JPH01199577A - イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 - Google Patents

イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途

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JPH01199577A
JPH01199577A JP63024762A JP2476288A JPH01199577A JP H01199577 A JPH01199577 A JP H01199577A JP 63024762 A JP63024762 A JP 63024762A JP 2476288 A JP2476288 A JP 2476288A JP H01199577 A JPH01199577 A JP H01199577A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドと
そのポリペプチドとβ−アミラーゼとを用いて澱粉質を
加水分解し、マルトース高含有物を製造する方法に関す
る。
〈従来の技術〉 澱粉やグリコーゲンのα−1,6グルコシド結合を加水
分解する酵素、すなわち、イソアミラーゼ(EC3,2
,1,68)は、例えば、アプライド マイクロバイオ
ロジー(八ρρ1ied Hicrabiology)
 、第16巻、第1439乃至1444頁(1968年
)および同誌第28巻、第336乃至339頁(197
4年)などにも記載されているように、シュードモナス
 アミロデラモーサ(Psauclononas am
yloderanlosa)から産生され、エフイービ
ーニス  レターズ(FEBS LetterS) 、
第57巻、第1乃至4頁(1975年)などに記載され
ているように、サイトファーガ[Cytophaaa)
属に属する一菌株から産生され、また、スターチシュテ
ルケ(Starch StMrke) 、第32巻、第
132乃至136頁(1980年)などに記載されてい
るように、フラボバクテリウム(F 1avobact
er1un)属に属する一菌株がら産生され、更に、ア
プライド アンド エンパイアロメンタル マイクロバ
イオロジー(八oolied and EnVlrol
llenial HhCrobiolHy) 、第44
巻、第1253乃至1257頁(1982年)などに記
載されているようにリボマイセス コノネ7 コニ(L
Vl]O1′ll’11CeS KOnOnenkOe
)から産生されることが知られている。
しかしながら、これらの記載から明らかなように、イソ
アミラーゼは、一部の酵素的性質しか知られておらす、
工業上、安定して供給し、安心して利用する上にはなお
不充分であり、より解明されたイソアミラーゼの確立が
望まれている。
〈発明が解決しようとする課題〉 本発明者等は、より詳細に解明されたイソアミラーゼ、
とりわけ、アミノ酸配列まで解明されたイソアミラーゼ
活性を有するポリペプチド(以下、本明細書では、単に
、ポリペプチドと略称する。)と、その用途について鋭
意研究した。
その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、 (a ) )4et−Asp−Val−Val−Tyr
−^5n−His−Thrおよび、 (b)  八sp−Gly−Phe−Arg−Phe−
八5p−1,e、uから選ばれる1種または2種の配列
を有していることが判明し、更に詳細には、前記の部分
配列がN末端側から近い順に、(a)および(b)の部
分配列を有していることが判明した。
そして、その特徴的性質としては、澱粉やグリコーゲン
に作用して、それらのα−1,6グリコシド結合を加水
分解する作用を有する。
以下、本発明の内容を詳述し、併せて、本発明の詳細な
説明する。
本明細書の記載において、アミノ酸、ペプチド、その他
に関し、略号で表記する場合、それらは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものである。それらの例を以下に列
記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場合に
は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA:デオキシリボ核酸 RNA :リボ核酸 A 、アテニン T :チミン G ニゲアニン C、シトシン dNTP:チオキシヌクレオチド二リン酸ddNTP 
ニジデオキシヌクレオチド三リン酸d CTP :デオ
キシシチジン二リン酸SDSニドデシル硫酸ナトリウム Ala:アラニン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン Asp:アスパラギン酸 Cys :シスヂイン Gln:グルタミン G 1 u :グルタミン酸 Glyニゲリシン His:ヒスチジン Ice:インロイシン Leu:ロイシン Lys:リジン Met:メチオニン Phe :フェニルアラニン Pro ニブロリン Ser:セリン Thr:スレオニン Trp:)リプトファン Tyr:チロシン Val:バリン 本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、イソ
