JPH1028594A - ウリジン二リン酸−ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 - Google Patents
ウリジン二リン酸−ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法Info
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- JPH1028594A JPH1028594A JP8207959A JP20795996A JPH1028594A JP H1028594 A JPH1028594 A JP H1028594A JP 8207959 A JP8207959 A JP 8207959A JP 20795996 A JP20795996 A JP 20795996A JP H1028594 A JPH1028594 A JP H1028594A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として用
いた場合であっても収率よくウリジン二リン酸−Ｎ−ア
セチルグルコサミン（ＵＤＰＡＧ）を製造する方法を提
供する。 【解決手段】酵母を用いてウリジル酸とＮ−アセチルグ
ルコサミンからＵＤＰＡＧを製造する方法であって、反
応系にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させる
ことを特徴とするＵＤＰＡＧの製造方法に関する。
いた場合であっても収率よくウリジン二リン酸−Ｎ−ア
セチルグルコサミン（ＵＤＰＡＧ）を製造する方法を提
供する。 【解決手段】酵母を用いてウリジル酸とＮ−アセチルグ
ルコサミンからＵＤＰＡＧを製造する方法であって、反
応系にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させる
ことを特徴とするＵＤＰＡＧの製造方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖合成の重要な
基質であるウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン（ＵＤＰＡＧ）の製造法に関するものである。
基質であるウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン（ＵＤＰＡＧ）の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖鎖についての研究が急速に進
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。
【０００３】従来、オリゴ糖の製造は天然物からの抽出
法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの
併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大
量製造に適した方法であると考えられている。すなわ
ち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱
保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的の
オリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性によ
り、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点
などが他の方法より有利と考えられるためである。さら
に、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成酵
素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつある
ことが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果と
なっている。
法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの
併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大
量製造に適した方法であると考えられている。すなわ
ち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱
保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的の
オリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性によ
り、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点
などが他の方法より有利と考えられるためである。さら
に、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成酵
素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつある
ことが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果と
なっている。
【０００４】酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い
単糖を用いることができるという利点はあるものの、反
応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成
収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった
点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。一
方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成収率
や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で
前者の方法よりも有利であると考えられており、また、
近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の
量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い
単糖を用いることができるという利点はあるものの、反
応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成
収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった
点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。一
方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成収率
や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で
前者の方法よりも有利であると考えられており、また、
近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の
量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
【０００５】しかしながら、糖転移酵素を用いる合成法
