JPH01199577A

JPH01199577A - イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途

Info

Publication number: JPH01199577A
Application number: JP63024762A
Authority: JP
Inventors: Akimichi Amemura; 雨村　明倫; Masamitsu Futai; 二井　將光
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1988-02-04
Filing date: 1988-02-04
Publication date: 1989-08-10
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: KR0133727B1; CA1336509C; EP0327391B1; EP0327391A3; DE68928271T2; EP0327391A2; KR890013059A; DE68928271D1; JP2838798B2; US5118622A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドと
そのポリペプチドとβ−アミラーゼとを用いて澱粉質を
加水分解し、マルトース高含有物を製造する方法に関す
る。

〈従来の技術〉澱粉やグリコーゲンのα−１，６グルコシド結合を加水
分解する酵素、すなわち、イソアミラーゼ（ＥＣ３，２
，１，６８）は、例えば、アプライド　マイクロバイオ
ロジー（八ρρ１ｉｅｄ　Ｈｉｃｒａｂｉｏｌｏｇｙ）
　、第１６巻、第１４３９乃至１４４４頁（１９６８年
）および同誌第２８巻、第３３６乃至３３９頁（１９７
４年）などにも記載されているように、シュードモナス
　アミロデラモーサ（Ｐｓａｕｃｌｏｎｏｎａｓ　ａｍ
ｙｌｏｄｅｒａｎｌｏｓａ）から産生され、エフイービ
ーニス　　レターズ（ＦＥＢＳ　ＬｅｔｔｅｒＳ）　、
第５７巻、第１乃至４頁（１９７５年）などに記載され
ているように、サイトファーガ［Ｃｙｔｏｐｈａａａ）
属に属する一菌株から産生され、また、スターチシュテ
ルケ（Ｓｔａｒｃｈ　ＳｔＭｒｋｅ）　、第３２巻、第
１３２乃至１３６頁（１９８０年）などに記載されてい
るように、フラボバクテリウム（Ｆ　１ａｖｏｂａｃｔ
ｅｒ１ｕｎ）属に属する一菌株がら産生され、更に、ア
プライド　アンド　エンパイアロメンタル　マイクロバ
イオロジー（八ｏｏｌｉｅｄ　ａｎｄ　ＥｎＶｌｒｏｌ
ｌｌｅｎｉａｌ　ＨｈＣｒｏｂｉｏｌＨｙ）　、第４４
巻、第１２５３乃至１２５７頁（１９８２年）などに記
載されているようにリボマイセス　コノネ７　コニ（Ｌ
Ｖｌ］Ｏ１′ｌｌ’１１ＣｅＳ　ＫＯｎＯｎｅｎｋＯｅ
）から産生されることが知られている。

しかしながら、これらの記載から明らかなように、イソ
アミラーゼは、一部の酵素的性質しか知られておらす、
工業上、安定して供給し、安心して利用する上にはなお
不充分であり、より解明されたイソアミラーゼの確立が
望まれている。

〈発明が解決しようとする課題〉本発明者等は、より詳細に解明されたイソアミラーゼ、
とりわけ、アミノ酸配列まで解明されたイソアミラーゼ
活性を有するポリペプチド（以下、本明細書では、単に
、ポリペプチドと略称する。）と、その用途について鋭
意研究した。

その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、（ａ　）　）４ｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−＾５ｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒおよび、（ｂ）　　八ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−
八５ｐ−１，ｅ、ｕから選ばれる１種または２種の配列
を有していることが判明し、更に詳細には、前記の部分
配列がＮ末端側から近い順に、（ａ）および（ｂ）の部
分配列を有していることが判明した。

そして、その特徴的性質としては、澱粉やグリコーゲン
に作用して、それらのα−１，６グリコシド結合を加水
分解する作用を有する。

以下、本発明の内容を詳述し、併せて、本発明の詳細な
説明する。

本明細書の記載において、アミノ酸、ペプチド、その他
に関し、略号で表記する場合、それらは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものである。それらの例を以下に列
記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場合に
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ＲＮＡ　：リボ核酸Ａ　、アテニンＴ　：チミンＧ　ニゲアニンＣ、シトシンｄＮＴＰ：チオキシヌクレオチド二リン酸ｄｄＮＴＰ　
ニジデオキシヌクレオチド三リン酸ｄ　ＣＴＰ　：デオ
キシシチジン二リン酸ＳＤＳニドデシル硫酸ナトリウムＡｌａ：アラニンＡｒｇ：アルギニンＡｓｎ：アスパラギンＡｓｐ：アスパラギン酸Ｃｙｓ　：シスヂインＧｌｎ：グルタミンＧ　１　ｕ　：グルタミン酸ＧｌｙニゲリシンＨｉｓ：ヒスチジンＩｃｅ：インロイシンＬｅｕ：ロイシンＬｙｓ：リジンＭｅｔ：メチオニンＰｈｅ　：フェニルアラニンＰｒｏ　ニブロリンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＴｒｐ：）リプトファンＴｙｒ：チロシンＶａｌ：バリン本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、イソ
アミラーゼ産生菌からポリペプチド遺伝子をクローニン
グした後、その塩基配列を解読して決定した。