アミラーゼ産生菌からポリペプチド遺伝子をクローニン
グした後、その塩基配列を解読して決定した。
一方、ポリペプチドのN末端を含有する部分のアミノ酸
配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プロ
ティン シークエンサーを用いて調べた。
ポリペプチド遺伝子のクローニング ポリペプチド産生能を有する供与体微生物より、その微
生物のDNAを分離精製した後、例えば、超音波、制限
酵素などで切断し、得られたDNA断片と、同様にして
ベクターを切断して得られたベクター断片とを、例えば
、DNAリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチド遺
伝子を含む組換えDNAを形成する。
この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能を
有する微生物、例えば、米国特許第3゜560.345
号明細書に記載されているシュードモナス アミロデラ
モーサ(PseudoIilc+nas alyl。
deramosa) ATCC21262、または、こ
れらの変異株などが有利に用いられる。
供与体微生物由来のDNAは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約1〜3日間通気゛撹拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって調製することができる。溶菌方法は、例え
ば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。また、必
要によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸
ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍
結融解処理を施すことも自由である。
このようにして得られる溶菌物からDNAを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。
DNAを切断する方法は、例えは、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるDNA
断片とベクター断片との結合を容易にするためには、制
限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する。例
えば、5au3A  I、EcoRI、Hind  m
、BamHI、Sal  I、Xma  I、Xba 
 I、Sac  I、Pst  Iなとの■型制限酵素
が適している。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドが適している。
ファージとしては、例えば、エッシェリヒアコリ(Es
ch’erichia coli)を宿主微生物とする
場合には、λgt・λC1λgt・λBなどが、バチル
ス ズブチリス(Bacillus 5ubtilis
)を宿主微生物とする場合には、ρ11、φ1、φ10
5などが使用できる。
また、プラスミドとしては、例えば、エツシェリヒア 
コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pU
c18などが、バチルス ズブチリスを宿主微生物とす
る場合には、pUB 110、pTZ4 (pTP4)
、pc194などが使用でき、更に、例えば、エッシェ
リヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの二種以上の
宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、pHV14
、TRp7、YEp’7、pBS7などのベクターを利
用することも可能である。このようなベクタニを、先に
述べたDNAと同様に制限酵素などで切断し、ベクター
断片を得る。゛ DNA断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えは、
DNA断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体
外で適当なりNAリガーゼの作用により組み換えDN’
Aを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微
生物に導入して、生体内のDNAリガーゼを利用して組
み換えDNAにすることもできる。
宿主微生物としては、組み換えDNAが安定かつ自律的
増殖が可能なものであればよい。
宿主微生物に組み換えDNAを導入する方法は、公知の
方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する
微生物の場合にはカルシ7ウムイオン存在下で行ない、
バチルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル
法又はプロドプラシスト法などを採用することができる
組み換えDNAが導入′され形質転換された形質転換微