で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のもの
を除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずか
な供給量でしか提供し得ないのが現状である。多くの生
理活性糖鎖のコア部分に含まれるＮ−アセチルグルコサ
ミンの供与体であるＵＤＰＡＧについても耐浸透圧性酵
母を用いる方法などが報告されているものの（特開平８
−２３９９３号公報）、工業的生産の現実化までにはま
だまだ検討の余地が残されている。
で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のもの
を除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずか
な供給量でしか提供し得ないのが現状である。多くの生
理活性糖鎖のコア部分に含まれるＮ−アセチルグルコサ
ミンの供与体であるＵＤＰＡＧについても耐浸透圧性酵
母を用いる方法などが報告されているものの（特開平８
−２３９９３号公報）、工業的生産の現実化までにはま
だまだ検討の余地が残されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、酵母中
でのＵＤＰＡＧを生合成経路について検討した結果、グ
ルコサミンがグルコサミン−６−リン酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−リン酸を経てＮ−アセチルグルコサ
ミン−１−リン酸まで活性化される一連の反応経路の中
でグルコサミン−６−リン酸からＮ−アセチルグルコサ
ミン−６−リン酸へのアセチル化反応が律速段階となっ
ていることを突き止めた。このため、Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−リン酸を基質とすればＵＤＰＡＧの合成
効率は向上するものの、この物質を安価にしかも大量に
入手することは現時点では不可能である。
でのＵＤＰＡＧを生合成経路について検討した結果、グ
ルコサミンがグルコサミン−６−リン酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−リン酸を経てＮ−アセチルグルコサ
ミン−１−リン酸まで活性化される一連の反応経路の中
でグルコサミン−６−リン酸からＮ−アセチルグルコサ
ミン−６−リン酸へのアセチル化反応が律速段階となっ
ていることを突き止めた。このため、Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−リン酸を基質とすればＵＤＰＡＧの合成
効率は向上するものの、この物質を安価にしかも大量に
入手することは現時点では不可能である。
【０００７】そこで、現時点において安価にしかも大量
に供給可能なＮ−アセチルグルコサミンを基質として用
いることができれば、律速段階であるアセチル化反応を
経なくてすみ、グルコサミンよりも理想的な基質となり
得ると考え、栃倉らにより報告されているウリジル酸と
Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として用いた酵母によ
るＵＤＰＡＧの製造方法（特公昭４９−８２７８号公
報：栃倉法）について検討を行った。しかしながら、グ
ルコサミンよりもＮ−アセチルグルコサミンを基質とし
て用いた方がＵＤＰＡＧの生成量が減少し、ごく僅かの
ＵＤＰＡＧしか製造できないという栃倉らの報告を再確
認したに過ぎないものであった。したがって、本発明
は、栃倉法を改良し、Ｎ−アセチルグルコサミンを基質
として用いた場合であっても収率よくＵＤＰＡＧを製造
する方法を提供することを目的とするものである。
に供給可能なＮ−アセチルグルコサミンを基質として用
いることができれば、律速段階であるアセチル化反応を
経なくてすみ、グルコサミンよりも理想的な基質となり
得ると考え、栃倉らにより報告されているウリジル酸と
Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として用いた酵母によ
るＵＤＰＡＧの製造方法（特公昭４９−８２７８号公
報：栃倉法）について検討を行った。しかしながら、グ
ルコサミンよりもＮ−アセチルグルコサミンを基質とし
て用いた方がＵＤＰＡＧの生成量が減少し、ごく僅かの
ＵＤＰＡＧしか製造できないという栃倉らの報告を再確
認したに過ぎないものであった。したがって、本発明
は、栃倉法を改良し、Ｎ−アセチルグルコサミンを基質
として用いた場合であっても収率よくＵＤＰＡＧを製造
する方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく研究を重ねた結果、（１）Ｎ−アセチルグル
コサミンをリン酸化する酵素活性がパン酵母中にはほと
んどないか、あってもごく微弱であり、このためにＮ−
アセチルグルコサミンが基質となりえなこと、（２）反
応系にＮ−アセチルグルコサミンのリン酸化酵素である
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させること
で、効率的にＵＤＰＡＧを製造することができることを
見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
酵母を用いてウリジル酸（ＵＭＰ）とＮ−アセチルグル
コサミンからＵＤＰＡＧを製造する方法であって、反応
系にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させるこ
とを特徴とするＵＤＰＡＧの製造法に関するものであ
る。
達成すべく研究を重ねた結果、（１）Ｎ−アセチルグル
コサミンをリン酸化する酵素活性がパン酵母中にはほと
んどないか、あってもごく微弱であり、このためにＮ−
アセチルグルコサミンが基質となりえなこと、（２）反
応系にＮ−アセチルグルコサミンのリン酸化酵素である
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させること
で、効率的にＵＤＰＡＧを製造することができることを
見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
酵母を用いてウリジル酸（ＵＭＰ）とＮ−アセチルグル
コサミンからＵＤＰＡＧを製造する方法であって、反応
系にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させるこ
とを特徴とするＵＤＰＡＧの製造法に関するものであ
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明で使用する酵母としては、
従来のＵＤＰＡＧの製造、たとえば栃倉法で使用されて
いた酵母であれば特に制限なく使用することができる。
具体的には、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyce
s）属、カンディダ（Candida）属、トルロプシス（Toru
lopsis）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、デバリオミ
セス（Debaryomyces）属などの属に属する酵母を使用す
ることができる。このような酵母は、生酵母、乾燥酵母
いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾
燥酵母を用いるのが好ましい。反応に使用するＵＭＰと
Ｎ−アセチルグルコサミンは既に市販されており、この
市販品を使用することができる。使用濃度としては、た
とえばそれぞれ１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１０
０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
従来のＵＤＰＡＧの製造、たとえば栃倉法で使用されて
いた酵母であれば特に制限なく使用することができる。
具体的には、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyce
s）属、カンディダ（Candida）属、トルロプシス（Toru
lopsis）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、デバリオミ
セス（Debaryomyces）属などの属に属する酵母を使用す
ることができる。このような酵母は、生酵母、乾燥酵母
いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾
燥酵母を用いるのが好ましい。反応に使用するＵＭＰと
Ｎ−アセチルグルコサミンは既に市販されており、この
市販品を使用することができる。使用濃度としては、た
とえばそれぞれ１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１０
０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
【００１０】上記ＵＭＰとＮ−アセチルグルコサミン以
外に、好ましくは無機リン酸とエネルギー源を反応系に
添加し、本発明方法を実施する。使用する無機リン酸と
しては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することも
できるが、好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用するの
が好ましい。使用濃度は、たとえば１０〜５００ｍＭ、
好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲から適宜設定する
ことができる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜
８．０の範囲から適宜設定すればよい。エネルギー源と
しては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、
クエン酸などの有機酸を使用することができる。
外に、好ましくは無機リン酸とエネルギー源を反応系に
添加し、本発明方法を実施する。使用する無機リン酸と
しては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することも
できるが、好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用するの
が好ましい。使用濃度は、たとえば１０〜５００ｍＭ、
好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲から適宜設定する
ことができる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜
８．０の範囲から適宜設定すればよい。エネルギー源と
しては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、
クエン酸などの有機酸を使用することができる。
【００１１】本発明において、反応系に共存させるＮ−
アセチルグルコサミンキナーゼとしては、動物由来、植
物由来、微生物由来など、特定の由来のものに限定され
ず、すべての由来のものを使用することができる。しか
し、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来のＮ−ア
セチルグルコサミンキナーゼを使用するのが好都合であ
る。微生物由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼに
関しては、既にキャンディダ（Candida）属（Biochemic
a et Biophysica Acta, 614,350(1980)）、ストレプト
コッカス（Streptococcus）属（Methods in Enzymolog
y,9,415(1966)）及びエッシェリヒア（Escherichia）属
（Methods in Enzymology,9,421(1966)）に属する微生
物において報告がなされている。また、本発明者らの行
ったスクリーニングの結果においても、バシラス（Baci
llus）属、クレブシェラ（Klebsiella）属などの多くの
細菌において比較的強いＮ−アセチルグルコサミンキナ
ーゼ活性を確認している。
アセチルグルコサミンキナーゼとしては、動物由来、植
物由来、微生物由来など、特定の由来のものに限定され
ず、すべての由来のものを使用することができる。しか
し、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来のＮ−ア
セチルグルコサミンキナーゼを使用するのが好都合であ
る。微生物由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼに
関しては、既にキャンディダ（Candida）属（Biochemic
a et Biophysica Acta, 614,350(1980)）、ストレプト
コッカス（Streptococcus）属（Methods in Enzymolog
y,9,415(1966)）及びエッシェリヒア（Escherichia）属
（Methods in Enzymology,9,421(1966)）に属する微生
物において報告がなされている。また、本発明者らの行
ったスクリーニングの結果においても、バシラス（Baci
llus）属、クレブシェラ（Klebsiella）属などの多くの
細菌において比較的強いＮ−アセチルグルコサミンキナ
ーゼ活性を確認している。
【００１２】反応系に添加するＮ−アセチルグルコサミ
ンキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態で
あってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処
理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示
することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物
が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離
等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシ
ラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）またはクレブシェラ・プランティコラ（Klebs
iella planticola）に属する細菌を例に挙げ説明すれ
ば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプ
トン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）ま
たは２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イースト
エキストラクト、０．５％食塩）などを使用することが
でき、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜
５０時間程度必要により攪拌しながら培養し、得られた
培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性を有する微生物
菌体を調製することができる。
ンキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態で
あってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処
理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示
することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物
が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離
等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシ
ラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）またはクレブシェラ・プランティコラ（Klebs
iella planticola）に属する細菌を例に挙げ説明すれ
ば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプ
トン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）ま
たは２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イースト
エキストラクト、０．５％食塩）などを使用することが
でき、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜
５０時間程度必要により攪拌しながら培養し、得られた
培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性を有する微生物
菌体を調製することができる。
【００１３】微生物の菌体処理物としては、上記微生物
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
【００１４】酵素調製物としては、上記菌体処理物から
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性を有する画分を
通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有
機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処
理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示
することができる。微生物菌体からのＮ−アセチルグル
コサミンキナーゼの調製法を具体的に説明すれば、集菌
して得られた菌体を超音波処理により菌体を破砕し、菌
体破壊液を遠心して上清を得、この上清に硫酸アンモニ
ウムを添加し、３０〜５４％飽和画分を回収する。回収
した沈澱を脱塩後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー処
理を施し、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性画分
を濃縮、脱塩することで目的とする酵素調製物を取得す
ることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性を有する画分を
通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有
機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処
理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示
することができる。微生物菌体からのＮ−アセチルグル
コサミンキナーゼの調製法を具体的に説明すれば、集菌
して得られた菌体を超音波処理により菌体を破砕し、菌
体破壊液を遠心して上清を得、この上清に硫酸アンモニ
ウムを添加し、３０〜５４％飽和画分を回収する。回収
した沈澱を脱塩後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー処
理を施し、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性画分
を濃縮、脱塩することで目的とする酵素調製物を取得す
ることができる。
【００１５】ＵＤＰＡＧの合成反応は、リン酸緩衝液中
に酵母、ＵＭＰ、Ｎ−アセチルグルコサミン、エネルギ
ー源として糖類を添加し、さらにＮ−アセチルグルコサ
ミンキナーゼを０．００１ユニット／ｍｌ以上、好まし
くは０．００１〜１００ユニット／ｍｌ、さらに好まし
くは０．０１〜１０ユニット／ｍｌ添加し、５〜３０℃
以下、好ましくは５〜２０℃で１〜５０時間程度、必要
により攪拌しながら反応させることにより実施できる。
また、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼの添加時期
は、反応開始時が好ましいものの、反応途中で添加して
もかまわない。このようにして得られたＵＤＰＡＧは、
糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）
により単離精製することができる。
に酵母、ＵＭＰ、Ｎ−アセチルグルコサミン、エネルギ
ー源として糖類を添加し、さらにＮ−アセチルグルコサ
ミンキナーゼを０．００１ユニット／ｍｌ以上、好まし
くは０．００１〜１００ユニット／ｍｌ、さらに好まし
くは０．０１〜１０ユニット／ｍｌ添加し、５〜３０℃
以下、好ましくは５〜２０℃で１〜５０時間程度、必要
により攪拌しながら反応させることにより実施できる。
また、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼの添加時期
は、反応開始時が好ましいものの、反応途中で添加して
もかまわない。このようにして得られたＵＤＰＡＧは、
糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）
により単離精製することができる。
【００１６】なお、本発明におけるＮ−アセチルグルコ
サミンキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法で測定、算出したものである。 Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性の測定と単位の
算出法；１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン溶液、５
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍ
Ｍ アデノシン三リン酸溶液、１００ｍＭ 塩化マグネ
シウム溶液を各々５０μｌずつ分注後、５０μｌ酵素調
製液を添加し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。ま
た、アデノシン三リン酸溶液の代わりに水を用いて同様
の反応を行わせ、コントロールとする。
サミンキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法で測定、算出したものである。 Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性の測定と単位の