一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部分のアミノ酸
配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プロ
ティン　シークエンサーを用いて調べた。

ポリペプチド遺伝子のクローニングポリペプチド産生能を有する供与体微生物より、その微
生物のＤＮＡを分離精製した後、例えば、超音波、制限
酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同様にして
ベクターを切断して得られたベクター断片とを、例えば
、ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチド遺
伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。

この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能を
有する微生物、例えば、米国特許第３゜５６０．３４５
号明細書に記載されているシュードモナス　アミロデラ
モーサ（ＰｓｅｕｄｏＩｉｌｃ＋ｎａｓ　ａｌｙｌ。

ｄｅｒａｍｏｓａ）　ＡＴＣＣ２１２６２、または、こ
れらの変異株などが有利に用いられる。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約１〜３日間通気゛撹拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって調製することができる。溶菌方法は、例え
ば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。また、必
要によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸
ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍
結融解処理を施すことも自由である。

このようにして得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。

ＤＮＡを切断する方法は、例えは、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるＤＮＡ
断片とベクター断片との結合を容易にするためには、制
限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する。例
えば、５ａｕ３Ａ　　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ　　ｍ
、ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ　　Ｉ、Ｘｍａ　　Ｉ、Ｘｂａ　
　Ｉ、Ｓａｃ　　Ｉ、Ｐｓｔ　　Ｉなとの■型制限酵素
が適している。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドが適している。

ファージとしては、例えば、エッシェリヒアコリ（Ｅｓ
ｃｈ’ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが、バチル
ス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）を宿主微生物とする場合には、ρ１１、φ１、φ１０
５などが使用できる。

また、プラスミドとしては、例えば、エツシェリヒア　
コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
ｃ１８などが、バチルス　ズブチリスを宿主微生物とす
る場合には、ｐＵＢ　１１０、ｐＴＺ４　（ｐＴＰ４）
、ｐｃ１９４などが使用でき、更に、例えば、エッシェ
リヒア　コリ、バチルス　ズブチリスなどの二種以上の
宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、ｐＨＶ１４
、ＴＲｐ７、ＹＥｐ’７、ｐＢＳ７などのベクターを利
用することも可能である。このようなベクタニを、先に
述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、ベクター
断片を得る。゛ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えは、
ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体
外で適当なりＮＡリガーゼの作用により組み換えＤＮ’
Ａを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微
生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組
み換えＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
増殖が可能なものであればよい。

宿主微生物に組み換えＤＮＡを導入する方法は、公知の
方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する
微生物の場合にはカルシ７ウムイオン存在下で行ない、
バチルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル
法又はプロドプラシスト法などを採用することができる
。

組み換えＤＮＡが導入′され形質転換された形質転換微
生物の選択方法は、　　Ｐでラベルしたオリゴヌクレオ
チドを用いてのコロニーハイブリダイゼーション法、ま
たは澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からア
ミロースを生成するものを選択する方法などを用いれば
よい。

ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡを制限酵素な
どにより、切断してポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断
片とし、これと同様にプラスミドなどのベクターを切断
して得られるベクター断片とを結合させることも容易に
実施できることが判明した。

ポリペプチド遺伝も２ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、シーン（Ｇｅｎｅ）
、第９巻、第２５９乃至２６８頁（１９８２年）に示さ
れているジテオキシチェーンターミネータ−法で解読す
ればよい。

この方法は、クローニングにより得られたポリペプチド
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐｕｃｉｓなど
のプラスミドに制限酵素を利用して、そのクローニング
部位に挿入する。得られた組み換えプラスミドは、形質
転換によってエツシェリヒア　コリ　Ｊ　Ｍ　８３など
に移入し、次いで組み換えプラスミドを有する微生物を
選択する。

この微生物を増殖させたものを用いて組み換えプラスミ
ドを調製する。

得られた組み換えプラスミドを合成プライマーとアニー
リングし、これにフレノウ（にｌｅｎｏｗ）断片を働か
せてプライマーを伸長させ相補ＤＮＡを生成させる。

この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いで
、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチド
遺伝子の塩基配列を決定する。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。

ポリペプチドのアミノ酸配りポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より決定する
。　− また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。

ポリペプチドのＮ　・を　　　る部　アミノ　配列ポリペプチド産生能を有するシュードモナスアミロデラ
モーサを栄養培地で培養してポリペプチドを産生させる
。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これを硫安
分画、イオン交換クロマトクラフィー、高速液体クロマ
トグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドとする。

