KR19990067481A

KR19990067481A - 당누클레오티드의 제조법

Info

Publication number: KR19990067481A
Application number: KR1019980703499A
Authority: KR
Inventors: 겐지 다께노우찌; 도모끼 하마모또; 도시따다 노구찌
Original assignee: 하마구찌 미찌오; 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 1999-08-25
Also published as: CA2237199A1; EP0867516A4; AU4032297A; WO1998011248A1; EP0867516A1; US6040158A; CN1200765A; JP3231791B2

Abstract

본 발명은 효모 균체를 사용하여 누클레오티드에서 당누클레오티드를 제조하는 방법에 있어서, 반응계에 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제와 당1-인산을 공존시키는 것을 특징으로 하는 당누클레오티드의 제조법에 관한 것이다. 이 방법에 의하면, 종래의 효모 균체법에서는 생산성이 낮았던 각종 누클레오티드를 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

당누클레오티드의 제조법

최근, 당쇄에 대한 연구가 급속하게 진행되면서 그 기능이 밝혀짐에 따라, 생리 활성을 갖는 올리고당의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 주목을 끌고 있다. 그러나, 현재 시판되고 있는 올리고당은 극히 제한된 종류의 것밖에 없을 뿐 아니라, 매우 고가이다. 또한, 그와 같은 올리고당은 시약 정도로밖에 제조할 수 없으므로, 반드시 그의 대량 제조법이 확립되어 있다고 할 수는 없다.

종래, 올리고당은 천연물로부터의 추출법, 화학 합성법 혹은 효소 합성법, 나아가 그들의 병용법으로 제조되었는데, 그 중에서도 효소 합성법이 대량 제조에 적합한 방법으로 여겨지고 있다. 즉, (1) 효소 합성법은 화학 합성법이 나타내는 보호, 탈보호의 번잡한 수순을 필요로 하지 않고, 목적하는 올리고당을 신속하게 합성할 수 있는 점, (2) 효소의 기질 특이성에 의해, 구조 특이성이 매우 높은 올리고당을 합성할 수 있는 점 등이 다른 방법보다 유리하다고 여겨지기 때문이다. 그리고, 최근의 재조합 DNA 기술의 발달로, 각종 합성 효소가 저렴하면서도 대량으로 생산될 수 있도록 하고 있는 것이, 효소 합성법의 우위성을 더욱 부추키는 결과가 되고 있다.

효소 합성법으로 올리고당을 제조하는 방법으로는, 올리고당의 가수 분해 효소의 역반응을 이용하는 방법, 및 당전이 효소를 이용하는 방법의 2 가지 방법을 생각할 수 있다. 전자의 방법은 기질로서 단가가 싼 단당을 사용할 수 있다는 이점은 있지만, 반응 자체는 분해 반응의 역반응을 이용하는 것이기 때문에, 합성 수율이나 복잡한 구조를 갖는 올리고당 제조에의 응용이란 점에서는, 반드시 최상의 방법이라고 생각되지는 않는다.

한편, 후자는 당전이 효소를 사용하는 합성법으로서, 합성 수율이나 복잡한 구조를 갖는 올리고당 제조에의 응용이라는 점에서, 전자의 방법보다 유리하다고 생각되고 있으며, 또한 최근의 재조합 DNA 기술의 진보로, 각종 당전이 효소의 양산화도 이 기술을 실현화하는데 도움이 되고 있다.

그러나, 당전이 효소를 사용하는 합성법에 사용되는 당공여체인 당누클레오티드는 일부의 것을 제외하고는 여전히 고가이며, 양적으로도 시약 규모의 매우 적은 공급량밖에 제공할 수 없는 것이 현상황이다. 예컨대, 많은 생리 활성 당쇄의 코어 부분에 함유되는 글루코오스의 공여체인 우리딘이인산글루코오스 (UDPG) 에 대하여도, 우리딜산 (UMP) 과 글루코오스-1-인산 (G-1-P) 에서 화학적으로 합성하는 방법, 혹은 UMP 와 글루코오스를 기질로 사용한 효모 균체법 (T. Tochikura et al., J. Ferment. Technol., 46, 957 (1968), S. Shirota, et al., Agric. Biol. Chem., 35, 325 (1971), S. Watanabe and I Takeda, Agric, Biol. Chem., 36, 2265 (1972)) 등이 보고되어 있으나, 공업적 생산의 현실화까지는 아직도 검토의 여지가 남아 있다.

