JPH0582200B2 - - Google Patents
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- JPH0582200B2 JPH0582200B2 JP60275162A JP27516285A JPH0582200B2 JP H0582200 B2 JPH0582200 B2 JP H0582200B2 JP 60275162 A JP60275162 A JP 60275162A JP 27516285 A JP27516285 A JP 27516285A JP H0582200 B2 JPH0582200 B2 JP H0582200B2
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、母乳中に含まれているオリゴ糖の一
種であるＮ−アセチルラクトサミンを、微生物と
酵素との作用により短時間で収率よく製造するＮ
−アセチルラクトサミンの製造法に関する。
種であるＮ−アセチルラクトサミンを、微生物と
酵素との作用により短時間で収率よく製造するＮ
−アセチルラクトサミンの製造法に関する。
従来の技術
Ｎ−アセチルラクトサミン（以下LacNACと
略記する）は、人乳オリゴ糖あるいは糖タンパク
質、糖脂質の糖鎖中に含まれる、ガラクトースと
Ｎ−アセチルグルコサミンがβ1、４結合した２
糖類であつて、腸内におけるビフイズス菌の増殖
活性を有していて優れた整腸作用を示すことか
ら、育児用調製粉乳のような高度栄養食品への利
用上重要視されている。
略記する）は、人乳オリゴ糖あるいは糖タンパク
質、糖脂質の糖鎖中に含まれる、ガラクトースと
Ｎ−アセチルグルコサミンがβ1、４結合した２
糖類であつて、腸内におけるビフイズス菌の増殖
活性を有していて優れた整腸作用を示すことか
ら、育児用調製粉乳のような高度栄養食品への利
用上重要視されている。
従来、LacNACの合成法については、Brew
et al.の報告プロシーデングス・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.、
59，491，1968）がある。この方法は、ウリジン
ジリン酸ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミ
ンを基質として、これに牛乳由来の牛乳ガラクト
シルトランスフエラーゼを作用させてLacNAC
を合成することから成る。
et al.の報告プロシーデングス・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.、
59，491，1968）がある。この方法は、ウリジン
ジリン酸ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミ
ンを基質として、これに牛乳由来の牛乳ガラクト
シルトランスフエラーゼを作用させてLacNAC
を合成することから成る。
しかし、この合成法は、基質として用いるウリ
ジンジリン酸ガラクトースが高価であるため、工
業的規模での合成法としては実用性に乏しい。
ジンジリン酸ガラクトースが高価であるため、工
業的規模での合成法としては実用性に乏しい。
一方、基質であるウリジンジリン酸ガラクトー
スの製造法として、ウリジンモノリン酸とガラク
トースを含む反応液に、サツカロミセス属、キヤ
ンデイダ属、トルロプシス属もしくはプレタノマ
イセス属に属する微生物の菌体もしくは乾燥菌体
等を作用させることにより、ウリジンジリン酸ガ
ラクトースを比較的で高収率で合成する方法（特
公昭47−1837号）が提案されている。
スの製造法として、ウリジンモノリン酸とガラク
トースを含む反応液に、サツカロミセス属、キヤ
ンデイダ属、トルロプシス属もしくはプレタノマ
イセス属に属する微生物の菌体もしくは乾燥菌体
等を作用させることにより、ウリジンジリン酸ガ
ラクトースを比較的で高収率で合成する方法（特
公昭47−1837号）が提案されている。
しかし、上記方法を利用してLacNACを合成
するには、該方法で得られたウリジンジリン酸ガ
ラクトースとＮ−アセチルグルコサミンを基質と
し、これに牛乳ガラクトシルトランスフエラーゼ
を作用させて反応させるという２工程の組合わせ
が必要となり、各工程毎での作業管理を別々に行
うことも必要となるので工業上有利な合成法とは
言えない。
するには、該方法で得られたウリジンジリン酸ガ
ラクトースとＮ−アセチルグルコサミンを基質と
し、これに牛乳ガラクトシルトランスフエラーゼ
を作用させて反応させるという２工程の組合わせ
が必要となり、各工程毎での作業管理を別々に行
うことも必要となるので工業上有利な合成法とは
言えない。
発明が解決しようとする問題点
本発明者らは、LacNACを工業的に一そう効
率よく合成するための方法について検討した結
果、LacNACを１工程で効率よく合成し得る方
法を達成し、本発明をなすに至つた。
率よく合成するための方法について検討した結
果、LacNACを１工程で効率よく合成し得る方