この試料を用いてジャーナル　オブ　バイオロジカル　
ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ１０１ｏ（］
１Ｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５６巻、第７９
９０乃至７９９７頁（１９８１年）の記載に準じて、気
相プロティン　シークエンサーにより分解し、高速液体
クロマトクラフィーで同定して、ポリペプチドのＮ末端
を含有する部分アミノ酸配列を決定する。

形　転換微生物によるポリペプチドの調製上述のように
して得られた形質転換微生物を栄養培地で培養すること
により多量のポリペプチドを安定して産生じうろことを
見いだした。

栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、更
に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養
素などを含有させればよい。

この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解物、
グルコース、フラクトース、スクロース、マルトースな
どの糖質が有利に用いられる。窒素源としては、アンモ
ニアカス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩など
の無機窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コー
ンステイープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜
用いられる。

培養方法は、例えは、液体培地をｐ　Ｈ２〜８、温度２
５〜６５°Ｃの範囲に維持しつつ、通気撹拌などの好気
的条件下で約１〜６日培養し、ポリペプチドを生成蓄積
せしめればよい。

培養物中のポリペプチドは、そのまま採取し利用するこ
ともできるか、一般には常法に従って、濾過、遠心分離
などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離した
後に利用される。

ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音
波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで
濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。

このようにして得られるポリペプチド溶液を、例えば、
減圧濃縮、膜濃縮、澱粉吸着、溶出し、更に、硫安、硫
酸ソータなどによる塩析、メタノール、エタノール、ア
セトンなどによる分別沈澱法などを適宜組み合せて精製
し、より高純度のボー　１８　＝リペプチドを採取して利用することも、更に、これらペ
プチドを常法に従って、担体結合法、架橋法、包括法な
どによって固定化して利用することも有利に実施できる
。

本発明で利用するポリペプチドは、特定するアミノ酸配
列まで解明され、安心して利用しうるちのであればよく
、先に述べた遺伝子組み換えによる形質転換微生物から
のもののみに限定されるものではない。

本発明のポリペプチドは、アミロペクチン、グリコーゲ
ンのα−１，６クリコシド結合を加水分解する酵素とし
て有利に利用でき、例えば、澱粉、アミロペクチン、澱
粉部分加水分解物など澱粉質からのアミロースの製造に
有利に利用できる。

また、これら澱粉質を基質とし、これに、ポリペプチド
とグルコアミラーゼを併用してグルコース高含有物の製
造、ポリペプチドとβ−アミラーゼとを併用してマルト
ース高含有物の製造が容易となる。

マルトース高含有物の製造方法としては、例えば、特公
昭４７　１３０８９号公報、特公昭５４　３９３８号公
報などに開示されている糊化又は液化澱粉にイソアミラ
ーゼとβ−アミラーゼとを作用させてマルトース高含有
物を採取する方法等がある。

この際、このようにして得られるマルトース高含有物に
象まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、例えば、
特公昭５６−２８１５３号公報、特公昭５７−３３５６
号公報、特公昭５６−２８１５４号公報などに開示され
て゛いる酵素を作用させてマルトースを生成するが、さ
らには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報などに
開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラム
分画法により夾雑糖類を除去するなどの方法によりマル
トース純度を更に高めることも好都合である。

次いで、これらのマルトース高含有物は、通常、濾過し
、活性炭による脱色およびＨ型、ＯＨ型イオン交換樹脂
による脱塩などの精製工程を経て、濃縮し、シラツブ状
製品を、更に、マルトースの種晶を加えて助晶し粉末化
して、粉末状結晶製品とするか、または助晶した後、分
密してきわめて高純度の結晶製品とする。

このようにして得られたマルトースは、甘味度の低い甘
味料として、また、注射用、経管栄養補給用糖質として
食品、医薬品分野に広く利用される。

更に、マルトースは、例えば、特開昭５７−１３４４９
８号公報に記載される方法により、水素添加してマルチ
トールを製造し、これを、難吸収性の甘味料、健康食品
、美容食品などに利用することも好都合である。

以下、実験で本発明の詳細な説明する。

実験１シュードモナス　アミロデラモーサ　ポリペプチド遺伝
子のエッシエリヒア　コリへのクローニング（１）シュードモナス　アミロデラモーサのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製シュードモナス　ア
ミロデラモーサ５Ｂ−１５（ＡＴＣＣ２１２６２）をヘ
フトンＩＷ／Ｖ％、酵母エキス０．５Ｗ／Ｖ％と塩化ナ
トリウム０゜５Ｗ／′■％を倉む培地で３０°Ｃ通気撹
拌培養した。

培養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体を２５　Ｗ
　／　Ｖ％スクロースを陰むトリス緩衝液（ｐＨ８，０
）に懸濁し、次にリゾチームを０．１５Ｗ／■％になる
様に加え２５℃で２０分間保持した。