본 발명자들은 UMP 와 글루코오스를 기질로 사용한 종래의 효모 균체법에 의한 UDPG 의 생산법을 검토하였으나, UDPG 의 생성량이 매우 적고, 첨가한 UMP 의 60 % 이상은 우리딘삼인산 (UTP) 혹은 우리딘이인산 (UDP) 으로 변환되어, UDPG 의 생산 방법으로서는 도저히 실용화할 수 있는 방법이 아니었다.

따라서, 본 발명은 종래의 효모 균체법을 개량하여, UDPG 등의 당누클레오티드를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 효모에 의한 UDPG 의 합성은 UMP 에서 UTP 를 합성하는 반응계, 글루코오스에서 G-1-P 를 합성하는 반응계, 및 UTP 와 G-1-P 에서 UDPG 를 합성하는 반응계의 3 개의 반응계가 효과적으로 공역하는 것이 중요한 바, UMP 에서 UTP 를 합성하는 반응은 비교적 원활하게 진행되는데 비하여, G-1-P 합성 활성과, UTP 와 G-1-P 로부터의 UDPG 합성 활성이 미약하고, 더욱이 그들이 효과적으로 공역하지 않기 때문에, 결과적으로 목적하는 UDPG 의 생산량이 낮아지는 것을 밝혀냈다.

이 문제를 해결하기 위하여 더욱 연구를 진행시킨 결과, 효모에 있어서는 UDPG 가 아니라 UTP 의 합성을 주안으로 하여, 반응계에 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제와 G-1-P 를 공존시킴으로써, 각각의 효소 반응을 효과적으로 공역시킬 수 있으며, 따라서 목적으로 하는 UDPG 를 고수율로 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 이 방법은 UDPG 에 한정되지 않고, 다른 당누클레오티드의 합성에도 적용할 수 있는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 효모 균체를 사용하여 누클레오티드에서 당누클레오티드를 제조하는 방법에 있어서, 반응계에 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제와 당1-인산을 공존시키는 것을 특징으로 하는 당누클레오티드의 제조법에 관한 것이다.

본 발명은 올리고당 합성의 중요한 기질인 당누클레오티드의 제조법에 관한 것이다.

도 1 은 UDPG 의 시간의 경과에 따른 생성량을 나타낸 것이다.

도 2 는 GDP 만노오스의 시간의 경과에 따른 생성량을 나타낸 것이다.

발명을 실시하기 위한 최상의 형태

본 발명에서의 당누클레오티드로는, 공지된 당누클레오티드라면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, UDPG, UDP 갈락토오스, UDP 글루크론산 등의 UDP 당, GDP 만노오스, GDP 푸코오스, GDP 글루코오스 등의 GDP 당, ADP 글루코오스 등의 ADP 당, dTDP 글루코오스, dTDP 갈락토오스 등의 dTDP 당, CDP 글루코오스 등의 CDP 당 등을 예시할 수 있다.

반응에 사용되는 효모로는, 종래 누클레오티드, 당누클레오티드 등의 제조에 사용되는 효모라면 특별히 제한하지 않고 사용할 수 있다. 구체적으로는, 지고사카로미세스 (Zygosaccharomyces) 속, 사카로미세스 (Saccharomyces) 속, 칸디다 (Candida) 속, 토루로프시스 (Torulopsis) 속, 한세누라 (Hansenula) 속, 데바리오미세스 (Debaryomyces) 속 등의 속에 속하는 효모를 사용할 수 있다. 이와 같은 효모는 생 효모, 건조 효모의 어떤 것이라도 되는데, 반응 수율의 관점에서 건조 효모를 사용하는 것이 바람직하다.

반응계에 공존시키는 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제로는, 특정한 유래의 것에 한정되지 않고, 동물 유래, 식물 유래, 미생물 유래 등 모든 유래의 것을 사용할 수 있으나, 효소 조제의 간편성 등의 관점에서 미생물 유래의 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 사용하는 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제 유전자가 클론화되어 있는 경우에는, 그 클론화된 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제 유전자를 사용하여, 통상의 방법으로 대장균 등을 숙주로서 대량 생산시켜, 당해 재조합균에서 당해 효소를 조제할 수도 있다.