算出法；１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン溶液、５
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍ
Ｍ アデノシン三リン酸溶液、１００ｍＭ 塩化マグネ
シウム溶液を各々５０μｌずつ分注後、５０μｌ酵素調
製液を添加し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。ま
た、アデノシン三リン酸溶液の代わりに水を用いて同様
の反応を行わせ、コントロールとする。
【００１７】反応液に５％硫酸亜鉛溶液および１５０ｍ
Ｍ水酸化バリウム溶液各々５００μｌを添加して反応を
停止させ、遠心分離にて沈殿を除去後、別の容器に上清
１６６μｌを分取し、これに３３μｌホウ酸塩溶液
（４．９５ｇのホウ酸を５０ｍｌの水に溶解し、１Ｎ水
酸化カリウムでｐＨ９．１に調整したものを水で１００
ｍｌとする）を添加後、３分間煮沸する。煮沸後、水で
室温まで冷却してから１ｍｌ ＤＭＢＡ試薬（１０ｇの
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１０Ｎ塩酸を１
２．５％含む氷酢酸１００ｍｌに溶解し、これを使用直
前に氷酢酸で１０倍希釈したもの）を混和し、３７℃で
２０分間放置した後、分光光度計で５８５ｎｍの吸収を
測定する。濃度既知のＮ−アセチルグルコサミン溶液に
より作成した検量線より反応液中の残存するＮ−アセチ
ルグルコサミンの量を算出し、３７℃で１分間に１μＭ
のＮ−アセチルグルコサミンが消費される活性を１単位
（ユニット）とする。
Ｍ水酸化バリウム溶液各々５００μｌを添加して反応を
停止させ、遠心分離にて沈殿を除去後、別の容器に上清
１６６μｌを分取し、これに３３μｌホウ酸塩溶液
（４．９５ｇのホウ酸を５０ｍｌの水に溶解し、１Ｎ水
酸化カリウムでｐＨ９．１に調整したものを水で１００
ｍｌとする）を添加後、３分間煮沸する。煮沸後、水で
室温まで冷却してから１ｍｌ ＤＭＢＡ試薬（１０ｇの
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１０Ｎ塩酸を１
２．５％含む氷酢酸１００ｍｌに溶解し、これを使用直
前に氷酢酸で１０倍希釈したもの）を混和し、３７℃で
２０分間放置した後、分光光度計で５８５ｎｍの吸収を
測定する。濃度既知のＮ−アセチルグルコサミン溶液に
より作成した検量線より反応液中の残存するＮ−アセチ
ルグルコサミンの量を算出し、３７℃で１分間に１μＭ
のＮ−アセチルグルコサミンが消費される活性を１単位
（ユニット）とする。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、従来の栃倉法では基質と
しての利用価値に低かったＮ−アセチルグルコサミンを
基質として用いた場合であってもＵＤＰＡＧを効率的に
製造することが初めて可能となったのである。この方法
は、Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として用いること
により律速段階であるアセチル化反応を経なくて済み、
グルコサミンを基質として用いる方法よりも有利と考え
られる。
しての利用価値に低かったＮ−アセチルグルコサミンを
基質として用いた場合であってもＵＤＰＡＧを効率的に
製造することが初めて可能となったのである。この方法
は、Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として用いること
により律速段階であるアセチル化反応を経なくて済み、
グルコサミンを基質として用いる方法よりも有利と考え
られる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰＡＧの定
量にはＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離にはＹ
ＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液と
して０．５Ｍ リン酸一カリウム溶液を用いた。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰＡＧの定
量にはＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離にはＹ
ＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液と
して０．５Ｍ リン酸一カリウム溶液を用いた。
【００２０】実施例１ （１）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼの調製 １０ｍｌの２×ＹＴ（１．６％トリプトン、１％イース
トエキストラクト、０．５％食塩）に一白金耳の Bacil
lus stearothermophilus ATCC15952 を植菌して、５０
℃にて２４時間振とう培養した。これを前培養菌体とし
て５００ｍｌ容坂口フラスコに入った１００ｍｌの２×
ＹＴに植菌して５０℃にて１８時間振とう培養した。３
リットル（Ｌ）の培養液から遠心分離によって菌体を回
収し、５００ｍｌの１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に菌体を再懸濁した。遠心分離により回収した
菌体を、３００ｍｌのＰＥＮ（５０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ Ｎ−
アセチルグルコサミン）に懸濁したのち、超音波破砕処
理により菌体を破砕した。遠心分離により得た上清を粗
酵素液とした。
トエキストラクト、０．５％食塩）に一白金耳の Bacil
lus stearothermophilus ATCC15952 を植菌して、５０
℃にて２４時間振とう培養した。これを前培養菌体とし
て５００ｍｌ容坂口フラスコに入った１００ｍｌの２×
ＹＴに植菌して５０℃にて１８時間振とう培養した。３
リットル（Ｌ）の培養液から遠心分離によって菌体を回
収し、５００ｍｌの１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に菌体を再懸濁した。遠心分離により回収した
菌体を、３００ｍｌのＰＥＮ（５０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ Ｎ−
アセチルグルコサミン）に懸濁したのち、超音波破砕処
理により菌体を破砕した。遠心分離により得た上清を粗
酵素液とした。
【００２１】回収された２７０ｍｌの粗酵素液には１．
０５ユニット／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミンキナー
ゼ活性が含まれており、タンパク質あたりの活性は０．
０７ユニット／ｍｇであった。粗酵素液に硫酸アンモニ
ウム９０％飽和溶液を２７０ｍｌ添加して冷所で１時間
放置したのち遠心分離にて上清を回収した。回収液に対
してさらに１３５ｍｌの硫酸アンモニウム９０％飽和溶
液を添加して得た沈殿を回収、３０ｍｌのＰＥＮに溶解
したものをＰＥＮに対して透析して４３．５ｍｌの酵素
調製物を得た。この酵素標品には４．５ユニット／ｍｌ
のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性が含まれてお
り、タンパク質あたりの活性は０．２１ユニット／ｍｇ
であった。