これにＥＤＴＡを６２．５　ｍ　Ｍになる様に加え、さ
らに２０分間保持した後、ＳＤＳを０．０６２５Ｗ／Ｖ
％になる様に加え５７℃に加温し菌体を完全に溶菌させ
た。

この溶菌液をリボヌクレアーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製造、商品名ＲＮ　ａ　Ｓ　ｅ　Ａ　）およびプロ
テアーゼ（ベーリンガーマンハイム社製造、商品名Ｐｒ
ｏｎａｓｅ　　Ｋ）で処理し、次いで、クロロポルム・
イソアミルアルコール混液を加え、遠心分離して得られ
る上滑に２倍容のエタノールを加え、染色体ＤＮＡを回
収し、ＳＳＣＭ衝液（塩化ナトリウム、クエン酸３ナト
リウム倉有）に溶解した。再度、クロロホルム・イソア
ミルアルコール混液処理し、エタノール沈澱、次いでイ
ツブロバノール沈澱を行い精製染色体ＤＮＡを得た。

（２）プラスミドｐＵｃ９の調製プラスミドρＵＣ９はゼイ　メ・ｆヤーズ＜ｊ、Ｈｅｙ
ｅｒｓ）等の方法［ジＡ・−ナル　オブ　バクテリオロ
シー＜　ｊｏｕｒｎａ：　Ｏｆ　ＢａＣｔｅｒｉＯＩＯ
（ｌｙ）　、第１２７巻、第１５２４乃至１５３７頁＜
１９７６年）］に準じてエソシェリヒア　コリから分離
・調製した。

（３）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤ　Ｎ　Ａの
作製実験１−（１）で調製したポリペプチド遺伝子を含む精
製染色体ＤＮＡに対して制＠酵素５ａｕ３ＡＩ（宝酒造
株式会社製３＠　＞を作用させ染色体ＤＮＡを部分的に
切断した後、ショ糖密度勾配超遠心法で約３〜７Ｋｂｐ
の染色体ＤＮＡ断片を分離・取得した。

制限＃素ＢａｍＨ１（宝酒造株式会社製造）で完全に切
断したプラスミドベクターｐυＣ９と前記の約３〜７Ｋ
ｂｐの染色体ＤＮＡ断片を混合しＴ４ＤＮＡリカーゼ（
東洋紡績株式会社製造）を添加して４°Ｃで一夜反応さ
せて組み換えＤＮＡを作製した。

（４）ポリペプチド遺伝子を含む組み換Ｄ　Ｎ　Ａの選
択宿主微生物としてエソシェリヒア　コリＪＭ８３　（Ａ
ＴＣＣ３５６０７）を用いた。本微生物をＹＴツブス［
トリプロン０．８Ｗ／Ｖ％、酵母エキス０　、　５　Ｗ
／　Ｖ％と塩化ナトリウム０．２５Ｗ／′■％を含有］
で３７°Ｃ２７５分間培養し、集菌した後、５０　ｍ　
Ｍ塩化カルシウム水溶液に懸濁し、氷水中で４０分間静
置し、遠心分離にて集菌し、続いて塩化カルシウム水溶
液に懸濁したものに、実験１−（３）で得た組み換えＤ
ＮＡを加え、氷水中で６０分間静置した。更に、４２℃
に加温してＹＴツブスを加え、３７°Ｃで９０分間保ち
、その後遠心分離にて集菌し、塩化ナトリウム０．８５
Ｗ／Ｖ％に懸濁し、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−ガラクトシド（５ｂｒ。

ｍｏ’−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙ−β−ｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　　　ｏｒ　　　Ｘ−ｇａｌ）を
象有する培地に生育させ白色のコロニーを形成した微生
物を形質転換微生物として選択しな。得られた約１．１
００個のコロニーをニトロセルロース上に固定した。ポ
リペプチドのＮ末端から１１番目から１６番目のアミノ
酸配列に対応する合成りＮＡすなわちう・　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
゜ＩＡ　２Ｔ３Ａ４Ｃ５Ｔ　６Ａ　７Ｃ８Ｑ　９ＡＩＯ
ＧＩ！Ｔ１２Ｔ１３Ｑ１４’ｐ１５Ｔ！６ＣＩ７Ｑ　ｉ
７ｍｅ。

（Ｇ）　　　　（Ｇ）　　　　（Ｇ）　　　、（ｃ）　
　　、（Ｃ）（′ｒ）（Ｃ）（３番目の塩基はＡまたはＧ、６番目の塩基はＡまたは
Ｇ、９番目の塩基はＡ、Ｇ、　Ｔ、Ｃのいずれか、１２
番目の塩基はＴまたはＣ１１５番目の塩基はＴまたはＣ
であり、組み合わせて６４通りの合成りＮＡの混合物と
なる。）を３２ｐで標識したプローブに３０°Ｃで強く会合した
１３菌株を選んだ。