이와 같은 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제는 당해 활성을 갖는 한, 어떤 형태라도 된다. 구체적으로는, 미생물의 균체, 이 균체의 처리물 또는 이 처리물에서 얻어지는 효소 조제물 등을 들 수 있다.

미생물의 균체의 조제는 당해 미생물이 생육할 수 있는 배지를 사용하여, 통상의 방법으로 배양시킨 후, 원심 분리 등으로 집균하는 방법으로 행할 수 있다. 구체적으로, 바실러스속 또는 대장균류에 속하는 세균을, 예를 들어 설명하면, 배지로는 부용 (borth) 배지, LB 배지 (1 % 트립톤, 0.5 % 이스트엑스토락토, 1 % 식염) 또는 2 × YT 배지 (1.6 % 트립톤, 1 % 이스트엑스토락토, 0.5 % 식염) 등을 사용할 수 있으며, 당해 배지에 종균을 접종시킨 후, 약 30 ∼ 50 ℃ 로 약 10 ∼ 50 시간 정도 필요에 따라 교반하면서 배양하고, 얻어진 배양액을 원심 분리하여 미생물 균체를 집균함으로써, 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제 활성을 갖는 미생물 균체를 조제할 수 있다.

미생물의 균체 처리물로는, 상기 미생물 균체를 기계적 파괴 (워링 브렌더, 프렌치 프레스, 호모디나이저, 유발 등에 의함), 동결 융해, 자기 소화, 건조 (동결 건조, 바람 건조에 의함), 효소 처리 (리조팀 등에 의함), 초음파 처리, 화학 처리 (산, 알칼리 처리 등에 의함) 등의 일반적인 처리법에 따라 처리하여 얻어지는 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 혹은 세포막의 변성물을 들 수 있다.

효소 조제물로는, 상기 균체 처리물에서 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제 활성을 갖는 획분을, 통상적인 효소 정제 수단, 예를 들면 염석 처리, 등전점 침전 처리, 유기 용매 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등을 실시하여 얻어지는 조효소 또는 정제 효소를 사용할 수 있다.

반응액에 첨가하는 당1-인산 및 누클레오티드 (누클레오시드모노인산) 는 목적으로 하는 당누클레오티드에 따라, 이미 알려져 있는 것으로부터 적절하게 선택하며, 시판되어 있는 것, 혹은 공지된 방법으로 조제된 것 등을 사용하면 된다. 사용 온도로는 각각 약 1 ∼ 200 mM 이 바람직하며, 약 10 ∼ 100 mM 이 특히 바람직하다.

당누클레오티드의 합성에 사용하는 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제, 누클레오티드 및 당1-인산의 조합의 구체예를 하기 표 1 에 나타낸다.

당누클레오티드	누클레오티드	당1-인산	누클레오티드이인산-당피로포스포릴라아제
①UDP 당 UDP 글루코오스 UDP 갈락토오스 UDP 글루크론산②GDP 당 GDP 만노오스 GDP 푸코오스 GDP 글루코오스③ADP 당 ADP 글루코오스④dTDP 당 dTDP 글루코오스 dTDP 갈락토오스⑤CDP 당 CDP 글루코오스	UMPUMPUMPGMPGMPGMPAMPdTMPdTMPCMP	글루코오스1-인산갈락토오스1-인산글루크로네이트1-인산만노오스1-인산푸코오스1-인산글루코오스1-인산글루코오스1-인산글루코오스1-인산갈락토오스1-인산글루코오스1-인산	UDP글루코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.9)UDP갈락토오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.10)UDP글루크론산피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.44)GDP만노오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.13)GDP푸코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.30)GDP글루코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.34)ADP글루코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.27)dTDP글루코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.24)dTDP갈락토오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.32)CDP글루코오스피로포스포릴라아제(E.C.2.7.7.33)

또한, 당1-인산 대신에 당1-인산의 생성계를 반응액에 공존시켜도 된다. 예를 들면, 자당과 자당 포스포릴라아제의 조합에 의한 G-1-P 생성계 (E. J. Vandamme et al., Adv. Appl. Microbiol., 32, 163-201 (1987)), 글리코겐과 글리코겐포스포릴라아제의 조합에 의한 G-1-P 생성계 (P. H. Strausbauch et al., Methods in Enzymology, 11, 671-675) 등을 이용할 수 있다.