生物の選択方法は、  Pでラベルしたオリゴヌクレオ
チドを用いてのコロニーハイブリダイゼーション法、ま
たは澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からア
ミロースを生成するものを選択する方法などを用いれば
よい。
ポリペプチド遺伝子を含む組み換えDNAを制限酵素な
どにより、切断してポリペプチド遺伝子を含むDNA断
片とし、これと同様にプラスミドなどのベクターを切断
して得られるベクター断片とを結合させることも容易に
実施できることが判明した。
ポリペプチド遺伝も2 ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、シーン(Gene)
、第9巻、第259乃至268頁(1982年)に示さ
れているジテオキシチェーンターミネータ−法で解読す
ればよい。
この方法は、クローニングにより得られたポリペプチド
遺伝子を含むDNA断片を、プラスミドpucisなど
のプラスミドに制限酵素を利用して、そのクローニング
部位に挿入する。得られた組み換えプラスミドは、形質
転換によってエツシェリヒア コリ J M 83など
に移入し、次いで組み換えプラスミドを有する微生物を
選択する。
この微生物を増殖させたものを用いて組み換えプラスミ
ドを調製する。
得られた組み換えプラスミドを合成プライマーとアニー
リングし、これにフレノウ(にlenow)断片を働か
せてプライマーを伸長させ相補DNAを生成させる。
この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いで
、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチド
遺伝子の塩基配列を決定する。
また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。
ポリペプチドのアミノ酸配り ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より決定する
。 − また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。
ポリペプチドのN ・を   る部 アミノ 配列 ポリペプチド産生能を有するシュードモナスアミロデラ
モーサを栄養培地で培養してポリペプチドを産生させる
。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これを硫安
分画、イオン交換クロマトクラフィー、高速液体クロマ
トグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドとする。
この試料を用いてジャーナル オブ バイオロジカル 
ケミストリー(Journal of B101o(]
1Cal chemistry)、第256巻、第79
90乃至7997頁(1981年)の記載に準じて、気
相プロティン シークエンサーにより分解し、高速液体
クロマトクラフィーで同定して、ポリペプチドのN末端
を含有する部分アミノ酸配列を決定する。
形 転換微生物によるポリペプチドの調製上述のように
して得られた形質転換微生物を栄養培地で培養すること
により多量のポリペプチドを安定して産生じうろことを
見いだした。
栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、更
に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養
素などを含有させればよい。
この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解物、
グルコース、フラクトース、スクロース、マルトースな
どの糖質が有利に用いられる。窒素源としては、アンモ
ニアカス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩など
の無機窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コー
ンステイープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜
用いられる。
培養方法は、例えは、液体培地をp H2〜8、温度2
5〜65°Cの範囲に維持しつつ、通気撹拌などの好気
的条件下で約1〜6日培養し、ポリペプチドを生成蓄積
せしめればよい。
培養物中のポリペプチドは、そのまま採取し利用するこ
ともできるか、一般には常法に従って、濾過、遠心分離
などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離した
後に利用される。
ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音
波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで
濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。
このようにして得られるポリペプチド溶液を、例えば、