得られた１３菌株についてサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）−２５＝の方法［ジで一ナル　オブ　モリキュラー　バイオロジ
ー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　９８　、　５０３
．１９７５′Ｊにより、Ｎ末端から１５番目力）ら１９
９番目アミノ酸配列に対応する合成りＮＩ、プローブす
なわち５１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ン１’Ｇ
　２Ｔ　３Ｔ　’Ｃ５Ｇ　６Ａ　７Ｔ　”Ｔ　９Ａ”Ｔ
”Ａ”’Ａ１３Ｔ”Ｇ　　１４ｉａｒ（Ｃ）（Ｇ）（Ｇ
）（Ｇ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｃ）（３番目の塩基はＴまたはＣ２６番目の塩基はＡ、Ｇ、
Ｔ、Ｃのいずれか、９番目の塩基はＡまたはＧ、１２番
目の塩基はＡ、Ｇ、Ｔのいずれかであり、組み合わせて
４８通りの合成り　Ｎ　Ａの混合物となる。）とも会合する１菌株を選択した。

本微生物の一菌株をエツシエリヒア　コリＩＡＭ２７５
と命名し、これが保有する組み換えＤＮＡをｐＩＡＭ２
７５と命名した。

組み換えＤ　Ｎ　Ａ　Ｐ　Ｉ　Ａ　Ｍ　２７５について
シュー−２６＝トモナス　アミロデラモーサ由来ＤＮＡ部分の制限酵素
切断地図を図に示す。

図に示したＤＮＡ部分は、５．５に’ｏｐの大きさであ
る。

実験２シュードモナス　アミロデ°ラモーサ由来ポリペプチド
のＮ末端を含有した部分アミノ酸配列（１）ポリペプチ
ドの調製シュードモナス　アミロデラモーサ５Ｂ−１５＜ＡＴＣ
Ｃ２１２６２）をマルトース２Ｗ／′ｖ％、グルタミン
酸ナトリウム０．４Ｗ／Ｖ％、リン酸アンモニウム０　
、　１５　Ｗ／’Ｖ％、リン酸二カリウム０．１Ｗ／Ｖ
％、硫酸マグネシウム・７水塩０゜０５Ｗ／Ｖ％塩化鉄
・６水塩、塩化マンガン及び塩化ナトリウム各々０．０
ＯＯＩＷ／Ｖ％を含有する培地（ｐＨ７，０）にて３０
℃、３日間通気撹拌培養し、培地中にポリペプチドを産
生させた。

遠心分離して上滑を採取し、硫安塩析によりポリペプチ
ド画分を得、次いで、陰イオン交換体カラムクロマトグ
ラフィー（米国ブラウン社製造、商品名ＤＥＡＥ−セル
ロース）更に陽イオン交換体カラムクロマトグラフィー
（和光純薬工業株式会社製造、商品名ＣＭ−セルロース
）により精製して、高度に精製されたポリペプチドを採
取した。

本島の比活性は５９．Ｃｏｏ単位±５，０００単位／’
ｍｇ蛋白質を示しな。

本明細書でいうイソアミラーゼ活性１単位とは、１．０
Ｗ／Ｖ％可溶性モチゴメ澱粉５ｍｌに０．５Ｍ酢酸緩衝
液（ｐ　Ｈ３、５）　１　ｍｌを加え、次いで酵素液１
ｍｌを加え、４０℃で一定時間反応させた後１ｍｌをと
り、これにＯ，０１Ｍヨード・ヨードカリ溶液１　ｍｌ
を加え２５ｍ１に水で希釈し、１５分後に液層１■で６
１０ｎｍの吸光度を測定し、反応１時間に吸光度０．０
１増加させる酵素量を１単位とした。

（２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実感２−（１
）の方法で調製したポリペプチドを気相プロティン　シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社製造、商品
名　４７０Ａ型）にかけ、次いで高速液体クロマトグラ
フィーにより分析してＮ末端を含有する部分アミノ酸配
列を決定した。

結果は、八１ａ−１１ｅ−Ａｓｒ＋−３ｅｒ−Ｎｅｔ−
３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ　１ａ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ａ　１ａ−ＧＩｎ−ＧＩｎ−八１ａ−Ａｓｎ−
ｉ　Ｉｅ−Ｔｔｌｒ−Ｐｈｅの配列を有していることが
判明した。

実験３シュードモナス　アミロデラモーサ由来ポリペプチド遺
伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列（１）プラスミドρＵＣｌ３の調製プラスミドｐＵＣ１８はこれを導入したエッシェリヒア
　コリＪＭ８３から実験１−（２）の方法に準じて調製
した。

〈２）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡの作製実験１−　（３）の方法に準じて組み換えＤＮＡを作製
した。即ち、実験１−　（２）の方法で調製したポリペ
プチド遺伝子を含むプラスミドに各種制限酵素を作用さ
せて切断し、ポリペプチド遺伝子を含む断片を得、また
実験３−（１）の方法で調製したプラスミドｐＵｃ１８
を同様に各種制限酵素で切断しこれら両断片にＴ４ＤＮ
Ａリカーゼを作用させて組み換えＤＮＡを作製した。

（３）組み換えＤＮＡのエツシェリヒア　コリへの導入エッシェリヒア　コリ　Ｊ　Ｍ　８３に実験１−（４）
の方法に準じて組み換えＤ　Ｎ　Ａを移入し形質転換さ
せた。

（４）形質転換微生物からの組み換えＤ　Ｎ　Ａの調製形質転換微生物を抗生物質アンピシリン５０μｇ　／　
ｍｌを含むし一グロスで培養し、得られる菌体からアル
カリ溶菌法により組み換えＤＮＡを調製した。

（５）組み換えＤＮＡの塩基配列ジデオキシ　チェーン　ターミネータ法に従って解読し
た。

即ち、実験３−（４）て−調製した組み換えＤＮＡと合
成プライマー（１７塩基）を加え、６０℃で２０分間ア
ニーリングした後、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、［α−３２
２］αＣＴＰおよびクレノー断片を加え、３７°Ｃで３
０分間反応させ、プライマーを５′側から３′方向へ伸
長させて相補ＤＮＡを生成させた。これに過剰のｄＮＴ
Ｐを加えて、さらに３７°Ｃで３０分間反応させた後、
ホルムアミド色素溶液を加えて、反応を停止させた。次
いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて約２５ｍＡで電気泳動し、伸長した相補ＤＮ
Ａを分離した。電気泳動した後ゲルを固定し乾燥させた
。

本ゲルを用いてオートラジオグラフィーを行ないオート
ラジオグラム上の塩基断片のシーフェンス解析を行って
ポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。

その結果は第１−１表に示した。

またそれの５′側の上流に続くシグナルペプチド遺伝子
の塩基配列も同様にして調べた。

その結果は第１−２表に示した。

第１−１表＋０　　　　　　３０　　　４Ｑ　　　　　　　６０Ｇ
ＣＣＡＴＣＡＡＣＡ　ＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴ　ＧＧＧＣ
ＧＣＧＡＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡ
Ａ　ＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＣＡＣＴ
ＡＴＣＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＧＴ　ＧＧＣＡＴＣＴ
ＡＴＧ　ＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧ　ＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＣＣＡＧＴＡ　ＣＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＧＧＣ
ＡＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＡＣＡＣＧＣＧ　ＣＧＣＡＧＡＡ
ＧＧＡ　ＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＴＧＴＧＣＧＣＧＧ　　ＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧ　　ＣＡ
ＧＧＡＣＡＣＣＴ　　ＣＴＡＴＣＣＣＴＧＣＧＣＡＧＴ
ＡＴＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴ　　ＡＣＧＧＴＧ（：
ＡＧＧ　　ＧＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＣＧ
　　ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧ　　ＣＧＴＧＡＣＣＧＣＧ６
７０　　　　　６８０　　　　　６９０５７００　　　
　　７’ｌＯ７２０ＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧ
ＴＧＣＡ　　ＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧ　　ＡＡＴＧＡＴＧ
ＣＧＡ　　ＡＣ：ＧＡＡＣＴＧＧＴ　　ＴＣＣＣＡＡＴ
ＴＣＡ７３０　　　’　　　７４０　　　　　７５０　
　　　　７６０　　　　　７７０　　　　　７８０ＧＡ
ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧ　　ＧＧＧＣＴ
ＡＣＡ丁Ｇ　　ＡＣＣＧＡＧＡＡＣＴ　　ＡＣＴＴＣＴ
ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＣＡＣＧＴ　
ＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴ　ＧＡＣＣＴＣＧＧＧＣＡＡＣＣ
ＡＡＴＡＣＴ　ＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡ　ＣＡＣＧＧＧＣ
ＡＴＴＧＧＣＧＣＧさＡＣＴ　　ＴＣＡＡＴＡＣＧＴＡ
　　ＣＡＡＣＡＣＧＧＴＧ　　ＧＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴ
ＴＡＴＣＧＴＣＧＡ　　ＣＴＣＧＧＴＧＧＣＧ１０９０
　　　　　　　１１００　　　　　　　１１１０　　　
　　　　１１２０　　　　　　　１１３０　　　　　　
１＋４０ＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡ　ＡＣＡＣＧＡＴＧＧＧ
　ＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＴＣＧ　ＡＣＣ
ＴＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＧＧＣ＋２７０　　　　
　　１！８０　　　　　　１２９０　　　　　１３００
　　　　　　１３１０　　　　　　　＋３２０ＣＣＧＧ
ＣＧＧＣＧＧ　ＧＣＧＧＣＡＣＧＧＴ　ＣＴＧＧＡＴＣ
ＴＧＴ　ＴＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧ
ＧＣＧＧＣＡＡＣＴ第１−２表（６）ポリペプチドのアミノ酸配列第１−１表の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ
酸配列を決定し、その結果を第２−１表に示した。

またそれのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチドのア
ミノ酸配列を決定し、その結果を第２−２表に示した。

以上の結果からシュードモナス　アミロテラモーサ由来
ポリペプチドのアミノ酸配列は第２−１表の配列を有し
ていることが明らかになった。

第２−１表６Ｄ　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−３ｅｒ−３ｅｒ−１１
ｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−１２Ｄ　Ｔｙｒ−Ａｌａ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−１３６＞　Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−１８１）　Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓ
ｅｒ−１１ｅ−澄＞　Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−２７１＞　
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍ
ｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−２８６＞　ｌ１ｅ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｈｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
４５１＞　Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ（ｉ　１ｕ−Ｔ
ｒｐ−５ｅｒ−Ｖａ　ｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｎ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＧＩｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−４６６＞　
Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（ｉｌｙ−Ｓｅｒ−）４ｅｔ−
Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−４８Ｄ　Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｎ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｎｇ−３ｅｒ−
第２−２表＝　３６− なお、このアミノ酸配列を澱粉枝切作用を有するプルラ
ナーゼのそれと比較した。すなわち、ジャーナル　オブ
　バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１６９巻、第２３０１乃至２３０
６頁（１９８７年）に記載されているプルラナーゼのア
ミノ酸配列と比較してみた。

意外なことにグリコーゲン分解型枝切り酵素である本ポ
リペプチドのアミノ酸配列中にはプルラン分解型枝切り
酵素であるプルラナーゼと相同性を有する部分配列が存
在していることが判明した。

その結果を第３表に示した。

第３表の結果から明らかなように本ポリペプチドはプル
ラナーゼのアミノ酸配列と近似した部分アミノ酸配列を
有しており、この部分アミノ配列が、両酵素の共通性質
であるα−１，６グルコシド結合に作用するに際して大
きく関与しているものと判断される。

即ち、ポリペプチドの特定された部分アミノ酸配列とし
て（ａ　）　Ｎｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒおよび（ｂ　　）　　Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−＾ｒａ−Ｐｉ
ｅ−八Ｓｌｌ−Ｌｅへの配列を有していることが判明し
、しかもこれら部分アミノ酸配列はＮ末端から近い順に
Ｃａ　）および（ｂ）の部分配列を有していることが判
明した。

第　　３　　表［− １でイー１カ実＠４形質転換微生物によるポリペプチドの産生シュードモナ
ス　アミロデラモーサ由来のポリペプチド遺伝子を含む
組み換えＤＮＡを導入した形質転換微生物エツシエリヒ
ア　コリ　ＩＡＭ２７５とその宿主微生物エツシエリヒ
ア　コリ　ＪＭ　８３ならびに供与体微生物シュードモ
ナス　ア゛ミロテラモーサ　５Ｂ−１５（ＡＴＣＣ２１
２６２）の産生するポリペプチド産生量をその活性で比
較した。液体培地は、マルトース２Ｗ／’Ｖ％、グルタ
ミン酸ナトリウム０．４Ｗ／Ｖ％、コーンステイープリ
カー〇、２Ｗ／Ｖ％、ポリペプトン０　、　　Ｉ　Ｗ／
’Ｖ％、リン酸７　ンモ−ラム０．ＩＷ／Ｖ％、リン酸
二カリウム０．１Ｗ／Ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．０５Ｗ／Ｖ％および水がちなりｐＨ７，０に調整し
て１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して調製した。

エツシェリヒア　コリ　ＩＡＭ２７５の場合には、この
培地に抗生物質アンピシリンをｍｌ当り５０μｇの割合
で加えて植菌しまた、エツシェリヒア　コリ　Ｊ　Ｍ　
８３の場合には抗生物質を加えずに植菌しそれぞれ３７
℃、２４時間通気撹拌培養した。

また、シュードモナス　アミジデラモーサ　５Ｂ−１５
（ＡＴＣＣ２１２６２＞（１７）場合には前記液体培地
に抗生物質を加えることなく２８℃で２４時間および９
６時間培養しな。各培養液を遠心分離し上清と菌体とに
分離し、上滑はそのまま活性測定し菌体は超音波処理し
て破壊した後活性測定し培養液量に換算して活性を求め
た。

結果は第４表に示す。

第　　４　　表第４表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており工業的生産方法と
して好都合である。