상기 효소 및 기질 이외에, 반응계에는 무기 인산과 에너지원을 첨가하는 것이 바람직하다.

사용하는 무기 인산으로는, 인산칼륨 등의 인산염을 그대로 사용할 수 있으나, 인산 완충액으로서 사용하는 것이 바람직하다. 사용 농도는 약 10 ∼ 500 mM 이 바람직하고, 약 100 ∼ 300 mM 이 특히 바람직하다. 또한, 인산 완충액의 pH 도 약 6.0 ∼ 9.0 의 범위에서 적절히 설정할 수 있다.

에너지원으로는, 글루코오스, 푸락토오스, 수크로오스 등의 당류, 아세트산, 구연산 등의 유기산을 사용할 수 있다.

당누클레오티드의 합성 반응은 인산 완충액중에 효모 균체, 누클레오시드, 당1-인산, 에너지원으로서의 당류 혹은 유기산을 첨가하고, 그리고 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제를 바람직하게는 약 0.001 유닛/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.01 ∼ 100 유닛/㎖ 로 첨가한 후, 바람직하게는 약 30 ℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 ∼ 20 ℃ 에서 약 1 ∼ 50 시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.

그리고, 당1-인산과 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제는 반응 개시시에 첨가하여도 되지만, 반응 개시후에, 첨가한 누클레오티드에 대응하는 누클레오시드삼인산의 생산이 최대로 된 시점에서, 반응액을 약 60 ℃ 이상에서 5 분 이상의 열처리 등의 효모 유래의 효소를 실활 (失活) 시키는 처리를 한 다음, 당1-인산과 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제를 첨가하여 효소 반응을 계속해서 실행시키는 것이 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어진 당누클레오티드는 당누클레오티드의 통상의 단리 정제 수단 (이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 염석 등) 으로 단리 정제할 수 있다.

이하, 실시예를 나타냄으로써 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

그리고, 이하의 실시예에서의 DNA 조제, 제한 효소에 의한 절단, T4DNA 리가아제에 의한 DNA 연결, 및 대장균의 형질 전환법은 모두 「Molecular cloning」 (Maniatis 등 편, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) 에 따라 실시한다. 또한, 제한 효소, AmpliTaq DNA 폴리머라아제, T4DNA 리가아제는 다까라 슈조 (주) 에서 입수하였다. 그리고, 반응액중의 당누클레오티드의 정량은 HPLC 법으로 실행한다. 구체적으로는, 분리에는 YMC 사 제조의 ODS-AQ 312 칼럼을 사용하고, 용출액으로 0.5 M 인산-칼륨 용액을 사용하는 계, 분리에는 YMC 사 제조의 ODS-AM 303 칼럼을 사용하고, 용출액으로 0.2 M 트리에틸아민-아세트산 (pH 8.0) 을 사용하는 계 등을 채택하였다.

실시예 1 : UDPG 의 합성 1

(1) 대장균 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제 유전자의 클로닝

대장균 K 12 주 JM 109 균 (다까라 슈조 (주) 에서 입수) 의 염색체 DNA 를 사이또와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 조제한다. 이 DNA 를 템퍼레이트로서, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상의 방법에 따라 합성하고, PCR 법으로 대장균 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제 (gal U) 유전자 (Weissborn et al., J. Bacteriol., 176, 2611 (1994)) 를 증폭한다.

프라이머 (A) : 5'-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3'

프라이머 (B) : 5'-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3'

PCR 에 의한 galU 유전자의 증폭은, 50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 % 젤라틴, 템퍼레이트 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (A) 및 (B) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5 유닛의 조성의 반응액 100 ㎕ 에 대해, DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조) 를 사용하여, 열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (55 ℃, 1.5 분), 폴리머라이제이션 (72 ℃, 1.5 분) 의 단계를 25 회 반복함으로써 실시한다.

유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액으로 처리하고, 수용성 획분에 2 배 용량의 에탄올을 첨가하여, DNA 를 침전시킨다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular cloning, 상술함) 의 방법에 따라, 아가로오스겔 전기 영동으로 분리하여, 1.0 kb 상당의 DNA 단편을 정제한다. 이 DNA 를 제한 효소 EcoRI 및 SalI 로 절단하고, 마찬가지로 제한 효소 EcoRI 및 SalI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech. 사에서 입수) 와 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결한다. 연결 반응액을 사용하여 대장균 JM 109 균을 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 형질 전환체에서 플라스미드 pTrc-galU 를 단리한다. pTrc-galU 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 EcoRI-SalI 절단 부위에 대장균 galU 유전자를 함유하는 EcoRI-SalI DNA 단편이 삽입된 것이다.