減圧濃縮、膜濃縮、澱粉吸着、溶出し、更に、硫安、硫
酸ソータなどによる塩析、メタノール、エタノール、ア
セトンなどによる分別沈澱法などを適宜組み合せて精製
し、より高純度のボー 18 = リペプチドを採取して利用することも、更に、これらペ
プチドを常法に従って、担体結合法、架橋法、包括法な
どによって固定化して利用することも有利に実施できる
本発明で利用するポリペプチドは、特定するアミノ酸配
列まで解明され、安心して利用しうるちのであればよく
、先に述べた遺伝子組み換えによる形質転換微生物から
のもののみに限定されるものではない。
本発明のポリペプチドは、アミロペクチン、グリコーゲ
ンのα−1,6クリコシド結合を加水分解する酵素とし
て有利に利用でき、例えば、澱粉、アミロペクチン、澱
粉部分加水分解物など澱粉質からのアミロースの製造に
有利に利用できる。
また、これら澱粉質を基質とし、これに、ポリペプチド
とグルコアミラーゼを併用してグルコース高含有物の製
造、ポリペプチドとβ−アミラーゼとを併用してマルト
ース高含有物の製造が容易となる。
マルトース高含有物の製造方法としては、例えば、特公
昭47 13089号公報、特公昭54 3938号公
報などに開示されている糊化又は液化澱粉にイソアミラ
ーゼとβ−アミラーゼとを作用させてマルトース高含有
物を採取する方法等がある。
この際、このようにして得られるマルトース高含有物に
象まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、例えば、
特公昭56−28153号公報、特公昭57−3356
号公報、特公昭56−28154号公報などに開示され
て゛いる酵素を作用させてマルトースを生成するが、さ
らには、例えば、特開昭58−23799号公報などに
開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラム
分画法により夾雑糖類を除去するなどの方法によりマル
トース純度を更に高めることも好都合である。
次いで、これらのマルトース高含有物は、通常、濾過し
、活性炭による脱色およびH型、OH型イオン交換樹脂
による脱塩などの精製工程を経て、濃縮し、シラツブ状
製品を、更に、マルトースの種晶を加えて助晶し粉末化
して、粉末状結晶製品とするか、または助晶した後、分
密してきわめて高純度の結晶製品とする。
このようにして得られたマルトースは、甘味度の低い甘
味料として、また、注射用、経管栄養補給用糖質として
食品、医薬品分野に広く利用される。
更に、マルトースは、例えば、特開昭57−13449
8号公報に記載される方法により、水素添加してマルチ
トールを製造し、これを、難吸収性の甘味料、健康食品
、美容食品などに利用することも好都合である。
以下、実験で本発明の詳細な説明する。
実験1 シュードモナス アミロデラモーサ ポリペプチド遺伝
子のエッシエリヒア コリへのクローニング (1)シュードモナス アミロデラモーサのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体DNAの調製シュードモナス ア
ミロデラモーサ5B−15(ATCC21262)をヘ
フトンIW/V%、酵母エキス0.5W/V%と塩化ナ
トリウム0゜5W/′■%を倉む培地で30°C通気撹
拌培養した。
培養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体を25 W
 / V%スクロースを陰むトリス緩衝液(pH8,0
)に懸濁し、次にリゾチームを0.15W/■%になる
様に加え25℃で20分間保持した。
これにEDTAを62.5 m Mになる様に加え、さ
らに20分間保持した後、SDSを0.0625W/V
%になる様に加え57℃に加温し菌体を完全に溶菌させ
た。
この溶菌液をリボヌクレアーゼ(ベーリンガーマンハイ
ム社製造、商品名RN a S e A )およびプロ
テアーゼ(ベーリンガーマンハイム社製造、商品名Pr
onase  K)で処理し、次いで、クロロポルム・
イソアミルアルコール混液を加え、遠心分離して得られ
る上滑に2倍容のエタノールを加え、染色体DNAを回
収し、SSCM衝液(塩化ナトリウム、クエン酸3ナト
リウム倉有)に溶解した。再度、クロロホルム・イソア
ミルアルコール混液処理し、エタノール沈澱、次いでイ
ツブロバノール沈澱を行い精製染色体DNAを得た。
(2)プラスミドpUc9の調製 プラスミドρUC9はゼイ メ・fヤーズ<j、Hey
ers)等の方法[ジA・−ナル オブ バクテリオロ
シー< journa: Of BaCteriOIO
(ly) 、第127巻、第1524乃至1537頁<
1976年)]に準じてエソシェリヒア コリから分離
・調製した。
(3)ポリペプチド遺伝子を含む組み換えD N Aの
作製 実験1−(1)で調製したポリペプチド遺伝子を含む精
製染色体DNAに対して制@酵素5au3AI(宝酒造
株式会社製3@ >を作用させ染色体DNAを部分的に
切断した後、ショ糖密度勾配超遠心法で約3〜7Kbp
の染色体DNA断片を分離・取得した。
制限#素BamH1(宝酒造株式会社製造)で完全に切
断したプラスミドベクターpυC9と前記の約3〜7K
bpの染色体DNA断片を混合しT4DNAリカーゼ(
東洋紡績株式会社製造)を添加して4°Cで一夜反応さ
せて組み換えDNAを作製した。
(4)ポリペプチド遺伝子を含む組み換D N Aの選
択 宿主微生物としてエソシェリヒア コリJM83 (A
TCC35607)を用いた。本微生物をYTツブス[
トリプロン0.8W/V%、酵母エキス0 、 5 W
/ V%と塩化ナトリウム0.25W/′■%を含有]
で37°C275分間培養し、集菌した後、50 m 
M塩化カルシウム水溶液に懸濁し、氷水中で40分間静
置し、遠心分離にて集菌し、続いて塩化カルシウム水溶
液に懸濁したものに、実験1−(3)で得た組み換えD
NAを加え、氷水中で60分間静置した。更に、42℃
に加温してYTツブスを加え、37°Cで90分間保ち
、その後遠心分離にて集菌し、塩化ナトリウム0.85
W/V%に懸濁し、5−ブロモ−4−クロロ−3−イン
ドリル−β−ガラクトシド(5br。
mo’−4−chloro−3−indoly−β−g
alactoside   or   X−gal)を
象有する培地に生育させ白色のコロニーを形成した微生
物を形質転換微生物として選択しな。得られた約1.1
00個のコロニーをニトロセルロース上に固定した。ポ
リペプチドのN末端から11番目から16番目のアミノ
酸配列に対応する合成りNAすなわち う・                      5
゜IA 2T3A4C5T 6A 7C8Q 9AIO
GI!T12T13Q14’p15T!6CI7Q i
7me。
(G)    (G)    (G)   、(c) 
  、(C)(′r) (C) (3番目の塩基はAまたはG、6番目の塩基はAまたは
G、9番目の塩基はA、G、 T、Cのいずれか、12
番目の塩基はTまたはC115番目の塩基はTまたはC
であり、組み合わせて64通りの合成りNAの混合物と
なる。) を32pで標識したプローブに30°Cで強く会合した
13菌株を選んだ。
得られた13菌株についてサザーン(Southern
)−25= の方法[ジで一ナル オブ モリキュラー バイオロジ
ー(J、 Mo1. Biol、) 98 、 503
.1975′Jにより、N末端から15番目力)ら19
9番目アミノ酸配列に対応する合成りNI、プローブす
なわち 51                   ン1’G
 2T 3T ’C5G 6A 7T ”T 9A”T
”A”’A13T”G  14iar(C)(G)(G
)(G) (T)(T) (C) (3番目の塩基はTまたはC26番目の塩基はA、G、
T、Cのいずれか、9番目の塩基はAまたはG、12番
目の塩基はA、G、Tのいずれかであり、組み合わせて
48通りの合成り N Aの混合物となる。) とも会合する1菌株を選択した。
本微生物の一菌株をエツシエリヒア コリIAM275
と命名し、これが保有する組み換えDNAをpIAM2
75と命名した。
組み換えD N A P I A M 275について
シュー−26= トモナス アミロデラモーサ由来DNA部分の制限酵素
切断地図を図に示す。
図に示したDNA部分は、5.5に’opの大きさであ
る。
実験2 シュードモナス アミロデ°ラモーサ由来ポリペプチド
のN末端を含有した部分アミノ酸配列(1)ポリペプチ
ドの調製 シュードモナス アミロデラモーサ5B−15<ATC
C21262)をマルトース2W/′v%、グルタミン
酸ナトリウム0.4W/V%、リン酸アンモニウム0 
、 15 W/’V%、リン酸二カリウム0.1W/V
%、硫酸マグネシウム・7水塩0゜05W/V%塩化鉄
・6水塩、塩化マンガン及び塩化ナトリウム各々0.0
OOIW/V%を含有する培地(pH7,0)にて30
℃、3日間通気撹拌培養し、培地中にポリペプチドを産
生させた。
遠心分離して上滑を採取し、硫安塩析によりポリペプチ
ド画分を得、次いで、陰イオン交換体カラムクロマトグ
ラフィー(米国ブラウン社製造、商品名DEAE−セル
ロース)更に陽イオン交換体カラムクロマトグラフィー
(和光純薬工業株式会社製造、商品名CM−セルロース
)により精製して、高度に精製されたポリペプチドを採
取した。
本島の比活性は59.Coo単位±5,000単位/’
mg蛋白質を示しな。
本明細書でいうイソアミラーゼ活性1単位とは、1.0
W/V%可溶性モチゴメ澱粉5mlに0.5M酢酸緩衝
液(p H3、5) 1 mlを加え、次いで酵素液1
mlを加え、40℃で一定時間反応させた後1mlをと
り、これにO,01Mヨード・ヨードカリ溶液1 ml
を加え25m1に水で希釈し、15分後に液層1■で6
10nmの吸光度を測定し、反応1時間に吸光度0.0
1増加させる酵素量を1単位とした。
(2)N末端を含有する部分アミノ酸配列実感2−(1
)の方法で調製したポリペプチドを気相プロティン シ
ークエンサー(アプライドバイオシステム社製造、商品
名 470A型)にかけ、次いで高速液体クロマトグラ
フィーにより分析してN末端を含有する部分アミノ酸配
列を決定した。
結果は、八1a−11e−Asr+−3er−Net−
3er−Leu−Gly−A 1a−3er−Tyr−
Asp−A 1a−GIn−GIn−八1a−Asn−
i Ie−Ttlr−Pheの配列を有していることが
判明した。
実験3 シュードモナス アミロデラモーサ由来ポリペプチド遺
伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列 (1)プラスミドρUCl3の調製 プラスミドpUC18はこれを導入したエッシェリヒア
 コリJM83から実験1−(2)の方法に準じて調製
した。
〈2)ポリペプチド遺伝子を含む組み換えDNAの作製 実験1− (3)の方法に準じて組み換えDNAを作製
した。即ち、実験1− (2)の方法で調製したポリペ
プチド遺伝子を含むプラスミドに各種制限酵素を作用さ
せて切断し、ポリペプチド遺伝子を含む断片を得、また
実験3−(1)の方法で調製したプラスミドpUc18
を同様に各種制限酵素で切断しこれら両断片にT4DN
Aリカーゼを作用させて組み換えDNAを作製した。
(3)組み換えDNAのエツシェリヒア コリへの導入 エッシェリヒア コリ J M 83に実験1−(4)
の方法に準じて組み換えD N Aを移入し形質転換さ
せた。
(4)形質転換微生物からの組み換えD N Aの調製 形質転換微生物を抗生物質アンピシリン50μg / 
mlを含むし一グロスで培養し、得られる菌体からアル
カリ溶菌法により組み換えDNAを調製した。
(5)組み換えDNAの塩基配列 ジデオキシ チェーン ターミネータ法に従って解読し
た。
即ち、実験3−(4)て−調製した組み換えDNAと合
成プライマー(17塩基)を加え、60℃で20分間ア
ニーリングした後、dNTP、ddNTP、[α−32
2]αCTPおよびクレノー断片を加え、37°Cで3
0分間反応させ、プライマーを5′側から3′方向へ伸
長させて相補DNAを生成させた。これに過剰のdNT
Pを加えて、さらに37°Cで30分間反応させた後、
ホルムアミド色素溶液を加えて、反応を停止させた。次
いで、3分間煮沸し、これを6%ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて約25mAで電気泳動し、伸長した相補DN
Aを分離した。電気泳動した後ゲルを固定し乾燥させた
本ゲルを用いてオートラジオグラフィーを行ないオート
ラジオグラム上の塩基断片のシーフェンス解析を行って
ポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。
その結果は第1−1表に示した。
またそれの5′側の上流に続くシグナルペプチド遺伝子
の塩基配列も同様にして調べた。
その結果は第1−2表に示した。
第1−1表 +0      30   4Q       60G
CCATCAACA GCATGAGCCT GGGC
GCGAGCTACGACGCGCAACAGGCCA
A CATCACCTTTGCCTCTGCGCACT
ATCGCACCACCGACAGT GGCATCT
ATG CACCCAAGGG TGTCGTGCTG
GTGCCCAGTA CGCAAAGTACCGGC
ACCAAA CCCACACGCG CGCAGAA
GGA TGATGTGATCTACGAGGTGCA
TGTGCGCGG  CTTCACCGAG  CA
GGACACCT  CTATCCCTGCGCAGT
ATCGCGGCACCTATT  ACGGTG(:
AGG  GCTCAAGGCCAGTTACCTCG
  CCAGCCTGGG  CGTGACCGCG6
70     680     6905700   
  7’lO720GTGGAATTCCTGCCGG
TGCA  GGAAACGCAG  AATGATG
CGA  AC:GAACTGGT  TCCCAAT
TCA730   ’   740     750 
    760     770     780GA
TGCCAACCAGAACTACTG  GGGCT
ACA丁G  ACCGAGAACT  ACTTCT
CGCCGGATCGCCGCAATGCCACGT 
ACTACGAGCT GACCTCGGGCAACC
AATACT TCTACGACAA CACGGGC
ATTGGCGCGさACT  TCAATACGTA
  CAACACGGTG  GCGCAGAACCT
TATCGTCGA  CTCGGTGGCG1090
       1100       1110   
    1120       1130      
1+40TATTGGGCGA ACACGATGGG
 CGTGGATGGCTTTCGCTTCG ACC
TTGCTTCCGTGCTCGGC+270    
  1!80      1290     1300
      1310       +320CCGG
CGGCGG GCGGCACGGT CTGGATC
TGT TTGCGGAACCTTGGGCCATCG
GCGGCAACT第1−2表 (6)ポリペプチドのアミノ酸配列 第1−1表の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ
酸配列を決定し、その結果を第2−1表に示した。
またそれのN末端側の上流に続くシグナルペプチドのア
ミノ酸配列を決定し、その結果を第2−2表に示した。
以上の結果からシュードモナス アミロテラモーサ由来
ポリペプチドのアミノ酸配列は第2−1表の配列を有し
ていることが明らかになった。
第2−1表 6D Val−Pro−Val−3er−3er−11
e−Lys−Ala−Ala−Gly−11e−Thr
−Gly−Ala−Val−12D Tyr−Ala−
Gln−Glu−Val−Ser−Gln−Asp−P
ro−Leu−Asn−Pro−5er−Asn−Gl
n−136> Asn−Gly−Asn−Val−Ph
e−Ala−Ser−Ala−His−Tyr−Arg
−Thr−Thr−Asp−Ser−181) Tyr
−Glu−Val−His−Val−Arg−Gly−
Phe−Thr−Glu−Gln−Asp−Thr−S
er−11e−澄> Val−Gln−Glu−Thr
−Gln−Asn−Asp−Ala−Asn−Asp−
Val−Val−Pro−Asn−Ser−271> 
Thr−Ala−Glu−Phe−Gln−Ala−M
et−Val−Gln−Ala−Phe−His−As
n−Ala−Gly−286> l1e−Lys−Va
l−Tyr−Het−Asp−Val−Val−Tyr
−Asn−His−Thr−Ala−Glu−Gly−
451> Va l−Arg−Va l(i 1u−T
rp−5er−Va l−Pro−Arg−G ln−
Leu−Arg−GIn−Ala−Gln−466> 
Asn−Glu−Leu(ily−Ser−)4et−
Thr−11e−Tyr−Val−Thr−Gln−A
sp−Ala−Asn−48D Asp−Phe−Se
r−Gly−Ser−Ser−Asn−Leu−Phe
−Gln−Set−Ser−Gly−Ang−3er−
第2−2表 = 36− なお、このアミノ酸配列を澱粉枝切作用を有するプルラ
ナーゼのそれと比較した。すなわち、ジャーナル オブ
 バクテリオロジー(Journal of Bact
eriology)第169巻、第2301乃至230
6頁(1987年)に記載されているプルラナーゼのア
ミノ酸配列と比較してみた。
意外なことにグリコーゲン分解型枝切り酵素である本ポ
リペプチドのアミノ酸配列中にはプルラン分解型枝切り
酵素であるプルラナーゼと相同性を有する部分配列が存
在していることが判明した。
その結果を第3表に示した。
第3表の結果から明らかなように本ポリペプチドはプル
ラナーゼのアミノ酸配列と近似した部分アミノ酸配列を
有しており、この部分アミノ配列が、両酵素の共通性質
であるα−1,6グルコシド結合に作用するに際して大
きく関与しているものと判断される。
即ち、ポリペプチドの特定された部分アミノ酸配列とし
て (a ) Net−Asp−Val−Val−Tyr−
Asn−His−Thrおよび (b  )  Asp−Gly−Phe−^ra−Pi
e−八Sll−Leへの配列を有していることが判明し
、しかもこれら部分アミノ酸配列はN末端から近い順に
Ca )および(b)の部分配列を有していることが判
明した。
第  3  表 [− 1で イー 1カ 実@4 形質転換微生物によるポリペプチドの産生シュードモナ
ス アミロデラモーサ由来のポリペプチド遺伝子を含む
組み換えDNAを導入した形質転換微生物エツシエリヒ
ア コリ IAM275とその宿主微生物エツシエリヒ
ア コリ JM 83ならびに供与体微生物シュードモ
ナス ア゛ミロテラモーサ 5B−15(ATCC21
262)の産生するポリペプチド産生量をその活性で比
較した。液体培地は、マルトース2W/’V%、グルタ
ミン酸ナトリウム0.4W/V%、コーンステイープリ
カー〇、2W/V%、ポリペプトン0 、  I W/
’V%、リン酸7 ンモ−ラム0.IW/V%、リン酸
二カリウム0.1W/V%、硫酸マグネシウム・7水塩
0.05W/V%および水がちなりpH7,0に調整し
て120℃で20分間滅菌し、冷却して調製した。
エツシェリヒア コリ IAM275の場合には、この
培地に抗生物質アンピシリンをml当り50μgの割合
で加えて植菌しまた、エツシェリヒア コリ J M 
83の場合には抗生物質を加えずに植菌しそれぞれ37
℃、24時間通気撹拌培養した。
また、シュードモナス アミジデラモーサ 5B−15
(ATCC21262>(17)場合には前記液体培地
に抗生物質を加えることなく28℃で24時間および9
6時間培養しな。各培養液を遠心分離し上清と菌体とに
分離し、上滑はそのまま活性測定し菌体は超音波処理し
て破壊した後活性測定し培養液量に換算して活性を求め
た。
結果は第4表に示す。
第  4  表 第4表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており工業的生産方法と
して好都合である。
以下、本発明の実施例と優れた効果を述べる。
実施例1.ポリペプチド マルトース2W/V%、グルタミン酸ナトリウム0.I
W/V%、コーンステイープl−1,0W/V%、ポリ
ペプトン0.5W/V%、硝酸アンモニウム0.2W/
’V%、リン酸二カリウム02W/V%、硫酸マグネシ
ウム・7水塩0.05W/′v%および水からなる液体
培地を30.fl容シャーファメニターに15.Q入れ
pH7,0に調製し120°Cで20分間滅菌し冷却し
て調製した。この培地に抗生物質アンピシリンをm1当
り50μgの割合で加えた後、形質転換微生物エッシェ
リヒア コリ I A M 275の種培養液を1−7
77%植菌し、37°Cで24時間通気撹培養した。培
養液のイソアミラーゼ活性は、ml当り約380単位で
あった6培養液からの菌体を超音波処理し、遠心分離し
て得られる上清を実験2−(1>の方法に準じて精製し
、高度に精製されたポリペプチド含有液を得た。
本ポリペプチド含有液は澱粉質がらのマルトース高含有
物の製造に有利に利用できる。
実施例2.マルトース高含有物 コーンスターチ3重量部と水10重量部との懸濁液に、
市販の細菌液化型α−アミラーゼを加え、90℃に加熱
糊化した後、130°Cに加熱して酵素反応を止め、D
E約3の液化液とし、この澱粉液を55°Cに急冷して
、これに実施例1の方法で得なポリペプチド含有液を、
澱粉ダラム当り100単位と、大豆由来のβ−アミラー
ゼを同じく30単位とを加えpH5,0に保って36時
間糖化し糖化液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で脱
塩したのち濃縮し種晶を加え助晶した後、5日間静置し
て固化し、これを切削して糖組成がグルコース2.6%
、マルトース85.4%、マルトトリオース7.4%、
マルトテトラオース以上のテキストリン4.6%からな
る粉末状のマルトース高含有物を、原料澱粉固形物当り
約97%の収率で得た。
本島は、低甘味性の甘味料として、各種飲食物の製造に
有利に利用できる。
〈発明の効果〉 上記したことから明らかなように本発明は、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプチ
ドを用いる澱粉質からのマルト−ス高含有物の製造方法
に関する。
本発明は特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用
いることにより安心して澱粉を加水分解できることが判
明しその工業的意義は大きい。
その上ポリペプチドの給源として元来ポリペプチド産生
能を有するシュードモナス アミロデラモーサのみなら
ず、その産生能を有するポリペプチド遺伝子を生体外遺
伝子組換え技術により導入した形質転換微生物も利用し
うろことを解明したことはより広範囲な給源を確保する
とともにポリペプチド産生量の向上を容易に達成するこ
ととなり、その工業的意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
図は、組換えDNA  prAM275についてシュー
ドモナス アミロデラモーサ由来DNA部分の制限酵素
切断地図を示す。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、(a
    )Met−Asp−Val−Val−Tyr−Asn−
    His−Thrおよび、 (b)Asp−Gly−Phe−Arg−Phe−As
    p−Leuから選ばれる1種または2種の配列を有して
    いることを特徴とするイソアミラーゼ活性を有するポリ
    ペプチド。
  2. (2)ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、N末
    端側から近い順に、 (a)Met−Asp−Val−Val−Tyr−As
    n−His−Thrおよび、 (b)Asp−Gly−Phe−Arg−Phe−As
    p−Leuの配列を有していることを特徴とする特許請
    求の範囲第(1)項記載のイソアミラーゼ活性を有する
    ポリペプチド。
  3. (3)ポリペプチドが、そのN末端を含有する部分アミ
    ノ酸配列として、 【アミノ酸配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
    (1)項または第(2)項記載のイソアミラーゼ活性を
    有するポリペプチド。
  4. (4)ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【アミノ
    酸配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
    (1)項、(2)項または第(3)項記載のイソアミラ
    ーゼ活性を有するポリペプチド。
  5. (5)ポリペプチドが、イソアミラーゼ産生能を有する
    微生物由来のポリペプチドであることを特徴とする特許
    請求の範囲第(1)項、第(2)項、第(3)項、また
    は第(4)項記載のイソアミラーゼ活性を有するポリペ
    プチド。
  6. (6)ポリペプチドが、シュードモナス アミロデラモ
    ーサ由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請
    求の範囲第(1)項、第(2)項、第(3)項、第(4
    )項または、第(5)項記載のイソアミラーゼ活性を有
    するポリペプチド。
  7. (7)部分アミノ酸配列として、 (a)【アミノ酸配列があります】 および、 (b)【アミノ酸配列があります】 から選ばれる1種または2種の配列を有し、且つイソア
    ミラーゼ活性を有するポリペプチドをβ−アミラーゼと
    ともに澱粉質に作用せしめ、得られるマルトース高含有
    物を採取することを特徴とするマルトース高含有物の製
    造方法。
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