法を達成し、本発明をなすに至つた。
すなわち、本発明の目的は、ウリジンリン酸ガ
ラクトースの合成反応とLacNACの合成反応を
同一系内で行うことにより、LacNACを１工程
で極めて短時間で効率よく合成するための方法を
提供することにある。
ラクトースの合成反応とLacNACの合成反応を
同一系内で行うことにより、LacNACを１工程
で極めて短時間で効率よく合成するための方法を
提供することにある。
因に、従来の２工程方式では、ウリジンリン酸
ガラクトースを反応液からイオン交換樹脂を用い
て精製する必要があり、反応開始からウリジンリ
ン酸ガラクトースを得るのに10日間以上を要す
る。
ガラクトースを反応液からイオン交換樹脂を用い
て精製する必要があり、反応開始からウリジンリ
ン酸ガラクトースを得るのに10日間以上を要す
る。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成
本発明の特徴は、5′−ウリジンモノリン酸、ガ
ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンを含
む基質に、トルロプシス属に属するウリジンジリ
ン酸ガラクトース産生能を有する微生物と牛乳ガ
ラクトシルトランスフエラーゼを同時的に作用さ
せてＮ−アセチルラクトサミンを合成し、これを
単離することにある。
ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンを含
む基質に、トルロプシス属に属するウリジンジリ
ン酸ガラクトース産生能を有する微生物と牛乳ガ
ラクトシルトランスフエラーゼを同時的に作用さ
せてＮ−アセチルラクトサミンを合成し、これを
単離することにある。
問題点を解決するための手段
本発明において用いる微生物は、トルロプシス
属に属する酵母であつて、菌体自体、菌体磨砕
物、菌体抽出物もしくは乾燥菌体等の形態で使用
し得る。ここで利用する微生物としてはトルロプ
シス・ホルミイー（Torulopsis Holmii）KY−
５（微工研寄第5766号）、トルロプシス・キヤンデ
イタ（Torulopsis candida）IFO 0768を例示で
きる。
属に属する酵母であつて、菌体自体、菌体磨砕
物、菌体抽出物もしくは乾燥菌体等の形態で使用
し得る。ここで利用する微生物としてはトルロプ
シス・ホルミイー（Torulopsis Holmii）KY−
５（微工研寄第5766号）、トルロプシス・キヤンデ
イタ（Torulopsis candida）IFO 0768を例示で
きる。
これらの微生物の培養はその特性に応じて行わ
れるが、通常の微生物の培養に用いられる培地中
で行われる。例えば、炭素源として可溶性デンプ
ン、乳糖、グルコース、ガラクトース、シヨ糖
等、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母抽出
物を含む培地を用いることができる。
れるが、通常の微生物の培養に用いられる培地中
で行われる。例えば、炭素源として可溶性デンプ
ン、乳糖、グルコース、ガラクトース、シヨ糖
等、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母抽出
物を含む培地を用いることができる。
また、本発明で用いられる牛乳ガラクトシルト
ランスフエラーゼは、牛乳から採取、精製したも
のが用いられるが、必ずしも高度に精製したもの
でなくてもよく、部分精製したものでも有効に用
い得る。
ランスフエラーゼは、牛乳から採取、精製したも
のが用いられるが、必ずしも高度に精製したもの
でなくてもよく、部分精製したものでも有効に用
い得る。
本発明では、上記微生物および牛乳ガラクトシ
ルトランスフエラーゼを、5′−ウリジンモノリン
酸、ガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミ
ンを含む反応基質に同時的に添加して作用させ
る。
ルトランスフエラーゼを、5′−ウリジンモノリン
酸、ガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミ
ンを含む反応基質に同時的に添加して作用させ
る。
この場合、反応基質のPHを４〜９、温度５〜40
℃に保持して２〜６日間作用させることが好まし
い。また、反応基質における各原料物質は、ウリ
ジンモノリン酸を0.5〜４％（ｗ／ｗ）、ガラクト
ースを３〜６％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液２〜４
％（ｗ／ｗ）及びＮ−アセチルグルコサミンを
100〜300mM濃度となし、上記酵母（乾燥菌体と
して）を10〜20ｇ％および牛乳ガラクトシルトラ
ンスフエラーゼ１〜５ｇ％の割合の組成にするこ
とが好ましい。なお、基質にはリン酸供与体（リ
ン酸として）200〜400mモル濃度および酵母の生
育促進物質としてマグネシウム塩（MgSO4とし
て）10〜30mモル濃度の割合で添加する。ここで
Mg++は酵母のエネルギー生成反応に関与する酵