以下、本発明の実施例と優れた効果を述べる。

実施例１．ポリペプチドマルトース２Ｗ／Ｖ％、グルタミン酸ナトリウム０．Ｉ
Ｗ／Ｖ％、コーンステイープｌ−１，０Ｗ／Ｖ％、ポリ
ペプトン０．５Ｗ／Ｖ％、硝酸アンモニウム０．２Ｗ／
’Ｖ％、リン酸二カリウム０２Ｗ／Ｖ％、硫酸マグネシ
ウム・７水塩０．０５Ｗ／′ｖ％および水からなる液体
培地を３０．ｆｌ容シャーファメニターに１５．Ｑ入れ
ｐＨ７，０に調製し１２０°Ｃで２０分間滅菌し冷却し
て調製した。この培地に抗生物質アンピシリンをｍ１当
り５０μｇの割合で加えた後、形質転換微生物エッシェ
リヒア　コリ　Ｉ　Ａ　Ｍ　２７５の種培養液を１−７
７７％植菌し、３７°Ｃで２４時間通気撹培養した。培
養液のイソアミラーゼ活性は、ｍｌ当り約３８０単位で
あった６培養液からの菌体を超音波処理し、遠心分離し
て得られる上清を実験２−（１＞の方法に準じて精製し
、高度に精製されたポリペプチド含有液を得た。

本ポリペプチド含有液は澱粉質がらのマルトース高含有
物の製造に有利に利用できる。

実施例２．マルトース高含有物コーンスターチ３重量部と水１０重量部との懸濁液に、
市販の細菌液化型α−アミラーゼを加え、９０℃に加熱
糊化した後、１３０°Ｃに加熱して酵素反応を止め、Ｄ
Ｅ約３の液化液とし、この澱粉液を５５°Ｃに急冷して
、これに実施例１の方法で得なポリペプチド含有液を、
澱粉ダラム当り１００単位と、大豆由来のβ−アミラー
ゼを同じく３０単位とを加えｐＨ５，０に保って３６時
間糖化し糖化液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で脱
塩したのち濃縮し種晶を加え助晶した後、５日間静置し
て固化し、これを切削して糖組成がグルコース２．６％
、マルトース８５．４％、マルトトリオース７．４％、
マルトテトラオース以上のテキストリン４．６％からな
る粉末状のマルトース高含有物を、原料澱粉固形物当り
約９７％の収率で得た。

本島は、低甘味性の甘味料として、各種飲食物の製造に
有利に利用できる。

〈発明の効果〉上記したことから明らかなように本発明は、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプチ
ドを用いる澱粉質からのマルト−ス高含有物の製造方法
に関する。

本発明は特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用
いることにより安心して澱粉を加水分解できることが判
明しその工業的意義は大きい。

その上ポリペプチドの給源として元来ポリペプチド産生
能を有するシュードモナス　アミロデラモーサのみなら
ず、その産生能を有するポリペプチド遺伝子を生体外遺
伝子組換え技術により導入した形質転換微生物も利用し
うろことを解明したことはより広範囲な給源を確保する
とともにポリペプチド産生量の向上を容易に達成するこ
ととなり、その工業的意義は大きい。

【図面の簡単な説明】

図は、組換えＤＮＡ　　ｐｒＡＭ２７５についてシュー
ドモナス　アミロデラモーサ由来ＤＮＡ部分の制限酵素
切断地図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、（ａ
）Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−Ｔｈｒおよび、（ｂ）Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕから選ばれる１種または２種の配列を有して
いることを特徴とするイソアミラーゼ活性を有するポリ
ペプチド。
（２）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ末
端側から近い順に、（ａ）Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒおよび、（ｂ）Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕの配列を有していることを特徴とする特許請
求の範囲第（１）項記載のイソアミラーゼ活性を有する
ポリペプチド。
（３）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
ノ酸配列として、【アミノ酸配列があります】の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
（１）項または第（２）項記載のイソアミラーゼ活性を
有するポリペプチド。
（４）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【アミノ
酸配列があります】の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
（１）項、（２）項または第（３）項記載のイソアミラ
ーゼ活性を有するポリペプチド。
（５）ポリペプチドが、イソアミラーゼ産生能を有する
微生物由来のポリペプチドであることを特徴とする特許
請求の範囲第（１）項、第（２）項、第（３）項、また
は第（４）項記載のイソアミラーゼ活性を有するポリペ
プチド。
（６）ポリペプチドが、シュードモナス　アミロデラモ
ーサ由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請
求の範囲第（１）項、第（２）項、第（３）項、第（４
）項または、第（５）項記載のイソアミラーゼ活性を有
するポリペプチド。
（７）部分アミノ酸配列として、（ａ）【アミノ酸配列があります】および、（ｂ）【アミノ酸配列があります】から選ばれる１種または２種の配列を有し、且つイソア
ミラーゼ活性を有するポリペプチドをβ−アミラーゼと
ともに澱粉質に作用せしめ、得られるマルトース高含有
物を採取することを特徴とするマルトース高含有物の製
造方法。