(2) 대장균 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제의 조제

플라스미드 pTrc-galU 를 유지하는 대장균 JM 109 균을, 100 ㎎/L 의 암피실린을 함유하는 2 × YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고, 37 ℃ 에서 진탕 배양한다. 4 × 10⁸균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에, 마지막 농도가 1 mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 2.5 시간 동안 진탕 배양을 더 계속한다.

배양 종료 후, 원심 분리 (9,000 × g, 10 분) 에 의해 균체를 회수하고, 50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 % 트라이톤 X-100, 0.2 ㎎/㎖ 리조팀의 조성의 완충액 60 ㎖ 에 현탁한다. 37 ℃ 로 1 시간 보온한 후, 초음파 처리를 실시하여 균체를 파쇄하고, 그리고 원심 분리 (20,000 × g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거한다. 이와 같이 하여 얻어진 상청 획분을 효소 표품으로 한다. 효소 표품에서의 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제 활성을 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM 109 균) 과 함께 하기 표 2 에 나타낸다.

균주	UDP 글루코오스피로포스포릴라아제 활성(유닛/㎎ 단백질)
JM109/pTrc99AJM109/pTrc-galU	＜0.520.4

그리고, UDP 글루코오스피로포스포릴라아제 활성의 단위 (유닛) 는 이하에 나타내는 방법으로 측정하여 산출한다. 즉, 5 mM 염화마그네슘, 6 mM UTP, 6 mM G-1-P 를 함유하는 50 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.0) 에 효소 표품을 첨가하고, 37 ℃ 로 보온함으로써 반응을 실시하며, 100 ℃ 에서 5 분간의 열처리로 효소를 실활시킨 다음, HPLC 법으로 반응액중의 UDPG 를 정량하여, 37 ℃ 에서 1 분 동안에 1 μ몰의 UDPG 를 생성하는 활성을 1 단위 (유닛) 로 한다.

(3) 건조 빵효모를 사용한 UDPG-UTP 액의 조제

40 mM UMP, 100 mM 글루코오스, 200 mM 인산나트륨 (pH 8.0), 10 mM 염화마그네슘의 조성의 반응액 20 ㎖ 를 100 ㎖ 용량 비이커에서 조제하고, 이것에 2 g 의 건조 빵효모 (오리엔탈 효모 공업 주식회사) 를 현탁시켜, 20 ℃ 에서 9 시간 동안 교반 반응시킨다. 반응 종료후, 반응액을 100 ℃ 에서 5 분간 처리하고, 원심 분리 (2,000 × g, 10 분간) 에 의해 효모 균체를 제거한다. 회수한 상청 획분을 HPLC 로 분석한 결과, 7.9 mM UDPG, 21.9 mM UTP 의 생성이 확인되었다.

(4) UDPG-UTP 액에의 UDPG 피로포스포릴라아제 및 G-1-P 첨가에 의한 UDPG 의 합성

상술한 UDPG-UTP 액 100 ㎖ 에 마지막 농도가 30 mM 이 되도록 G-1-P 를 첨가하고, 0.5 유닛/㎖ UDP 글루코오스피로포스포릴라아제가 되도록 실시예 2 기재의 효소 표품을 첨가하여, 30 ℃ 에서 30 시간 동안 반응시킨다. 반응액중의 UDPG 농도를 HPLC 로 분석한 결과, 30.9 mM 의 UDPG 의 생성이 확인되었다.

실시예 2 : UDPG 의 합성 2

실시예 1 의 (3) 및 (4) 와 같은 방법으로 UDPG 를 합성한다. 단, 첨가하는 UDP 글루코오스피로포스포릴라아제는 0 유닛, 0.5 유닛 또는 5 유닛의 효소 단위의 효소를 사용한다.

UDPG 의 시간의 경과에 따른 생성량을 도 1 에 나타낸다.

실시예 3 : UDPG 의 합성 3

(1) 대장균 말토덱스트린포스포릴라아제 유전자의 클로닝

대장균 K 12 주 JM 109 균 (다까라 슈조 (주) 에서 입수) 의 염색체 DNA 를 사이또와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 조제한다. 이 DNA 를 템퍼레이트로서, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상의 방법에 따라 합성하고, PCR 법으로 대장균 말토덱스트린포스포릴라아제 (malP) 유전자 (Nature, 313(6002), 500 ∼ 502 (1985)) 를 증폭한다.

프라이머 (C) : 5'-TAGAATTCAACTCCTCCCTGCCTAATCCCCC-3'

프라이머 (D) : 5'-TTGGATCCCGGCATTATCCAGACGTTTGCTT-3'

PCR 에 의한 mal P 유전자의 증폭은, 50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 % 젤라틴, 템퍼레이트 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (C) 및 (D) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5 유닛의 조성의 반응액 100 ㎕ 에 대해, DNA Thermal Cycler (Perkin-ELmer Cetus Instrument 사 제조) 를 사용하여, 열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (60 ℃, 1.5 분), 폴리머라이제이션 (72 ℃, 3 분) 의 단계를 25 회 반복함으로써 실시한다.

유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액으로 처리하고, 수용성 획분 2 배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시킨다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular cloning, 상술함) 의 방법에 따라, 아가로오스겔 전기 영동으로 분리하여, 2.0 kb 상당의 DNA 단편을 정제한다. 이 DNA 를 제한 효소 EcoRI 및 BamHI 로 절단하고, 마찬가지로 제한 효소 EcoRI 및 BamHI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech. 사에서 입수) 와 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결한다. 연결 반응액을 사용하여 대장균 JM 109 균을 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 형질 전환체에서 플라스미드 pTrc-malP 를 단리한다. pTrc-malP 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 EcoRI-BamHI 절단 부위에 대장균 malP 유전자의 프로모터 및 구조 유전자를 함유하는 EcoRI-BamHI DNA 단편이 삽입된 것이다.

(2) 대장균 말토덱스트린포스포릴라아제의 조제

플라스미드 pTrc-malP 를 유지하는 대장균 JM 109 균을, 100 ㎎/L 의 암피실린을 함유하는 2 × YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고, 37 ℃ 에서 8 시간 동안 진탕 배양한다. 4 × 10⁸균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에, 마지막 농도가 1 mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 시간 동안 진탕 배양을 더 계속한다.

배양 종료 후, 원심 분리 (9,000 × g, 10 분) 에 의해 균체를 회수하고, 50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 % 트라이톤 X-100, 0.2 ㎎/㎖ 리조팀의 조성의 완충액 60 ㎖ 에 현탁한다. 37 ℃ 로 1 시간 보온한 후, 초음파 처리를 실시하여 균체를 파쇄하고, 그리고 원심 분리 (9,000 × g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거한다. 이와 같이 하여 얻어진 상청 획분을 효소 표품으로 한다. 효소 표품에서의 말토덱스트린포스포릴라아제 활성을 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM 109 균) 과 함께 하기 표 3 에 나타낸다.

균주	말토덱스트린포스포릴라아제 활성(유닛/㎎ 단백질)
JM 109/pTrc99AJM 109/pTrc-malP	1.593.8

그리고, 본 발명에서의 말토덱스트린포스포릴라아제 활성의 단위 (유닛) 는 이하의 방법으로 측정하여 산출한 것이다. 즉, 5 mM 염화마그네슘, 6 mM UTP, 0.5 % 덱스트린 (W/V), 1 U/㎖ 기질의 UDPG 피로포스포릴라아제를 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0) 에 말토덱스트린포스포릴라아제 효소 표품을 첨가하고, 30 ℃ 로 보온함으로써 반응을 실시하며, 반응량과 등량의 70 % 에탄올을 첨가함으로써 효소를 실활시킨 다음, HPLC 법으로 반응액중의 UDPG 를 정량하여, 30 ℃ 에서 1 분 동안에 1 μ몰의 UDPG 를 생성하는 활성을 1 단위 (유닛) 로 한다.

(3) UDPG-UTP 효모 반응액에의 UDPG 피로포스포릴라아제, 말토덱스트린포스포릴라아제 및 덱스트린 첨가에 의한 UDPG 의 합성

실시예 1 의 (3) 에서 조제한 UDPG-UTP 액 100 ㎖ 에, 마지막 농도가 2 % (W/V) 가 되도록 덱스트린 (Difco 사 제조) 을 첨가하고, 0.5 유닛/㎖ 가 되도록 UDPG 글루코오스피로포스포릴라아제 및 말토덱스트린포스포릴라아제 표품을 더 첨가하여, 30 ℃ 에서 30 시간 동안 반응시킨다. 반응액중의 UDPG 농도를 HPLC 로 분석한 결과, 31.0 mM 의 UDPG 의 생성이 확인되었다.

실시예 4 : GDP 만노오스의 합성

(1) 대장균 GDP 만노오스피로포스포릴라아제 유전자의 클로닝

대장균 ATCC 4157 의 염색체 DNA 를 사이또와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 조제한다. 이 DNA 를 템퍼레이트로서, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상의 방법에 따라 합성하고, PCR 법으로 대장균 GDP 만노오스피로포스포릴라아제 (manC) 유전자 (Gordon Stevenson et al., J. Bacteriol., 178, 4885 (1996)) 를 증폭한다.

프라이머 (E) : 5'-ATGCCGAATTCCCGTCGAAACTGA-3'

프라이머 (F) : 5'-GGAATTCCGTTGGGGAAATTGCCG-3'

PCR 에 의한 man C 유전자의 증폭은, 50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 % 젤라틴, 템퍼레이트 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (E) 및 (F) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5 유닛의 조성의 반응액 100 ㎕ 에 대해, DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조) 를 사용하여, 열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (55 ℃, 2 분), 폴리머라이제이션 (72 ℃, 3 분) 의 단계를 25 회 반복함으로써 실시한다.

유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액으로 처리하고, 수용성 획분에 2 배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시킨다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular cloning, 상술함) 의 방법에 따라, 아가로오스겔 전기 영동으로 분리하여, 1.8 kb 상당의 DNA 단편을 정제한다. 이 DNA 를 제한 효소 EcoRI 로 절단하고, 마찬가지로 제한 효소 EcoRI 로 소화한 플라스미드 pUC18 (다까라 슈조 (주) 에서 입수) 와 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결한다. 연결 반응액을 사용하여 대장균 JM 109 균을 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 형질 전환체에서 플라스미드 pUC18-manC 를 단리한다. pUC18-manC 는 pUC18 의 lac 프로모터 하류의 EcoRI 절단 부위에 대장균 manC 유전자를 함유하는 EcoRI DNA 단편이 삽입된 것이다.

(2) 대장균 GDP 만노오스피로포스포릴라아제의 조제

플라스미드 pUC18-manC 를 유지하는 대장균 JM 109 균을, 100 ㎎/L 의 암피실린을 함유하는 2 × YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고, 37 ℃ 에서 진탕 배양한다. 4 × 10⁸균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에, 마지막 농도가 1 mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 5 시간 동안 진탕 배양을 더 계속한다.

배양 종료 후, 원심 분리 (9,000 × g, 10 분) 에 의해 균체를 회수하고, 50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 % 트라이톤 X-100, 0.2 ㎎/㎖ 리조팀의 조성의 완충액 60 ㎖ 에 현탁한다. 37 ℃ 로 1 시간 보온한 후, 초음파 처리를 실시하여 균체를 파쇄하고, 그리고 원심 분리 (20,000 × g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거한다. 이와 같이 하여 얻어진 상청 획분을 효소 표품으로 한다. 효소 표품에서의 GDP 만노오스피로포스포릴라아제 활성을 대조균 (pUC18 을 유지하는 대장균 JM 109 균) 과 함께 하기 표 4 에 나타낸다.

균주	GDP 만노오스피로포스포릴라아제 활성(유닛/㎎ 단백질)
JM 109/pUC18JM 109/pUC18-macC	＜0.010.23

그리고, GDP 만노오스피로포스포릴라아제 활성의 단위 (유닛) 는 이하에 나타내는 방법으로 측정하여 산출한 것이다. 즉, 1 mM 염화마그네슘, 5 mM GTP, 5 mM 만노오스-1-P 를 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.6) 에 효소 표품을 첨가하고, 37 ℃ 로 보온함으로써 반응을 실시하며, 100 ℃ 에서 5 분간의 열처리에 의해 효소를 실활시킨 후, HPLC 법으로 반응액중의 GDP 만노오스를 정량하여, 37 ℃ 에서 1 분 동안에 1 μ몰의 GDP 만노오스를 생성하는 활성을 1 단위 (유닛) 로 한다.

(3) 건조 빵효모를 사용한 GDP 만노오스-GTP 액의 조제

40 mM GMP, 200 mM 글루코오스, 200 mM 인산칼륨 (pH 8.0), 10 mM 염화마그네슘의 조성의 반응액 20 ㎖ 를 100 ㎖ 용량 비이커에서 조제하고, 이것에 2 g 의 건조 빵효모 (오리엔탈 효모 공업 주식회사) 를 현탁하여, 20 ℃ 에서 7 시간 동안 교반 반응시킨다. 반응 종료후, 반응액을 100 ℃ 에서 5 분간 처리하고, 원심 분리 (2,000 × g, 10 분간) 에 의해 효모 균체를 제거한다. 회수한 상청 획분을 HPLC 로 분석한 결과, 11.2 mM GDP 만노오스, 10.1 mM GTP 의 생성이 확인되었다.

(4) GDP 만노오스-GTP 액에의 GDP 만노오스피로포스포릴라아제 및 만노오스-1-P 첨가에 의한 GDP 만노오스의 합성

상술한 GDP 만노오스-GTP 액 200 ㎕ 에, 마지막 농도가 20 mM 이 되도록 만노오스-1-P 를 첨가하고, 0.1 유닛/㎖ GDP 만노오스피로포스포릴라아제가 되도록 상기 효소 표품을 첨가하여, 물로 전량을 400 ㎕ 로 한 다음, 37 ℃ 에서 8 시간 동안 반응시킨다. 반응액중의 GDP 만노오스 농도를 HPLC 로 분석한 결과, 10.5 mM 의 GDP 만노오스의 생성이 확인되었다.

실시예 5

실시예 4 의 (3) 및 (4) 와 같은 방법으로 GDP 만노오스를 합성한다. 단, 첨가하는 GDP 만노오스피로포스포릴라아제는 0 유닛, 0.025 유닛, 0.05 유닛, 0.1 유닛의 효소 단위의 효소를 사용한다. GDP 만노오스의 시간의 경과에 따른 생성량을 도 2 에 나타낸다.

본 발명에 의하면, 종래의 효모 균체법에서는 생산성이 낮았던 각종 당누클레오티드를 효율적으로 제조할 수 있다.

Claims

효모 균체를 사용하여 누클레오티드에서 당누클레오티드를 제조하는 방법에 있어서, 반응계에 누클레오시드이인산-당피로포스포릴라아제와 당1-인산을 공존시키는 것을 특징으로 하는 당누클레오티드의 제조법.
제 1 항에 있어서, 당누클레오티드가 UDP 당, GDP 당, ADP 당, dTDP 당 및 CDP 당으로 이루어지는 군에서 선택되는 제조법.
제 1 항에 있어서, 당누클레오티드가 다음의 ① ∼ ⑤ 로 이루어지는 A 군에서 선택되는 제조법 :

(A 군)

ⓛ UDP 당 ; UDP 글루코오스, UDP 갈락토오스 및 UDP 글루크론산

② GDP 당 ; GDP 만노오스, GDP 푸코오스 및 GDP 글루코오스

③ ADP 당 ; ADP 글루코오스

④ dTDP 당 ; dTDP 글루코오스 및 dTDP 갈락토오스

⑤ CDP 당 ; CDP 글루코오스.
제 1 항에 있어서, 당1-인산 대신에 당1-인산 생성계를 공존시키는 제조법.
제 4 항에 있어서, 당1-인산 생성계가 포스포릴라아제를 사용한 것인 제조법.
제 4 항에 있어서, 당1-인산 생성계가 글루코오스-1-인산 (G-1-P) 생성계인 제조법.
제 4 항에 있어서, 당1-인산 생성계가 자당과 자당 포스포릴라아제의 조합에 의한 G-1-P 생성계, 글리코겐과 글리코겐포스포릴라아제의 조합에 의한 G-1-P 생성계, 또는 덱스트린과 말토덱스트린포스포릴라아제의 조합에 의한 G-1-P 생성계인 제조법.