10〜20W／
Ｗ％を加え、更に架橋剤（例えばＮ，N′−メチ
レンビスアクリルアミド等）、重合促進剤（例え
ばβ−ジメチルアミノプロピオニトリル等）およ
び重合開始剤（例えば過硫酸カリウム等）をアク
リルアミド単量体に対して１〜7W／Ｗ％、４〜
8W／Ｗ％および５〜10W／Ｗ％それぞれ加え０
〜25℃とりわけ５℃で５分〜10分間静置すること
により重合させることができ、ついで生成したゲ
ルを適当な大きさ、形状に成型することによりポ
リアクリルアミドゲルに酵母菌体を固定化するこ
とができる。 本発明において、ポリアクリルアミドゲルに固
定化した解糖系活性を有する酵母（以下、単に固
定化酵母という）を用いるATP生成反応は、
ATP前駆物質、解糖系基質、マグネシウムイオ
ン及びリン酸供与体を適量含む水溶液を調製し、
これに固定化酵母を接触させることにより実施す
ることができる。 この場合において、ATP前駆物質としては、
アデノシンのほか、例えばAMP、ADP等のアデ
ノシン誘導体を好適に用いることができる。更に
マグネシウムイオン源としては例えば塩化マグネ
シウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等
を好適に使用することができる。リン酸供与体と
しては、リン酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム、リン酸アンモニウムの如き無機リン酸又は
その塩、あるいはリン酸塩緩衝液を用いることが
できるが、とりわけリン酸塩緩衝液を用いれば反
応液PHの変動が殆んどなく好ましい。これら
ATP前駆物質、解糖系基質、マグネシウムイオ
ンおよびリン酸供与体は、固定化酵母１〜５ml
（解糖系活性；2.0mg／ゲルml／ｈ）に対して
ATP前駆物質を約0.005〜0.05モル、とりわけ約
0.01モル、解糖系基質を約0.05〜1.0モル、とりわ
け約0.5モル、マグネシウムイオンを約0.001〜
0.05モル、とりわけ0.005モル、リン酸供与体を
約0.05〜1.0モル濃度、とりわけ約0.2モル濃度と
なるように使用するのが好ましい。 また、本発明においては反応系にジチオスレイ
トール、Ｌ−システイン又は２−メルカプトエタ
ノールを存在させれば反応時間を著しく短縮する
ことができるので好ましい。該化合物は約0.001
〜0.05モル、とりわけ約0.02モルとなるように添
加するのが好ましい。 本発明の反応はバツチ法およびカラム法のいず
れによつても実施することができ、バツチ法によ
る場合は上記のATP前駆物質、解糖系基質、マ
グネシウムイオンおよびリン酸供与体を含有する
水溶液に、固定化酵母を加え、かくはん乃至振と
うして反応を実施するのが好ましい。この場合、
PHは約６〜7.5、とりわけ7.0、反応温度は約25〜
37℃、とりわけ30℃がよく、反応時間は約５〜10
時間、とりわけ上記至適条件下では６時間で終了
する。また、カラム法による場合、固定化酵母を
カラムに充填し、これに上記ATP前駆物質、解
糖系基質、マグネシウムイオンおよびリン酸供与
体を含有する水溶液を上記反応条件下に導通して
実施するとよく、この場合、該反応液の導通速度
はSV約0.05〜2.0、とりわけ約0.1〜0.3が好まし
い。 本発明によれば、ATP製造に際してポリアク
リルアミドゲルに固定化した酵母を用いるので、
該酵素反応をバツチ法のみならず、カラム法も実
施することができ、ATPの連続生産を行なうこ
とができる上、生成したATPの回収も容易であ
る等の効果が得られるものである。 以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例 １ (1) 固定化酵母の調製 サツカロミセス・セレビジアエIFO2044をグ
ルコース0.5％、ペプトン1.0％、酵母エキス1.0
％、肉エキス1.0％、塩化ナトリウム0.5％を含
む培地（PH6.0）に接種し30℃で20時間振とう
培養する。集菌後、生理食塩水で一度洗浄した
後、生菌体28ｇ（湿重量）を30％塩化カリウム
溶液15mlに懸濁し、これに33.5％アクリルアミ
ドモノマー12ml、20％Ｎ，N′−メチレンビス
アクリルアミド２ml、5.0％β−ジメチルアミ
ノプロピオニトリル５mlおよび6.7％過硫酸カ
リウム６mlを加え、５℃にて５分間放置する。
ついで固定化した酵母を１辺２mmの立方体に成
型し、生理食塩水にて洗浄することにより、固
定化サツカロミセス・セレビジアエIFO2044、
70ｇ（湿重量）を得る。 (2) ATPの生成及び結果 (1)の固定化酵母3.0mlをアデノシン10ミリモ
ル、塩化マグネシウム５ミリモル、グルコース
0.5モル及びリン酸緩衝液（PH7.0）0.1モルを含
む反応液10ml中で振とう反応させ、経時的に生
成したATPを定量した。 ATP量は、ヘキソキナーゼとグルコース−
６−リン酸脱水素酵素共役反応によつて生じる
（NADPの還元に基づく）340nｍの吸光度の変
化より算出した。（以下同） 経時的ATPの生成量は第１表の如くであつ
た。

【表】 実施例 ２ 実施例１−(1)と同様にして得た固定化酵母を用
い、実施例１−(2)と同様の条件でリン酸緩衝液濃
度のみを種々変化させ生成するATPを定量した。
結果を第２表に示す。

【表】 実施例 ３ 実施例２と同様に、実施例１の条件のうちアデ
ノシン濃度のみを種々変化させ生成するATPを
定量した。結果を第３表に示す。

【表】 実施例 ４ 実施例１−(1)と同様にして調整した固定化酵母
を用い、反応基質としてグルコースに代えて解糖
系中間体であるフラクトース−１，６−ジリン酸
を用いて反応を行なつた。但しアデノシン濃度は
50ミリモル、反応時間は６時間とした。結果を第
４表に示す。

【表】 実施例 ５ 実施例１−(1)と同様にして調製した固定化酵母
を用い、アデノシン15ミリモル、塩化マグネシウ
ム５ミリモル、グルコース0.5モル及びリン酸緩
衝液（PH7.0）0.1モルにジチオスレイトール0.01
モルを加えた反応液で振とう反応させ、経時的に
生成したATPを定量した。結果を第５表に示す。

【表】 実施例 ６ 実施例５と同様にして反応させた反応液をろ過
して固定化酵母を除き、得られるろ液を強塩基性
陰イオン交換樹脂Dowex1×２（Cl^-型）に導通し
てATPを吸着させる。ついで吸着したATPを0.5
規定塩酸にて溶出し0.5規定水酸化ナトリウムで
中和する。中和液を濃縮し、冷却することにより
ATPナトリウム塩72mgを得る。収率80％ 実施例 ７ 実施例１−(1)と同様にして調製した固定化酵母
５mlをカラムに充填し、カラム下端よりグルコー
ス0.5モル、リン酸緩衝液（PH7.0）0.1モル、塩化
マグネシウム0.01モル、アデノシン15ミリモル、
アデノシン−5′−モノリン酸１ミリモル、ニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド0.5ミリモ
ル及びジチオスレイトール１ミリモルを含む基質
溶液を種々の流速で導通し、上端より流出する流
出液中のATP量を測定した。流速とATP生成量
の関係を第６表に示す。

【表】 実施例 ８ 実施例６と同様の固定化酵母充填カラムに、実
施例６と同一組成の基質溶液を流速0.3（S.V.／時
間）で導通し連続反応した場合の反応日数と
ATP生成量の変化を調べた。本発明の固定化酵
母は９日経過後も第１日目の活性の91％の活性が
認められATPを生産した。反応日数とATP生成
量を第７表に示す。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ サツカロミセス属に属し解糖系活性を有する
   酵母菌体のけん濁液中でアクリル酸アミド単量体
   を重合反応させ、かくして得られた固定化酵母を
   アデノシン−5′−トリリン酸前駆物質、解糖系基
   質、マグネシウムイオンおよびリン酸供与体に作
   用させることを特徴とするアデノシン−5′−トリ
   リン酸の製法。