素を活性化する。
℃に保持して２〜６日間作用させることが好まし
い。また、反応基質における各原料物質は、ウリ
ジンモノリン酸を0.5〜４％（ｗ／ｗ）、ガラクト
ースを３〜６％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液２〜４
％（ｗ／ｗ）及びＮ−アセチルグルコサミンを
100〜300mM濃度となし、上記酵母（乾燥菌体と
して）を10〜20ｇ％および牛乳ガラクトシルトラ
ンスフエラーゼ１〜５ｇ％の割合の組成にするこ
とが好ましい。なお、基質にはリン酸供与体（リ
ン酸として）200〜400mモル濃度および酵母の生
育促進物質としてマグネシウム塩（MgSO4とし
て）10〜30mモル濃度の割合で添加する。ここで
Mg++は酵母のエネルギー生成反応に関与する酵
素を活性化する。
上記基質に酵母と牛乳ガラクトシルトランスフ
エラーゼを同時的に添加して作用させると、酵母
の作用によるウリジンモノリン酸とガラクトース
とからのウリジンジリン酸ガラクトースの合成反
応と、牛乳ガラクトシルトランスフエラーゼによ
るウリジンジリン酸ガラクトースとＮ−アセチル
グルコサミンとからのLacNACの合成反応が同
一系内で行われ、LacNACが従来の２工程の組
合わせから成る方法に比べて非常に短時間で合成
される。
エラーゼを同時的に添加して作用させると、酵母
の作用によるウリジンモノリン酸とガラクトース
とからのウリジンジリン酸ガラクトースの合成反
応と、牛乳ガラクトシルトランスフエラーゼによ
るウリジンジリン酸ガラクトースとＮ−アセチル
グルコサミンとからのLacNACの合成反応が同
一系内で行われ、LacNACが従来の２工程の組
合わせから成る方法に比べて非常に短時間で合成
される。
このような複合酵素系を同時的に作用させるこ
とにより、上記両反応が同一系内で効率的行われ
るのは、本発明で利用する微生物の特性に因るも
のと推定されるが、LacNAC合成上の従来の技
術水準からは予期し得ないことである。
とにより、上記両反応が同一系内で効率的行われ
るのは、本発明で利用する微生物の特性に因るも
のと推定されるが、LacNAC合成上の従来の技
術水準からは予期し得ないことである。
上述のようにして得られたLacNACは、必要
に応じてイオン交換樹脂および活性炭で処理して
分離、精製される。
に応じてイオン交換樹脂および活性炭で処理して
分離、精製される。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。
明する。
実施例
乾燥酵母の調製
トルロプシス・ホルミイーKY−５株
（Torulopsis holmii KY−５）微工研菌寄第
5766号を、ガラクトース50ｇ、ペプトン５ｇ、酵
母エキス５ｇ、リン酸−１−カリウム２ｇ、リン
酸−２−アンモニウム２ｇ、および硫酸マグネシ
ウム７水和物１ｇを含む培養液１に接種して、
30℃で72時間振とう培養した。培養終了後に、
8000Gで30分間遠心分離して集菌し、１の水を
加えて数回洗浄した後、凍結乾燥して乾燥酵母30
ｇを調製した。
（Torulopsis holmii KY−５）微工研菌寄第
5766号を、ガラクトース50ｇ、ペプトン５ｇ、酵
母エキス５ｇ、リン酸−１−カリウム２ｇ、リン
酸−２−アンモニウム２ｇ、および硫酸マグネシ
ウム７水和物１ｇを含む培養液１に接種して、
30℃で72時間振とう培養した。培養終了後に、
8000Gで30分間遠心分離して集菌し、１の水を
加えて数回洗浄した後、凍結乾燥して乾燥酵母30
ｇを調製した。
牛乳ガラクトシルトランスフエラーゼの調製
４の脱脂乳に40の蒸留水を加えて、これに
乾燥CM−セフアデツクスＣ−50 20ｇを加えて
酢酸でPH6.5に調整した。
乾燥CM−セフアデツクスＣ−50 20ｇを加えて
酢酸でPH6.5に調整した。
次に、上記混合液を濾過して得たゲルを２の
0.02モル濃度食塩で洗浄後、カラム（φ10×40mm）
に充填し、0.1モル濃度ジメチルグルタル酸ナト
リウム（PH8.0）で溶出した。この溶出により得
られた活性を有する画分を集め、これに等容の硫
安飽和溶液を加えて生じた沈澱を8000Gで15分間
遠心分離して集めた。沈澱物に少量の水を加えて
溶解して透析した後、凍結乾燥して牛乳ガラクト
シルトランスフエラーゼ200mgを調製した。
0.02モル濃度食塩で洗浄後、カラム（φ10×40mm）
に充填し、0.1モル濃度ジメチルグルタル酸ナト
リウム（PH8.0）で溶出した。この溶出により得
られた活性を有する画分を集め、これに等容の硫
安飽和溶液を加えて生じた沈澱を8000Gで15分間
遠心分離して集めた。沈澱物に少量の水を加えて
溶解して透析した後、凍結乾燥して牛乳ガラクト
シルトランスフエラーゼ200mgを調製した。
LacNACの合成反応
5′−ウリジンモノリン酸1.9％、ガラクトース
3.6ｇ％、リン酸緩衝液２％、硫酸マグネシウム
0.14ｇ％、Ｎ−アセチルグルコサミン3.4％、上
記の方法で調製した乾燥酵母10％および牛乳ガラ