０５ユニット／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミンキナー
ゼ活性が含まれており、タンパク質あたりの活性は０．
０７ユニット／ｍｇであった。粗酵素液に硫酸アンモニ
ウム９０％飽和溶液を２７０ｍｌ添加して冷所で１時間
放置したのち遠心分離にて上清を回収した。回収液に対
してさらに１３５ｍｌの硫酸アンモニウム９０％飽和溶
液を添加して得た沈殿を回収、３０ｍｌのＰＥＮに溶解
したものをＰＥＮに対して透析して４３．５ｍｌの酵素
調製物を得た。この酵素標品には４．５ユニット／ｍｌ
のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性が含まれてお
り、タンパク質あたりの活性は０．２１ユニット／ｍｇ
であった。
【００２２】次に DEAE-toyopearl 650M（２．２×２５
ｃｍカラム）による分画を行った。０から０．５Ｍの食
塩の濃度勾配で溶出して得たフラクションから活性画分
を回収したところ、４７．５ｍｌの回収液を得た。これ
に９５ｍｌの硫酸アンモニウム９０％飽和溶液を添加し
て冷所に放置後、遠心分離により沈殿を回収した。１５
ｍｌのＰＥＮに沈殿を溶解後、ＰＥＮに対して透析して
部分精製酵素２１ｍｌを得た。これには６．８４ユニッ
ト／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性が含
まれており、タンパク質あたりの活性は０．９９ユニッ
ト／ｍｇであった。
ｃｍカラム）による分画を行った。０から０．５Ｍの食
塩の濃度勾配で溶出して得たフラクションから活性画分
を回収したところ、４７．５ｍｌの回収液を得た。これ
に９５ｍｌの硫酸アンモニウム９０％飽和溶液を添加し
て冷所に放置後、遠心分離により沈殿を回収した。１５
ｍｌのＰＥＮに沈殿を溶解後、ＰＥＮに対して透析して
部分精製酵素２１ｍｌを得た。これには６．８４ユニッ
ト／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ活性が含
まれており、タンパク質あたりの活性は０．９９ユニッ
ト／ｍｇであった。
【００２３】（２）ＵＤＰＡＧの合成 ２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および所定の活性を含む Bacillus stearothermophilus
ATCC15952 由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ
調製物（部分精製酵素）を含む反応液１０ｍｌに乾燥パ
ン酵母（オリエンタル酵母工業）１ｇを添加し、２０℃
で攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を行
った結果を図１に示す。図１から明らかなように、反応
液中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しない
時にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始
６時間後には０．１ユニット／ｍｌ添加で９．２ｍＭ、
０．２ユニット／ｍｌ添加で１１．５ｍＭのＵＤＰＡＧ
が反応液中に生成しているのが明らかとなった。
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および所定の活性を含む Bacillus stearothermophilus
ATCC15952 由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼ
調製物（部分精製酵素）を含む反応液１０ｍｌに乾燥パ
ン酵母（オリエンタル酵母工業）１ｇを添加し、２０℃
で攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を行
った結果を図１に示す。図１から明らかなように、反応
液中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しない
時にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始
６時間後には０．１ユニット／ｍｌ添加で９．２ｍＭ、
０．２ユニット／ｍｌ添加で１１．５ｍＭのＵＤＰＡＧ
が反応液中に生成しているのが明らかとなった。
【００２４】実施例２ ２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および実施例１の（１）と同様にして調製した Escheri
chia coli IAM1268 由来のＮ−アセチルグルコサミンキ
ナーゼ２ユニットを含む反応液（１０ｍｌ）に乾燥パン
酵母（オリエンタル酵母工業）を１ｇ添加し、２０℃で
攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を行っ
た結果を図２に示す。図２から明らかなように、反応液
中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しない時
にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセチル
グルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始８
時間後に７．３ｍＭのＵＤＰＡＧが生成した。
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および実施例１の（１）と同様にして調製した Escheri
chia coli IAM1268 由来のＮ−アセチルグルコサミンキ
ナーゼ２ユニットを含む反応液（１０ｍｌ）に乾燥パン
酵母（オリエンタル酵母工業）を１ｇ添加し、２０℃で
攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を行っ
た結果を図２に示す。図２から明らかなように、反応液
中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しない時
にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセチル
グルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始８
時間後に７．３ｍＭのＵＤＰＡＧが生成した。
【００２５】実施例３ ２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および実施例１の（１）と同様にして調製した Klebsie
lla planticolaIFO3317 由来のＮ−アセチルグルコサミ
ンキナーゼ２ユニットを含む反応液（１０ｍｌ）に乾燥
パン酵母（オリエンタル酵母工業）を１ｇ添加し、２０
℃で攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を
行った結果を図３に示す。図３から明らかなように、反
応液中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しな
い時にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセ
チルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開
始８時間後に７．８ｍＭのＵＤＰＡＧが生成した。
塩化マグネシウム、３０ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭ グルコース
および実施例１の（１）と同様にして調製した Klebsie
lla planticolaIFO3317 由来のＮ−アセチルグルコサミ
ンキナーゼ２ユニットを含む反応液（１０ｍｌ）に乾燥
パン酵母（オリエンタル酵母工業）を１ｇ添加し、２０
℃で攪拌しつつ反応を行った。経時的に反応液の分析を
行った結果を図３に示す。図３から明らかなように、反
応液中にＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを添加しな
い時にはＵＤＰＡＧは全く生成しなかったが、Ｎ−アセ
チルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開
始８時間後に７．８ｍＭのＵＤＰＡＧが生成した。
【００２６】実施例４ 実施例１と同様の反応液組成で液量を１０００ｍｌとし
て２４時間反応を行った後、反応液のｐＨを塩酸により
３．０として、遠心により上清を回収した。回収液中の
ＵＤＰＡＧを定量したところ、７．２ｇのＵＤＰＡＧが
含まれていた。
て２４時間反応を行った後、反応液のｐＨを塩酸により
３．０として、遠心により上清を回収した。回収液中の
ＵＤＰＡＧを定量したところ、７．２ｇのＵＤＰＡＧが
含まれていた。
【００２７】
【図１】図１は、Bacillus stearothermophilus ATCC15
952 由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存さ
せたときのＵＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したもので
ある。
952 由来のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存さ
せたときのＵＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したもので
ある。
【図２】図２は、Escherichia coli IAM1268 由来のＮ
−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させたときのＵ
ＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したものである。
−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させたときのＵ
ＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したものである。
【図３】図３は、Klebsiella planticola IFO3317 由来
のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させたとき
のＵＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したものである。
のＮ−アセチルグルコサミンキナーゼを共存させたとき
のＵＤＰＡＧ生成量の経時変化を示したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:22）
Claims (3)
- 【請求項１】 酵母を用いてウリジル酸とＮ−アセチル
グルコサミンからウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグル
コサミンを製造する方法であって、反応系にＮ−アセチ
ルグルコサミンキナーゼを共存させることを特徴とする
ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造
法。 - 【請求項２】 Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼが細
菌由来のものである、請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼがバ
シラス（Bcillus）属、エッシェリヒア（Escherichia）
属またはクレブシェラ（Klebsiella）属に属する細菌由
来のものである、請求項１記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8207959A JPH1028594A (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | ウリジン二リン酸−ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8207959A JPH1028594A (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | ウリジン二リン酸−ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1028594A true JPH1028594A (ja) | 1998-02-03 |
Family
ID=16548366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8207959A Pending JPH1028594A (ja) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | ウリジン二リン酸−ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1028594A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011810A1 (fr) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Yamasa Corporation | Procede de production d'uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| JP2002335988A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-11-26 | Yamasa Shoyu Co Ltd | オリゴ糖の製造法 |
-
1996
- 1996-07-18 JP JP8207959A patent/JPH1028594A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011810A1 (fr) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Yamasa Corporation | Procede de production d'uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| US6287819B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-09-11 | Yamasa Corporation | Process for producing uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| JP2002335988A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-11-26 | Yamasa Shoyu Co Ltd | オリゴ糖の製造法 |
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