クトシルトランスフエラーゼ1.5％を含む混液10
mlを、30℃で５日間反応させた。反応により反応
液100ml当り、1.5％のLacNACが合成された。
3.6ｇ％、リン酸緩衝液２％、硫酸マグネシウム
0.14ｇ％、Ｎ−アセチルグルコサミン3.4％、上
記の方法で調製した乾燥酵母10％および牛乳ガラ
クトシルトランスフエラーゼ1.5％を含む混液10
mlを、30℃で５日間反応させた。反応により反応
液100ml当り、1.5％のLacNACが合成された。
分離精製
前記の条件で反応させて得られた反応混合液10
mlを、0.45μmメンブランで濾過して菌体成分を
除いた後、ダウエツクス１×２（Cl型）カラム
（φ10×10cm）に通じて核酸を除いた。
mlを、0.45μmメンブランで濾過して菌体成分を
除いた後、ダウエツクス１×２（Cl型）カラム
（φ10×10cm）に通じて核酸を除いた。
次に得られた液を活性炭：ゼオライト（２：
１）カラム（φ10×30cm）に通じて十分量の
水を流して未反応のガラクトース−Ｎ−アセ
チルグルコサミンを除いた後、50％アルコー
ル２を通じてLacNACを溶出させた。溶
出液を濃縮乾燥して白色粉末130mgを得た。
この標品中のLacNAC純度は92％であつた。
収率は原料の5′−ウリジンモノリン酸に対し
て10％であつた。
１）カラム（φ10×30cm）に通じて十分量の
水を流して未反応のガラクトース−Ｎ−アセ
チルグルコサミンを除いた後、50％アルコー
ル２を通じてLacNACを溶出させた。溶
出液を濃縮乾燥して白色粉末130mgを得た。
この標品中のLacNAC純度は92％であつた。
収率は原料の5′−ウリジンモノリン酸に対し
て10％であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 5′−ウリジンモノリン酸、ガラクトースおよ
びＮ−アセチルグルコサミンを含む基質に、トル
ロプシス属に属するウリジンジリン酸ガラクトー
ス産生能を有する微生物と牛乳ガラクトシルトラ
ンスフエラーゼとを同時に作用させてＮ−アセチ
ルラクトサミンを産生させ、これを単離すること
を特徴とするＮ−アセチルラクトサミンの製造
法。 ２ 微生物がトルロプシス・ホルミー
（Torulopsis holmii）KY−５（微工研菌寄第
5766号）である特許請求の範囲１記載の方法。 ３ 基質には、5′−ウリジンモノリン酸0.5〜４
％（ｗ／ｗ）、ガラクトース３〜６％（ｗ／ｗ）
及びＮ−アセチルグルコサミン100〜300mM含有
させ、２〜４％（ｗ／ｗ）のリン酸緩衝液中でPH
４〜９において温度５〜40℃で２〜６日間Ｎ−ア
セチルラクトサミン産生反応を行う特許請求の範
囲１記載の製造法。 ４ Ｎ−アセチルラクトサミン産生反応にリン酸
供与体及びマグネシウム化合物を関与させる特許
請求の範囲１記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60275162A JPS62134096A (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60275162A JPS62134096A (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62134096A JPS62134096A (ja) | 1987-06-17 |
| JPH0582200B2 true JPH0582200B2 (ja) | 1993-11-17 |
Family
ID=17551536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60275162A Granted JPS62134096A (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62134096A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3927801A1 (de) * | 1989-08-23 | 1991-02-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur enzymatischen synthese galactosylierter glycoprotein-bausteine |
| CA2237849C (en) * | 1996-09-17 | 2009-06-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates |
-
1985
- 1985-12-09 JP JP60275162A patent/JPS62134096A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62134096A (ja) | 1987-06-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |