DE69228005T2

DE69228005T2 - Herstellung von fucosylierten Kohlenhydraten durch enzymatische Fucosylierungs-Synthese der Zuckernukleotide; und in situ Regeneration von GDP-fucose

Info

Publication number: DE69228005T2
Application number: DE69228005T
Authority: DE
Inventors: Yoshitaka San Diego Ca 92122 Ichikawa; Kun-Chin New Haven Ct 06511 Liu; Gwo-Jenn Carlsbad Ca 92009 Shen; Chi-Huey Rancho Santa Fe Ca 92122 Wong
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1991-10-15
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2012-10-16
Also published as: ES2129458T3; DE69228005D1; AU675209B2; US6518418B1; JPH07500248A; FI941732A0; AU2785492A; US7335500B2; FI941732A; BG98713A; EP0642526A4; CA2121365C; US20020068331A1; SK42594A3; ATE174925T1; CA2121365A1; RO118132B1; EP0642526B1; EP0642526A1; WO1993008205A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung stellt verbesserte Verfahren zur enzymatischen Herstellung von fucosylierten Kohlenhydraten bereit. Außerdem werden Zuckernukleotide offenbart, welche als Donorzucker zur Fucosylierung von Akzeptorkohlenhydraten verwendet werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines fucosylierten Kohlenhydrats in einer Einfachreaktionsmischung bzw. einem einzigen Reaktionsgemisch bereit, umfassend die Schritte: Verwenden einer Fucosyltransferase zum Bilden einer O-Glycosidbindung zwischen einer Nukleosid-5'-diphospho-fucose und einer verfügbaren Hydroxylgruppe eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls zum Erhalten eines fucosylierten Kohlenhydrats und eines Nukleosid-5'-diphosphats; und in situ-Regeneration des Nukleosid-5'- diphosphats mit Fucose zum Bilden der entsprechenden Nukleosid-5'-diphosphofucose. Zu bevorzugten Verfahren dieser Erfindung gehören die Verwendung von Guanin als Base für das Nukleosid, die Verwendung von katalytischen Mengen von Nukleosiden, die Verwendung von N-Acetylglucosamin, Galactose, N-Acetylgalactosamin oder N-Acetyllactosamin als Kohlenhydrat-Akzeptormolekül und die Verwendung eines sialylierten Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls.
Diese Erfindung zieht ferner in Betracht das vorstehende Verfahren zum Herstellen eines fucosylierten sialylierten Kohlenhydratmoleküls durch enzymatische Bildung von glycosidischen Verknüpfungen in einer Einfachreaktionsmischung umfassend: Bilden einer ersten glycosidischen Verknüpfung zwischen einem diphosphonukleosid-aktivierten Glycosyldonor wie UDP-Gal und einer verfügbaren Hydroxylgruppe eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls wie GlcNAc unter Verwendung einer ersten Glycosyltransferase wie β1,4-Galactosyltransferase beim Herstellen von Galβ1,4GlcNAc; das Bilden einer zweiten glycosidischen Verknüpfung zwischen einem monophosphonukleosid-aktivierten Sialyldonor wie CMP-NeuAc und einer verfügbaren Hydroxylgruppe des Zucker- Akzeptormoleküls wie dem in 3-Stellung befindlichen Hydroxyl von Gal von Galβ1,4GlcNAc unter Verwendung einer Sialyltransferase wie α2,3-Sialyltransferase; das Bilden einer dritten glycosidischen Verknüpfung zwischen einem diphosphonukleosid-aktivierten Fucosyldonor wie GDP-Fuc und einer verfügbaren Hydroxylgruppe des Zucker-Akzeptormoleküls wie dem in 3-Stellung befindlichen Hydroxyl des GlcNAc von Galβ1,4GlcNAc unter Verwendung einer Fucosyltransferase wie α1,3/4-Fucosyltransferase, worin mindestens einer der Schritte (a), (b) oder (c) ferner die in situ-Bildung des phosphonukleotid-aktivierten Glycosyldonors aus einer katalytischen Menge des entsprechenden Monophosphat- und Diphosphatnukleosids umfaßt. Besonders bevorzugt sind Verfahren dieser Erfindung, worin das fucosylierte sialylierte Kohlenhydratbestandteil-Produkt ein sialylierter Lewis-Ligand wie Sialyl Lex (SLex) oder Sialyl Lea (SLea) ist und worin die Fucose von einem Fucosyldonor auf eine Hydroxylgruppe eines N-Acetylglucosamin- oder Galactoserests des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls übertragen wird.
Dieses Verfahren umschließt mehrere Glycosyltransferasen, die Reaktionen in einer Einfachreaktionsmischung katalysieren, und bevorzugt sind diejenigen Verfahren, bei denen eine Glycosyltransferase eine Sialyltransferase ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: α2,3-Sialyltransferase, einer α2,4-Sialyltransferase, einer α2,6-Sialyltransferase und α2,8-Sialyltransferase. Die Erfindung zieht die Fucosylierung eines Oligosaccharids in Betracht und bevorzugt sind diejenigen Fucosyltransferasen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: einer α1,2-Fucosyltransferase, α1,3/4-Fucosyltransferase, α1,3-Fucosyltransferase, α1,6-Fucosyltransferase und α1,4-Fucosyltransferase. Zu besonders bevorzugten Fucosyltransferasen gehören β-Galactosidase, α1,2-Fucosyltransferase, N-Acetylglucosamin-α1,3-fucosyltransferase, N-Acetylglucosamin-α1,4-fucosyltransferase und N-Acetylglucosamin-α1,6- fucosyltransferase.
Die Kohlenhydrat-Akzeptormoleküle unterliegen praktisch keinerlei Beschränkungen, da die Glycosyltransferasen über die benachbarten Zuckerstellungen hinaus nicht selektiv sind. Folglich kann es sich bei ihnen um ein beliebiges kohlenhydratsubstituiertes Molekül handeln, bei dem das Kohlenhydrat ein Galβ1,4GlcNAc-Molekül oder ein Analogon davon ist oder das mit einem Galβ1,4GlcNAc-X-Bestandteil endet, wobei X ein organisches Molekül ist. Zu weiteren Kohlenhydrat-Akzeptormolekülen, welche Substrate für eine Fucosylase sind, gehören Analoga von Galβ1,4GlcNAc und Galβ1,4GlcNAc-X. Beispielhaft für solche Moleküle sind Lactose, NeuAcα1,6Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,4Glucal (Lactal), NeuAcα2,3Galβ1,4Glucal, die 2-halogen-substituierten Reaktionsprodukte der vorstehenden Glucalverbindungen, Galβ1,4(5-thio)Glc, Galβ1,4GlcNAcβ-O-allyl und dergleichen. Es versteht sich, daß das Kohlenhydrat- Akzeptormolekül eine verfügbare Hydroxylgruppe an dem Saccharid enthalten muß, mit dem die abgegebene Fucosyl- oder andere Zuckergruppe verknüpft wird, und das Hydroxyl, welches vorhanden sein muß, ist durch das Glycosyltransferase-Enzym festgelegt, welches in der Reaktion verwendet wird.
Das in dieser Anmeldung in Betracht gezogene Verfahren umfaßt ferner die Regeneration von katalytischen Mengen von Nukleotiden, die zum Bilden von Nukleosidzuckern vermiendet werden. Bevorzugte Basen für die Nukleotide sind entweder Cytidin, Guanin oder Uridin. Monosacchariddonoren sind aktivierte Nukleotidzucker wie Cytidin-5'- monophospho-N-acetylneuraminsäure, Guanidin-5'-diphospho-fucose und Uridin-5'- diphospho-galactose.
Außer den vorstehenden Verfahren zieht diese Erfindung auch in vitro-Reaktionssysteme in Betracht. Solche Systeme beziehen sich auf einen inerten oder nicht reaktiven Behälter oder Teilraum, in dem die Reagenzien untergebracht sind, die verwendet werden, um die vorstehend beschriebenen Reaktionen durchzuführen. Im einzelnen weisen diese Reaktionssysteme zumindest eine Fucosyltransferase und ein Nukleosiddiphospho-fucose bildendes Enzym auf. Diese Reaktionssysteme können außerdem Guanosin-diphosphofucose-pyrophosphorylase als GDP-Fucose-bildendes Enzym, eine Kinase wie Pyruvatkinase oder Fructose-1,6-diphosphatkinase, Acetylkinase oder Fucosekinase umfassen. Zu weiteren Reagenzien können ein NADPH-Regenerationssystem oder Guanosin-diphosphat-mannose und Guanosin-diphosphomannosepyrophosphorylase gehören. Wenn ein NADPH-Regenerationssystem vorhanden ist, kann es eine katalytische Menge von NADP, Isopropanol in einer Menge von ungefähr 1% bis ungefähr 10%, vorzugsweise ungefähr 2% bis 4% Gew./Vol. des Reaktionssystems und eine Alkoholdehydrogenase umfassen.
In dieser Anmeldung wird auch eine Anzahl von chemischen Verfahren zum Synthetisieren von Oligosacchariden offenbart. Ein Verfahren umfaßt die Herstellung eines Glycosyl-1- oder 2- phosphats durch Umsetzen eines geschützten Glycosylrings mit einem Hydroxyl in der anomeren Stellung (1- oder 2-Stellung) mit einem dreiwertigen Phosphitylierungsreagenz zum Erhalten eines geschützten Glycosyl-1- oder 2-phosphit-substituierten Rings. Das geschützte Phosphit wird oxidiert, um ein entsprechendes Phosphat zu bilden, welches in einer Enzymreaktion verwendet wird. Der Glycosylring kann ein Galactosyl, Glucosyl, Fucosyl, N-Acetylglucosyl und Mannosyl sowie andere Saccharide umfassen. Die bevorzugten dreiwertigen Phosphitylierungsreagenzien sind Dibenzyl- N,N-dialkylphosphoramidit wie etwa Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit. Solche Dialkylreste sind niedere Alkylreste mit 1 bis einschließlich 5 Kohlenstoffatomen und können gleich oder verschieden sein. Dieses Verfahren verwendet außerdem schützende Reagenzien wie Acetyl oder Benzyl. Der Glycosylring ist gegebenenfalls aus der Gruppe bestehend aus D- oder L-Aldosen mit vier, fünf oder sechs Kohlenstoffatomen oder aus der Gruppe, bestehend aus D- oder L-Ketosen mit vier, fünf oder sechs Kohlenstoffatomen, sowie Sacchariden mit bis zu 9 Kohlenstoffatomen in der Saccharidkette.
Außerdem werden in dieser Anmeldung neue Zwischenprodukte zur Herstellung von Glycosyl-1- oder 2-phosphaten offenbart. Ein bevorzugtes Zwischenprodukt ist ein geschütztes Phosphitylmonosaccharid der Formel I:
worin R&sub1; Aryl oder niederes Alkyl bedeutet;
X unabhängig voneinander Sauerstoff oder Stickstoff bedeutet;
R&sub2; unabhängig voneinander eine Acyl-, Benzyl-, Silyl- oder Alkyl- Schutzgruppe bedeutet;
R&sub3; unabhängig voneinander -CH&sub3;, -OR&sub2;, -CH&sub2;OR&sub2;, -GH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;) oder -CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;) -CH(OR&sub2;) bedeutet;
R&sub4; Wasserstoff (H), Carboxyl oder C&sub1;-C&sub5; oder Benzylcarboxylatester bedeutet; und
n 1 oder 2 bedeutet.

Definitionen

Der Ausdruck "verfügbare Hydroxylgruppe" bezieht sich auf ein hydroxy-substituiertes Kohlenstoffatom, das einen Teil des Ringanteils eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls bildet, welches eine glycosidische Verknüpfung durch die Wirkung einer Glycosyltransferase bilden kann, welche einen mono- oder diphosphonukleosid-aktivierten Glycosyldonor auf das verfügbare Kohlenstoffatom überträgt. Die "verfügbare Hydroxylgruppe" befindet sich typischerweise in der 3-Stellung für eine Fucosylierung.
Der Ausdruck "geschützter Glycosylring" bezieht sich auf Glycosylringe, bei denen die verfügbaren Amino- oder Hydroxysubstituenten mit Acyl-, Benzyl-, Silyl- oder Alkyl- Schutzgruppen umgesetzt worden sind. Solche Gruppen sind allgemein beschrieben worden in Green, T. W., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Inc., 1981.
Der Begriff "Kohlenhydrat(e)" soll jeden organischen Bestandteil umfassen, der Kohlenhydrate aufweist, die kovalent mit irgendwelchen monomeren Sacchariden verknüpft sind. Dies würde Disaccharide, Oligosaccharide, Glycolipide, Glycoproteine und unnatürliche Verknüpfungen wie etwa Saccharide, die an organische Verbindungen gebunden sind, welche natürlicherweise nicht an Zucker gebunden sind, umfassen.
Der Ausdruck "Kohlenhydrat-Akzeptormolekül" bezieht sich auf ein Molekül, das mindestens ein Monosaccharid enthält, wobei dieses Monosaccharid eine oder mehrere verfügbare Hydroxylgruppen zum Bilden von glycosidischen Verknüpfungen mit mono- oder diphosphonukleosid-aktivierten Glycosyldonoren aufweist.
Der Ausdruck "katalytische Menge" bezieht sich auf Konzentrationen von Reagenzien, die im Vergleich zu Reagenzien, welche in stöchiometrischen Mengen vorliegen, in rela tiv geringen Mengen vorliegen, und deren Konzentration während des Reaktionsprozeßes nicht um eine signifikante Menge verringert wird. Diese Reagenzien, die in katalytischen Mengen vorliegen, sind typischerweise Aktivierungsreagenzien, welche anschließend durch Nebenreaktionen regeneriert in die Reaktion zurückgeführt werden.
Der Ausdruck "mono- oder diphosphonukleosid-aktivierter Glycosyldonor" oder "aktiviertes Donormolekül" bezieht sich auf einen Nukleotidzucker wie Uridin-5'-diphosphogalactose. Diese Verbindungen enthalten energiereiche Bindungen, welche die Bildung der Glycosylbindung an das Kohlenhydrat-Akzeptormolekül erleichtern. Das Nukleosid kann aus beliebigen natürlichen Basen und Zuckern zusammengesetzt sein und kann auch geringfügig abgewandelte Derivate wie Methyl- oder Azosubstitutionen an der Base, dehydroxylierte oder geschützte Hydroxygruppen an den Zuckern und Thiophosphat-Analoga des Diphosphatbestandteils umfassen.
Der Ausdruck "glycosidische Verknüpfung" bezieht sich auf eine Sauerstoff/Kohlenstoff- Verknüpfung, die man typischerweise zwischen Zuckern antrifft. Sie kann entweder die α- oder β-Konfiguration aufweisen und es ist typischerweise daran eine Dehydratisierungssynthesereaktion beteiligt, bei der ein diphosphonukleosid-aktivierter Glycosyldonor auf einen verfügbaren Kohlenstoff eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls übertragen wird, wobei eine Glycosyltransferase verwendet wird.
Der Ausdruck "Glycosylring" bezieht sich auf einen Zucker oder Aminozucker mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring. Dazu gehören Aldosen, Desoxyaldosen und Ketosen, ohne Berücksichtigung der Orientierung oder Konfiguration der Bindungen der asymmetrischen Kohlenstoffatome. Dazu gehören Zucker wie etwa Ribose, Arabinose, Xylose, 1 yxose, Allose, Altrose, Glucose, Idose, Galactose, Talose, Ribulose, Xylulose, Psicose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin, N-Acetylmannosamin, N-Acetylneuraminsäure, Fructose, Sorbose, Tagatose, Rhamnose und Fucose.
Der Begriff "Glycosyltransferase" bezieht sich auf eine Familie von Enzymen, welche einen mono- oder diphosphonucleosid-aktivierten Glycosyldonor mit einem verfügbaren Kohlenstoff eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls über eine glycosidische Verknüpfung verbinden. Zu diesen Enzymen gehören sowohl Enzyme, die aus natürlichen Ausgangs materialien gereinigt wurden, als auch Enzyme, die aus Ausgangsmaterialien gereinigt wurden, welche genetisch modifiziert worden sind, um solche Enzyme zu exprimieren. Zu der Glycosyltransferase-Familie gehören Sialyltransferasen, N-Acetylglucosaminyltransferasen, N-Acetylgalactosaminyltransferasen, Fucosyltransferasen, Mannosyltransferasen, Galactosyltransferasen und KDO-Transferasen.
Der Ausdruck "NADPH-Regenerationssystem" bezieht sich auf ein Komplement von Enzymen, welche bei einer in situ-Enzymreaktion erzeugtes NADP wieder in NADPH zurückverwandeln. Typischerweise beruht ein solches System auf einer Alkoholdehydrogenase, die einen Alkohol (Isopropanol) in ein Keton (Aceton) umwandelt.
Der Ausdruck "sialylierter Lewis-Ligand" bezieht sich in funktioneller Hinsicht auf ein Molekül, das entweder an die ELAM-Rezeptor- oder die GMP-140-Rezeptor-Proteine binden kann. Chemisch definiert gehören zu diesen Liganden die natürlichen Tetrasaccharid-Liganden SLex und SLea und Derivate davon. Zu solchen Derivaten gehören geringfügige Substitutionen der Hydroxygruppen für Wasserstoff, Alkyl, Acyloxy, Alkoxy, Halogen, Glycosyl und dergleichen, Glycalmoleküle, eine Glycosylringverbindung, bei der der Ringsauerstoff durch S oder NH ersetzt ist, und ihre Alkyl- oder Acyl-Derivate oder oxidierte Derivate, das Anknüpfen des anomeren Kohlenstoffatoms an Kohlenhydrate oder organische Moleküle, Änderungen der Orientierung und der Stellungen von glycosidischen Verknüpfungen oder die Substitution von Enantiomeren der natürlichen Zucker.
Der Ausdruck "stöchiometrisches Verhältnis" bezieht sich auf Mengen eines Ausgangsprodukts, welche in direktem Verhältnis zu den Reaktionsprodukten vorliegen. Ein Reagenz liegt im stöchiometrischen Verhältnis zu den Endprodukten vor, da es typischerweise bei den Reaktionen, welche das Endprodukt ergeben, verwendet wird, und während dieses Verfahrens nicht regeneriert wird. Stöchiometrische Verhältnisse weisen typischerweise ein Verhältnis von annähernd 1 : 1 oder 2 : 1 des Ausgangsprodukts zu dem Endprodukt auf.
Der Ausdruck "dreiwertiges Phosphitylierungsreagenz" bezieht sich auf ein Reagenz, das mit einer Hydroxylgruppe einer organischen Verbindung unter Bildung eines phosphithaltigen Produkts reagiert, welches mit einem oxidierenden Reagenz oxidiert werden kann, um nach der Entfernung der Schutzgruppe eine Phosphatverbindung zu erzeugen.
Sofern nichts anderes angegeben ist, sind alle Literaturstellen durch Bezugnahme in diese Anmeldung mit aufgenommen.

Abkürzungen

ADP, Adenosin-5'-diphosphat;
ATP, Adenosin-5'-triphosphat;
CMP, Cytidin-5'-monophosphat;
CDP, Cytidin-5'-diphosphat;
CTP, Cytidin-5'-triphosphat;
CMP-NeuAc, Cytidin-5'-monophospho-N-acetylneuraminsäure;
Fuc, Fucose;
Fk, Fucosekinase;
Fuc-1-P, Fucose-1-phosphat;
Fuc-T, Fucosyltransferase;
Gal, Galactose;
GalNAc, N-Acetylgalactosamin;
GTP, Guanosin-5'-triphosphat;
GDP-Fuc, Guanosin-5'-diphosphofucose;
GDP, Guanosin-5'-diphosphat;
GDP-Man, Guanosin-5'-diphospho-mannose;
GDP-ManPP, GDP-Mannose-pyrophosphorylase;
GDP-FucPP, GDP-Fucose-pyrophosphorylase;
Glc-1-P, Glucose-1-Phosphat;
GlcNAc, N-Acetylglucosamin;
ManNAc, N-Acetylmannosamin;
NADP (NADPH), Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat;
NeuAc, N-Acetylneuraminsäure;
NMK, Nukleosidmonophosphatkinase;
MK, Myokinase;
PPase, anorganische Pyrophosphatase;
PK, Pyruvatkinase;
PEP, Phospho(enol)pyruvat;
Pyr, Pyruvat;
PPi, anorganisches Pyrophosphat;
Pi, anorganisches Phosphat;
Rha, Rhamnose;
UDP, Uridin-5'-diphosphat;
UTP, Uridin-5'-triphosphat;
UDP-Glc, Uridin-5'-diphospho-glucose;
UDP-Gal, Uridin-5'-diphospho-galactose.
Viele der in dieser Anmeldung verwendeten Strukturformeln beinhalten nur zwei oder drei Gruppen, die an Kohlenstoffatome des Rings gebunden sind. Gemäß der allgemeinen Gepflogenheit sind die nicht gezeigten Gruppen Wasserstoffatome und werden üblicherweise nicht an Kohlenstoffatome gebunden dargestellt, es sei denn, daß die Stereochemie gezeigt werden soll. In anderen Formeln werden schwarz ausgefüllte keilförmige Linien verwendet, um Bindungen wiederzugeben, die aus der Ebene der Seite hervortreten, wogegen gestrichelte keilförmige Linien verwendet werden, um Bindungen darzustellen, die aus der Ebene des Papiers zurücktreten. Gewellte Linien werden verwendet, um anzuzeigen, daß beide Bindungsarten (sowohl α- als auch β-Bindungen) in Betracht kommen.
Die folgenden Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, sind Marken: Triton, Dowex, Sephadex, DEAD-Sepharose.

Ausführliche Beschreibung der Abbildungen

Die Fig. 1 gibt einen typischen zeitlichen Verlauf der Umwandlung von GDP-Mannose in GDP-Fucose durch NADPH-Oxidation unter Verwendung von Messungen der optischen Dichte (Abs) wieder.
Kurve A: Kontrollküvette ohne GDP-Mannose. Kurve B: wie die Kontrolle mit der Ausnahme, daß 1 umol GDP-Mannose zugegeben wurde. Die Ordinate gibt Extinktionseinheiten bei 340 nm an, während die Abszisse Minuten angibt.
Die Fig. 2 zeigt in drei Einzeldarstellungen als Fig. 2-A, 2-B und 2-C HPLC-Elutionsdiagramme für die Umwandlung von GDP-Mannose (α) in GDP-Fucose (b) zum Zeitpunkt 0(2-A), ungefähr drei Stunden (2-B) bzw. ungefähr sechs Stunden (2-C) nach dem Beginn der Reaktion. Die Ordinate gibt relative Absorptionseinheiten bei 254 nm an, während die Abszisse Minuten angibt.
Die Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche die synergistische Hemmung von α1,3-Fucosyltransferase durch Guanosin-5'-diphosphat (GDP) und Verbindung 50 in Gegenwart von 0,2 mM¹&sup4;C-GDP-Fucose und 20 mM MnCl&sub2; bei pH 6,2 veranschaulicht. Die Symbole sind wie folgt: offene Dreiecke = kein Inhibitor; ausgefüllte Dreiecke = 0,05 mM GDP; offene Quadrate = 34 mM Verbindung 50; und offene Kreise = 0,05 mM GDP plus 34 mM Verbindung 50. Die Ordinate gibt Einheiten des Kehrwerts der Anfangsgeschwindigkeit der Produktbildung (1/v) an, während die Abszisse den Kehrwert der Konzentration von N-Acetyllactosamin (LacNAc) angibt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung zieht ein in situ-Multienzymreaktionsverfahren in Betracht, bei dem ein Kohlenhydrat-Akzeptormolekül mit einer Nukleosid-5'-diphosphofucose unter Verwendung einer Fucosyltransferase fucosyliert wird, wobei die Nukleosid-5'-diphosphofucose vorzugsweise enzymatisch aus katalytischen Mengen von Nukleotiden erzeugt wird. Siehe allgemein die nachstehenden schematischen Darstellungen 1 und 2. Schema 1 Schema 2
In der vorliegenden Anmeldung werden auch verbesserte Mittel zum Erhalten der Nukleotidzuckervorläufer offenbart, welche als Donorsubstrate für die Glycosyltransferasereaktionen dienen. Zu diesen Verfahren gehören chemische und enzymatische Mittel. Die chemische Verbesserung bezieht sich auf eine verbesserte Ausbeute und Stabilität der geschützten Zuckerzwischenproduktverbindungen, die verwendet werden, um die Glycosyl-1- oder 2-phosphate zu bilden, welche ihrerseits zu Phosphaten oxidiert werden, welche mit Nukleosidmonophosphaten kondensiert werden, um Nukleosid-5'- diphosphozucker oder Nukleotidzucker zu erhalten.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Entwicklung eines Multienzymsystems, umfassend mehr als eine Glycosyltransferasereaktion für die Synthese von Kohlenhydraten, wobei eine Verbesserung darin liegt, daß katalytische Mengen des Nukleotids verwendet werden. Die Nukleotide werden aus der Mono- oder Diphosphatform zu der Triphosphatform regeneriert, wobei eine in situ-Enzymreaktion gleichzeitig mit den Glycosyltransferasereaktionen verwendet wird. Katalytische Mengen des Nukleotids sind nützlich aufgrund der Hemmwirkung, welche Nukleotide auf Glycosyltransferasen ausüben.
Die folgenden zugehörigen US-Patentanmeldungen enthalten einen Gegenstand, der sich auf die beschriebenen Erfindungen bezieht: US-Serien-Nr. 07/670,701, eingereicht am 18. März 1991; US-Serien-Nr. 07/707,600, eingereicht am 30. Mai 1991; US-Serien- Nr. 07/738,211, eingereicht am 30. Juli 1991 mit dem Titel: Oligosaccharide Enzyme Substrates and Inhibitors: Methods and Compositions (Oligosaccharidenzymsubstrate und Inhibitoren: Verfahren und Zusammensetzungen); US-Serien-Nr. 07/852,409, eingereicht am 16. März 1992 und US-Serien-Nr. 07/889, 652, eingereicht am 26. Mai 1992. Jede dieser fünf Patentanmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen.

A. Fucosylierung

Diese Erfindung ist auf die Verwendung der vorstehend beschriebenen und angegebenen Technologie für die Fucosylierung von Kohlenhydraten gerichtet. Die Fucosylierung ist eine häufige Endmodifikation für viele biologisch aktive Kohlenhydrate wie etwa die Lewis-Antigene, und zwar sowohl die sialylierten als auch die nicht sialylierten.
(1) Fucosyltransferasen
Die Fucosylierung ist die Folge der Wirkung einer Fucosyltransferase. Fucosyltransferasen sind wohlbekannt und eine Übersicht ist in Adv. Enzymol., 52: 44-56 (1981) angegeben. Das Kohlenstoffatom des Akzeptorkohlenhydrats ist typischerweise ein Ringbestandteil einer Glucose, einer Galactose oder eines N-Acetylglucosamins, oder eines Analogons davon. Die O-glycosidische Verknüpfung weist in den meisten Fällen die α-Orientierung auf. Die häufigsten Stellen sind das 2-, 3- oder 6-Hydroxyl von Galactose, die 3-, 4-, oder 6-Hydroxylgruppe von N-Acetylglucosamin oder das 3- oder 4-Hydroxyl von Glucose. Glucal- und (5-thio)glucose-haltige Saccharide können ebenfalls die akzeptierende Saccharideinheit eines Akzeptorkohlenhydrats für Fucosyltransferase-Enzyme sein.
Fucosyltransferasen können aus natürlichen Ausgangsmaterialien oder aus rekombinanten Mikroorganismen isoliert werden, welche genetisch verändert worden sind, so daß sie Fucosyltransferasen exprimieren. Gereinigte native Fucosyltransferasen sind beschrieben worden von Foster, J. Biol. Chem., 266: 3526-3531 (1991); Muramatsu, Eur. J. Biochem., 157: 71-75 (1986); und Prieels et al., J. Biol. Chem., 256: 10456-10463 (1981). Von Campell et al., J. Biol. Chem., 259: 11208-11214 (1984); Larsen, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 87: 6674-6678 (1990); und Kukowska-Latallo, et al., Genes and Devel., 4: 1288-1303 (1990); Weston et al., J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992) ist über Fucosyltransferasegene berichtet worden, die kloniert und exprimiert wurden.
Im allgemeinen sind die Fucosyltransferasen membrangebunden. Somit sind intakte Fucosyltransferasen typischerweise in wäßriger Lösung unlöslich. Um ihre Verwendung in den Verfahren und Reaktionssystemen dieser Erfindung zu erleichtern, ist es vorzuziehen, lösliche Enzyme zu verwenden, bei denen der unlösliche cytoplasmatische Schwanz entfernt wurde oder durch selektive Deletion oder Addition von polaren Aminosäuren hydrophiler gemacht wurde. Es können jedoch native intakte Fucosyltransferasen durch die Zugabe von kleineren Mengen von nicht-ionischen Detergenzien wie Triton X-100 in dieser Erfindung verwendet werden.
Fucosyltransferasen sind eine spezifische Art von Glycosyltransferase. Das aktivierte Donormolekül ist typischerweise eine Nukleotid-5'-diphosphofucose. Die Reaktion erzeugt das Nukleotid als Abgangsgruppe und eine Fucose mit einem reaktiven Carboniumion, welches eine glycosidische Verknüpfung mit der verfügbaren Hydroxylgruppe des Akzeptormoleküls bildet.

(2) Fucosylierungsreaktionsbedingungen und -substrate

Die Fucosyltransferasen sind typische Glycosylasen und sind relativ robuste Enzyme. Die Reaktionsbedingungen, die für die meisten Glycosyltransferasen geeignet sind, sind für Fucosyltransferasen geeignet. Zum Beispiel gehören zu geeigneten Reaktionsbedingungen ein Temperaturbereich von ungefähr 10ºC bis 40ºC, zu Puffern gehören organische und anorganische Puffer, deren pl innerhalb des physiologischen pH-Bereichs liegt. Ein annehmbarer pH-Bereich ist ungefähr 4 bis ungefähr 9. Die Salzkonzentrationen sind ungefähr 0 bis 200 mM und es wird ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,0% eines nicht-ionischen Detergenzes (z. B. Triton-X 100) verwendet, wenn die Enzyme ansonsten nicht in dem wäßrigen Fucosylierungsmedium löslich sind. Häufig werden zweiwertige Kationen wie Mn²&spplus; benötigt.
Die Kohlenhydrat-Akzeptormoleküle unterliegen praktisch keinen Beschränkungen. Die Verknüpfungen an den bekannten Stellen sind vorstehend angegeben; der Rest des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls hat jedoch keine kritische Bedeutung. Die Fucosyltransferasen sind ziemlich substrattolerant und über den Akzeptorzucker, an dem die Fucose angeknüpft ist, und die Zucker, die dem Akzeptorzucker unmittelbar benachbart sind, hinaus hat die übrige Struktur des Substrats wenig Bedeutung. Die Akzeptorkohlenhydratmoleküle können ausschließlich aus Zuckerresten einschließlich Monosacchariden, aus Glycoproteinen, aus Glycolipiden, oder unnatürlichen Verbindungen, bei denen der die Fucose akzeptierende Zucker an Verbindungen wie Aryl, Heterocyclen, Cycloalkane und acyclische Kohlenwasserstoffe gebunden ist, bestehen.
Ein bevorzugtes Kohlenhydrat-Akzeptormolekül endet mit einem Galβ1,4GlcNAc-X- Bestandteil, wobei X ein organisches Molekül ist. Beispielhafte X-Gruppen sind nachstehend im Text angegeben. Zu beispielhaften Kohlenhydrat-Akzeptormolekülen gehören Galβ1,4GlcNAc, Lactose, NeuAcα2, 6Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,4Glucal (Lactal), NeuAcα2,3Galβ1,4Glucal, die 2-halogen-substituierten Reaktionsprodukte der vorstehend genannten Glucal-Verbindungen, Galβ1,4(5-thio)Glc, Galβ1,4GlcNAcβ-O- allyl.
Ein SLex- oder SLea-Analogon kann somit ein Halogenatom anstelle von einer der Hydroxylgruppen des Rings enthalten. Es ist ein neues Verfahren zur Herstellung von 2- oder 3-Halogenmono- und oligosacchariden aus ihren entsprechenden Glycalverbindungen durch die Verwendung von Chlorperoxidase gefunden worden. Die sich dabei ergebenden 2(3)-Desoxy-2(3)-halogensaccharide können anschließend in den andernorts in dieser Anmeldung erörterten Synthesen verwendet werden.
Gemäß diesem Verfahren wird ein Glycal mit Wasserstoffperoxid, einem Halogenidion der Wahl (Chlorid, Bromid oder Iodid) und einer katalytischen Menge an Chlorperoxidase (EC 1.11.10) in einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von ungefähr 2,5 bis ungefähr 3,5 vermischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Das sich dabei ergebende Reaktionsgemisch wird anschließend beibehalten, bis das gewünschte Produkt gebildet ist. Die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien können schwanken, wie im Fachgebiet wohl bekannt ist. Beispielhafte Konzentrationen und Synthesen sind nachstehend angegeben. Das so gebildete Halohydronprodukt wird anschließend vorzugsweise isoliert.
Bei Raumtemperatur betragen die typischen Reaktionszeiten ungefähr 15 Minuten bis 2-4 Tage. Iodid reagiert am schnellsten und Chlorid reagiert am langsamsten.
Es werden typischerweise thermodynamisch gebildete Produkte erhalten, außer wenn 1,3-diaxiale Wechselwirkungen die Bildung eines 2-axial-substituierten Produktes ausschließen. Wenn 1,3-diaxiale Wechselwirkungen in dem reagierenden Glycal vorliegen, wird eine Stereospezifität in dem halohydrierten Produkt beobachtet, was die α- oder β-Orientierung der Halogengruppe anbelangt, wobei beide Anomere der 1- oder 2-Hydroxylgruppe ebenfalls gebildet werden. Beispielhafte Synthesen von 2- oder 3-Halogen-Kohlenhydrat-Akzeptormolekülen und ihren Vorläufern sind in den schematischen Darstellungen 3, 4 und 4a nachstehend veranschaulicht.
Die Bromhydrierung eines Sialyl-Lex-Moleküls mit einem endständigen Glycal (Verbindung 36 von Schema 4a), welches eine Konformation in der Lösung aufweist, die der von Sialyl-Lex ähnelt, ergab Produkte (die Verbindungen 37a und 37b). Diese Produkte wiesen die gleiche Konformation wie Verbindung 36 und Sialyl-Lex in dem aus NeuAc-Gal-Fuc bestehenden Bindungsdomänenbereich gemäß NOE-Untersuchungen auf.
Bromierte Saccharide können auch unter Verwendung von N-Bromsuccinimid (NBS) in einem Acetonitril-Wasser-Lösungsmittel hergestellt werden. Diese Arbeitsweise kann verwendet werden, um ein verändertes Verhältnis der gebildeten Produkte zu ergeben, wie etwa Verbindung 32 und 33, die in der Enzymreaktion in gleicher Menge hergestellt werden und bei Verwendung von NBS in einem Verhältnis von 1 : 2,5 (32 : 33) hergestellt werden. Die 3-Halogenverbindung 35 und ihr isomeres Halohydrierungsprodukt Verbindung 35a werden bei Verwendung der NBS-Reaktion in einem Verhältnis von 2 : 3 (35 : 35a) hergestellt, verglichen mit einem einzigen Isomer, Verbindung 35, wenn die Enzymreaktion verwendet wird. Schema 3
Schema 3 veranschaulicht die Bromhydrierung von D-Glucal, D-Galactal und D-Fucal und die Bildung der entsprechenden 2-Desoxy-2-brommonosaccharide, d. h. die Verbindungen 20, 21, 22 und 23. Die Bromhydrierung von Sialal, Verbindung 34, mit Chlorperoxidase (CPO) unter Bildung der entsprechenden 3-Desoxy-3-bromsialinsäure, Verbindung 35, ist ebenfalls im Schema 3 unten gezeigt.
Das Schema 4 veranschaulicht die Chlor- und Iodhydrierung von Galactal unter Bildung der Verbindungen 25, 26 und 27. In Schema 4 ist auch die Bromhydrierung von Gal1,3Glucal (Verbindung 28) und Gal1,4Glucal (Verbindung 31) unter Bildung der entsprechenden α- und β-2-Desoxy-2-brom-Verbindungen, d. h. die Verbindungen 29 und 30 und die Verbindungen 32 bzw. 33, gezeigt. Schema 4
Der aktivierte Fucosedonor, Nukleosid-5'-diphosphofucose ist in den meisten Fällen aus einem Guanosin zusammengesetzt; es gibt jedoch alternative Donoren, wie etwa ein Nukleotid, das einen beliebigen L-Zucker wie etwa L-Rhamnose, und L-Idose umfaßt.
Um die Fucosyltransferasereaktion mit einer zweiten Glycosyltransferasereaktion zu verknüpfen, macht man sich einfach die Tatsache zunutze, daß die optimalen Reaktionsbedingungen für die meisten Glycosyltransferasen überlappen. Somit gestatten die gegebenen Reaktionsbedingungen für eine beliebige Glycosyltransferase das Funktionieren der bekannten Fucosyltransferasen. Unter Verwendung der vorstehend angegebenen Reaktionsbedingungen für die Fucosyltransferasen und unter Verwendung einer routinemäßigen Titrationsversuchsdurchführung kann man Reaktionsbedingungen erhalten, die sich für die Synthese eines fucosylierten Oligosaccharids eignen, wobei nur Monosaccharide verwendet werden.
Im allgemeinen zieht man bei der Auswahl der Reaktionsbedingungen für mehrfache Glycosyltransferasereaktionen in einem einzigen Reaktionsgemisch die Temperatur, den pH, die Lösungsmittelosmolarität und Ionenzusammensetzung wie vorstehend angegeben in Betracht. Wenn eine der Glycosyltransferasen eine Fucosyltransferase ist, umfassen annehmbare Reaktionsbedingungen einen pH-Bereich vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 bis ungefähr 8,5 und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 7,0 und ungefähr 7,5. Zweiwertige Kationen wie Mn²&spplus; sind nützlich und Chelatoren von zweiwertigen Ionen sind nicht erwünscht.
Die Puffer haben keine kritische Bedeutung. Wäßrige Puffer wie etwa HEPES sind angemessen. Die Osmolarität des Puffers einschließlich des Puffers liegt zwischen 100 mOsm bis ungefähr 300 mOsm.
Die vorstehenden Bedingungen, bei denen die Enzyme funktionsfähig sind, werden in dieser Anmeldung als biologische Reaktionsbedingungen bezeichnet.
Die Reaktionszeiten variieren mit den Substraten, Enzymen und Temperaturen. Typischerweise betragen die Reaktionszeiten 24 bis 96 Stunden.
Unter bestimmten Umständen, wenn eine Galactosyltransferase verwendet wird und der Monosaccharidakzeptor ein Aglycon von einer Stellung von Glucose in einer α-Orientierung aufweist, können die Reaktionsbedingungen Lactalbumin, vorzugsweise α-Lactalbumin umfassen.
Zum Beispiel kann die Sialyltransferasereaktion, die in Ichikawa et al.. J. Amer. Chem. Soc., 113: 4698-4700 (1991) beschrieben ist, mit einer rekombinanten Human-Lewis α(1,3/4)-Fucosyltransferase verknüpft werden, wie von Kukowska-Latallo et al., Genes and Devel., 4: 1288 (1990) beschrieben ist. Man verwendet einfach das basische Reaktionsgemisch eines wäßrigen Puffers (HEPES) mit einem pH-Bereich von 7,0-7,5, eine Salzkonzentration von 50-200 mM ist zweckmäßig. Die Reaktion wird bei ungefähr 37ºC durchgeführt.

B. Untersuchung der Substratspezifität und Hemmung von Glycosyltransferasen

α1.3/4FucT. Die Fucosyltransferase, welche den Fuc-Bestandteil von GDP-Fuc auf die 3- und die 4-OH&supmin;Gruppen von GlcNAc unter Bildung von Lex oder Lea übertragen kann, ist α1,3/4FucT. [Fukowska-Latallo et al., Gene & Developement, 4: 1288 (1990); Dumas et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 1: 425 (1990)]. Wie in Tabelle 1 nachstehend angegeben ist, katalysiert das Enzym die Fucosylierung von Galβ1,3GlcNAc schneller (Vrel 580) als Galβ1,4GlcNAc (LacNAc) (Vrel 100) (Einträge 1 und 4) bei einer Konzentration von 10 mM des Kohlenhydrat-Akzeptors. Sialyliertes LacNAc (Eintrag 7) ist ebenfalls ein Substrat für dieses Enzym, welches die Synthese [Dumas et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991)] von Sialyl-Lex gestattet. Interessanterweise ist Galβ1,4(5-thio)Glc [Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137-8245 (1991)] unter diesen Bedingungen ein besseres Substrat als das entsprechende Disaccharid Lactose (Einträge 2 und 3). Jedes der Substrate von Tabelle 1 stellt einen Kohlenhydrat-Akzeptor für Fucose von dem Fucosyldonor unter Verwendung dieses Enzyms dar. Galβ1,4desoxynojirimycin [Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137-8245 (1991)] (Eintrag 11) ist jedoch ein Inhibitor (IC&sub5;&sub0; 40 mM). Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von α1,3/4Fuc wurde keine weitere Untersuchung durchgeführt. Schema 4a

Tabelle 1

Disaccharid und Trisaccharide als Substrate oder Inhibitoren für α1, 3/4-Fucosyltransferase

Eintrag Substrate Vrela
1. Galb 1,4GlcNAc 100
2. Galb1,4Glc 120
3. Galb 1,4(5-thioGlc)c 310
4. Galb1,3GlCNAc 580
5. GlCNAcβ1,4GlCNAc 23
6. Galβ1,4GalNAc 27
7. NeuAcα2, 3Galβ1, 4GlCNAcd 60
8. FUCα1,2Galβ1,4Glce 250
9. GlCNAcβ1,6Galβ1,4Glce 13

Inhibitoren IC&sub5;&sub0; (mM)

10. Galβ1,4(3-desoxy)GlcNAcβOallylc > 125
11. Galβ1,4desoxynojirimycinc 40
12. Galβ1,4Glucalc,f > 125
a Relative Geschwindigkeiten mit 0,20mM GDP-Fuc, 20 mM MnCl&sub2; und 10 mM Akzeptor. Spezifische Aktivität = 2U/mg (1U = 1 umol verbrauchtes GDP-Fuc pro Stunde). b Inhibitorkonzentration, die erforderlich ist, um eine 50%-Hemmung mit 0,2 mM GDP-Fuc zu ergeben. c Gautheron-Le Narvor C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 1130; Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 1991 713, 8137. d Bezogen von Oxford GiycoSystems, Inc., Rosedale, New York. e Bezogen von Sigma, St. Louis, MO. f Haworth, W. N. et al., J. Chem. Soc. 1930, 2644.
α1,3FucT. Das Enzym, das für die Sialyl-Lex-Produktion verantwortlich ist, ist Human- Plasma-α1,3FucT, welches in letzter Zeit kloniert, überexprimiert [Weston et al.. J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992)] und in der Synthese verwendet wurde. Die Substratspezifität zeigte an (Tab.2, nachstehend), daß, wie erwartet, das Enzym mehr spezifisch für LacNAc (V/Km 2,9, Eintrag 1) als für Galβ1,3GlcNAc (V/Km 0,22, Eintrag 5) ist. Ähnlich wie bei dem Ergebnis für α1,3/4FucT (Eintrag 3 in Tabelle 1) ist Galβ1,4(5-thio)Glc auch ein Substrat für αFucT (Eintrag 3 in Tabelle 2). Anders als beim α1,3/4-Enzym ist Lactal (Eintrag 6) ein Substrat für das α1,3-Enzym.
Das Trisaccharid NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc (Eintrag 7), ein Vorläufer für Sialyl-Lex, ist das beste Substrat mit einer relativen maximalen Geschwindigkeit von 620% bezogen auf LacNAc. Das α2,6-verknüpfte Sialosid (Eintrag 10) ist als Substrat ungefähr 50 mal weniger aktiv als das α2,3-Isomer. Es ist bemerkenswert, daß das Enzym auch Fuc auf das glucalhaltige sialylierte Trisaccharid übertragen kann (Vrel 330%, Eintrag 9).
Im Hinblick auf die Bindung hat das Enzym eine höhere Affinität für Disaccharide (Einträge 1, 3, 4, 6) als für Trisaccharide. Eine Zunahme der Affinität wurde beobachtet, wenn der GlcNAc-Bestandteil von LacNAc durch 5-Thio-Glc, Glucal [Haworth et al., J. Chem. Soc., 2644 (1990)] oder GlcNAcbOallyl ersetzt wurde. Lactose weist jedoch eine sehr niedrige Affinität auf, obwohl die relative Rate bei Vmax ziemlich hoch ist. (150%). Jedes der Substrate von Tabelle 2 ist ein Kohlenhydrat-Akzeptor für Fucose von dem Fucosyldonor unter Verwendung dieses Enzyms. Tabelle 2 Disaccharid und Trisaccharide als Substrate für α1,3Fucosyltransferase
a Relative maximale Geschwindigkeiten mit 0,1 mM GDP-Fuc, 10 mM MnCl&sub2; und 10 mM Galβ1,4GlcNAc. Spezifische Aktivität = 2,6 U/mg (1U = 1 umol verbrauchtes GDP-Fuc pro Stunde.
b Gautheron-Le Narvor C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 1130; Wong, C.-H. et al., J. Am. Chem. Soc., 1991 193, 8137. d Haworth, W. N. et al., J. Chem. Soc. 1930, 2644. e Bezogen von Oxford GlycoSystems, Inc., Rosedale, New York. f in dieser Untersuchung enzymatisch hergestellt, wobei eine α2,3-Sialyltransferase von Cytel Co. verwendet wurde. g Ichikawa, Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4698.
In unserer Untersuchung der Hemmung von α1,3FucT (Tabelle 3, nachstehend), ist die Beobachtung, daß 3'-Desoxy-LacNAcbOallyl [Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137-8245 (1991)] ein schwacher Inhibitor ist (Eintrag 5), im Einklang mit dem früheren Bericht über desoxygenierte Oligosaccharide für Glycosyltransferasen [Hindsgaul et al., J. Biol. Chem., 266: 17858 (1991)]. Unter den untersuchten Akzeptorkohlenhydrat-Substratanaloga ist Galβ1,4desoxynojirimycin der stärkste Inhibitor (Eintrag 4, IC&sub5;&sub0; = 8 mM).
Zwei Azazucker [Kajimoto et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 6679 (1991)], die als wirksame α-Fucosidase-Inhibitoren bekannt sind, wurden als Akzeptoranaloga untersucht (Einträge 8 und 9) und es wurde gefunden, daß sie mäßige Inhibitoren gegenüber LacNAc für FucT waren (ICso ungefähr 34 bis ungefähr 52 mM). Desoxynojirimycin war jedoch ein Substrat für α1,4GalT. [Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137-8145 (1991)]. GDP-Man ist ebenfalls ein starker Inhibitor von α1,3FucT (IC&sub5;&sub0; 2 mM).
Für die Produkthemmungsuntersuchung richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf das freigesetzte Nukleosiddiphosphat. GDP ist ein Nebenprodukt der enzymatischen Fucosylierung und ist ein sehr starker, nichtkompetitiver Inhibitor gegenüber LacNAc (Kii = 0,13 mM, Kis = 0,16 mM, Eintrag 10). Ein weiteres Nukleosiddiphosphat, UDP, welches bei der enzymatischen Galactosylierung freigesetzt wird, ist ebenfalls ein sehr starker Inhibitor von GalT (Ki = 0,46 mM). GDP-Fuc ist ein starker Inhibitor von α1,3FucT bei einer Konzentration über 0,2 mM in Gegenwart von 10 mM LacNAc. Es ist jedoch kein Inhibitor von α1,3/4FucT.
Außer den Azazuckern der Einträge 8 und 9 in Tabelle 3 hemmen andere Azazucker wie die nachstehenden Verbindungen 51, 52 und 53 ebenfalls die α-Fucosidaseaktivität, wie dies bei Verbindung 50 der Fall ist (Eintrag 9 von Tabelle 3). Die Verbindungen 50-53 wiesen Ki-Werte mit diesem Enzym von 4, 22, 8 bzw. 1,4 uM auf. [Siehe auch Dumas et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2: 33 (1992).]
Zusätzlich zu Verbindung 50 wurde nun gefunden, daß auch Verbindung 53 ein kompetitiver Inhibitor der Human-Plasma-α-1,3-Fucosyltransferase ist. Der IC&sub5;&sub0;-Wert gegenüber LacNAc betrug 80 mM. Außerdem weist GDP, welches während der Fucosylierungsreaktion aus GDP-Fuc gebildet wird und ein nichtkompetitiver Inhibitor ist, wenn es bei seinem IC&sub5;&sub0; von 0,05 mM vorliegt, eine tiefgehende synergistische Hemmung in Gegenwart von einer der Verbindungen 50 oder 53 auf. Die Daten von einer beispielhaften Hemmstudie unter Verwendung der Verbindung 50 sind in Fig. 3 gezeigt. Dieser synergistische Effekt kann auf eine Wechselwirkung zwischen GDP und dem Azazucker an der Wirkstelle des Enzyms unter Bildung eines Komplexes, welcher die Struktur des Übergangszustands der Fucosyltransferreaktion nachahmt, zurückzuführen sein.
Die vorstehenden Ergebnisse stellen ein Verfahren zum Hemmen einer Glycosyltransferasereakticn wie einer Fucosyltransferasereaktion bereit. Gemäß diesem Verfahren werden eine Glycosyltransferase wie etwa Human-Plasma-α1,3-Fucosyltransferase, ein Kohlenhydrat-Akzeptormolekül wie LacNAc, ein aktiviertes Glycosyldonormolekül wie GDP-Fuc und eine hemmende Menge eines Azazuckers wie etwa eine der Verbindungen 50 oder 53 in einem wäßrigen Medium vermischt und unter biologischen Reaktionsbedingungen während eines Zeitraums gehalten, der dafür ausreicht, daß die Glycosyltransferasereaktion gehemmt wird.
Mehr bevorzugt ist auch eine hemmende Menge des Nukleosiddiphosphatprodukts der Glycosylierungsreaktion wie UDP oder GDP vorhanden, wenn GDP-Fuc der Glycosylierungsdonor ist. Die hemmenden Mengen des Azazuckers und, falls es vorhanden ist, des Nukleosiddiphosphats, liegen vorzugsweise im Bereich von mindestens 10% ihrer individuellen IC&sub5;&sub0;-Werte und mehr bevorzugt betragen diese Mengen mindestens 50% ihrer individuellen IC&sub5;&sub0;-Werte, die, wie nachstehend erörtert wird, in vitro für die jeweilige Glycosylierungsreaktion, die gehemmt werden soll, gemessen werden. Es können auch Konzentrationen verwendet werden, die höher sind als die IC&sub5;&sub0;-Werte. Diese Glycosylierungsreaktion wird typischerweise durch mindestens 25% und mehr bevorzugt durch mindestens 50% gehemmt.
Die Glycosylierungshemmung kann in vitro oder in vivo stattfinden. Eine beispielhafte in vitro-Hemmstudie ist nachstehend veranschaulicht. Für die in vivo-Verwendung sind das Enzym, der Glycosyldonor und Akzeptormoleküle und GDP im Wirtssäugetier, bei dem es sich um ein Labortier wie eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen, oder um einen Menschen handeln kann, vorhanden. Der Azazucker wird dem Wirt durch eine üblicherweise verwendete Methode zum Verabreichen von Arzneimitteln, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, verabreicht. Zusätzliche Mengen an GDP können ebenfalls verabreicht werden, falls dies gewünscht wird. Die biologischen Reaktionsbedingungen werden vom Körper des Wirtssäugetiers bereitgestellt. Der zugegebene Azazucker wird in dem Wirtssäugetier beibehalten, bis er ausgeschieden oder katabolisiert wird. Tabelle 3
a Inhibitorkonzentration, die erforderlich ist, um eine 50%ige Hemmung mit 0,1 mM GDP-Fuc, 10 mM Mn²&spplus; und 10 mM LacNAc bei pH 6,2 und 37ºC zu ergeben. b Gautheron-Le Narvor C. et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1991, 1130. c Es wurde keine Hemmung bis zu einer Inhibitorkonzentration von 50 mM beobachtet. d Kajimoto, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 713, 6679.
e Ki = 19 ± 3 mM. e Kii = 0,13 ± 0,05 mM, Kis = 0,16 ± 0,06 mM.

C. Chemische und enzymatische Mittel zum Herstellen von GDP-Fucose

Die Fucosyltransferase-Zyklus-Reaktion kann entweder durch die Zugabe von stöchiometrischen Mengen des geeigneten Zuckernukleotids wie GDP-Fucose vorangetrieben werden, oder vorzugsweise kann das Zuckernukleotid durch katalytische Mengen des entsprechenden Nukleotids und stöchiometrische Mengen von PEP und Man-1-P oder Fuc-1-P erzeugt werden.
GDP-Fucose ist der bevorzugte aktivierte Zuckerdonor für die bekannten Fucosyltransferasen. Er ist schwierig und kostspielig herzustellen und für die anderen in dieser Anmeldung beschriebenen Reaktionszyklen ist es bevorzugt, daß seine Synthese die in situ-Regeneration seiner Nukleotid-Vorläufer einbezieht. Ein allgemeines Schema ist in dem Fucose-Zyklus von Schema 1 angegeben.

(1) Chemische Synthese von Fucose-1-phosphat und GDP-Fucose

Die chemische Synthese von GDP-Fuc beruht auf der Kupplung von Fucose-1-phosphafund einem aktivierten GMP wie etwa GMP-Morpholidat. Siehe allgemein, (α) Kochetov et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 28: 307 (1973); (b) Moffat, Methods Enzymol., 8: 136 (1966); und (c) Roseman et al., Am. Chem. Soc., 83: 659 (1961). Aufgrund der relativ hohen Labilität von Fucose-1-phosphat und GDP-Fuc waren die berichteten chemischen Ausbeuten für die Synthese von Fuc-1-P und die Kupplungsreaktion von Fuc-1-P und dem GMP-Derivat niedrig. Es sind verschiedene Fucose-1-phosphat-Synthesen beschrieben worden. Da nur Fuc-1-P unter den Zuckernukleotiden einen thermodynamisch instabilen β-Phosphat-Bestandteil am anomeren Zentrum von Fucose aufweist, ist es schwierig, die Stereochemie des anomeren Zentrums zu steuern. In dieser Anmeldung sind zwei wirksame Wege zu GDP-Fuc angegeben: einer über ein chemisches Verfahren und ein weiterer über ein enzymatisches Verfahren.
Die erste chemische Synthese von GDP-Fuc wurde von Barkers Gruppe durchgeführt. [Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981)]. Für die Herstellung von Fucose-1- phosphat verwendeten sie 2,3,4-Tri-O-acetyl-β-L-fucose, die aus dem entsprechenden Bromderivat hergestellt wurde, gefolgt von einer fraktionierten Kristallisation und der Phosphorylierung des resultierenden β-Anomers. Die Hindsgaul-Gruppe [Gokhale, et a1., Can. J. Chem., 68: 1063 (1990)] verwendete eine Glycosylierungsreaktion von Acetofucosylbromid und dem Dibenzylphosphattetrabutylammoniumsalz, um ein relativ instabiles Glycosylphosphat herzustellen (< 10 Min. bei einer Silicagel-Chromatographie). Schmidt et al. [Schmidt et al., Liebigs Ann. Chem., 191: 121 (1991)] verwendete ein Fucosyl-Imidat und erhielt das Glycosidierungsprodukt ohne einen Lewis-Säure- Katalysator in hoher Ausbeute. Die von Boom-Gruppe [Westerduinn et al., Tetrahedron Lett., 27: 1211 (1986)] wandte ein dreiwertiges Phosphitylierungsmittel auf 2,3,4-Tri-Obenzyl-fucose an und wandelte sie in ein α-Fucosylphosphat um.
In dieser Anmeldung werden zwei verbesserte Vorgehensweisen für die chemische Synthese von GDP-Fucose beschrieben (siehe die nachstehenden schematischen Darstellungen 5-7). Die eine davon, in Schema 5, verwendet eine Glycosylierungsreaktion von benzoyliertem (Bz) Fucosylbromid (Verbindung 3) und Dibenzylphosphat. Wenn man eine Benzoylgruppe anstelle von Acetyl als Schutzgruppe einsetzt, erhält man eine verbesserte Stabilität für das Fucosylderivat und Stereoselektivität der Glycosylierungsreaktion. Die Glycosylierung von Verbindung 3 und Dibenzylphosphat [(Linshorst et al., Carbohydr. Res., 209: 119 (1991)] lief sehr reibungslos ab und gab das Kupplungsprodukt mit einer Ausbeute von 95% als einziges Produkt. Wie erwartet war die Verbindung 4 stabil genug, um an einer Silicagel-Säule (> 3 Std.) gereinigt zu werden; das gereinigte Material war jedoch instabil. Wenn die gereinigte Verbindung 4 über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde, beobachtete man eine gewisse Zersetzung und Anomerisierung der Verbindung 4. Es sollte beachtet werden, daß die gereinigte Verbindung 4 unmittelbar für den nächsten Schritt verwendet wurde. Die Entfernung der Benzyl (Bn)-Schutzgruppen von dem Phosphat-Bestandteil und den Benzoylgruppen erfolgte stufenweise, wie es bereits beschrieben wurde [Gokhale, et al., Can. J. Chem., 68: 1063 (1990)]. Schema 5
Die andere Vorgehensweise verwendet ein dreiwertiges Phosphitylierungsreagenz wie Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit (DDP), welches für die Herstellung von Dihydroxyacetylphosphat (DHAP) verwendet worden ist (siehe Schema 6, nachstehend). [Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991).]. So wurde 2,3,4-Tri-O-acetylfucose, Verbindung 7, die entweder durch chemische oder enzymatische Desacetylierung hergestellt wurde [Hennen et al., J. Org. Chem., 53: 4943 (1988)], mit DDP in Gegenwart von Tetrazol phosphiniert. Die Reaktion lief reibungslos ab und ergab eine Ausbeute von 79% von Verbindung 8, einer Verbindung der Formeln 1 und 11, welche zu der entsprechenden Phosphatverbindung 9 oxidiert wurde. Die Entfernung der Schutzgruppen von Verbindung 9 erfolgte auf ähnliche Weise wie bei der Herstellung der Verbindung 5 aus der Verbindung 4. Schema 6
Die Phosphitylierungsreaktion unter Verwendung von (BnO&sub2;)PNEt&sub2; (DDP), die in Schema 6 veranschaulicht ist, ist ziemlich nützlich zum Bilden einer Vielzahl von Phosphiten und entsprechenden Phosphaten in hohen Ausbeuten. Weitere beispielhafte Verbindungen und Einzelheiten werden nachstehend in Abschnitt H erörtert.
Fuc-1-P wird durch Umwandlung in das Trialkylammoniumsalz durch Reaktion mit Guanosin-5'-monophosphomorpholidat (1 : 2) in einem Lösungsmittel wie Pyridin wirksam aktiviert. Das Produkt GDP-Fuc, Verbindung 12, wird unter Verwendung einer herkömmlichen Säulenchromatographie gereinigt. Diese Reaktionen sind in Schema 7 nachstehend gezeigt. Schema 7

(2) Enzymatische Herstellungvon GDP-Fucose

Die enzymatische Herstellung von GDP-Fuc aus Fucose ist bevorzugt. Die enzymatische Herstellung von GDP-Fucose wurde von Schacter et al., Methods of Enzymol., 28: 285 (1972) beschrieben, wobei Fucosekinase und GDP-Fucose-Pyrophosphorylase aus Schweineleber verwendet wurde.
Wie man sich leicht vorstellen kann, kann diese Multienzymreaktion unter Verwendung einer Kombination von verschiedenen Enzymen und energiereichen Substraten ausgeführt werden. Die Fucosereaktionszyklen, die in den schematischen Darstellungen 1 und 8 veranschaulicht sind, ergeben Beispiele für dieses Multienzymsystem. Darin wird Fucose in einer stöchiometrischen Menge zusammen mit PEP zugegeben. Katalytische Mengen von PK, FK und GDP-FucPP werden zusammen mit ÄDP und GDP zugegeben. Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie die vorstehend für die Transferasen angegebenen. Schema 8

(3) Mannose als Ausgangsmaterial

Alternativ dazu kann GDP-Fuc effizient durch die Herstellung von GDP-Mannose und die anschließende enzymatische Umwandlung in GDP-Fuc erhalten werden. Der Vorläufer von GDP-Man ist Man-1-P, Verbindung 18. Man-1-P wird unter Verwendung der gleichen Vorgehensweise hergestellt, wie sie für die Herstellung von Fucose-1-P beschrieben wurde. Bevorzugt ist die Verwendung von Acetylschutzgruppen zum Bilden von Mannose-per-O-acetat, wie in Schema 9 nachstehend gezeigt ist. Alternativ dazu kann Man-1-P auf eine zu Glc-1-P analoge Weise enzymatisch hergestellt werden. Schema 9
Die enzymatische Synthese von GDP-Fucose aus Mannose-1-phosphat mit in situ-Erzeugung von GDP-Mannose wird durch Kombination von zwei Enzymsystemen erreicht: GDP-Mannose-Pyrophosphorylase und GDP-Fucose-Syntheseenzyme. Die NADPH- Regeneration ist für die Bildung von GDP-Fucose erforderlich. Eine solche Regeneration kann durch Verwendung von NADPH-abhängiger Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobacterium brokü in Gegenwart von Isopropanol oder Glucosephosphatdehydrogenase in Gegenwart von Glucose erhalten werden. Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase kann aus Hefe wie nachstehend beschrieben erhalten werden; aber andere Ausgangsmaterialien wie Arthrobacter [Preiss et al., J. Biol. Chem., 239: 3119 (1964)], Escherichia coli [Liebermann et al., J. Bact., 101: 965 (1970)], sowie aus Ausgangsmaterialien von Säugetieren [Smooth et al., Eur. J. Biochem., 148: 83 (1985)], sind beschrieben worden.
Die Umwandlung von GDP-Fucose aus GDP-Mannose wurde zuerst von Ginsburg und Kirkman beschrieben [Ginsburg et al., J. Am. Chem. Soc., 80: 3481 (1958)]. Das Enzym wurde aus A. aerogenes (ATCC 12658), gegenwärtig als Klebstella pneumoniae neu benannt, teilweise gereinigt und verwendet, um die Umwandlung von GDP-Mannose in GDP-Fucose zu zeigen, [Gipsburg, J. Biol. Chem., 235: 2196 (1960)]. Die Reaktion war NADPH-abhängig. Yamamoto et al. berichteten auch über die Synthese von GDP- Fucose aus GDP-Mannose unter Venrwendung des Enzyms, das aus Agrobacterium radiobacter erhalten wurde [Yamamoto et al., Agric. Biol. Chem., 48: 823 (1984)].
In dieser Anmeldung ist die Umwandlung von Mannose-1-phosphat in GDP-Fucose mit in situ-Erzeugung von GDP-Mannose beschrieben. Mannose-1-phosphat wird in GDP-Fucose durch Kombinieren von zwei Enzymsystemen, GDP-Mannose- Pyrophosphorylase und GDP-Fucose-Syntheseenzym mit Regeneration von NADPH umgewandelt. Wenngleich das Anfangsergebnis niedrige Ausbeuten liefert, wird jedoch erwartet, daß, wenn höhere Enzymaktivitäten erhalten werden, die Ausbeute signifikant verbessert werden kann. Diese Reaktionen sind in den schematischen Darstellungen 10 und 11 dargelegt. Schema 10 Schema 11
Für die Synthese von fucosyliertem Oligosaccharid wurde ein Kofaktor-Regenerationssystem verwendet, bei dem das freigesetzte GDP in GTP mit Hilfe von Phosphoenolpyruvat (PEP) und Pyruvatkinase (PK) umgewandelt wurde, und das hergestellte NADP in NADPH mit 2-Propanol in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase umgewandelt wurde. Galβ1,3GlcNAc wurde in Galβ1,3(Fucα1,4) GlcNAc umgewandelt, wobei α1,3/4-Fucosyltransferase verwendet wurde. [Dumas et al., Biomed. Chem. Lett., 1: 425 (1991)].

D. Regeneration der Nukleotide

Da Glycosyltransferasen häufig von Nukleotiden gehemmt werden, ist es bevorzugt, daß die Nukleotidkonzentration auf einem Minimalwert gehalten wird. Die Regeneration von Nukleosidtriphosphaten aus Nukleotiddonorzuckern gestattet die Verwendung von katalytischen Mengen von Nukleotiden, was eine ungebührliche Hemmung der Glycosyl transferaseaktivität wirksam ausschaltet. Die Regeneration der Nukleotide, die als energiereiche Bindungen der Nukleotidfucosyldonormoleküle dienen können, erfordert, daß die Reaktionsbedingungen sowohl Pyruvatkinase als auch Guanosin-5'-diphosphofucose-Pyrophosphorylase-Enzymreaktionen unterstützen. Ein beispielhaftes Regenerationssystem ist im nachstehenden Schema 12 gezeigt. Schema 12
Diese aktivierten Donormonosaccharid-Regenerationssysteme unterstützen die Glycosyltransferasereaktionen. Die Regenerationssysteme enthalten aktiviertes Donormonosaccharid, und die Enzyme zum Regenerieren des aktivierten Nukleotidzuckerdonors aus ihrem jeweiligen Phosphatdonor, Nukleotid und Zuckerdonor. Die Enzyme in den Regenerationssystemen umfassen Kinasen wie Pyruvatkinase, Acetylkinase bzw. 1,6-Diphosphofructokinase und Nukleotid-Zucker-Pyrophosphorylasen wie GDP-Fuc-PP. Die Phosphatdonoren umfassen PEP, Acetylphosphat und D-Fructose- 1,6-diphosphat.
Einige Phosphatdonoren können die Aktivität von anderen Enzymen in dem System hemmen, und die Donoren sollten mit Sorgfalt ausgewählt werden. Das Nukleotid, welches durch die Kinase phosphoryliert wird, sollte so ausgewählt werden, daß es als geeignetes Substrat für die Nukleotid-Zucker-Pyrophosphorylase dient.
Das vorstehend beschriebene Regenerationssystem kann durch einen Rückkopplungsmechanismus gehemmt werden, wenn die Konzentration des anorganischen Pyrophosphats unangemessen hoch ist. Die Verwendung von katalytischen Mengen von anorganischer Pyrophosphatase bereinigt dieses Problem.

E. Sialyl-Lewis-Lipanden

Bevorzugte Endprodukte, die durch die in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren hergestellt werden, sind pharmazeutisch wirksame Kohlenhydrate. Zu solchen Produkten gehören Sialyl-Lewis-Liganden (siehe die nachstehenden schematischen Darstellungen 1 und 13. Die Gruppe R von Schema 13 kann Wasserstoff oder eine organische Gruppe X sein, wie bereits festgestellt wurde). Sialyl-Lewis-Liganden sind definiert als eine beliebige Verbindung, die an einem selektiven Rezeptor bindet, wie in Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 88: 6224-6228 (1991) beschrieben ist. Diese Liganden werden verkörpert von ihren sialinsäure- und fucosehaltigen endständigen Strukturen, die an Glycoproteinen und Glycolipiden vorkommen. Zu diesen Liganden gehören die natürlich vorkommenden Liganden Sialyl-Lex (SLex) und Sialyl-Lea (Slea). Zu diesen Liganden gehören ferner nichtnatürliche Analoga, welche auf ähnliche Weise an die natürlichen Rezeptoren der Liganden binden. Zum Beispiel können Ligandenanaloga mit Akzeptoroligosaccharidanaloga für Glycosyltransferasen hergestellt werden. Es sind verschiedene Akzeptoranaloga bekannt und dazu gehören die desoxygenierten Oligosaccharide, die in Hindsgaul et al., J. Biol. Chem., 266: 17858-17862 (1991) beschrieben sind. Schema 13
Ligandenanaloga werden unter Verwendung der vorstehenden Reaktionsverfahren leicht hergestellt und werden unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Tests leicht getestet. Zum Beispiel erkennen die Rezeptoren einen Liganden, der von der natürlichen Stelle durch eine Epimerisierungsreaktion (von GlcNAc zu GalNAc) oder eine Änderung der Orientierung einer der glycosidischen Verknüpfungen (eine α2,6- zu einer β2,6-Verknüpfung) modifiziert worden ist. Beispielhafte Arbeitsweisen werden nachstehend erörtert.
Galactosvlierung Zwei Multienzymsysteme für die Synthese von LacNAc sind mit in situ- Kofaktor-Regeneration entwickelt worden. Das eine System beginnt mit Glc-1-P und verwendet UDP-Glc-Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9, UDPGP) und UDP-Gal 4-Epimerase (EC 5.1.3.2, UDPGE) [Wong et al., J. Org. Chem., 47: 5416 (1982); Auge et al., Carbohydr. Res., 151: 147 (1986); Thiem et al., AnQew. Chem. Int. Ed. Engl., 30: 1163 (1991); Thiem et al., Synthesis, 141 (1992)]. Dies ist in nachstehendem Schema 14 gezeigt, worin NAcGlcβOallyl (Verbindung 40; X ist O-allyl) als zur Veranschaulichung dienender Akzeptor für GalT verwendet wird. UDP-Galactose wird aus UDP-Glc mit UDPGE erzeugt; dieses Gleichgewicht begünstigt jedoch die Bildung von UDP-Glc und Glc-1-P muß getrennt davon hergestellt werden. Glc-1-P kann unter Verwendung der in dieser Anmeldung erörterten Phosphitylierungsreaktion hergestellt werden. Schema 14
Das andere System verwendet Gal anstelle von Glc-1-P als Donorvorläufer und UDPGP, Galactokinase (GK; EC 2.7.1.6) und Gal-1-P-Uridyltransferase (Gal-1-P UT; EC 2.7.7.12). Dies ist in nachstehendem Schema 15 gezeigt, welches 1-¹³C-Gal verwendet, welches in dem Schema durch einen schraffierten Kreis in der 1-Stellung dargestellt ist. GK ist spezifisch für Galactose und gestattet die direkte Herstellung von Gal- 1-P, welches in UDP-Gal mit Gal-1-P UT und UDP-Glc umgewandelt wird. Dieses zuletzt genannte System hat sich als für die Herstellung von [Gal-1-¹³C]-LacNAc geeignet erwiesen. Schema 15
Das Multienzymsystem (Schema 15) ging von 1-¹³C-Gal [99 Atomprozent, bezogen von Isotec Inc., Miamisburg, OH], GlcNAcβOallyl (Verbindung 40), [Lee et al., Carbohydr. Res., 37: 193 (1974)] Phosphoenolpyruvat (PEP) und katalytischen Mengen von Glc-1- P, ATP und UDP aus. UDP wurde mit Pyruvatkinase (PK; EC 2.7.1.40) und PEP in UTP umgewandelt und UTP reagierte mit Glc-1-P, katalysiert durch UDPGP, wobei UDP-Glc hergestellt wurde. Das Nebenprodukt, anorganisches Pyrophosphat (PPi), wurde durch anorganische Pyrophosphatase (PPase; EC 3.6.1.1) zersetzt. Mit Gal-1-P UT reagierte UDP-Glc mit ¹³C-Gal-1-P, das aus ¹³C-Gal und ATP in Gegenwart von GK erzeugt wurde, wobei UDP-¹³C-Gal und Glc-1-P erhalten wurde. Das ¹³C-Gal von UDP-¹³C-Gal wurde auf den Akzeptor (GlcNAcβOallyl) durch GalT übertragen, wobei [Gal-1-¹³C]-haltiges LacNAcbOallyl (Verbindung 41) erhalten wurde. Das erzeugte UDP wurde durch eine Reaktion von PK und PEP wieder in UTP umgewandelt, welches mit dem freigesetzten Glc-1-P reagierte, wobei UDP-Glc regeneriert wurde. Unter Verwendung dieses Multienzymsystems wurde [Gal-1-¹³C]LacNAcβOallyl mit 54% Ausbeute erhalten. Die gleiche Arbeitsweise wurde auch bei der Herstellung von nichtmarkiertem LacNAc und Analoga davon verwendet. Beispielhafte Analoga 41a-c sind in dem Schema veranschaulicht.
Sialylierung. Ein Multienzymsystem für die Sialylierung geht aus von NeuAc, [Gal-1-¹³C]- LacNAcbOallyl, PEP und katalytischen Mengen von ATP und CMP, wie im nachstehen- den Schema 16 gezeigt ist. CMP wurde durch Nukleosidmonophosphatkinase (EC 2.7.4.4, NMK) in Gegenwart von ATP, welches aus seinem Nebenprodukt ADP durch PK in Gegenwart von PEP katalysiert regeneriert wurde, in CDP umgewandelt und anschließend mit PEP durch PK in CTP umgewandelt. Das CTP wurde dann mit NeuAc mit CMP-NeuAc-Synthetase (EC 2.7.7.43) umgesetzt, um CMP-NeuAc herzustellen. Das Nebenprodukt PPi wurde durch PPase zu P1 hydrolysiert. Die Sialylierung von LacNAcβOallyl wurde mit CMP-NeuAc und α2,3-Sialyltransferase (α2,3SiaT; EC 2.4.99.6) zustandegebracht. Das freigesetzte CMP wurde wieder in CDP, CTP und schließlich in CMP-NeuAc umgewandelt. Unter Verwendung dieses Systems wurde [Gal-1-¹³C]NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβOallyl (Verbindung 42) sowie das nicht markierte Trisaccharid hergestellt. Schema 16
Interessanterweise war das Lactal (Galβ1,4Glucal) auch ein gutes Substrat für α2,3SiaT, wobei es gestattete, NeuAcα2,3Galb1,4Glucal (Verbindung 43, in Schema 16 gezeigt) mit 21% Ausbeute herzustellen. Lactal wurde entweder chemisch [Haworth et a1., J. Chem. Soc., 2644 (1930) oder enzymatisch unter Verwendung von GalT und Glucal hergestellt. [Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 8137-8245 (1991)]. Das glycal-haltige Oligosaccharid wie etwa Verbindung 43 kann in andere Sialyl-Lex-Derivate umgewandelt werden, wobei die von Danishefsky und anderen entwickelte Chemie eingesetzt wird. [Griffith et al., J. Am. Chem. Soc., 112: 5811 (1990); Halcomb et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 6661 (1989); Kessler et al., Anaew. Chem. Int. Ed. Engl., 29: 425 (1990); Thiem et al., Synthesis, 696 (1978)]. Die Verbindung 43 kann auch wie in dieser Anmeldung erörtert halohydratisiert werden, um die 2-Halogen-2-desoxy-Glc-Derivate zu ergeben.
Eine ähnliche Arbeitsweise wie die in Schema 16 gezeigte ergab unter Verwendung von α2,6-Sialyltransferase (EC 2.4.99.1) mit Galβ1,4GlcNAc als Akzeptorkohlenhydrat eine 22%ige Ausbeute von NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc nach einer zwei Tage langen Reaktion bei Raumtemperatur.
Fucosylierung. Das klonierte menschliche Enzym wurde für die Fucosylierung wie in Schema 17 nachstehend gezeigt verwendet, wobei GDP-Fuc (99 Atomprozent, bezogen von Isotec Inc., Miamisburg, OH) in stöchiometrischer Menge verwendet wurde. Schema 17
So ergab die Fucosylierung Von Sialyl-LacNAcβOallyl (Verbindung 42) die Sialyl- Lex-Verbindung 44 nach einer Reinigung mit Silicagel und BioGel P-2. LacNAcβOallyl (Verbindung 41) und das Sialylglycal, Verbindung 43, wurden ebenfalls fucosyliert, wobei das Lex -Trisaccharid Verbindung 45 bzw. Sialyl Lex-Glycal Verbindung 46 erhalten wurden, wobei die zuletzt genannten zwei Verbindungen im Schema 16 gezeigt sind. Interessanterweise akzeptieren α1,3-FucT und α1,3/4FucT Galb1,4(5-thio)Glc, wobei sie ein (5-thio)Glc-Lex-Analogon, Galb1,4(fucα1,3)-(5-thio)Glc ergeben, wie in Schema 18 nachstehend gezeigt. Schema 18
Was die in situ-Regeneration von GDP-Fuc anbelangt, wurde die Umwandlung von Man-1-P in GDP-Fuc über GDP-Man auf der Basis des Biosynthesewegs von GDP-Fuc in Mikroorgansimen zuerst untersucht, wie in Schema 19 gezeigt ist. Das "Akzeptor-OH" der schematischen Darstellungen 19 und 20 (nachstehend) ist eine Hydroxylgruppe eines Kohlenhydrat-Akzeptorsubstrats, wie etwa den in Tabelle 2 vorstehend aufgeführten. Schema 19
Mikrobielle Enzyme wurden wegen des leichen Zugangs verwendet. Außerdem gestattet dieses System die Regeneration von GDP-Man. GDP-Man-Pyrophosphorylase (GDP- Man PP) ist in Hefe gefunden worden [Munch-Peterson, Methods in Enzymol., 5: 171 (1962); Simon et al., J. Or4. Chem., 55: 1834 (1990)] und es ist bekannt, daß GDP-Fuc erzeugende Enzyme in dem Bakterium Klebstella pneumonia vorhanden sind [Ginsburg, J. Biol. Chem., 235: 2196 (1960); Ginsburg, Methods in Enzymol., 8: 293 (1966)]. Bei dieser Regeneration wurde GTP aus GDP in Gegenwart von PEP und PK erzeugt. Man-1-P reagierte mit GTP unter Bildung von GDP-Man durch GDP-Man PP aus getrockneten Hefezellen. GDP-Man wurde in Gegenwart von NADPH und GDP-Fuc erzeugenden Enzymen, die teilweise aus dem Bakterium gereinigt worden waren, in GDP-Fuc umgewandelt. Das oxidierte NADP wurde in NADPH durch Thermoanaerobium brockii-Alkoholdehydrogenase (TADH) (EC 1.1.1.1) und Isopropanol zurückverwandelt. Die Herstellung von GDP-Man und GDP-Fuc wurde durch HPLC bestätigt und die Fucosylierung von LacNAcβOallyl und Verbindung 42 erfolgte, wobei die Verbindungen 45 und 44 in einer Menge von 5-10 mg erhalten wurden. Eine präparative Synthese von Sialyl-Lex mit in situ-Regeneration von GDP-Fuc unter Verwendung von gereinigten Enzymen ist in Arbeit.
Ein alternatives Verfahren ging von Fuc-1-P aus, welches durch GDP-Fuc- Pyrophosphorylase (GDP-Fuc P) katalysiert in GDP-Fuc umgewandelt wurde, wie in Schema 20 nachstehend gezeigt ist. [Ishihara et al., J. Biol. Chem. 243: 1103 (1968); Ishihara et al., J. Biol. Chem. 243: 1110 (1968); Schachter et al., Methods in Enzymol., 28: 285 (1972); Richards et al., Biochim. Biophys. Acta, 484: 353 (1977); Kilker et al., Biochim. Biophys. Acta, 570: 271 (1979)]. GDP-Fuc P ist aus Schweineleber teilweise gereinigt worden [lshihara et al., J. Biol. Chem. 243: 1110 (1968)], und es ist gezeigt worden, daß das in Schema 20 abgebildete Regenerationssystem im analytischen Maßstab für die Synthese von Lex und Sialyl-Lex funktioniert. Schema 20
Außer den Sialyl-Lewis-Antigen SLex, SLea und ihren jeweiligen Analoga sind die ABH- Blutgruppenantigene ebenfalls wichtige Oligosaccharide. Diese Erfindung stellt ein schnelles und wirtschaftliches Mittel zum Erhalten aller dieser Verbindungen bereit. Um beispielsweise SLea, welches die Struktur NeuAcα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc aufweist, zu erhalten, kombiniert man die folgenden drei Glycosyltransferasen: β1,3-Galactosyltransferase, α2,3-Sialyltransferase und α1,4-Fucosyltransferase. Die Reaktionsbedingungen und Hilfssubstrat-Enzyme zur Regeneration von Zuckemukleotiden sind wie vorstehend angegeben.
Für H-aktive Oligosaccharide, das Blutgruppen-O-Antigen, welches die Struktur Fucα1,2Galβ-R aufweist, wobei R β1,3GlcNAc-R1 oder β1,3GalNAc-R1 sein kann und wobei R1 ein beschränktes Oligosaccharid ist, kann man die folgenden Glycosyltransfe rasen: β1,3-Galactosyltransferase und α1,2-Fucosyltransferase mit den geeigneten Hilfsreaktionskomponenten und Bedingungen, wie sie vorstehend für SLex oder SLea angegeben sind, kombinieren, um Fucα1,2Galβ1,3GlcNAc-R1 zu erhalten. Die R1-Gruppe einer Blutgruppe 0 konstituiert somit eine weitere Gruppe X, wie sie vorstehend erörtert wurde, ebenso wie die R1-Gruppen für die Blutgruppen A und B.
Für A-aktive Oligosaccharide, das Blutgruppe-A-Antigen, welches die Struktur Gal- NAca,1,3(Fuca,1, 2)Galβ-R aufweist, wobei R β1,3GlcNAc-R1 oder β1,3GalNAc-R1 sein kann, und wobei R1 ein beschränktes Oligosaccharid ist, kann man die folgenden Glycosyltransferasen: β1,3-Galactosyltransferase, α1,2-Fucosyltransferase, α1,3-N-Acetylgalactosaminyltransferase mit den geeigneten Hilfsreaktionskomponenteri und Bedingungen wie vorstehend angegeben kombinieren, um GalNAcα1,3(Fucα1,2)Galβ1,3GlcNAc-R1 zu erhalten.
Für B-aktive Oligosaccharide, das Blutgruppe-B-Antigen, welches die Struktur Galα1,3(Fucα1,2)Galβ-R aufweist, wobei R β1,3GlcNAc-R1 oder ß1,3GalNAc-R1 sein kann, und wobei R1 ein beschränktes Oligosaccharid ist, kann man die folgenden Glycosyltransferasen: β1,3-Galactosyltransferase, α1,2-Fucosyltransferase, α1,3-Galactosyltransferase mit den geeigneten Hilfsreaktionskomponenten und Bedingungen wie vorstehend angegeben kombinieren, um Galα1,3(Fucα1,2)Galβ1,3GlcNAc- R1 zu erhalten.
So werden enzymkatalysierte stufenweise Synthesen von Oligosacchariden einschließlich fucosylierten und fucosylierten sialylierten Kohlenhydratmolekülen in Betracht gezogen, bei denen die Produkte jeder Glycosylierungsreaktion vor dem nächsten Glykosylierungsschritt isoliert werden. Diese Glycosylierungsreaktionen können die vorstehend erörterten Regenerationsschritte verwenden und tun dies vorzugsweise auch.
Ebenfalls in Betracht gezogen werden mehrfache Glycosylierungen in einer Einfachreaktionsmischung, um die gleichen fucosylierten und fucosyüerten sialylierten Kohlenhydratmoleküle zu ergeben. Auch hier werden die vorstehend erörterten Regenerationsreaktionen verwendet. Außerdem werden Km und Vrel-Daten wie die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Daten und veröffentlichte Werte verwendet, um die Konzentrationen der Reaktantenspezies so einzustellen, daß Nebenreaktionen minimiert werden. Inhibitoren, die in Tabelle 3 gezeigt sind, können ebenfalls verwendet werden, um die Bildung von Produkten zu steuern.
Weiter werden mehrstufige Glycosylierungsreaktionen in einer Einfachreaktionsmischung in Betracht gezogen, um die vorstehenden Produkte zu ergeben, wobei aber ein Enzym oder Reaktant, das bzw. der für die Glycosylierung benötigt wird, zugegeben wird, nachdem die anderen Reaktionen im wesentlichen abgeschlossen sind, so daß eine Glycosylierungsreaktion beginnt, nachdem mindestens eine oder vorzugsweise zwei andere Glycosylierungen im wesentlichen abgeschlossen sind. In einer beispielhaften Synthese werden alle Reagenzien und Enzyme, die in Schema 1 gezeigt sind, mit Ausnahme von Fucosyltransferase (FucT) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und es wird NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc-OR gebildet, wie auch in Schema 16 für die Bildung von Verbindung 42 gezeigt ist, wobei R ein Allyl ist. Sobald eine Verbindung wie Verbindung 42 von Schema 16 gebildet worden ist, wird ein FucT wie x1,3-Fucosyltransferase oder α1,3/4-Fucosyltransferase zugegeben und das fucosylierte sialylierte Kohlenhydrat wie etwa Verbindung 44 von Schema 17 wird gebildet. Alternativ dazu kann das FucT- Enzym vorhanden sein und der Fucosyldonorvorläufer wie etwa Fucose kann weggelassen werden. Entsprechend kann Fucose ohne ihr phosphorylierendes Enzym, Fucosekinase, vorhanden sein.

F. Derivatisieren der fucosvlierten Produkte zum Bilden von Liganden

Die vorstehend beschriebenen fucosylierten Produkte sind Haptene, die am besten als Liganden wirken, wenn sie an größere Bestandteile gebunden sind. Zu solchen Bestandteilen gehören Proteine, Glycoproteine, Glycolipide und nichtbiologische Analoga von solchen Molekülen. Typischerweise wird das reduzierende Ende des Zuckers mit einem freien Amin oder Mercaptan über eine glycosidische Bindung verknüpft. Liposomen sind brauchbar zum Herstellen eines mehrwertigen Makromoleküls. Zur Herstellung von Liposomen stehen eine Vielzahl von Verfahren zur Vertilgung, die z. B. in Szoka et al., Ann. Rev. Biophvs. Bioeng, 9: 467 (1980), in den US-Patenten Nr. 4,235,871, 4,501,728 und 4,837 028, welche durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen sind, beschrieben sind.

G. Testen der Sialyl-Lewis-Lipandenaktivität

Eine Ausführungsform dieser Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von sialylierten Lewis-Antigenen sowohl in natürlicher Form als auch von Mimetika oder Analoga. Diese Antigene spielen eine Rolle bei der interzellulären Adhäsion und spielen eine Rolle bei einer Entzündung und anderen Erkrankungen von Menschen und Säugetieren. Um die Herstellung dieser Antigene unter Verwendung der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung zu erleichtern, ist es hilfreich, die dabei entstehenden Produkte auf ihre Fähigkeit zum Binden an natürliche sialylierte Lewis-Antigenrezeptoren wie die ELAM- und GMP 140-Rezeptoren zu testen. Solche Tests sind in Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 88: 6224-6228 (1991) und Phillips et al., Science, 250: 1130-1132 (1990), die jeweils durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen sind, ausführlich beschrieben.
Obwohl eine Anzahl von verschiedenen Tests zur Verfügung steht, mißt ein bevorzugter Test die Fähigkeit der Antigene, die Bindung von Zellen, welche die passenden Adhäsionsrezeptoren tragen und Zellen, welche das entsprechende sialylierte Lewis-Antigen exprimieren, zu blockieren oder zu hemmen. Die Bindung wird visuell unter einem Mikroskop bestimmt. Bevorzugte rezeptor-exprimierende Zellen sind aktivierte Blutplättchen und Endothelzellen. Die Rezeptoren sind Teil einer Familie, die als Selectine oder LEC-CAM's bekannt sind und LEC-CAM-1, ELAM-1, GMP-140 und CD62 einschließen. Die Liganden kommen auf Neutrophilen, Monocyten und Tumorzellen vor.
In einem typischen Test werden Neutrophile durch Überschichten von Mono-Poly Resolving Medium (Ficoll-Hypaque-Flow Laboratories) mit heparinisiertem Blut, gefolgt von einer Zentrifugation während 25 Minuten bei 2000 U/min und anschließend weiteren 25 Minuten bei 2500 U/min isoliert.
Blutplättchen können gemäß der beschriebenen Arbeitsweise isoliert werden. Blut wird von einem normalen menschlichen Spender in eine Spritze, die ACD-Antikoagulans (Dextrose, 2,0 g; Natriumcitrat 2,49 g; und Zitronensäure 1,25 g; ergänzt zu 100 ml mit dH&sub2;O) enthält, in einem Verhältnis von 6 Teilen Blut zu 1 Teil Antikoagulans aufgezogen. Das Blut wird bei 800 U/min (ungefähr 90 x g) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und bei 1200 U/min (ungefähr 400 x g) 6 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und bei 2000 U/min (1200 x g) 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Plättchen zu pelletieren. Der Plättchenniederschlag wird zweimal mit Tyrode-HEPES-Puffer, pH 6,5 (NaCl 8,0 g; KCl 0,2 g; NaH&sub2;PO&sub4; · H&sub2;O, 0,057 g; MgCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,184 g; NaHCO&sub3; 0,1 g; Dextrose 1,0 g; und HEPES, 2,383 g; Auffüllen auf 1 I mit DI-Wasser, Einstellen auf pH 6,5 mit 1 N NaOH) gewaschen, gefolgt von einer Waschung in PBS. Die Plättchen werden bis zu einer Konzentration von 108/ml in PBS suspendiert und durch Inkubation während 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Thrombin in einer Endkonzentration von 0,25 U/ml aktiviert.
Für den Test werden 20 ul der Plättchensuspension (2 · 10&sup8;/ml) in ein Eppendorf-Zentrifugenröhrchen gegeben. Ein gleiches Volumen der Oligosaccharid-Zubereitungen in Konzentrationen von 200 ug/ml bis 0,3 ug/ml oder von Glycolipid-Liposomen-Zubereitungen (hergestellt wie vorstehend beschrieben) in Konzentrationen von 2 ug/ml bis 0,25 ug/ml wurde zugegeben und die Röhrchen wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurden 20 ul der Neutrophil-Zubereitung (2 · 10&sup6;/ml) zugegeben und die Röhrchen wurden weitere 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
Die Adhäsion von aktivierten Plättchen an die Neutrophile wird mikroskopisch untersucht. Typischerweise werden 100 Neutrophile ausgewertet. Sie werden als positiv bewertet, wenn zwei oder mehr Plättchen anhafteten und als negativ, wenn weniger als zwei Plättchen gebunden waren.

H. Verbesserte Mittel zum Herstellen von Glycosyl 1- oder 2-P

Phosphorylierte Zucker, die das Phosphat am anomeren Kohlenstoffatom (1- oder 2-Stellung) aufweisen, sind wertvoll als Zwischenprodukte bei den in dieser Anmeldung beschriebenen Reaktionen und verschiedene davon sind im Handel erhältlich. Ein verbessertes Mittel zum selektiven Phosphorylieren dieses Kohlenstoffatoms eines Monosaccharids schließt die Verwendung eines dreiwertigen Phosphitylierungsreagenzes zum Übertragen eines Phosphityl-Bestandteils auf das gewünschte Kohlenstoffatom ein. Das dabei entstehende Phosphit wird anschließend verwendet, um das entsprechende Phosphat herzustellen, welches selbst in einer Enzymreaktion verwendet wird, die in dieser Anmeldung beschrieben ist.
Die Struktur eines geschützten Phosphitylmonosaccharids entspricht der nachstehenden Formel I:
worin jedes R&sub1; gleich oder verschieden ist und eine Arylgruppe wie Phenyl oder Benzyl oder eine niedere C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe bedeutet;
X unabhängig voneinander Sauerstoff oder Stickstoff bedeutet;
R&sub2; unabhängig voneinander eine Acyl-, Benzyl-, Silyl- oder Alkylschutzgruppe bedeutet oder X-R&sub2; zusammen nicht vorhanden sind und durch Wasserstoff ersetzt sind;
R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff (-H), -CH&sub3;, -OR&sub2;, -CH&sub2;OR&sub2;, -CH(OR2)-CH(OR&sub2;), -CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;), -NH&sub2;, oder-NHR&sub2; bedeutet;
R&sub4; bedeutet Wasserstoff (H), Carboxyl oder C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Benzylcarboxylat; und n ist 1 oder 2, vorzugsweise 2.
Ein in Betracht gezogenes geschütztes Phosphitylmonosaccharid schließt somit Derivate von Sialinsäure, KDO, KDN und ähnliche Verbindungen ein, worin R&sub4; eine Carboxyl- oder Carboxylatestergruppe bedeutet. In einer bevorzugten Gruppe von Verbindungen der Formel I ist R&sub4; Wasserstoff. Wenn dies der Fall ist, wird aus Formel I die nachstehende Formel 11, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, X und n wie vorstehend definiert sind.
Es versteht sich, daß jede R&sub1;-Gruppe von der anderen verschieden sein kann. Dies beruht auf der Tatsache, daß das Phosphitylierungsreagens durch Reaktion von PCl&sub3; mit einem sekundären Amin wie Diisopropylamin und zwei Molen Alkohol hergestellt werden kann. So kann man durch Vermischen des alkoholischen Anteils der Reaktionsmischung ein Phosphitylierungsreagens und Phosphit herstellen, welches zwei verschiedene R&sub1;-Gruppen wie Benzyl und Ethyl aufweisen kann. Vorzugsweise sind beide R&sub1;-Gruppen gleich und am meisten bevorzugt sind beide Benzylgruppen oder Phenylgruppen, da diese Gruppen durch Hydrogenolyse entfernt werden können.
Es versteht sich auch, daß jedes X Sauerstoff oder Stickstoff sein kann, und Verbindungen, in denen beide Gruppen anwesend sind, werden besonders in Betracht gezogen, wie etwa das geschützte Sialyldibenzylphosphat, Verbindung 97. Zu den Schutzgruppen R&sub2; gehören Acylgruppen wie C&sub1;-C&sub5;-Acylgruppen wie Formyl-, Acetyl-, Pivaloyl- und Pentanoylgruppen, Benzoyl- und Phthaloylgruppen, Alkylschutzgruppen und Silylgruppen. Zu beispielhaften Alkylgruppen gehören C&sub1;-C&sub5;-Alkyl wie Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, t-Butyl-, Cyclopentyl- und Pentylgruppen. Acetale und Ketale, die aus C&sub1;-C&sub5;-Alkylketonen oder Aldehyden gebildet sind, wie etwa das besonders bevorzugte Aceton und Formaldehyd können ebenfalls eine Alkylschutzgruppe bilden. Benzaldehyd wird ebenfalls als acetal-bildende Schutzgruppe in Betracht gezogen. Solche Ketale und Acetale sind wohlbekannte Schutzgruppen auf dem Gebiet der Saccharidchemie. Zu beispielhaften Silylschutzgruppen gehören die Tri-C&sub1;-C&sub5;-alkylsilylgruppen wie Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und dergleichen, C&sub1;-C&sub5;-Alkyldiphenylsilylschutzgruppen wie etwa eine Diphenylmethylsilylgruppe, Di-C&sub1;-C&sub5;-alkylphenylsilylschutzgruppen wie etwa eine Phenyldimethylsilylgruppe und eine Triphenylsilylschutzgruppe.
Es ist gewöhnlich bevorzugt, daß alle Schutzgruppen gleich sind, oder daß sie, wenn sie verschieden sind, durch verschiedene Reaktionen selektiv entfernt werden können. Zum Beispiel können Benzylgruppen in Gegenwart von Acetylgruppen durch Hydrogenolyse entfernt werden, wogegen eine Acetylgruppe in Gegenwart einer Benzylgruppe durch Behandlung mit einem primären Amin wie Benzylamin entfernt werden kann. Acetyl ist eine besonders bevorzugte Schutzgruppe, da eine O-Acetylgruppe in der anomeren Stellung (1- oder 2-Stellung) in Gegenwart von anderen O-Acetylgruppen in den anderen Ringstellungen durch Behandlung mit einem primären Amin leicht entfernt werden kann.
Es wird auch darauf hingewiesen, daß X-R&sub2; nicht vorhanden und durch Wasserstoff ersetzt sein kann. Als solches ist das geschützte Monosaccharid ein Desoxymonosaccharid, wofür die Verbindungen 97 und 101 bis 113 Beispiele darstellen.
Es versteht sich auch, daß, wenn n = 2 in Formel I, wie es für Zucker mit sechsgliedrigem Ring bevorzugt ist, beide (R&sub3;-CH)-Gruppen nicht gleich sein müssen und gewöhnlich verschieden sind. Z. B. ist bei dem geschützten Fucosylphosphit, Verbindung 8, welche bereits im Hinblick auf Schema 6 erörtert wurde, eine R&sub3;-Gruppe CH&sub3;, wogegen die andere O-Acetyl (OAc) ist. Entsprechend ist bei dem geschützten Mannosylphosphit, Verbindung 16, die im Hinblick auf Schema 9 erörtert wurde, ein R&sub3; eine CH&sub2;OAc-Gruppe, wogegen das andere eine OAc-Gruppe ist.
Formel I kann alternativ als Formel IA, nachstehend, ausgedrückt werden, worin:
jedes R&sub1; gleich oder verschieden ist und eine Arylgruppe wie Phenyl oder Benzyl oder eine niedere C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe bedeutet;
X unabhängig voneinander Sauerstoff oder Stickstoff bedeutet;
R&sub2; unabhängig voneinander eine Acyl-, Benzyl-, Silyl- oder Alkylschutzgruppe bedeutet oder X-R&sub2; zusammen nicht vorhanden und durch Wasserstoff ersetzt sind;
R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff (-H), -CH&sub3;, -OR&sub2;, -CH&sub2;OR&sub2;, -CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;), oder -CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;)-CH(OR&sub2;) bedeutet;
R&sub4; Wasserstoff (H), Carboxyl oder C&sub1;-C&sub5;-Alkyl- oder Benzylcarboxylat bedeutet; und
m null oder 1 ist, so daß, wenn m null ist, die (CH-X-R&sub2;)-Gruppe nicht vorhanden ist und ein fünfgliedriger Ring gebildet wird, und wenn m 1 ist, die (CH-X-R&sub2;)-Gruppe vorhanden ist und das Monosaccharid einen sechsgliedrigen Ring aufweist, was bevorzugt ist.
Gemäß der Bevorzugung von geschützten Monosaccharidphosphiten mit sechsgliedrigem Ring kann die Formel IA als vorstehende Formel IB ausgedrückt werden, worin R&sub1;&submin;&sub4; und X wie in Formel IA sind.
Gemäß der Bevorzugung von Verbindungen, worin R&sub4; Wasserstoff ist, kann die Formel II als nachstehende Formel IIA ausgedrückt werden. Gemäß der Bevorzugung von ge schützten Monosacchariden mit sechsgliedrigem Ring (worin m = 1), kann die Formel IIA als nachstehende Formel IIB ausgedrückt werden. R&sub1;&submin;&sub3;, m und X sind wie in Formel IA.
Mit Ausnahme der erwähnten Unterschiede hinsichtlich der Definitionen der Gruppe R zwischen den Formeln I, II, IA, IB und IIA sind die Identitäten von X, Acyl, Silyl, Alkyl und dergleichen Gruppen in diesen Formeln gleich.
Die dreiwertigen Phosphitylierungsreagenzien sind bereits definiert worden. Zu verfügbaren dreiwertigen Phosphitylreagenzien gehören Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit, 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit oder 2-Cyanoethyl-N,Ndiisopropylchlorphosphoramidit.
Das Verfahren zum Herstellen eines geschützten Monosaccharidphosphits aus einem, unsubstituierten (ungeschützten) Monosaccharid ist ein mehrstufiges Verfahren, welches mit einem beliebigen Monosaccharid (Aldose oder Ketose ohne Beschränkung hinsichtlich der Konformation oder Orientierung) beginnt. Das Monosaccharid wird zuerst an jedem freien Hydroxyl (oder Amin) geschützt, wobei ein gängiges Schutzreagenz wie eine Acyl-, Benzyl-, Silyl- oder Alkylgruppe verwendet wird, wie vorstehend erörtert wurde. Die Schutzgruppe, typischerweise eine C&sub1;-C&sub5;-Acyl- oder Benzylgruppe, in der 1- oder 2-Stellung wird anschließend selektiv entfernt, wobei entweder eine Schweinepankreaslipase oder ein Alkyl- oder Benzylamin in einem nichtwässrigen polaren Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder Dichlormethan verwendet wird. Das dreiwertige Phosphitylierungsreagenz wird anschließend in 1- oder 2-Stellung unter anaeroben Bedingungen unter Verwendung eines aromatischen sekundären oder tertiären Amin- Kondensationsmittels wie 1,2,4-Triazol, Imidazol, Tetrazol oder Pyridinium-p-toluolsulfonat addiert. Triazol oder Tetrazol sind gegenwärtig bevorzugte Kondensationsmittel.
Das Produkt wird anschließend oxidiert, wobei ein Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid oder t-Butyl-Hydroperoxid verwendet wird. Von der resultierenden Phosphorylgruppe wird die Schutzgruppe entfernt, so daß das Phosphatsalz (z. B. Natriumsalz) entsteht, wobei eine Reduktion mit Wasserstoff/Palladium für Benzylderivate und eine alkalische Behandlung für 2-Cyanoethylderivate verwendet wird.
So wurde unter Verwendung der vorstehenden Reaktion eine Anzahl von Monoglycosylphosphiten und entsprechenden Phosphaten hergestellt. Beispielhafte Verbindungen, als Phosphate, wurden hergestellt aus 2-Acetamido-2-desoxy-D-galactose (GalNAc; Verbindung 89), 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucose (GlcNAc; Verbindung 90), D-Galactose (Gal, Verbindung 91), D-Glucose (Glc; Verbindung 92), D-Mannose (Man; Verbindungen 18 und 93), L-Rhamnose (Rha; Verbindung 94), L-Fucose (Fuc; Verbindung 5) und N-Acetylneuraminsäure (NeuAc; Verbindung 99). Die nachstehenden schematischen Darstellungen 21-23 geben einen Überblick über diese Reaktionen. Das Phosphit von 2-Phthalimidoyl-2-desoxy-D-glucose-3,4,6-triacetat (Verbindung 100) wurde ebenfalls durch das in Schema 23 veranschaulichte Verfahren mit ungefähr 90% Ausbeute hergestellt. Schema 21 Schema 23
Die nachstehende Tabelle 4 gibt die Identitäten der verschiedenen "R"-Gruppen (R¹&supmin;&sup4;) an, die in den vorstehenden schematischen Darstellungen verwendet werden. Die Tabelle 5 gibt die Ausbeuten und anomeren Verhältnisse für verschiedene Verbindungen der schematischen Darstellungen 21-23 und der Tabelle 4 an.
Es hat sich gezeigt, daß Lösungsmittel das anomere Verhältnis der phosphitylierten Produkte beeinflussen. So betrug, wenn die Verbindung 70 in THF phosphityliert wurde, das α : β-Verhältnis 1 : 6, wogegen in Chloroform sich das Verhältnis änderte und 1 : 2 betrug. TABELLE 4 für die schematischen Darstellungen 21 und 22
*CP = Verbindung TABELLE 5 Anomere Verhältnisse und chemische Ausbeuten für die Schritte in den schematischen Darstellungen 21-23
*CP = Verbindung
Man beachte, daß die Verbindungen der vorstehenden schematischen Darstellungen und Tabellen Mannose- und Fucosederivate einschließen, denen bei vorangehenden Erörterungen unterschiedliche Zahlen zugewiesen wurden. Diese Verbindungen werden hier umnumeriert, um die Daten einfacher darstellen zu können. Beide Zahlen werden in den folgenden Beispielen angegeben.
Im Anschluß an die in Schema 23 dargelegten Reaktionen wird auch die Synthese von mehreren zusätzlichen spezifischen Monosaccharidcarboxylaten der Formel I in Betracht gezogen. Diese Verbindungen sind mit D-Sialinsäure (Verbindung 101), D- und L-KDN und D- und L-KDO verwandt. Die Strukturen für beispielhafte Methylester (Me)-Elemente von diesen Verbindungen, bei denen R&sub2; Acetyl bedeutet und R&sub1; Benzyl bedeutet, sind nachstehend als Verbindungen 101-113 gezeigt. Die zugrundeliegenden Monosaccharidcarboxylate können unter Verwendung von Sialinsäurealdolase-katalysierten Reaktionen hergestellt werden, wie in Gautheron-LeNarvor et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 7816 (1991) und Sugai et al., J. Am. Chem. Soc., im Druck, erörtert ist.

Beispiele

Nachdem eine allgemeine Übersicht über die Erfindung und eine Anleitung zur Kopplung der Fucosyltransferase-Reaktionen mit energieerzeugenden Reaktionen, welche katalytische Mengen von kostengünstigen Nukleotiden verwenden, und mit anderen Transferase-Reaktionen angegeben wurde, werden nachstehend Beispiele dargelegt, um weitere Einzelheiten anzugeben. Diese Beispiele werden nur zur Erläuterung angegeben und nicht mit der Absicht zu beschränken. Fachleute erkennen leicht, daß viele Parameter nicht kritisch sind und variiert werden könnten.

Beispiel 1: Chemische Synthese von Fucose-1-phosphat (Schematische Darstellungen 5 und 6)

(a) 1,2,3,4-Tetra-O-benzoyl-L-fucose (Verbindung 2)

Benzoylchlorid (21,4 g, 152,3 mmol; 17,7 ml) wurde tropfenweise zu einer gekühlten Lösung von L-Fucose (5,0 g, 30,5 mmol) in Pyridin (100 ml) bei 0-5ºC zugegeben und das Gemisch wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde in Eiswasser gegossen und mit Ethylacetat (EtOAc) extrahiert. Die Extrakte wurden nacheinander mit eiskaltem verdünnten HOI, wässrigem NaHCO&sub3; und Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert. Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.

(b) Dibenzylphosphoryl-2,3,4-tri-O-benzyl-β-L-Fucosid (Verbindung 4)

Zu einer gekühlten Lösung von Verbindung 2 (2,0 g, 3,44 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) und Ac&sub2;O (2 ml) wurden tropfenweise 30% HBr-AcOH (8 Minuten) bei 0-5ºC zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde auf Eiswasser gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die Extrakte wurden nacheinander mit Wasser, wässrigem NaHCO&sub3; und Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, um Verbindung 3 zu ergeben. Die Verbindung 3 wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,36 (3 H, d, J6,51 Hz, 6-CH&sub3;), 4,69(1H, br q, J6,56 Hz, H-5), 5,62 (1 H, dd, J3,91, 10,5 Hz, H-2), 5,84 (1 H, dd, J0,97, 3,33 Hz, H-4), 6,01 (1 H, dd, J 3,36, 10,50 Hz, H-3), 6,94 (1 H, d, J 3,92 Hz, H-1); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 15,8, 68,6, 69,2, 70,4, 89,4, 165,4, 165,6, 165,7.
Ag&sub2;CO&sub3; (1,90 g, 6,89 mmol) wurde in einer gekühlten (0-5ºC) Lösung von der vorstehenden Verbindung 3, Dibenzylphosphat (2,88 g, 10,3 mmol) und MS 3 Å (6 g) in CH&sub2;Cl&sub2;-Et&sub2;O-CH&sub3;CN (jeweils 20 ml) in einen Rundkolben gegeben, der mit Aluminiumfolie umwickelt war, um Licht auszuschließen. Das Gemisch wurde 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und durch ein Celitefilterkissen filtriert und das Filtrat wurde konzentriert. Der Rückstand wurde an Silicagel mit Toluol-EtOAc (2,5 : 1) chromatographiert, wobei Verbindung 4 (2,4 g, 95%) als einziges Produkt erhalten wurde.
¹H-NMR(CDCl&sub3;) δ: 1,35 (1 H, d, J6,35 Hz, 6-CH&sub3;), 4,225 (1 H, br dt, J 5,71, 6,70 Hz, H-5), 4,77 (1 H, dd, J 7,07, 11,65 Hz, Benzyl), 4,86 (1 H, dd, J 6,50, 1,63 Hz, Benzyl), 5,11 (1 H, dd, J 7,51, 11,71 Hz, Benzyl), 5,14 (1 H, dd, J 7,27, 11,70 Hz, Benzyl), 5,58 (1 H, dd, J 3,48, 10,44 Hz, H-3), 5,69 (1 H, dd, J 7,37, 7,89 Hz, H-1), 5,76 (1 H, dd, J 8,03, 3,44 Hz, H-4), 5,90 (1H, dd, J 8,03, 10,45 Hz, H-2); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 16,12, 69,31, 69,35, 69,54, 69,58, 69,63, 69, 70, 70,57, 70,83, 71,70, 96, 97, 97,00, 127,28, 127,40, 127,89, 128,06, 128,13, 128,26, 128,31, 128,43, 12ß,58, 128,66, 128,83, 129,06, 129,67, 129,72, 129,77, 129,93, 133,27, 133,41, 133,51, 165,24, 165,45, 165,79. HRMS berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub3;&sub7;O&sub1;&sub1; PCs (M+Cs&spplus;) 869,1128, gefunden 869,1138.

(c) β-L-Fucose-1-ohosphat(Verbindung 5)

Die Verbindung 4 (2,32 g, 3,15 mmol) wurde über 5% Pd/C (400 mg) in EtOH (60 ml) und 1 N NaHCO&sub3; (15 ml) 10 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde durch ein CeliteTM-Filterkissen abfiltriert. Zu einer gekühlten Lösung des Rückstands in Wasser (20 ml) wurde tropfenweise 1 N NaOH (20 ml) bei 0-5ºC zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde durch Zugabe von kalter 1 N AcOH bis zu pH 7,5 vorsichtig neutralisiert und unlösliches Material wurde durch ein CeliteTM-Kissen abfiltriert. Das Filtrat wurde auf 250 ml verdünnt und auf die Säule von Dowex 1-X8 [HCOz] (2 · 15 cm) aufgetragen und mit einem Stufengradienten von NH&sub4;OAc&sub2;; Wasser (200 ml), 0,1 M NH&sub4;OAc&sub2; (200 ml), 0,1 M NH&sub4;OAc&sub2; (200 ml) und 0,3 M NH&sub4;OAc&sub2; (200 ml) eluiert. Die Fucose wurde mit Wasser eluiert und die ge wünschte Verbindung 5 wurde zwischen 0,2-0,3 M NH&sub4;OAc&sub2; eluiert. Nach der Entfernung des Salzes wurde die Verbindung 5 (700 mg, 82%) erhalten. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Daten stimmten gut mit den von der Gruppe von Baker angegebenen Daten überein. [Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981)].

(d) 1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-L-fucose (Verbindung 6)

Ein Gemisch aus L-Fucose (3,0 g, 18,2 mmol) und wasserfreiem NaOAc (50 mg, 0,61 mmol) in Essigsäureanhydrid (20 ml) wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 2 Stunden lang auf 100ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch auf Eiswasser gegossen, 2 Stunden lang gerührt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden nacheinander mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde auf Silicagel mit Toluol-Ethylacetat (10 : 1) chromatographiert, wobei Verbindung 6 (5,92 g, 98%) als Gemisch aus α und β (1 : 7, abgeschätzt anhand des ¹H-NMR-Spektrums) erhalten wurde.

(e) 2,3,4-Tri-O-acetyl-L-fucose (Verbindung 7 oder 74)

i. Chemisches Verfahren: Eine Lösung von Verbindung 6 oder 67 (3,0 g, 9,0 mmol) und Benzylamin (1,45 g, 13,5 mmol; 1,47 ml) in THF (35 ml) wurde einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit eiskalter verdünnter Chlorwasserstoffsäure, wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde auf Silicagel mit Toluol-Ethylacetat (1 : 1) chromatographiert, wobei Verbindung 7 oder 74 erhalten wurde (2,40 g, 92%). Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit dem in der Literatur angegebenen Spektrum gut überein. [Hennen et al., J. Org. Chem., 53: 4743 (1988)].
ii. Enzymatisches Verfahren: Eine Suspension von Verbindung 6 oder 67 (2,5 g, 7,5 mmol) und Schweinepankreaslipase (5,6 g) in 13% (Vol/Vol.) DMF/Phosphatpuffer (50 mM, pH 7) wurde 5 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei in dieser Zeit der pH mit N NaOH eingestellt wurde. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Reinigung des Produkts erfolgte wie vorstehend angegeben, wobei Verbindung 7 oder 74 (1,1 g, 48,4%) als Gemisch aus α und β (1 : 1) erhalten wurde.

(f) Dibenzylohosphoryl-2.3.4-tri-O-acetyl-L-fucosid (Verbindung 9 oder 88)

Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidat [Pederson et al., Tetrahedron, 47: 2643 (1991)] (2,7 g, 8,5 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von Verbindung 7 oder 74 (1,0 g, 3,4 mmol) und Tetrazol (1,0 g, 14,5 mmol) in THF (50 ml) unter Stickstoff bei Raumtemperatur zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Ether (50 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und die organische Phase wurde mit eiskalter verdünnter Chlorwasserstoffsäure, wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde auf Silicagel mit Hexan-Ethylacetat (4 : 1) chromatographiert, wobei Verbindung 8 oder 81 (1,43 g, 79%) als Gemisch von α und β (1 : 10) erhalten wurde. β-Anomer: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,22 (3H, d, J 6,50 Hz, 6-CH&sub3;), 1,91, 1,99, 2,19, (jeweils 3H, s, 3 x OAc), 3,85 (1 H, dq, J 1,00, 6,50 Hz, H-5), 4,82-4,96 (4H, m, Benzylprotonen), 5,02-5,08 (2H, m, H-2, 3), 5,25 (1 H, dd, J 0,50, 3,50 Hz, H-4), 5,32 (1 H, dd, J 8,00, 10,50 Hz, H-1).
Zu einer gekühlten Lösung von Verbindung 8 oder 81 (500 mg, 0,9 mmol) in THF (50 ml) wurde 30% Wasserstoffperoxid (7 ml) in einer Portion zugegeben und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 90 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde mit Ether verdünnt und mit eiskaltem wässrigen Natriumthiosulfat, wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert, um Verbindung 9 oder 88 (420 mg, 81%) zu ergeben. Diese wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Das ¹H-NMR- Spektrum stimmte gut mit dem in der Literatur angegebenen Spektrum überein.
[Schmidt et al., Liebigs Ann. Chem., 191: 121 (1991)]. ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,22 (3H, 3, J 10,0 Hz, 6-CH&sub3;), 1,91, 1,99, 2,19 (jeweils 3H, s, 3 · OAc), 3,90 (1 H, dq, J 6,50, 7,50 Hz, H-5), 5,00-5,03 (m, H-3, Benzylprotonen), 5,03-5,12 (m, Benzylprotonen), 5,26 (1H, dd, J 1,00, 3,50 Hz, H-4), 5,27-5,33 (2H, m, H- 1,2). HRMS berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub1;O&sub1;&sub1;PCs (M+Cs)+ 683,0658, gefunden 683,0658.

(g) L-Fucose-1-ohosphat (Verbindung 5 oder 95)

Die Verbindung 9 oder 88 (5,0 g, 9,1 mmol) wurde über 5%PdIC (400 mg) in EtOH (70 mL) und N Natriumhydrogencarbonat (30 ml) unter Wasserstoffatmosphäre 3 Stunden lang bei Raumtemperatur hydriert, und der Katalysator wurde abfiltriert. Zu dem kalten Filtrat wurde N NaOH bei 0-5ºC zugegeben, bis die Lösung stark alkalisch wurde (> pH 13). Das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und durch die Zugabe von kalter N Essigsäure bis pH 7,5 neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert, auf 500 ml verdünnt, auf eine Säule aus Dowex 1-X8 [HCOO&supmin;]-Harz aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von Ammoniumbicarbonat (0-0,5 M) eluiert. Die passenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Überschüssiges Ammoniumbicarbonat wurde durch Zugabe von Dowex 50 X8 [H&spplus;]-Harz zu einer Lösung des lyophilisierten Pulvers in Wasser entfernt. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat wurde lyophilisiert. Eine Lösung des Produkts wurde durch eine Säule von Dowex 50 W-X8 [Na&spplus;] mit Wasser geleitet und lyophilisiert, wobei Verbindung 5 oder 95 (2,61 g, 99%) als Gemisch aus α und β (1 : 10, abgeschätzt anhand des ¹H-NMR) erhalten wurde. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit den in der Literatur angegebenen Spektren gut überein. [Nunez et al., Can. J. Chem., 59: 2086 (1981).]

Beispiel 2:

Chemische Synthese von GDP-Fucose (Verbindung 12) (Schema 7)

Die Verbindung 5 wurde zuerst in ihr Triethylammoniumsalz umgewandelt, indem sie durch eine Säule von Dowex 50 W-X8 [Et&sub3;NH&spplus;-Form] mit Wasser geleitet wurde, und lyophilisiert. Das lyophylisierte L-Fucose-1-phosphat-triethylammoniumsalz (Verbindung 10) (300 mg, 0,83 mmol) und Guanosin-5'-monophosphat-morpholidat (Verbindung 11; 600 mg, 0,83 mmol) wurden getrennt voneinander getrocknet, indem sie zweimal mit Pyridin gemeinsam verdampft wurden. Sie wurden anschließend mit trockenem Pyridin (20 ml) vereinigt und das Gemisch wurde 5 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt und konzentriert. Das Produkt wurde mit einer Säule von Sephadex 0-25 (superfein) (3 · 65 cm) zweimal mit Wasser gereinigt. Die passenden Fraktionen wurden zusammengegeben und durch eine Säule von Dowex 50 W-Xg (Na&spplus;) mit Wasser geleitet. Die Fraktionen wurden zusammengegeben und lyophilisiert, wobei Verbindung 12 0300 mg) gleichzeitig mit einer kleinen Menge von GMP (abgeschätzt anhand des ¹H-NMR) erhalten wurde. Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit dem in der Literatur angegebenen Wert gut überein. [Gokhale et al., Can. J. Chem., 68: 1063 (1990).]

Beispiel 3: Enzymatische Verfahren und Tests zum Umwandeln von Mannose-1-P in GDP-Fucose

(Schematische Darstellungen 9-11)

(a) Herstellung von GDP-Mannose-Pyrophosphorylase für die Umwandlung von Man-1-p in GDP-Mannose

Das Enzym zur Herstellung der GDP-Mannose ist GDP-Mannose-Pyrophosphorylase (GDP-ManPP), welche aus Hefe erhalten werden kann. Der größte Teil des GDP- ManPP aus der Hefe wurde durch Ammoniumsulfatfällung gewonnen (ungefähr 80%, verglichen mit dem zellfreien Rohextrakt), mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 0,1 Einheiten pro ml Enzymlösung.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde auf dem Medium wachsen gelassen: (g/l) Hefeextrakt, 5; Pepton, 10; pH 6,0. Die Kultur wurde bei 30ºC mit Schütteln über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit 50 mM Tris- Puffer (pH 7,5), welcher 2 mM MgCl&sub2; und 0,5 mM DTT enthielt, gewaschen. Die Zellen (ungefähr 10 g) wurden durch Glasperlen unter Verwendung einer Perlmühle (Beadbeater) (Bioseptic Products, OK) durch einen Puls mit Intervallen von 1 Minute 5 mal aufgeschlossen. Die Lösung wurde anschließend bei 4ºC bei 23000 g 1 Stunde lang zentrifugiert. Der Überstand (zellfreier Extrakt) wurde anschließend gesammelt und für die Enzymreinigung verwendet. Um das Enzym teilweise zu reinigen, wurden 40 bis 80% (bei 0ºC) der Ammoniumsulfatfällung gesammelt, indem langsam pulverisiertes Ammoniumsulfat zu dem zellfreien Extrakt bis zu einer 40%igen Sättigung zugegeben wurde, und bei 4ºC bei 15000 g 30 Minuten lang zentrifugiert und anschließend wurde zu dem Überstand weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer 80%igen Sättigung zugegeben. Nach der Zentrifugation wurde der Niederschlag gesammelt und in 20 ml 50 mM Tris-Puffer (pH 7,5), der 2 mM MgCl&sub2; und 0,5 mM DTT enthielt, wieder aufgelöst und in 41 des gleichen Puffers über Nacht (ungefähr 18 Stunden) bei 4ºC dialysiert. Die Aktivität dieser Zubereitung wurde auf ungefähr 0,1 U/ml auf der Grundlage des HPLC- Aktivitätstests abgeschätzt.

(b) Herstellung von GDP-Fucose-Syntheseenzymen für die Umwandlung von GDP-Mannose in GDP-Fucose

Der ursprüngliche Versuch, teilweise gereinigtes GDP-Fucose-Syntheseenzym (gesammelt nach der Ammoniumsulfatfällung) für die Umwandlung von GDP-Mannose in GDP-Fucose zu verwenden, war aufgrund der starken inneren Oxidation von NADPH nicht erfolgreich. Eine weitere Reinigung des Enzyms durch eine DEAD-Sepharose CL-6B-Säule führte zu einer höheren Aktivität des Enzyms sowie zu einer Abnahme der NADPH-Oxidationsaktivität. Auf der Grundlage des NADPH-Oxidationstests wurde geschätzt, daß die Enzymlösung auf dieser Stufe ungefähr 0,05 U/ml aufwies.
Die Zunahme der GDP-Fucosebildung wurde unter Verwendung des HPLC-Tests beobachtet. Nach 6-stündiger Reaktion wurde die Ausbeute an GDP-Fucose auf ungefähr 9%, bezogen auf das zugegebene Mannose-1-Phosphat, geschätzt. Es wird erwartet, daß eine höhere Ausbeute erhalten werden kann, wenn Enzymlösungen mit höheren Aktivitäten hergestellt werden können. Während der Reaktion wurde der Abbau von GDP-Mannose beobachtet. Dieser Abbau kann durch die Zugabe von Kaliumfluorid verhindert werden. Dies ist auf die Kontamination von anderen Enzymen in der Enzymzubereitung zurückzuführen. Wenn ein reines Enzym verwendet werden kann, ist die Zugabe eines Fluoridsalzes möglicherweise nicht erforderlich.
Die Bakterien Klebstella pneumonia ATCC 12658 wurden in 2 l eines Mediums wachsen gelassen, welches 10 g Casaminosäure (Difco), 5 g Hefeextrakt, 3 g K&sub2;HPO&sub4;, 1 g KH&sub2;PO&sub4; und 5 g D-Glucose pro Liter enthielt (pH 7,0). Nach einer 18 Stunden langen Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation (10000 · g, 50 Minuten, 4ºC) geerntet und in 50 mM Tris-Puffer, der 0,5 mM DTT enthielt (pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen wurden durch eine French-Druckzelle bei 1,1 · 10&sup8; Pa (16000 lb/in) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch 60 Minuten lange Zentrifugation bei 23000 · g entfernt und der Überstand (zelifreier Extrakt) wurde für die Enzymreinigung verwendet. Der zelifreie Extrakt (50 ml) aus einer 2 Liter-Kultur wurde mit 60 mg Protaminsulfat behandelt und der sich dabei ergebende Niederschlag wurde nach der Zentrifugation entfernt. Anschließend wurde festes Ammoniumsulfat zugegeben, wobei langsam gerührt wurde, bis eine Sättigung von 70% erreicht ist (0,436 g/ml bei 0ºC). Nach der Zentrifugation wurde der Niederschlag gesammelt und in 20 ml des Puffers (50 mM Tris, das 0,5 mM DTT enthielt, pH 7,5) resuspendiert und über Nacht (ungefähr 18 Stunden) bei 4ºC in 4 l des gleichen Puffers dialysiert. Die sich dabei ergebende Lösung (20 ml) wurde anschließend durch die DEAE-Sepharose CL-6B Säule (Pharmacia) (3 · 30 cm) geleitet, welche zuvor mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 mM NaCl in dem gleichen Puffer (insgesamt 400 ml) eluiert. Die aktive Fraktion wurde vereinigt und in 2 l 50 mM Tris-Puffer, der 0,5 mM DTT enthielt, (pH 7,5) dialysiert. Diese Enzymzubereitung wurde für die Synthese direkt verwendet. Die Aktivität wurde, anhand von IPCL und NADH-Oxidationstest, auf ungefähr 0,5 U/ml geschätzt.

(c) Test der Enzymaktivität

Ein HPLC-System wurde verwendet, um die Bildung von GDP-Man und GDP-Fucose zu bestimmen. Die Säule Partisil 5 SAX (Whatman Co.), 4,6 · 12,5 cm mit einer Teilchengröße von 5 um wurde verwendet. Der mobile Puffer war ein 0,1 M Phosphatpuffer (pH 3,5) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute (Druck 4,1 MPa [600 psi]). Die Verbindungen wurden durch einen UV-Detektor bei 254 nm nachgewiesen. Die Retentionszeit für GDP-Mannose betrug ungefähr 8, 9 Minuten und für GDP-Fucose ungefähr 13 Minuten. Die Aktivität der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurde durch Beobachtung der Bildung von GDP-Mannose aus α-Mannose-1-phosphat und GTP durch HPLC- Analyse getestet. Der Reaktionsansatz enthielt 10 umol Tris-HCl, 1 umol α-Mannose-1- phosphat, 1 umol GTP und teilweise gereinigtes Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Nach der Inkubation bei 30ºC während eines Zeitraums, der von der Enzymaktivität abhängt, wurde der Reaktant (100 ul) entnommen und durch eine Ultrafree-Filtereinheit (Ausschluß MG 10000, Millipore) zentrifugiert. Das Filtrat (5 ul) wurde anschlie ßend in die HPLC injiziert, um die Bildung von GDP-Mannose zu messen. Die Quantifizierung der GDP-Mannose erfolgte anhand der GDP-Mannose-Standardlösung, die aus gereinigter GDP-Mannose (Sigma) hergestellt worden war. Eine Einheit entspricht 1 umol GDP-Mannose, die pro Minute unter den Testbedingungen gebildet wurde.
Die Aktivitätsmessung für die Umwandlung von GDP-D-Mannose in GDP-L-Fucose kann entweder durch die spektralphotometrische Bestimmung der NADPH-Oxidation oder durch direktes Messen der Bildung von GDP-L-Fucose durch ein HPLC-Verfahren erfolgen. Da die Enzymzubereitungen eine NADPH-Oxidaseaktivität enthalten, ist es erforderlich, gleichzeitig die Geschwindigkeit der NADPH-Oxidation in Abwesenheit des Substrats zu bestimmen. In zwei Küvetten wurde 1 ml des 50 mM Tris-Puffers (pH 7,5) welcher 0,2 umol NADPH und Enzymlösung enthielt, und zu der anderen Küvette 0,1 umol GDP-Mannose zugegeben. Die Geschwindigkeit der Abnahme der optischen Dichte der beiden Küvetten bei 340 nm wurde bestimmt. Der Unterschied der Geschwindigkeit der NADPH-Oxidation ist die Messung des Umwandlungsprozeßes. Die Fig. 1 zeigt einen typischen Test, bei dem die Extinktions-Linie A die Kontroll-Küvette ohne GDP-Mannose ist und die Linie B die gleiche Lösung ist, welche außerdem 1 umol GDP-Mannose enthält. Eine Einheit ist gleich 1 umol NADPH-Oxidation pro Minute unter den Testbedingungen.
Für einen HPLC-Test war das Reaktionsmedium 1 ml Tris-Puffer (pH 7,5), der 1 umol GDP-D-Mannose, 0,2 umol NADPH, 2 umol KF, 2 U T. brokü-Alkoholdehydrogenase, 10 ul Isopropanol und die passende Enzymlösung enthielt. Nach der Inkubation während eines bestimmten Zeitraums (1 Stunde), wurden 100 ul des Reaktanten entnommen und durch eine Ultrafree-Filtereinheit (Ausschluß MG 10000, Millipore) zentrifugiert. Das Filtrat (5 ul) wurde anschließend in die HPLC eingespritzt, um die Bildung von GDP-Fucose zu messen. Die Quantifizierung der GDP-Fucose erfolgte anhand des GDP-Fucose-Standards, der aus gereinigter GDP-Fucose (Sigma) hergestellt worden war. Eine Einheit entspricht 1 umol GDP-Fucose, die pro Minute unter den Testbedingungen gebildet wurde. Die Fig. 2 zeigt drei beispielhafte HPLC-Diagramme zum Zeitpunkt 0 (A), ungefähr 3 Stunden (B) und ungefähr 6 Stunden (C) nach dem Beginn der Reaktion. Wie vorstehend bereits angemerkt wurde, eluiert GDP-Mannose bei ungefähr 8, 9 Minuten, wogegen GDP-Fucose bei ungefähr 13 Minuten eluiert.

Beispiel 4:

Enzymatische Synthese von GDP-Fucose aus Mannose-1-Phosphat

Zu 5 ml der Reaktionslösung wurden 5 umol Man-1-phosphat, 1 umol NADPH, 5 umol GTP, 5 umol PEP, 100 U Pyruvatkinase, 50 ul Isopropanol, 5 U T. brokü-Alkoholdehydrogenase, 1 umol MgCl&sub2;, 100 U anorganische Phosphatase, 5 umol KF, 0,1 U GDP-Mannose-Pyrophosphatase-Lösung und 0,05 U GDP-Fucose-Syntheseenzyme zugegeben und bei 30ºC 6 Stunden lang inkubiert, die Bildung von GDP-Fucose wurde durch einen HPLC-Test bestimmt.

Beispiel 5:

Herstellung von Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc unter Verwendung der in situ-Erzeugung von GDP-Fuc

Ein Gemisch aus dem GTP-Na-Salz (6,0 mg, 10 umol), Man-1-P-K-Salz (3,5 mg, 10 umol), Galβ1,3GlcNAc (3,8 mg, 10 umol), NaF (0,42 mg, 10 umol), NADPH (9,4 mg, 10 umol) PEP-K-Salz (4,1 mg, 20 umol), MgCl&sub2;-6H&sub2;O (2,6 mg, 10 umol), MnCl&sub2;-4H&sub2;O (2 mg, 10 umol), 2-Propanol (50 uL), ADH (12 U), PK (200 U), PPase (100 U), einer Rohenzymzubereitung von GDP-Mannose-Pyrophosphorylase (1,0 ml) und einer Rohenzymzubereitung von GDP-Fuc produzierendem Enzym (1,0 ml) in 100 mM Tris-Puffer (pH 7,5) wurde auf 3 ml verdünnt. α1,3/4-Fucosyltransferase (0,01 U) wurde zu dem Gemisch zugegeben und das resultierende Gemisch wurde unter Ar drei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde auf eine Säule von Dowex 1-X8 [OH&supmin;]-Form, gefolgt von einer Säule von Dowex 50 W-X8 [H&spplus;] mit Wasser aufgegeben. Die Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Das zurückbleibende Material wurde mit einer Säule von Sephadex G-25 (superfein) mit Wasser gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, um Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc zu erhalten. Sein ¹H-NMR-Spektrum war in guter Überein stimmung mit dem in der Literatur angegebenen Spektrum [Dumas et al., Biomed. Chem. Lett., 1: 425 (1991).]

Beispiel 6:

Chemische Synthese von Mannose-1-phosphat (Verbindung 18 oder 93: Schema 9)

(a) 1, 2.3,4,6-Penta-O-acetyl-D-mannose (Verbindung 14 oder 65)
D-Mannose (Verbindung 13; 5,0 g, 27,8 mmol wurde in wasserfreiem Pyridin (30 ml) aufgelöst und in einem Eisbad auf 0-5ºC gekühlt. Essigsäureanhydrid (20 ml) wurde langsam zu der Lösung zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 8 Stunden lang rühren gelassen. Das Gemisch wurde in Eiswasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden nacheinander mit kalter Chlorwasserstoffsäure, Wasser, kaltem gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser, gesättigtem Natriumchlorid und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Schicht wurde im Vakuum konzentriert und für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Verbindung 14 oder 65; 10,6 g, 98% Ausbeute, reines α-Isomer.

(b) 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-mannose (Verbindung 15 oder 72)

Das Pentaacetat (Verbindung 14 oder 65; 10,0 g, 25,6 mmol wurde in Tetrahydrofuran gelöst und 1,5 Äquivalente Benzylamin (4,6 ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen Tag lang gerührt. Es wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und nacheinander mit kalter Chlorwasserstoffsäure, Wasser, kaltem gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser, kaltem gesättigtem Natriumchlorid und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der zurückbleibende Sirup wurde auf Silicagel mit Ethylacetat : Hexan (2 : 3, Vol./Vol.) chromatographiert, wobei Verbindung 15 oder 72 erhalten wurde (7,8 g, 87% Ausbeute, reines α-Isomer) ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 2,00, 2,05, 2,11, 2,17 (3H, s, 4 · CH&sub3;CO), 4,01-4,15, (1H, m, 5-H), 4,21-4,29 (2H, m, 6-H), 5,24 (1 H, d, 1-H), 5,26-5,27 (1 H, m, 2-H), 5,30-5,34 (1H, d, J = 12,03 Hz, 4-H), 5,41-5,45 (1 H, dd, J 3,36, 9,99 Hz, 3-H).

(c) Dibenzylphosphityl-2.3.4,6-tetra-O-acetyl-D-mannosid (Verbindung 16 oder 79)

Das Mannose-tetraacetat (Verbindung 15 oder72) (1,5 g, 4,31 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (30 ml) gelöst und unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. 1,2,4-Triazol (1,5 g, 21,7 mmol) wurde in die Lösung zugegeben und gerührt, bis es sich auflöste. Zu der Lösung wurde Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit (10,0 g, 31 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang gerührt. 50 Milliliter Ether wurden zu der Lösung zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde nacheinander mit kaltem gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser, kaltem gesättigtem Natriumchlorid und Wasser extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der organische Extrakt wurde anschließend im Vakuum konzentriert und der zurückbleibende Sirup durch eine Silicagelsäule mit ETOAc-Hexan (1 : 4 Vol/Vol.) als Lösungsmittelsystem gereinigt (reines α-Isomer), um die Verbindung 16 oder 79 zu erhalten.
¹H-NMR (CDC13) δ: 2,0-2,3 (12H, 45, 4 · CH&sub3;CO), 3,92-3,98 (1 H, dd, 6-Ha), 4,05-4,1 (1H, m, 5-H), 4,18-4,24 (1 H, dd, 6-Hb), 4,85-5,12(4h m, CH&sub2;Ph), 5,22-5,24 (11H, m, 2-H), 5,28-5,32 (1 H, t, 4-H), 5,38-5,42 (1 H, dd, 3-H), 5,48-5,52 (1 H, dd, 1-H).

(d) Dibenzylphosphoryl-z.3.4,6-tetra-O-acetyl-D-mannosid (Verbindung 17 oder 86)

Die Verbindung 16 oder 79 wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und mit einem Trockeneis/Aceton-Bad auf -76ºC gekühlt und 30% Wasserstoffperoxid (7 ml) wurde zu der Lösung in einer einzigen Portion zugegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 90 Minuten lang gerührt. Das überschüssige Wasserstoffperoxid wurde durch Zugabe von eiskaltem Natriumthiosulfat neutralisiert. 100 ml Ether wurden anschließend zugegeben und die Extraktion erfolgte wie vorstehend beschrieben, um die Verbindung 17 oder 86 zu ergeben, welche für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

(e) D-Mannose-1-ohosphat (Verbindung 18 oder 93)

Die Verbindung 17 oder 86 wurde über 5% PdIC (400 mg) in Ethanol (30 ml) und in Natriumbicarbonat (10 ml) unter einer Wasserstoffatmosphäre 2 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde konzentriert. Natriumhydroxid wurde tropfenweise zu dem Rückstand bei 0-5ºC zugegeben, bis der pH des Reaktionsgemisches über 12 lag. Das Gemisch wurde drei Stunden lang bei 4ºC gerührt und anschließend durch die Zugabe von kalter N Essigsäure bis pH 7,2 neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert, auf 400 ml verdünnt, auf eine Dowex 1-X8 Säule (HCOO&supmin;-Form, 2 x 28 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von Ammoniumbicarbonat (0-0,6 M) eluiert. Die Fraktionen, welche D-Mannose-1-phosphat enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Überschüssiges Ammoniumbicarbonat wurde durch Waschen des lyophilisierten Pulvers mit Dowex 50 W-X8 (Wasserstoff-Form) entfernt, wobei Verbindung 18 oder 93 als Dinatriumsalz erhalten wurde.

Beispiel 7: Enzymatische Halohydratisierungen (Halohydrations)

A. Alhemeines Verfahren für Chlorperoxidase-katalysierte Halohydratisierung (Schematische Darstellunoen 3. 4 und 4a):

Ein Reaktionsgemisch, das 20 ml Citronensäure-Phosphat-Puffer (pH 3), 1 mmol Glycal, 5 mmol Kaliumhalogenid und 1170 Einheiten des Enzyms enthielt, wurde mit 600 gl H&sub2;O&sub2; (30%) versetzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang (lodhydratisierung), 3 Stunden lang (Bromhydratisierung) oder 3 Tage lang (Chlorhydratisierung) bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und Methanol wurde zu dem Rückstand zugegeben. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels C8-Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, wobei 2-Desoxy- 2-halogen-zucker erhalten wurden. Die Produkte wurden durch ein Standardverfahren (Pyridin, katalytische Menge von 4-Dimethylaminopyridin, Essigsäureanhydrid, 1 Tag) in Peracetate umgewandelt und durch Silicagel-Säulenchromatographie für die Charakterisierung gereinigt.

(1) Peracetat von Verbindung 20

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: α-Isomer: 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,21 (3H, s), 4,05 (1 H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,08 (1 H, dd, J = 3,5, 11 Hz, H-2), 4,28 (1 H, ddd, J = 2, 4, 10 Hz, H-5), 4,31 (1 H, dd, J = 4, 12,5 Hz, H-6), 5,09 (1 H, dd, J = 9, 10 Hz, H-3), 5,52 (1 H, dd, J = 9, 11 Hz, H-4), 6,36 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-1) ppm.
β-Isomer: 2,03 (3H, s), 2,09 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,18 (3H, s), 3,88 (1H, ddd, J = 2,4, 4, 5, 10,5 Hz, H-5), 3,90 (1 H, dd, J = 9, 10,5 Hz, H-2), 4,11 (1 H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,32 (1 H, dd, J = 4, 5, 12,5 Hz, H-6), 5,03 (1 H, dd, J = 9, 10 Hz, H-3), 5,34 (1 H, dd, J = 9, 10,5 Hz), 5,81 (1H, d, J = 9 Hz, H-1) ppm. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,52-20,67 (4 · C), 47,50, 62,10, 68,46, 72,85, 74,36, 93,11, 167,91-172,10 (4 · C) ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 433,0110/435, gefunden 433,0112/435.

(2) Peracetat von Verbindung 21

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: α-Isomer: 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,19 (1 H, ddd, J = 2,5, 4, 5, 10,5 Hz, H-5), 4,17 (1 H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz, H-6), 4,23 (1 H, dd, J = 4, 5, 12,5 Hz, H-6), 4,43 (1 H, dd, J = 2, 4 Hz, H-2), 5,21 (1 H, dd, J = 4, 9,5 Hz, H-4), 5,45 (1 H, t, J = 10 Hz, H-4), 6,32 (1 H, d, J = 2 Hz, H-1) ppm.
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,60, 20,66, 20,75, 20,86, 47,77, 61,82, 85,54, 68,75, 71,25, 93,11, 167,20-171,90 (4 · C) ppm.
β-Isomer: 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,18 (3H, s), 3,82 (1H, ddd, J = 2,5, 5, 9,5 Hz, H-5), 4,13 (1 H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,27 (1 H, dd, J = 5, 10,5 Hz, H-6), 4,60 (1 H, dd, J = 3,5, 1,5 Hz, H-2), 5,00 (1 H, dd, J-4, 9,5 Hz, H-3), 5,43 (1 H, t, J-9,5 Hz, H-4), 5,74 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1) ppm. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,60-20,85 (4 · C), 51,05, 61,82, 65,27, 71,01, 73,04, 90,01, 167,20-171,90 (4 · C) ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 433,0110/435, gefunden 433,0115/435.

(3) Peracetat von Verbindung 22

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: β-Isomer: 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,16 (3H, s), 2,19 (3H, s), 4,08 (1H, dd, J = 9, 11,5 Hz, H-2), 4,10-4,15 (3H, m, 2 · H-6 & H-5), 5,15 (1H, dd, J = 3, 11,5 Hz, H-3), 5,35 (1 H, d, J = 3 Hz, H-4), 5,84 (1 H, d, J = 9 Hz, H-1) ppm. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,42, 20,52, 20,61, 20,66, 46,35, 60,89, 67,03, 71,94, 72,78, 93,43, 168,31-170,90 (4 x C) ppm. α-Isomer: ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,42-20,66 (4 · C), 44,39, 67,04, 67,69, 68,64, 69,39, 91,05, 167,01-170,86 (4 · C) ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 433,0110/435, gefunden 433,0119/435.

(4) Verbindung 23

¹H-NMR (CDCl&sub3;), β-Isomer: 1,12 (3H, d, J = 6,5, CH&sub3;), 3,45 (1H, dd, J = 1, 3 Hz, H-4), 3,52 (1 H, dd, J = 3, 10,5 Hz, H-3), 3,58 (1 H, qd, J = 1, 6,5 Hz, H-5), 3,69 (1 H, dd, J = 8,5, 10,5 Hz, H-2), 4,45 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-1). ¹³C-NMR (CDC13), β-Isomer: 16,71, 58,04, 72,13, 73,56, 76,03, 98,78 ppm. β-Isomer: 16,71, 54,71, 67,25, 71,13, 74,55, 94,20 ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 248,9738/251, gefunden 248,9730/251.

(5) Peracetat von Verbindung 25

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: β-Isomer: 2,05 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,16 (3H, s), 2,18 (3H, s), 4,06 (1 H, dd, J = 9, 11,5 Hz, H-2), 4,07-415 (3H, m, 2 · H-6 & H-5), 5,09 (1 H, dd, J = 3, 11,5 Hz), 5,39 (1 H, d, J = 3 Hz, H-4), 5,75 (1 H, d, J = 9 Hz, H-1) ppm. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;), β-Isomer: 20,21-22,55 (4 · C), 55,30, 60,87, 66,84, 71,86, 72,74, 93,53, 168,20-180,21 (4 x C) ppm. α-Isomer: 20,1-22,55 (4 · C), 53,46, 61,04, 67,44, 68,67, 69,51, 90,94, 168,20-180,21 (4 · C) ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 389,0615/391, gefunden 389,0610/391.

(6) Peracetat von Verbindung 27

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: β-Isomer: 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,06- 4,17 (4H, m, H-2, 2 · H-6 & H-5), 5,13 (1H, dd, J = 3,5, 10 Hz, H-3), 5,25 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-4), 5,91 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-1) ppm. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;), β-Isomer: 20,5-22,50 (4 x C), 24,98, 60,94, 67,10, 72,16, 74,10, 94,15, 168,20-179,36 (4 x C) ppm; α-Isomer: 20,5-22,50 (4 · C), 29,87, 60,63, 67, 68, 68,31, 69,42, 92,16, 168,20-179,36 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na&spplus;): berechnet 480,9972, gefunden 480,9999.

B. Chlorperoxidase-katalysierte Halohydratisierung von Disaccharidglycalen und Sialal

(1) Halohydratisierung von Verbindung 28 (Schema 4)

40 Mikroliter 30%iges H&sub2;O&sub2; wurden zu einem Gemisch aus Verbindung 28 (20 mg, 0,065 mmol) KBr (38,6 mg, 0,32 mmol) und Chlorperoxidase (76 Einheiten) in Citratpuffer (1,4 ml; pH 3) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und MeOH wurde zu dem Rückstand zugegeben. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit einer Cs-Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, wobei ein Gemisch aus D-Galactopyranosyl-β(1,3)-2-brom-2-desoxy-D-glucopyranose, Verbindung 29, (10 mg) und D-Galactopyranosyl-β(1,3)-2-brom-2-desoxy-Dmannopyranose, Verbindung 30 (10 mg) mit 76% Ausbeute erhalten wurde. Die Produkte wurden mit Ac&sub2;O und Pyridin in Anwesenheit einer katalytischen Menge von DMAP für die Charakterisierung acetyliert.

(2) Chlorperoxidase-katalysierte Halohydratisierung von 2,3-Dehydro-N-acetylneuraminsäure (Verbindung 35) (Schema 3)

100 Mikroliter 30%iges H&sub2;O&sub2; wurden zu einem Gemisch aus Verbindung 34 [Meindl, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1350: 1088 (1969); 50 mg, 0,17 mmol] KBr (102 mg, 0,857 mmol) und Chlorperoxidase (200 Einheiten) in Citratpuffer (3,5 ml; pH 3) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur leicht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und MeOH wurde zu dem Rückstand zugegeben. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit einer BioGel P-2- Säule gereinigt und überdies mit einer C&sub8;-Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromato graphie CH&sub3;CN/H&sub2;O (5 : 1) gereinigt, wobei 2-Brom-2-desoxy-N-acetylneuraminsäure (Verbindung 35 (43 mg, 65 Prozent) erhalten wurde. Das Produkt wurde mit Ac&sub2;O und Pyridin in Anwesenheit einer katalytischen Menge von DMAP peracetyfiert, gefolgt von einer Methylierung mit Mel und Cs&sub2;CO&sub3; für die Charakterisierung.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,95, 2,04, 2,05, 2,10, 2,19, 2,20, (3H, s, jeweils, OAc und NHAc), 3,83 (3H, s, COOCH&sub3;), 4,11 (1 H, ddd, J = 8,7, 10,6, 10,7 Hz, H-5), 4,22 (1 H, dd, J = 6,4, 12,5 Hz, H-9), 4,32 (1 H, dd, J-1,8, 10,6 Hz, H-6), 4,57 (1 H, dd, J = 5,15 (1 H, ddd, J = 2,4, 5, 5, 6,4 Hz, H-8), 5,31 (1 H, dd, J = 1,8, 5,5 Hz, H-7), 5,43 (1 H, d, J = 8,7 Hz, NH), 5,67 (1 H, dd, J = 3,8, 10,7 Hz, H-4). HRMS: berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub0;NO&sub1;&sub4;BrCs (M+Cs&spplus;) 743,9904/746, gefunden 743,9900/746.

(3) 1,3.6,2',3',4',6'-Heptaacetyl-D-galactopyranosyl-β(1,4)-2-brom-2- desoxvglycopyranose (Verbindung 32) und -2-desoxymannopyranose (Verbindun4 33)

Gemäß der allgemeinen Verfahrensweise wurde ein 1 : 1-Gemisch von Verbindung 32 und Verbindung 33 (155 mg, 71%) aus Galb(1,4)Glucal (Verbindung 31) (96,5 mg) erhalten. Das Verhältnis der Verbindungen 32 und 33 wurde aus dem Integralverhältnis der anomeren Protonen der Verbindungen 32 und 33 bestimmt. Die Verbindungen 32 und 33 wurden als α : β-Anomeren-Gemische erhalten: Verbindung 32 (α : β = 1 : 3), Verbindung 33 (α : β = 2 : 1).
HRMS von Verbindung 32 und Verbindung 33: berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;O&sub1;&sub7;BrCs (M+Cs&spplus;) 831,0112/833, gefunden 831,0112/833.
¹H-NMR des Gemisches der Verbindungen 32 und 33: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 1,96, 1,97, 1,98, 1,981, 2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,070, 2,074, 2,075, 2,08, 2,12, 2,13, 2,132, 2,15, 2,16, 2,166, (-OCH&sub3;), 3,84 (dd, J = 1,6, 9,0 Hz, H-2 von Glu des β-Anomers von Verbindung 32), 3,73-4,22 (m), 4,40 (dd, J = 2, 2, 3,8 Hz, H-2 des α-Anomers von Verbindung 33), 4,43-4,47 (m), 4,46 (dd, J = 1,0, 7,6 Hz), 4,55 (d, J = 8,0 Hz), 4,57 (dd, J = 1,6, 4,0 Hz, H-2 des α-Anomers von Verbindung 33), 4,59 (d, J = 8,0 Hz), 4,93 (dd, J = 3,5, 5,1 Hz), 4,96 (dd, J = 3,5, 4,96 Hz), 4,99 (dd, J = 3,5, 10,5 Hz, H-3' des β-Anomers von Verbindung 32, 5,03 (dd, J = 3,8, 8,8 Hz), 4,07-5,12 (m), 5,16 (dd, J = 8,0, 10,5 Hz), 5,20-5,26 (m), 5,35-5,38 (m), 5,70 (d, J = 1,6, H-1 des β-Anomers von Verbindung 33), 5,76 (d, J = 9,0 Hz, H-1 des β-Anomers von Verbindung 32), 6,26 (d, J = 2,2 Hz, H-1 des α-Anomers von Verbindung 33), 6,30 (d, J = 3,4 Hz, H-1 des α-Anomers von Verbindung 32). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) 20,52, 20,61, 20,65, 20,75, 20,80, 20,84, 20,88, 20,93, 46,27, 47,95, 48,13, 51,26, 60,77, 60,91, 61,08, 61,49, 61,67, 61,79, 62,04, 66,56, 66,62, 66,71, 66,75, 68,97, 69,03, 69,09, 69,14, 69,30, 70,68, 70,72, 70,75, 70,78, 70,82, 70,86, 70,91, 70,94, 70,98, 71,16, 71,73, 73,44, 73,68, 73,80, 74,13, 74,29, 76,32, 76,61, 89,77, 90,34, 92,98, 93,13, 100,84, 101,19, 101,45, 168,42, 168,45, 168,53,168,92, 169,14, 169,22, 169,36, 169,59, 169,65, 170,08, 170,13, 170,16, 170,29, 170,36, 170,46.

(4) 1,3,6,2',3',4',6'-Heptaacetyl-D-galactopyranosyl-β(1,3)-2-brom-2- desoxyglucopyranose (Verbindung 29) und -2-desoxymannopyranose (Verbindung 30)

Gemäß der allgemeinen Verfahrensweise wurde ein 1 : 1-Gemisch (Verbindungen 29 und 30) (66 mg, 76 Prozent) aus Galb(1,3)Glucal (Verbindung 28) (38,6 mg) erhalten. Die Verbindungen 29 und 30 wurden durch Silicagel-Säulenchromatographie (AcOEt/n-Hexan, 5/2) als α : β-Anomeren-Gemische isoliert: Verbindung 29 (α : β = 1 : 10), Verbindung 30 (α : β = 12 : 5).
β-Anomer von Verbindung 29: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,98, 2,04, 2,07, 2,08, 2,09, 2,15, 2,17 (jeweils 3H, s, OAc x 7), 3,78 (1 H, ddd, J = 1,8, 4,6, 9,7 Hz, H-5 von Glu), 3,85 (1 H, t, J = 9,5 Hz, H-2 von Glu), 3,89 (1 H, t, J = 7 Hz, H-5 von Gal), 3,96 (1 H, t, J = 10,0 Hz, H-3 von Glu), 4,07 (1 H, m, H-6 von Gal), 4,09 (1 H, dd, J = 1,8, 12,4 Hz, H-6 von Glu), 4,13 (1H, dd, J = 7,0, 11,1 Hz, H-6 von Gal), 4,25 (1H, dd, J = 4,6, 12,4 Hz, H-6 von Glu), 4,89 (1 H, d, J = 7,7 Hz, H-1 von Gal), 4,97 (1 H, t, J = 9,6 Hz, H-4 von Glu), 5,03 (1 H, dd, J = 3, 4, 10,0 Hz, H-3 von Gal), 5,13 (1 H, dd, J = 7, 7, 10,0 Hz, H-2 von Gal), 5,36 (1 H, d, J = 3,4 Hz, H-4 von Gal), 5,75 (1 H, d, J = 9,0 Hz, H-1 von Glu).
HRMS: berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;C&sub1;&sub7;BrCs (M+Cs&spplus;) 831,0112/833, gefunden 831,0112/833.
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,55, 20,64, 20,68, 20,71, 20,75, 20,96, 50,11, 60,93, 61, 62, 66,73, 68,53, 68,96, 70,62, 70,82, 72,87, 77,21, 81,30, 92,86, 101,61, 168,77, 169,03, 169,35, 170,13, 170,20, 170,36, 170,67.
α-Anomer von Verbindung 30: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ:
4,24 (1 H, bd, J = 3,0 Hz, H-2 von Man), 4,55 (1 H, d, J = 8,0 Hz, H-1 von Gal), 5,01 (1 H, dd, J = 3, 4, 10,5 Hz, H-3 von Gal), 5,18 (1 H, dd, J = 7, 8, 10,5 Hz, H-2 von Gal), 5,32 (1 H, t, J = 8,7 Hz, H-4 von Man), 5,39 (1 H, dd, J = 1,0, 3,4 Hz, H-4 von Gal, 6,30 (1 H, d, J = 3,0 Hz, H-1 von Man).
β-Anomervon Verbindung 30: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ:
4,45 (1 H, dd, J = 2,0, 3,5 Hz, H-2 von Man), 4,55 (1 H, d, J = 8,0 Hz, H-1 von Gal), 5,01 (1 H, dd, J = 3, 4, 10,5 Hz, H-3 von Gal), 5,20 (1 H, dd, J = 7, 8, 10,5 Hz, H-2 von Gal), 5,30 (1 H, t, J = 7,4 Hz, H-4 von Man), 5,39 (1 H, dd, J = 1,0, 3,4 Hz, H-4 von Gal), 5,80 (1 H, d, J = 2,0 Hz, H-1 von Man).
HRMS: berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;O&sub1;&sub7;BrCs (M+Cs&spplus;)
831,0112/833, gefunden 831,0110/833.
¹³C-NMR 20,57, 20,65, 20,76, 20,87, 20,95, 21,01, 21,04, 48,21, 60,98, 61,19, 62,01, 62,61, 66,75, 66,82, 68,43, 68,52, 70,71, 70,88, 71,05, 72,03, 73,36, 74, 74, 75,93, 77,23, 90,08, 92,80, 100,10, 100,24, 168,23, 169,13, 169,22, 169,73, 170,18, 170,40.

(5) Sialyl-α(1,3)Galβ(1,4)[Fucα(1,3)1-2-brom-2-desoxyglucopvranose (Verbindung 37a) und -2-Brom-2-desoxymannopyranose (Verbindung 37b)

Gemäß der allgemeinen Verfahrensweise wurde ein 1 : 1-Gemisch der Verbindungen 37a und 37b (3,5 mg, 56 Prozent) aus NeuAc(2, 3)Galβ(1,4)[Fucα(1,3)]glucal Verbin dung 36 (5,5 mg) erhalten. Das Verhältnis der Verbindungen 37a und 37b wurde aus dem integrierten Verhältnis der Methylprotonen von Fucose bestimmt.
1H-NMR des Gemisches der Verbindungen 37a und 37b: ¹H-NMR (D&sub2;O) δ 1,17 (d, J = 6,0 Hz, CH&sub3; von Fuc), 1,18 (d, J = 6,0 Hz, CH&sub3; von Fuc), 1,80 (t, J = 12,7 Hz, H-3ax von NeuAc), 2,02 (s, NHAc), 2,75 (dd, J = 5,0, 12,7 Hz, H-3 eq von NeuAc), 3,45-4,13 (m), 4,48 (d, J = 8,0 Hz, H-1 von Gal), 4,49 (d, J = 8,0 Hz, H-1 von Gal), 5,0-5,04 (m), 5,18-5,22 (m), 5,38-4,42 (m).

Beispiel 8:

Allgemeine Verfahrensweise für die Bromhvdratisierung mit NBS

Zu einer Lösung von 1 mmol Glucal in einem Gemisch aus 3,6 ml CH&sub3;CN - 1,5 ml H&sub2;O wurde 1 mmol N-Bromsuccinimid (NBS) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei der gleichen Temperatur fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde an einer Silicagel- Säulenchromatographie chromatographiert. Die Produkte wurden durch Pyridin und Essigsäureanhydrid in Gegenwart einer katalytischen Menge von 4-Dimethylaminopyridin in Peracetate umgewandelt und durch eine Silicagel-Säulenchromatographie für die Charakterisierung gereinigt.

(a) 1,3,6,2',3',4',6'-Heptaacetyl-D-galactopyranosyl-O(1,4)-2-brom-2- desoxyglucowranose (Verbindung 32) und -2-Desoxymannopyranose (Verbindung 33)

Gemäß der allgemeinen Verfahrensweise wurde ein 1 : 2,5-Gemisch der Verbindungen 32 und 33 (30 mg, 78 Prozent) aus Galβ(1,4)Glucal (Verbindung 31) (17 mg) erhalten. Das Verhältnis der Verbindungen 32 und 33 wurde aus dem integrierten Verhältnis der anomeren Protonen bestimmt. Die Verbindungen 32 und 33 wurden als α : β-Anomeren- Gemische erhalten: Verbindung 32 (α : β = 3 : 5), Verbindung 33 (α : β = 5 : 2).

(b) Methyl-5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3-brom-3,5-didesoxy-β-Derythro-L-manno-2-nonulopyranosonat (Methylperacetyl-Verbindung 35, Verbindung 35a) und Methyl-5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3- brom-3,5-didesoxy-α-Derythro-L-gluco-2-nonulopyranosonat (Verbindung 35b)

Die chemische Bromhydratisierung erfolgte gemäß der allgemeinen Verfahrensweise und die Produkte wurden in Peracetäte umgewandelt, gefolgt von einer Veresterung mit Methyliodid in Gegenwart einer äquimolaren Menge von Cäsiumcarbonat, um ein Gemisch aus den Verbindungen 35a und 35b (155 mg, 74%) zu erhalten. Das Herstellungsverhältnis der Verbindungen 35a und 35b wurde aus dem Integralverhältnis der Methylesterprotonen bestimmt.
Die ¹H-NMR-Spektren der Verbindungen 35a und 35b stimmten gut mit früheren Litersturangaben überein.
Verbindung 35b: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,90, 2,03, 2,08, 2,10, 2,12, 2,15 (3H, s, jeweils, OAc und NHAc), 3,78 (3H, s, COOCH&sub3;), 4,04 (1 H, dd, J = 6,0, 12,4 Hz, H-9), 4,09 (1 H, d, J = 10,0 Hz, H-3ax), 4,33 (1 H, ddd, J = 10,0, 10,6, 10,7 Hz, H-5), 4,36 (1 H, dd, J = 2,4, 12,4 Hz, H-9'), 5,10 (1H, ddd, J = 2,4, 6,0, 6,1 Hz, H-8), 5,25 (1H, dd, J = 2,5, 10,7 Hz, H-6), 5,30 (1 H, dd, J = 10,0, 10,6 Hz, H-4), 5,38 (1 H, dd, J = 2,5, 6,1 Hz, H-7), 5,90 (1 H, d, J = 10,0 Hz, NH).

Beispiel 9:

Expression von Galβ1,3/4GlcNAc-α2 3-Sialyltransferase

Die Expression einer löslichen Galβ1,3/4GlcNAc-α2,3-sialyltransferase in hoher Ausbeute wurde in einem Baculovirus-Expressionssystem zustandegebracht, wobei cDNA verwendet wurde, die für ein Fusionsprotein zwischen dem Prä-Insulin-Signalpeptid und der katalytischen Domäne der Sialyltransferase kodiert. Die cDNA, welche für das Fusionsprotein kodiert, wurde von Wen et al. in dem Plasmidvektor pGIR199 konstruiert. [Huseh et al., J. Biol. Chem. 261: 4940 (1986)]. Um ein DNA-Fragment zu isolieren, wel ches die gesamte kodierende Sequenz enthält, wurde die nur einmal vorkommende Eco RI-Stelle am 3'-Ende der Chimäre zuerst geschnitten, das überstehende Ende wurde entfernt, so daß ein glattes Ende vorhanden war, und daran wurden synthetische Linker ligiert, die eine Nhe 1-Stelle enthielten. Das resultierende Plasmid wurde mit Nhe 1 verdaut, um die Fusionsprotein-cDNA freizusetzen, und dieses Fragment wurde in die nur einmal vorkommende Nhe 1-Stelle in pBlueßac, einem Baculovirus-Expressionssystem- Transfervektor, unter der Kontrolle des Baculovirus-Polyhedrin-Promoters (Invitrogen; San Diego, CA) kloniert. Alle Manipulationen der rekombinanten DNA erfolgten unter den Bedingungen, die von den Gebrauchsanweisungen des Enzymherstellers empfohlen wurden, wobei Standardarbeitsweisen verwendet wurden. [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)].
Die Erzeugung des rekombinanten Baculovirus erfolgte unter Verwendung des MaxBac Expressionssystems (Invitrogen), wobei die vom Hersteller empfohlenen Arbeitsweisen genau befolgt wurden. Kurz gesagt, wurden das Plasmid und die Wildtyp-Virus-DNA vermischt und verwendet, um Sf-9 Zellen durch das Calcium-Phosphat-Verfahren zu transfizieren. Das rekombinante Virus wurde durch die transferierten Zellen hergestellt und in das Kulturmedium abgegeben und wiederholt durch Grenzverdünnung als Plaques gereinigt. Mehrere isolierte klonale Plaques wurden auf ihre Fähigkeit, die Sezernierung von α2,3-NeuT in das infizierte Zell-Medium zu veranlassen, hin untersucht, indem ein Aliquot der Medien in einem Sialyltransferase-Test direkt auf eine α2,3 NeuT- Aktivität hin überprüft wurde. Das Isolat, welches die höchsten Werte einer α2,3 NeuT- Sezernierung hervorrief, wurde als rBv2,3ST bezeichnet und durch Infektion von frischen Sf-9-Zellen auf 500 ml vermehrt. Die α2,3 NeuT-Aktivität wurde getestet unter Verwendung einer Modifikation des veröffentlichten Tests mit 0,9 mM. Diese Manipulationen sind im nachstehenden Schema 24 schematisch veranschaulicht. Schema 24

Beispiel 10:

Galβ1, 3GlcNAcβ1, 3Galβ1, 4Glc als Akzeptor

Um große Mengen von α2,3 NeuT herzustellen, wurde rBv2,3ST venrvendet, um Sf-9- Zellen in Monolayer-Kultur zu infizieren und ergab im allgemeinen 2 bis 3 Einheiten der α2,3 NeuT-Aktivität, welche pro 10a infizierten Zellen sezerniert wurden, wenn diese in Excell-400 Medien (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wachsen gelassen wurden. Die Einheiten der Aktivität (mmol/min) sind definiert durch die Multiplikation der Testergebnisse mit einem Faktor 1,6, um die Aktivität bei Vmax zu ergeben. Konditionierte Medien von rBv2,3ST-infizierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion gesammelt und das rekombinante α2,3 NeuT wurde in einem einzigen Chromatographieschritt teilweise gereinigt. Drei Liter α2,3-NeuT enthaltendes Medium wurden in einem Amicon CH2PRS- Spiralpatronensystem, das mit einer S1Y10-Patrone ausgestattet war, filtriert und auf ungefähr 250 ml konzentriert. Die Einheit wurde dann im Diafiltrationsmodus betrieben, um den konzentrierten Überstand mit 3 Volumina 10mM Kakodylsäure, 25 mM NaCl, 25 Prozent Glycerin, pH 5,3 (Puffer A) zu entsalzen. Die Proben wurden anschließend auf eine Säule (2,5 · 17 cm) von S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), welche mit Puffer A äquilibriert worden war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute aufgegeben. Nachdem die gesamte Probe aufgetragen worden war, wurde die Säule mit Puffer A gewaschen, bis der OD&sub2;&sub8;&sub0; -Wert der die Säule verlassenden Flüssigkeit auf die Grundlinie zurückgekehrt war (1,6 Säulenvolumina).
α2,3 NeuT wurde anschließend mit 50 mM Kakodylsäure, 1 M NaCl, 25 Prozent Glycerin pH 6,5 von der Säule eluiert. Fraktionen, die α2,3 NeuT enthielten, wurden vereinigt und über Nacht (ungefähr 18 Stunden) gegen 1 l 50 mM Kakodylsäure, 0,5 M NaCl, 50 Prozent Glycerin, pH 6,0 dialysiert und anschließend bei -20ºC gelagert.

Beispiel 11:

Galactosylierung

(a) LacNAcβOallyl von Verbindung 41: Schema 14)

Ein Gemisch aus Verbindung 40 [Lee et al., Carbohydr. Res., 37: 193 (1974)] (2,0 g, 7,65 mmol), Glc-1-P (2,74 g, 7,65 mmol), PEP (K-Salz), 1,6 g, 7,65 umol), NAD&spplus; (193 mg, 0,25 mmol), MnCl&sub2; · 4H&sub2;O (79,2 mg, 0,4 mmol), MgCl&sub2; · 6H&sub2;O (162,6 mg, 0,8 mmol), DTT (306 mg, 2 mmol), KCl (1,04 g, 15 mmol), NaN&sub3; (20 mg, 0,31 mmol) und UDP (90 mg, 0,19 mmol) in HEPES-Puffer (100 mM, pH 7,5; 200 ml) wurde mit 10 N und N NaOH auf pH 7,5 eingestellt und die Enzyme UDPGE (10 U), UDPGP (20 U), PK (100 U), GalT (5 U) und PPase (100 U) wurden zu der Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur (25ºC) 5 Tage lang leicht gerührt. Das Gemisch wurde konzentriert und auf Silicagel mit CHCl&sub3;-EtOAc- MeOH (5 : 2 : 2 bis 5 : 2 : 3) chromatographiert, um ein Disaccharid zu ergeben, welches mit Sephadex G-25, mit Wasser, weiter gereinigt wurde, um LacNAcβOallyl (Verbindung 41) (1,7 g, 50 Prozent) zu ergeben; ¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 2,00 (3H, s, NHAc), 3,49 (1H, dd, J 7,84, 9,97 Hz, H-2 von Gal), 3,52-3,57 (1 H, m, H-5 von GlcNAc), 3,63 (1 H, dd, J 3,31, 10,04 Hz, H-3 von Gal), 3,65-3,75 (8 H, m), 3,79 (1 H, dd, J 5,10, 12,27 Hz, H-6a von GlcNAc), 3,88 (1 H, br d, J 3,32 Hz, H-4 von Gal), 3,95 (1 H, dd, J 2,14, 12,27 Hz, H-6b von GlcNAc), 4,43 (1 H, d, J 7,81 Hz, H-1 von Gal), 4,55 (1 H, d, J 8,28 Hz, H-1 von GlcNAc), 5,21-5,29 (2H, m, Allyl), 5,83-5,90 (1H, m, Allyl), ¹³C-NMR (D&sub2;O) δ: 22,6, 55,5, 60,5, 61,5, 69,0, 70,9, 71,4, 72,9, 75,2, 75,8, 78,8, 100,4, 103,3, 118,6, 133,7.

(b) Von Schema 15, Verbindung 1-¹³C-41

Eine Lösung der Verbindung 40 (1,15 g, 4,4 mmol), 1-¹³C-Gal (99 Atomprozent, bezogen von Isotec Inc., Miamisburg, OH; 800 mg, 4,4 mmol), PEP-K-Salz (1,82 g, 8,8 mmol; 95 Prozent), UDP (90 mg, 0,19 mmol) ATP (100 mg, 0,18 mmol), Cystein (116 mg, 0,96 mmol), DTT (183 mg, 1,2 mmol), MgCl&sub2; · 6H&sub2;O (244 mg, 1,2 mmol), MnCl&sub2; ·4H&sub2;O (118 mg, 0,6 mmol), KCl (179 mg, 2,4 mmol) und Glc-1-P (77 mg, 0,22 mmol) in HEPES-Puffer (100 mM, pH 7,5; 120 ml) wurde durch 10 N und N NaOH auf pH 7,5 eingestellt und die Enzyme GK (10 U), PK(200 U), PPase (10 U), Gal-1-P UT (10 U), UDPGP (10 U) und GalT (10 U) wurden zu der Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur (ca. 25ºC) drei Tage lang leicht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde auf Silicagel mit EtOAc-MeOH (2 : 1) chromatographiert, um ein Disaccharid zu ergeben, welches mit einer Säule von Sephadex G-25, mit Wasser, weiter gereinigt wurde, um die Verbindung 1-¹³C-41 zu ergeben (106 g, 57 Prozent). ¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 2,00 (3H, s, NHAc), 3,48-3,52 (1 H, m, H-2 von Gal), 4,43 (1 H, dd, JH-1,H-28,32' JH-113C-1 162,33 Hz, H-1 von Gal), 4,54 (1 H, d, J 8,32 Hz, H-1 von GlcNAc). HRMS berechnet für ¹²C&sub1;&sub6;¹³CH&sub2;&sub9;NO&sub1;&sub1;Na (M+Na&spplus;) 447,1672, gefunden 447,1681.

(c) 2-Desoxy-D-galactopyranosyl-b(1,4)-2-acetamido-2-desoxyglycopyranose

Verbindung 41b

(36 Prozent): sowohl das ¹H-NMR-Spektrum des Heptaacetats als αuch das ¹³C-NMR- Spektrum von Verbindung 41a stimmen mit den in der Literatur angegebenen Spektren gut überein. [Thiem et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30: 1163 (1991)].

(d) 2-Amino-2-desoxy-D-galactopyranosyl-b(1,4)-2-acetamido-2-desoxyglucopyranose

(Verbindung 41b)

(12 Prozent): ¹H-NMR für das HCl-Salz (D&sub2;O) δ: 2,022, 2,024 (s, NHAc des α- und β-Anomers von GlcNAc), 3,17-3,23 (1 H, m, H-2 von GalN), 4,67 (d, J 7,53 Hz, H-1b von GlcNAc), 5,13 (d, J 1,54 Hz, H-1a von GlcNAc). HRMS berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub0;Na (M+Na&spplus;) 405,1485, gefunden 405,1489. Das ¹H-NMR der Acetatform stimmt mit dem in der Literatur angegebenen Spektrum gut überein. [Palcic et al., Glycobiology, 1: 205 (1991)].

(e) Ethyl-D-Galactopyranosyl-b(1,4)-2-azido-2-desoxy-D-glucopyranosid (Verbindung 41c)

In diesem Fall wurde DTT weggelassen, da die 2-Azido-Gruppe mit DTT zu dem entsprechenden Amin reduziert wurde. (15 Prozent): ¹H-NMR β-Anomer (D&sub2;O) δ: 1,22 (1 H, t, J 7,80 Hz, OCH&sub2;CH&sub3;), 3,27 (1H, J 8,33, 9,64 Hz, H-2 von GlcN&sub3;), 4,40 (1 H, d, J 7,81 Hz, H-1 von Gal), 4,55 (1 H, H 8,24 Hz, H-1 von GlcN&sub3;). HRMS berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub1;&sub0;Na (M+Na&spplus;) 418,1438, gefunden 418,1438.
Der Akzeptor, Ethyl-2-azido-2-desoxy-D-glucopyranosid wurde wie folgt hergestellt: Triacetyl-D-glucal wurde azidonitriert [Lemieux et al., Can. J. Chem., 57: 1244 (1979)] [NaN&sub3; und Ce(NH&sub4;)&sub2;(NO&sub3;)&sub6; in CH&sub3;CN] und acetolysiert (NaOAc in AcOH), um 2-Azido- 1,3,4,6-tetra-0-acetyl-2-desoxy-D-glucopyranose zu ergeben, welche mit TiBr&sub4; in CH&sub2;Cl&sub2; und EtOAc behandelt wurde, wobei ein Glycosylbromid erhalten wurde, anschließend mit EtOH in Gegenwart von AgOTf und MS 4Å in CH&sub2;Cl&sub2; glycosyliert wurde, um nach der O-Desacetylierung mit NaOMe in MeOH Ethyl-2-azido-2-desoxy-D-glucopyranosid (22 Prozent Gesamtausbeute) als Gemisch aus α und β 1 : 1,5 zu ergeben. ¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 1,21 (t, J 7,80 Hz, OCH&sub2;CH&sub3; des β-Anomers), 1,22 (t, J 7,80 Hz, OCH&sub2;CH&sub3;), 2,99 (dd, J 7,43, 9,83 Hz, H-2 des β-Anomers), 5,11 (d, J 3,58 Hz, H-1 des α-Anomers). HRMS berechnet für C&sub8;H&sub1;&sub5;N&sub3;O&sub5;Cs (M+Cs&spplus;) 366,0066, gefunden 366,0066.

Beispiel 12:

Sialylierung (Schema 16)

(a) Verbindung 42

Eine Lösung von Verbindung 1-¹³C-41 (210 mg, 0,50 umol), NeuAc (160 mg, 0,52 umol), PEP-Na&sub3;-Salz (120 mg, 0,51 mmol), MgCl&sub2; · 6H&sub2;O (20 mg, 0,10 mmol), MnCl&sub2; · 4H&sub2;O (4,9 mg, 0,025 mmol), KCl (7,5 mg, 0,10 mmol), CMP (16 mg, 0,05 mmol), ATP (2,7 mg, 0,005 umol) und Mercaptoethanol (0,34 ml) in HEPES-Puffer (200 mM, pH 7,5; 3,5 ml) wurde mit N NaOH auf pH 7,5 eingestellt und die Enzyme NMK (5 U), PK (100 U), PPase (10 U), CMP-NeuAc-Synthetase (0,4 U) und α2,3SiaT (0,1 U) wurden zu der Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur (25ºC) 3 Tage lang leicht gerührt. Das Gemisch wurde konzentriert und der Rückstand wurde auf Silicagel mit EtOAc-iPrOH&supmin;H&sub2;O(2 : 2 : 1) chromatographiert, um ein Trisaccharid zu ergeben, welches mit Biogel P-2 mit Wasser weiter gereinigt wurde, um die Verbindung 42 zu ergeben (88 mg, 24 Prozent). ¹H-NMR (D&sub2;O) d 1,81 (1 H, br t, J 12,02 Hz, H-3ax von NeuAc), 2,04 (6H, s, NHAc von GlcNAc und NeuAc), 2,76 (1 H, dd, J 4,57, 12,33 Hz, H-3eq von NeuAc), 3,96 (1 H, br d, J 3,10 Hz, H-4 von Gal), 4,13 (1 H, dd, J 3,09, 9,94 Hz, H-3 von Gal), 4,56 (1 H, dd, JH-1,H-2 7,83, JH-1,13c 162,78 Hz, H-1 von Gal), 4,58 (1 H, d, J 8,32 Hz, H-1 von GlcNAc). HRMS berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub9;Cs&sub2; (M-H&spplus;+2Cs&spplus;) 980,0759, gefunden 980,0720.

(b) NeuAcα2,3'Lactal Verbindung 43 (82 mg)

¹H-NMR (D&sub2;O, 320ºK) δ: 1,84 (1 H, br t, J 12,18 Hz, H-3eq von NeuAc), 2,08 (3H, s, NHAc von NeuAc), 2,82 (1 H, dd, J 4,46, 12,32 Hz, H-3eq von NeuAc), 4,01 (1 H, br d, J 2,50 Hz, H-4 von Gal), 4,16 (1 H, dd, J 2,50, 9,50 Hz, H-3 von Gal), 4,43 (1 H, dt, J 1,18, 6,46 Hz, H-3 von Glucal), 4,65 (1 H, d, J 7,86 Hz, H-1 von Gal), 4,88 (1 H, dd, J 2,63, 6,07 Hz, H-2 von Glucal) und 6,51 (1H, dd, J 1,45, 6,08 Hz, H-1 von Glucal). HRMS berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub5;NO&sub1;&sub7;NaCs&sub2; (M-H&spplus;+2Cs&spplus;) 864,0092, gefunden 864,0066.

Beispiel 13:

Fucosylierung (Schema 17)

(a) Verbindungen 44, 45 und 46

Eine Lösung von FucT (0,02 U; 2 ml) wurde zu einer Lösung von Verbindung 42 (23 mg, 0,031 mmol) und GDP-Fuc (Ichikawa et al., J. Org. Chem., im Druck) (24 mg, 0,036 mmol) in HEPES-Puffer (3 ml; 200 mM, pH 7,5), welcher 5 mM ATP, 20 mM Mn²&spplus; enthielt, zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre 5 Tage lang bei Raumtemperatur (25ºC) leicht gerührt. Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, wenn eine Lösung, die Verbindung 42 (23 mg; 0,031 mmol) und GDP-Fuc (70 mg, 0,105 mmol) in HEPES-Puffer (1 ml; 200 mM, pH 7,4), der Mn²&spplus; (20 mM) enthielt, und eine α1,3FucT- Lösung (0,01 U) verwendet wurde, welche entsprechend gehandhabt wurde. Das Gemisch wurde konzentriert und auf Silicagel mit EtOAc-iPrOH&supmin;H&sub2;O (2 : 2 : 1) chromatographiert, um ein Tetrasaccharid zu ergeben, welches mit BioGel P-2, mit Wasser weiter gereinigt wurde. Das Eluat wurde durch eine Säule von Dowex 50 W-X8 [H~] geleitet, mit Wasser eluiert, um Mn²&spplus;-Kationen zu entfernen, mit N NaOH neutralisiert und lyophilisiert, um Verbindung 44 (18 mg) zu ergeben: entsprechend wurden die Verbindungen 45 (42 mg) und 46 (51 mg) in ähnlicher Weise hergestellt.
Verbindung 44 : ¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 1,11 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH&sub3; von Fuc), 1,73 (1 H, br t, J 12,04 Hz, H-3ax von NeuAc), 1,96 (3H, s, NHAc von GlcNAc), 1,97 (3H, s, NHAc von NeuAc), 2,69 (1 H, dd, J 4,52, 12,38 Hz, H-3eq von NeuAc), 3,46 (1H, dt, J 7,00, 9,68 Hz, H-2 von Gal), 3,71 (1 H br d, 3,00 Hz, H-4 von Fuc), 4,02 (1 H, dd, J 2,94, 9,78 Hz, H-3 von Gal), 4,46 (1 H, dd, J1,2 7,90, J13C,H 162,13 Hz, H-1 von Gal), 4,52 (1 H, d, J 8,41 Hz, H-1 von GlcNAc), 5,04 (1 H, d, J 3,98 Hz, H-1 von Fuc).
Verbindung 45 : ¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 1,17 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH&sub3; von Fuc), 2,03 (3H, s, NHAc von GlcNAc), 3,50 (1 H, ddd, J 6,47, 7,86, 9,86 Hz, H-2 von Gal), 3,80 (1 H, br d, J 2,88 Hz, H-4 von Fuc), 4,46 (1 H, dd, J1,2 7,79, J13C,H 161,45 Hz, H-1 von Gal), 4,59 (1 H, d, J 8,44 Hz, H-1 von GlcNAc), 4,84 (1 H, br q, J 7,50 Hz, H-5 von Fuc), 5,11 (1 H, d, J 3,90 Hz, H-1 von Fuc).
Verbindung 46: ¹H-NMR (D&sub2;O bei 320ºK) δ: 1,11 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH&sub3; von Fuc), 1,84 (1 H, br t, J 12,00 Hz, H-3ax von NeuAc), 2,08 (3H, s, NHAc von NeuAc), 2,80 (1 H, dd, J 4,52, 12,38 Hz, H-3eq von NeuAc), 4,49 (1 H, br q, J 7,50 Hz, H-5 von Fuc), 4,64 (1 H, d, J 8,0 Hz, H-1 von Gal), 5,02 (1 H, dd, J 2,5, 6,0 Hz, H-2 von Glucal), 5,09 (1 H, d, J 3,98 Hz, H-1 von Fuc), 6,51 (1H, dd, J 1,5, 6,0 Hz, H-1 von Glucal).

(b) Galβ1,4(Fucα1,3')-(5-thio)Glc

Eine Lösung von Galβ1,4(5-Thio)Glc (30 mg, 84 mmol), GDP-Fuc (60 mg, 84 mmol) und α1,3/4FucT (0,5 U) in Na-Kakodylatpuffer (5,4 ml; 50 mM, pH 6,2), welcher 5 mM ATP und 20 mM MnCl&sub2; enthielt, wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Rf-Werte des Ausgangsmaterials und des Produkts betrugen bei einer DSC auf Siliciumdioxid 0,39 bzw. 0,31, in EtOAc/AcOH/H&sub2;O 3 : 2 : 1. Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf eine Säule von Sephadex G-25 Superfine (1,5 · 30 cm) aufgetragen und mit Wasser eluiert. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden vereinigt und nacheinander durch Säulen von QAE-Sephadex und Dowex 50-X8 [H&spplus;] mit Wasser geleitet. Die herausfließende Flüssigkeit wurde zusammengegeben und lyophilisiert (21 mg).
¹H-NMR (D&sub2;O, 20ºC) δ: 1,13 (3H, d, J = 6,7 Hz, 6-CH&sub3; von Fuc), 3,40 (1 H, dd, J = 6,4 und 11,7 Hz), 3,60 (1 H, dd, J = 3,6 und 11,7 Hz), 4,52 (1 H, d, J = 7,9 Hz), 4,95 (1 H, J = 2,6 Hz, 5,34 (1 H, d, J = 3,8 Hz).

Beispiel 14:

Kinetische Untersuchungen der Enzyme

(a) Für FucT

Das Testverfahren war im wesentlichen das gleiche wie das vorstehend beschriebene [Fukowska-Latallo et al., Gene & Development, 4: 1288 (1990)] mit einigen Abwandlungen. Eine Stamm-Mischung, die 0,25 mM GDP-¹&sup4;C-Fuc (5000 Impulse pro Minute (cpm)/ml), 6,25 mM ATP, 25 mM MnCl&sub2; und 62,5 mM Natriumkakodylat-Puffer, pH 6,2 enthielt, wurde frisch zusammengemischt und auf Eis aufbewahrt. Zu dieser Lösung wurde FucT unmittelbar vor der Verwendung zugegeben und die Reaktion wurde durch Zusammengeben von 16 ul von dieser Mischung und 4 ul von 100 mM Akzeptor gestartet (die gesamte Inkubationslösung betrug 20 ul). Die Inkubation erfolgte bei 37ºC 30 bis 240 Minuten lang, was von dem untersuchten Akzeptor abhing. Getrennte Tests in Abwesenheit des Akzeptors wurden verwendet, um die Hintergrundhydrolyse von GDP- Fuc zu berücksichtigen. Nach der Beendigung der Inkubation wurden 400 ul einer 25%igen (Vol./Vol.)-Suspension von QAE-Sephadex zugegeben. Diese Suspensionen wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang leicht vermischt bevor sie bei 13000 U/min 1 Minute lang zentrifugiert wurden. Aus der Überstandsflüssigkeit wurden 200 ul extrahiert und mit 10 ml Szintillationscocktail vermischt. Die Radioaktivität wurde in einem Szintillationszähler gezählt. Es wurde darauf geachtet, daß mit Sicherheit weniger als 10% der Enzymreaktion während des Inkubationszeitraums stattgefunden hatten. Dieser Test kann in Abwesenheit von ATP ausgeführt werden.

(b) Für GalT

Die Anfangsgeschwindigkeiten der Enzymreaktion wurden durch Messen der Geschwindigkeit der LacNAc-Bildung mit einer leichten Abwandlung des Tests von Pierce et al. [Pierce et al., Anal. Biochem., 102: 441 (1980)] bestimmt. Alle Reaktionen wurden in 100 mM Kakodylat-Puffer (pH 7,5) mit festen Konzentrationen von Mn²&spplus; (9,3 mM) und UDP-Gal (0,1 mM; 58,5 cpm/pmol von UDP-¹&sup4;C-Gal) in 100 ml Lösung durchgeführt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von GalT (0,05 U, 120 mg Protein; von Sigma) gestartet und bei 20ºC 30 Minuten lang stehen gelassen. Die unspezifische Hydrolyse von UDP-Gal wurde durch die Kontrollreaktion in Abwesenheit von GalT gemessen. Die Reaktion wurde durch Überleiten durch eine Säule von QAE-Sephadex (700 ml) angehalten und durch leichten Luftdruck eluiert, um das nicht umgesetzte UDP-Gal zu entfernen. Das Reaktionsröhrchen wurde zweimal mit jeweils 400 ml Wasser gespült und durch die Harzsäule geleitet. Die Filtrate wurden gesammelt und direkt in ein Szintillationsröhrchen überführt. Die Szintillationsflüssigkeit wurde zu dem Röhrchen zugegeben und anschließend wurde die Radioaktivität durch einen Flüssigszintillationszähler gezählt. Die Daten wurden durch eine doppelt-reziproke Auftragung analysiert, um Km (1,5 mM für GlcNAc) [ein Wert von 1,3 ± 1 mM wurde in Palcic et al., Carbohydr. Res., 159: 315 (1987) angegeben] und K, (0,46 ± 0,06 mM) für UDP zu erhalten. Entsprechend wurde der IC&sub5;&sub0;-Wert von UDP für GalT bestimmt, wobei eine verschiedene Konzentration von UDP vermiendet wurde.

Beispiel 15:

GDP-Fuc erzeugendes Enzym, das in Schema 19 verwendet wurde.

(a) Enzymzubereitung (GDP-Fuc S)

Das Bakterium Klebstella pneumonia, ATCC 12658 wurde in 2 Liter des Mediums wachsen gelassen, das 10 g Casaminosäure (Difco), 5 g Hefeextrakt, 3 g K&sub2;HPO&sub4;, 1 g KH&sub2;PO&sub4; und 5 g D-Glucose pro Liter enthielt (pH 7,0). Nach 18 Stunden dauernder Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation (10000 · g, 50 Minuten, 4ºC) geerntet und in 50 mM Tris-Puffer, der 0,5 mM DTT enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden durch eine French-Presse bei 1,1 · 10&sup8; Pa (16000 Ib/in) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch 60 Minuten dauernde Zentrifugation bei 23000 · g entfernt und der Überstand (zelifreier Extrakt) wurde für die Enzymreinigung verwendet. Der zelifreie Extrakt (50 ml) für eine 2 l-Kultur wurde mit 60 mg Protaminsulfat behandelt und der sich dabei ergebende Niederschlag wurde nach der Zentrifugation entfernt. Anschließend wurde festes Ammoniumsulfat mit langsamem Rühren zugegeben, bis eine 70%ige Sättigung erreicht war (0,436 g/ml bei 0ºC). Nach der Zentrifugation wurde der Niederschlag gesammelt und in 20 ml des Puffers (50 mM Tris, das 0,5 mM DTT enthielt, pH 7,5) resuspendiert und über Nacht bei 4ºC in 4 l des gleichen Puffers dialysiert.
Die zurückbleibende Lösung (20 ml) wurde anschließend durch eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia) (3 · 30 cm), die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert war, geleitet. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 1 mM in dem gleichen Puffer (insgesamt 400 ml) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und in 2 l von 50 mM Tris-Puffer, der 0,5 mM DTT enthielt (pH 7,5) dialysiert. Diese Zubereitung des GDP-Fuc S-Enzyms wurde zur Herstellung von GDP-Fuc verwendet. Die Aktivität wurde auf ungefähr 0,05 U/ml geschätzt, beruhend auf einem IPLC und NADH-Oxidationstest.

(b) Enzymatische Herstellung und Regeneration von GDP-Fuc aus Man-1-P, Schema 19

Eine Lösung von Imidazol (10 mM), Man-1-P (10 mM), GDP (10mM), PEP (10 mM), KF (5 mM), Mg²&spplus; (10 mM), KCl (20 mM), NADP (2 mM), EDTA (6 mM), iPrOH (2 Prozent), PK (80 U), TBDH (32 U) Hefezellen (S. cerevisiae 52 mg, gefriergetrocknet aus 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5), GDP-Fuc S erzeugendes Enzym (400 ml) in HEPES-Puffer (pH 7,5), (das Gesamtvolumen der Lösung betrug 2 ml) wurde bei 37ºC unter einer Argonatmosphäre 18 Stunden lang inkubiert.
Es wurde die HPLC-Säule Partisil 5 SAX (Whatman Co.), 0,46 · 12,5 cm mit einer Teilchengröße von 5 mm verwendet. Die mobile Phase war 0,1 M Phosphatpuffer (pH 3,5) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min (bei einem Druck von 4,1 MPa [600 psi]). Die Verbindungen wurden durch einen UV-Detektor bei 254 nm nachgewiesen. Die Retentionszeiten für GDP-Man und GDP-Fuc waren 9,92 bzw. 13,4 Minuten. Gemäß der HPLC-Analyse wurden GDP-Fuc (5 Prozent) und GDP-Man (30 Prozent) gebildet.
Anschließend wurde eine Lösung von Verbindung 41 oder 42 (10 mM in 2 ml HEPES- Puffer pH 7,5, der 5 mM ATP und 20 mM MnCl&sub2; enthielt) zugegeben und das Gemisch wurde 5 Tage lang gerührt. DSC auf einer Silicagel-Platte: Rf = 0,28 für Verbindung 45 und 0,50 für Verbindung 41 mit EtOAc: AcOH: H&sub2;O = 4 : 2 : 1 (Vol./Vol.) und 0,56 für Verbindung 44 und 0,63 für Verbindung 42 mit 1 M NH&sub4;OH: iPrOH = 1 : 2,4 (Vol./Vol.).
Die Verbindungen 45 und 44 (jeweils 8 und 4 mg) wurden wie vorstehend beschrieben isoliert und gereinigt.

Beispiel 16:

Reinigung von GDP-Fucose-Pyrophosphorvlase zur Verwendung in Schema 20

(a) Enzymherstellung

Schweineleber (4 kg) wurde in eiskaltem 10 mM MOPS, pH 7,5 mit jeweils 1 mg/ml Antipain, Aprotinin, Chymostatin, Leupeptin und Pepstatin in einem Waring-Mischer homogenisiert (fünf 15 Sekunden-Mischvorgänge auf hoher Stufe). Die Zelltrümmer wurden durch 20 Minuten dauernde Zentrifugation bei 8000 xg bei 4ºC entfernt. Zu der Überstandsfraktion wurde 1 l einer 2%igen Lösung von Protaminsulfat zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang gerührt, und der Niederschlag durch Zentrifugation wie vorstehend angegeben entfernt. Festes Ammoniumsulfat wurde langsam zu der Überstandsfraktion bis zu einer 50%igen Sättigung zugegeben (0,291 g/ml bei 0ºC). Nach einer Zentrifugation, die wie vorstehend beschrieben durchgeführt wurde, wurde der Niederschlag gesammelt und in 1600 ml 1,2 M Ammoniumsulfat resuspendiert.
Die Probe wurde mit einer Aufschlämmung von Phenylsepharose (250 ml) vermischt, welche in 1,2 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden war. Das Harz mit dem daran ge bundenen Enzym wurde mit 1,2 M Ammoniumsulfat (1,5 l) gewaschen und die Enzymaktivität mit 0,4 M Ammoniumsulfat (750 ml) eluiert. Dieses Verfahren wurde mit der durchgelaufenen Lösung wiederholt, bis der größte Teil der Enzymaktivität von der Probe entfernt worden war. Ein Teil des Phenylsepharose-Eluats (200 ml) wurde gegen 10 mM MOPS, pH 7,5 dialysiert und durch eine Säule von DEAE 5PW (15 cm · 21,5 mm) geleitet, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Enzymaktivität wurde in dem Material, welches durch die Säule floß, beobachtet und mittels einer Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert.
Die Probe wurde anschließend einer Gelfiltration an einer Säule von TSK Gel 3000 SW9 (30 cm · 21,5 mm) unterzogen, die in 50 mM MOPS, pH 7,5 mit 150 mM KCl äquilibriert worden war und damit laufen gelassen wurde. Aktive Fraktionen wurden zusammengegeben und als 50-prozentige Ammoniumsulfataufschlämmung gelagert. Während der Reinigung wurde GDP-Fuc-Pyrophosphorylase gemäß dem Verfahren von Ishihara und Health getestet. [Ishihara et al., J. Bioo. Chem., 243: 1110 (1968)]. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als der Einbau von einem mmol anorganischem ³²P-Pyrophosphat in GTP pro Minute.

(b) GDP-Fucose Regeneration unter Verwendung von GDP-Fucose-Pyrophosphorylase, Schema 20. Synthese von Sialyl Lewis-x

Eine Lösung von MOPS, pH 7,5 (50 mM), Fuc 1-P (10 mM), GDP (1 mM), PEP (10 mM), KF (5 mM), Mg²&spplus; (10 mM), Mn²&spplus; (10 mM), PK (5 U), Sialyl-[3H]-LacNAcβ-O- (CH&sub2;)&sub6;CO&sub2;Me (10 mM), α1,3FucT (0,1 U), anorganische Pyrophosphatase (5 U) und GDP-Fuc-Pyrophosphorylase (0,1 U) wurde in einem Volumen von 100 ml vermischt. Die Reaktion wurde an einer Röhrchenwendevorrichtung bei Raumtemperatur 60 Stunden lang inkubiert. Die Produkte wurden an einer Sep-Pac C18-Säule gesammelt und mit 50%igem Methanol eluiert. Die Probe wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck getrocknet, in Wasser resuspendiert und durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten mit Isopropanol/1 M Ammoniumacetat (6 : 1) als Lösungsmittel analysiert. Sialyl Lewis x wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 30 Prozent gebildet, was durch Szintillationszählung festgestellt wurde.

Beispiel 17:

(2R)-Methyl-(55)-hydroxymethyl-(3R.4R)-dihydroxypyrrolidin (Verbindung 50)

A. cis-2,3-Epoxy-1,4-butan-diol

cis-2,3-Epoxy-1,4-butan-diol wurde aus 1,4-Dihydroxy-2-buten gemäß dem in der Literatur angegebenen Verfahren [Nelson et al., J. Med. Chem., 19: 153 [1976] hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Reaktion bei Raumtemperatur 36 Stunden lang durchgeführt wurde.

B. 2-Azido-2-desoxy-threitol

Eine Lösung, die cis-2,3-Epoxy-1,4-butan-diol (1,82 Gramm, 17,50 Millimol), Natriumazid (NaN&sub3;; 5,68 Gramm, 5 Äquivalente) und Ammoniumchlorid (NH&sub4;Cl; 4,68 Gramm, 5 Äquivalente) in 100 Milliliter (ml) Methanol und 12 ml H&sub2;O enthielt, wurde 24 Stunden lang zum Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, anschließend wurde Ethanol zugegeben und der Niederschlag wurde abfiltriert. Das Ausfällungsverfahren wurde mehrere Male wiederholt, um überschüssiges NaN&sub3; und NH&sub4;Cl zu entfernen, um dadurch 2-Azido-2-desoxy-threitol als gelbe Flüssigkeit zu erhalten (90%: R, = 0,28 (EtOAc 100 Prozent); Infrarot (Reinsubstanz) 2109 cm&supmin;¹ (-N&sub3;); ¹H-NMR (CD&sub3;COCD&sub3;) δ 3,49 (1 H, m) 3,59 (3H, m), 3,79 (5H, m), 4,03 (1 H, t, J = 5,5 Hz), 4,19 (1 H, d, J = 5, 5), 4,30 (1 H, t, J = 5,5 Hz) ppm. HRMS (M+H&spplus;) berechnet 148,0722, gefunden 148,072.

C. 5-Azido-5-desoxy-L-xylo-hexulose-1-phosphat

Eine Lösung, die das vorstehend hergestellte 2-Azido-2-desoxy-threitol (476 Milligramm, 3,24 Millimol) in 10 ml H&sub2;O enthielt, wurde auf 0ºC abgekühlt und es wurde Natriumperiodat (NaIO&sub4;; 762 Milligramm, 1, 1 Äquivalente) zugegeben. Nach 10 Minuten verschwand in der Dünnschichtchromatographie das Ausgangsmaterial vollständig und ein neuer Fleck erschien (Rf = 0,5, Ethylacetat). Anschließend wurde Bariumchlorid (BaCl&sub2; · 2H&sub2;O; 870 Milligramm, 1, 1 Äquivalente) zu der Lösung zugegeben und der Niederschlag wurde abfiltriert. Die Lösung wurde bis pH1 mit Dowex 50 (H&spplus;) angesäuert. Der so hergestellte racemische 2-Azido-3-hydroxypropionaldehyd wurde nicht isoliert.
Nach der Filtration wurde die Lösung, die das Racemat enthielt, mit Natriumhydroxid (NaOH; 10-normal) auf pH 7 eingestellt. Anschließend wurde Dihydroxyacetonphosphat (1,5 Millimol) zugegeben und die Lösung wurde mit 10-normaler NaOH wieder auf pH 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Kaninchenmuskel-FDP-Aldolase (500 Einheiten) zugegeben und die Lösung wurde 2 Tage lang langsam gerührt.
Ein Enzymtest zeigte an, daß das gesamte DHAP verbraucht worden war.
Die Titelverbindung wurde zuerst durch Zugabe von zwei Äquivalenten BaCl&sub2; · 2H&sub2;O zu dem Reaktionsgemisch als Bariumsalz isoliert. Die Lösung wurde über Nacht (ungefähr 18 Stunden lang) bei -20ºC gehalten. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit Dowex 50 (H&spplus;) in destilliertem Wasser behandelt, um die Barium-Kationen zu entfernen. Nach der Filtration wurde die Lösung auf pH 7 eingestellt und lyophylisiert, um die gereinigte Titelverbindung (75 Prozent) zu erhalten. ¹H-NMR (D&sub2;O) δ 3,13 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 3,14 (1 H, ddd, J = 9,5, 5,11 Hz, H-5), 3,20 (1 H, t, J = 11 Hz, H-6a), 3,31 (1 H, t, J = 9,5 Hz, H-4), 3,37 (1 H, dd, J = 6, 11 Hz, H-6e), 3,40-3,44 (2H, m, 2 · H-1) ppm. ¹³C-NMR (D&sub2;O) δ 61,78, 63,36, 67,35, 70,95, 97,67 (d, J = 9,5 Hz) ppm. HRMS (M-4H&spplus; + 5Na&spplus;) berechnet 395,9540, gefunden 395,9538.
D. Eine Lösung von 5-Azido-5-desoxy-L-xylo-hexulose-1-phosphat (100 Milligramm, 0,35 Millimol) in 5 ml Wasser wurde mit 20 Milligramm 10 Prozent Palladium- Kohlenstoff (Pd-C) unter 276 KPa (40 Pfund pro Quadratzoll (psi)) Wasserstoff einen Tag lang hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde an einer Silicagelsäule chromatographiert (Methanol:Chloroform: H&sub2;O = 6 : 4 : 2), wobei Verbindung 50 erhalten wurde (40 Milligramm, 78% Ausbeute, 2R : 2S 6 : 1). ¹H-NMR (D&sub2;O) δ 1,31 (3H, d, J = 7 Hz, 2R-CH&sub3;), 1,27 (3H, d, J-6,5 Hz, 2S-CH&sub3;), 3,36 (1 H, m, H-2), 3,66 (1 H, m, H-5), 3,74-3,81 (2H, m, 2 · H-5), 3,85 (1 H, m, H-3), 4,08 (1 H, dd, J = 2,5, 4,5 Hz, H-4) ppm. ¹³C-NMR (D&sub2;O) δ 16,58 (C-2), 57,90 (C-5), 61,50, 63,44 75,62, 87,09 ppm. HRMS (M+H&spplus;) berechnet 148,0974, gefunden 148,0974.

Beispiel 18:

Herstellung der FucT-Inhibitor-Verbindungen 51-53

Die Inhibitor-Verbindungen 51-53 wurden allgemein so hergestellt, wie es im nachstehenden Schema 25 gezeigt ist. Schema 25
Für die Synthese der Verbindungen 51-53 wurden die Azido-aldehyde (S)-54 und (R)-54 als Akzeptoren für die Aldolase-katalysierten Reaktionen mit Dihydroxyacetonphosphat ausgewählt (Schritt a, Fuculose-1-phosphat-aldolase; Schritt b, Kaninchenmuskel- Fructose-1,6-diphosphat-aldolase), um Phosphat-Zwischenprodukte zu bilden, welche zuerst mit saurer Phosphatase behandelt wurden und anschließend reduktiv aminiert wurden (Schritt c; H&sub2;/Pd-C, 50 psi), um die Endprodukte zu bilden, welche zwei zusätzliche chirale Zentren in den 3- und 4-Stellungen enthielten.
Die Verbindungen (S)-54 und (R)-54 wurden aus 2-Butin-1-ol über eine Reaktion mit einem Lindlar-Katalysator, gefolgt von einer Epoxidierung und einer Azidöffnung zum Herstellen der entsprechenden enantiomeren 2- und 3-Azidodiole in einem Verhältnis von 6 : 1 hergestellt. Die Trennung des 2-Azidodiols erfolgte anschließend unter Verwendung einer Lipase aus Pseudomonas sp. und Vinylacetat als Acylierungsmittel [Wang et al., J. Org. Chem., 53: 3127 (1988); Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 7200 (1980)], um das (2R, 3S)-2-Azido-3-hydroxy-4-acetat und das (2S, 3R)-2-Azido-3,4-diacetat in hoher optischer Reinheit zu erhalten, wie durch ¹H-NMR in Gegenwart von Eu(hfc)3 bestimmt wurde. Das gereinigte Azidohydroxyacetat und Azidodiacetat wurde getrennt hydrolysiert, um die jeweiligen Diole zu bilden, welche anschließend mit Natriumperiodat oxidativ gespalten wurden, um die Verbindungen (S)-54 und (R)-54 zu bilden.
Die physikalischen Daten für die Verbindungen 51-53 sind nachstehend angegeben.
53:[α]D²&sup5; + 21,8º (c = 1,0, CH&sub3;OH); Rf = 0,20 (CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH = 5/411/0,08); ¹H-NMR (500 MHz, CD&sub3;OD/TMS): δ 1,140 (3H, d, J = 6 Hz, CH&sub3;), 2,34-2,45 (1H, m, CHN), 2,47-2,55 (1 H, m, CHN), 3,656 (1 H, dd, J = 4 Hz und 11 Hz, CHaO), 3,744 (1 H, dd, J = 5 Hz und 11 Hz, CHbO), 3,876 (1 H, dd, J = 5 Hz und 5 Hz, CHO), 4,268 (1 H, dd, J = 5 Hz und 8 Hz, CHO). ¹³C-NMR (125 MHz, CD&sub3;OD): δ 12,98, 60,56, 65,24, 70,95, 72,14, 73,88. HRMS (M+M&spplus;) berechnet: 148,0974, gefunden: 148,0968.
52:[α]D²&sup5; + 22,7º (c = 1,2, CH&sub3;OH); Rf = 0,19 (CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH = 5/4/1/0,08); ¹H-NMR (500 MHz, CD&sub3;OD/TMS): δ 1,162 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH&sub3;), 2,915 (1H~, dt, J = 4 und 4,5 Hz CHN), 3,213 (1 H, dq, J = 4 und 6,5 Hz, CHN), 3,650 (1 H, dd, J = 5 Hz und 11 Hz, CHaO), 3,685 (1 H, dd, J = 5 Hz und 11 Hz, CHbO), 3,741 (1 H, dd, J = 1,5 Hz und 4 Hz, CHO), 3,835 (1H, dd, J = 1,5 Hz und 4 Hz, CHO). ¹³C-NMR (125 MHz, CD&sub3;OD): δ 13,72, 57,85, 63,07, 68,60, 80,60, 81,54. HRMS (M+M+) berechnet: 148,0974, gefunden: 148,0964.
51:[α]D²&sup5; + 39,1º (c = 0,8, CH&sub3;OH); Rf = 0,19 (CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH = 5/4/110,08); ¹H-NMR (500 MHz, CD&sub3;OD/TMS): δ 1,193 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH&sub3;), 2,920 (1H, dt, J = 6,5 und 7,5 Hz, CHN), 2,982 (1 H, ddd, J = 4, 5, 6,5 und 6,5 Hz, CHN), 3,500 (1 H, dd, J = 6,5 Hz und 7,5 Hz, CHO), 3,572 (1 H, dd, J = 6 Hz und 11 Hz, CHaO), 3,644 (1 H, dd, J = 4, 5 Hz und 11 Hz, CHbO), 3,751 (1 H, dd, J = 6,5 Hz und 6,5 Hz, CHO). ¹³C-NMR (125 MHz, CD&sub3;OD): δ 18,83, 58,07, 63,61, 64,36, 79,88, 84,88. HRMS (M+M&spplus;) berechnet: 148,0974, gefunden: 148,0971.

Beispiel 19:

Synthesen und Daten für die Verbindungen der schematischen Darstellungen 21-23

Die Verbindungen 61-99 und ihre Synthesen sind in Zusammenhang mit den schematischen Darstellungen 21-23 erörtert worden. Ausgewählte ¹H-NMR und HRMS-Daten für die Verbindungen dieser schematischen Darstellungen sind in den nachstehenden Tabellen 6-8 angegeben. Spezifische Einzelheiten der Synthese für beispielhafte Verbindungen sind zusätzlich zu den bereits erörterten nachstehend angegeben.
Die nachstehend beschriebenen Arbeitsweisen wurden auch auf die anderen Glycosyl- 1-phosphat-Verbindungen 89-95 angewandt. Die einzige Abwandlung erfolgte in dem Reinigungsschritt der Verbindungen 68, 69, 75 und 76. EtOAc wurde als Elutionsmittel für die Verbindungen 68 und 69 verwendet, EtOAc : Hexan (2 : 3) für die Verbindung 75 und CHCl&sub3;: EtOAc: MeOH (15 : 0,5 : 0,2) für die Verbindung 76.

A. 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-glucose (Verbindung 71)

Eine Lösung der Pentaacetat-Verbindung 64 (5,0 g, 12,8 mmol) und BnNH&sub2; (19,2 mmol) in THF (30 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht (ungefähr 18 Stunden) stehen gelassen. Das Gemisch wurde mit kaltem Wasser verdünnt und mit CHCl&sub3;(3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde nacheinander mit eiskaltem verdünnten HCl, gesättigtem NaHCO&sub3;, gesättigtem NaCl und Wasser gewaschen, anschließend über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde durch Silicagelchromatographie mit EtOAc/Hexan (2 : 3) gereinigt, um die Verbindung 71 (3,80 g, 85 Prozent) als 3 : 1 (α : β)-Gemisch der Anomere zu ergeben, wie durch ¹H-NMR (CDCl&sub3;) festgestellt wurde.

B. Dibenzylphosphinyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucose phosphit (Verbindung 78)

Dibenzyl-N,N-diethylphosphoramidit (0,86 g, 7,3 mmol) wurde zu einer Lösung von Verbindung 71 (1,0 g, 2,9 mmol) und 1,2,4-Triazol (0,8 g, 11,5 mmol) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 bis 2 Stunden lang gerührt, bevor es mit Ether verdünnt wurde. Das Gemisch wurde nacheinander mit eiskaltem gesättigtem NaHCO&sub3;, gesättigtem NaCl und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub3; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde an Silicagel mit EtOAc/Hexan (1 : 4) chromatographiert, wobei Verbindung 78 (1,73 g, 97 Prozent) als Gemisch aus (α : β) 1 : 4 erhalten wurde, wie durch ¹H-NMR (CDCl&sub3;) festgestellt wurde.

C. Dibenzylphosphoryl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucose (Verbindung 25)

Zu einer Lösung der Verbindung 78 (1,2 g, 2,2 mmol) in THF (50 ml), die mit einem Trockeneis-Aceton-Bad auf -78ºC gekühlt worden war, wurden tropfenweise 30% H&sub2;O&sub2; (10 ml) zugegeben und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Ether verdünnt und nacheinander mit eiskaltem gesättigtem Na&sub2;S&sub2;O&sub3;, gesättigtem NaHCO&sub3;, gesättigtem NaCl und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei ein α : β (1 : 4)-Gemisch der Verbindung 85 (1,36 g, 98 Prozent) erhalten wurde, wie durch ¹H-NMR (CDCl&sub3;) festgestellt wurde. Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.

D. Glucose-1-phosphat (Verbindung 92)

Die Verbindung 85 (1,0 g,1,8 mmol) wurde über 5 Prozent Pd/C (200 mg) in EtOH (30 ml) und 10 Prozent NaHCO&sub3; (20 ml) 10 Stunden lang bei Raumtemperatur hydriert (14,7 Psi). Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat konzentriert. Der Rückstand wurde mit 1 N NaOH (10 ml) bei Raumtemperatur 3 Stunden lang behandelt. Das Gemisch wurde mit eiskalter 1 N AcOH bis pH 7,5 neutralisiert und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Alternativ dazu wurde eine Lösung von MeOH : H&sub2;O (1 : 1 Vol./Vol.) in 10% Et&sub3;N anstelle von NaOH verwendet, so daß der anschließende Neutralisationsschritt wegfiel. Das Filtrat wurde konzentriert, mit Wasser verdünnt und durch eine Säule von Dowex 50 W-X8 [Na&spplus;] (1 · 15 cm) mit Wasser als Elutionsmittel geleitet. Die passenden Fraktionen wurden zusammengegeben und lyophilisiert, wobei die Verbindung 92 erhalten wurde.
Gelegentlich wurde eine kleine Menge des dephosphorylierten Produkts beobachtet. Es wurde entfernt, indem das verdünnte Filtrat auf eine Säule von Dowex 1 W-X8 [HCO&sub2;-] (1 · 30 cm) geleitet wurde. Die Säule wurde zuerst mit Wasser eluiert, um das neutrale Produkt zu entfernen und anschließend wurde ein linearer Gradient von NH&sub4;HCO&sub3; (0,1 M-0,3 M) angelegt, um das gewünschte Produkt zu eluieren. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in Wasser (10 ml) gelöst, auf 0ºC gekühlt und mit Dowex 50 W-X8 [H+]-Harz bis pH 7,0 neutralisiert. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat wurde erneut lyophilisiert, um die Verbindung 92 (0,30 g, 59 Prozent) als α : β (1 : 4)-Gemisch zu erhalten, wie durch ¹H-NMR (D&sub2;O) festgestellt wurde.

E. Methyl-5-acetamido-4,7.8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-β-D-glycero-Dgalacto-2-nonulopyranosonat (Verbindung 96)

Diese Verbindung wurde gemäß der Arbeitsvorschrift von Marra et al., Carbohvdr. Res., 190: 317 (1989) hergestellt. Alternativ dazu wurde ein Gemisch aus Methyl-2-chlor-5- acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-β-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosonat [Kuhn et al., Chem. Ber., 99: 611 (1966)] (0,67 g, 1,3 mmol) und Silbercarbonat (0,363 g, 1,3 mmol) in Aceton (5 ml)-H&sub2;O (0,5 ml) 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wurde filtriert, indem sie durch ein CeliteTM 545-Bett geleitet wurde, und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Chloroform verdünnt, mit Wasser und Salzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum verdampft, um ein Rohmaterial zu ergeben, welches auf einer Silicagel-Säule (Chloroform-Methanol 25 : 1) chromatographiert wurde, wobei Verbindung 96 (0,568 g, 88 Prozent) als weiße Nadeln erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 1,90, 2,02, 2,03, 2,10, 2,14 (jeweils 3H, s, 4xOAc und NAc), 2,17 (1 H, dd, J 5,04, 12,72 Hz, H-3eq), 2,29 (1 H, dd, J 11,52, 12,72 Hz, H-3ax), 3,87 (3H, s, COOMe), 4,02 (1 H, dd, J 7,04, 12,4 Hz, H-9), 4,12 (1 H, dd, J 2,1, 7,8 Hz, H-6), 4,13 (1H, d, J 7,8 Hz, NH), 4,17 (1H, ddd, 7, 8, 9,8, 10,28, Hz, H-5), 4,42 (1H, dd, J 1,92, 12,4 Hz, H-9'). 5,20-5,26 (2H, m, H-4 und H-8), 5,32 (1H, dd, J 2,1, 6,50 Hz, H-7), 5,37 (1H, bs, OH).

F. Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-(dibenzylphosphityl)-3,5- didesoxy-β-D-4lycero-D-palacto-2-nonulopyranosonat (Verbindung 97)

Dibenzyl-N,N-diethylphosphoamidat (0,25 g, 0,78 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von Verbindung 96 (0,166 g, 0,34 mmol) und 1 H-Tetrazol (0,10 g, 1,43 mmol) in THF (5 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Dichlormethan (10 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben, und die organische Phase wurde mit eiskaltem verdünnten HOI, wässrigem NaHCO&sub3; und Eiswasser gewaschen und über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum verdampft, um ein Rohmaterial zu ergeben, welches auf einer Silicagelsäule mit EtOAc/Hexan (5 : 1) chromatographiert wurde, wobei die Verbindung 97 (0,17 g, 68 Prozent) als farbloser Sirup erhalten wurde. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ: 20,7, 20,8, 20,9, 21,0, 23,1, 36,0, 49,5, 53,5, 62,6, 67,3, 67,4, 67,8, 69,3, 70,8, 94,8, 128,0, 128,7, 135,5, 141,8, 153,0, 169,1, 170,2, 170,4, 170,8, 171,0. HRMS: berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;NO&sub1;&sub5;PC&sub5; (M+Cs&spplus;) 868,1346, gefunden 868,1346.

G. Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-(dibenzylphosphoryl)-3,5- didesoxy-β-D-glycero-D-palacto-2-nonulopyranosonat (Verbindung 98)

Zu einer gekühlten Lösung von Verbindung 97 (0,13 g, 0,17 mmol) in THF (2 ml) wurde t-BuO&sub2;H (0,4 ml) bei -10ºC zugegeben und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt und mit eiskaltem wässrigen NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen, und anschließend über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die organische Phase wurde im Vakuum verdampft, um ein Rohmaterial zu ergeben, welches an Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (25 : 1) chromatographiert wurde, um Verbindung 98 (0,126 g, 95 Prozent) als farblosen Sirup zu ergeben. HRMS: berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;NO&sub1;&sub6;PCs (M+Cs&spplus;) 884,1396; gefunden 884,1305.

H. Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-β-D-glycero-Dgalacto-2-nonulopyranosonat-2-phosphorsäure (Verbindung 99, Wasserstoff-Form)

Die Verbindung 98 (0,22 g, 0,25 mmol) wurde über 5 Prozent Pd/C (10 mg) unter einer Wasserstoffatmosphäre 7 Stunden lang bei Raumtemperatur hydriert (14,7 Psi). Der Katalysator wurde durch ein CeliteTM 545 -Bett abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Das Rohmaterial wurde an einer Silicagelsäule mit einer Umkehrphase mit CH&sub3;CN/H&sub2;O (5 : 1) chromatographiert, wobei Verbindung 99 in der Wasserstoff-Form (0,164 g, 99 Prozent) als farbloser Sirup erhalten wurde. HRMS: berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub0;NO&sub1;&sub6;PC&sub5; (M+Cs&spplus;) 704,0356, gefunden 704,0356. Tabelle 6 ausgewählte 1H-NMR Daten für die Verbindungena von Schema 21
a: chemische Verschiebung in p.p.m Kopplungskonstante (J) in Hz.
b: hicht bestimmt aufgrund von spektraler Überlappung TABELLE 6 (Fortsetzung)
c: HRMS berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub4;PO&sub1;&sub1;NCs(M+Cs&spplus;) 724,0924, gefunden 724,0931.
d: HRMS berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub4;PO&sub1;&sub1;NNa(M+Na&spplus;) 614,1767, gefunden 614,1798.
e: HRMS berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub3;PO&sub1;&sub2;Cs(M+Cs&spplus;) 725,0764, gefunden 725,0764 für 77, 725,0760 für 78, 725,0766 für 79. TABELLE 6 (Fortsetzung)
f: Die ¹H-NMR-Daten stimmen gut mit den in der Literatur angegebenen überein.
g: Die ¹H-NMR-Daten stimmen gut mit den in der Literatur angegebenen überein. TABELLE 6 (Fortsetzung) Tabelle 7 Ausgewählte ¹H-NMR-Daten der Verbindungena von Schema 22
a: chemische Verbschiebung in p.p.m und Kopplungskonstante (J) in Hz.
b: nicht bestimmt aufgrund von spektraler Überlappung.
c: HRMS berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub1;PO&sub1;&sub0;Cs(M+Cs&spplus;) 557,1553 gefunden 557,1542
d: Die ¹H-NMR-Daten stimmen gut mit den in der Literatur angegebenen Daten überein. Tabelle 8 Ausgewählte ¹H-NMR-Daten der Verbindungena von Schema 22
a: chemische Verschiebung in p.p.m und Kopplungskonstante(J) in Hz
b: chemische Verschiebung von CH&sub3;CON für 97 = 1,79(s); 98 = 1,87(s); 99 = 1,89(s)
Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele sollen zur Erläuterung dienen und nicht als Beschränkung verstanden werden. Es sind noch weitere Abwandlungen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, möglich und Fachleute erkennen diese ohne weiteres.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines fucosylierten Kohlenhydrats in einer Einfachreaktionsmischung, das folgende Schritte umfaßt:

a) Verwenden einer Fucosyltransferase zur Bildung einer O-Glykosid-Bindung zwischen einer Nukleosid-5'-diphospho-fucose und einer verfügbaren Hydroxylgruppe einer Saccharid-Komponente eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls, zum Erhalten eines fucosylierten Kohlenhydrats und eines Nukleosid-5'-diphosphats, und

b) In situ-Regeneration des Nukleosid-5'-diphosphats mit Fucose zur Bildung der entsprechenden Nukleosid-5'-diphospho-fucose.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleosid-5'-diphosphat in einer katalytischen Menge vorhanden ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hydroxylgruppe des Kohlenhydrat- Akzeptormoleküls ein Teil eines N-Acetylglucosamins, einer Galaktose oder eines N-Acetylgalaktosamins ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Kohlenhydrat-Akzeptormolekül sialyliert ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines fucosylierten sialylierten Kohlenhydratmoleküls durch enzymatische Bildung von Glykosidverbindungen in einer Einfachreaktionsmischung, umfassend:

a) Bildung einer ersten Glykosidverbindung zwischen einem diphosphonukleosid-aktivierten Glykosyldonor und einer verfügbaren Hydroxylgruppe eines Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls unter Verwendung einer ersten Glykosyltransferase;

b) Bildung einer zweiten Glykosidverbindung zwischen einem monophosphonukleosid-aktivierten Sialyldonor und einer verfügbaren Hydroxylgruppe des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls unter Verwendung einer Sialyltransferase; und

c) Bildung einer dritten Glykosidverbindung zwischen einem diphosphonukleosid-aktivierten Fucosyldonor und einer verfügbaren Hydroxylgruppe des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls durch das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Glykosidverbindungen der Schritte a), b) und c) in einer Einfachreaktionsmischung gebildet werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die fucosylierte sialylierte Kohlenhydrat- Komponente ein sialylierter Lewis-Ligand ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Fucose von einem Fucosyldonor auf eine Hydroxylgruppe eines N-Acetylglucosamin-Rests des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls übertragen wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Fucosyldonor Fucose auf eine Hydroxylgruppe eines Galaktose-Rests des Kohlenhydrat-Akzeptormoleküls überträgt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Sialyltransferase aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus α2,3-Sialyltransferase, α2,4-Sialyltransferase, α2,6-Sialyltransferase und α2,8-Sialyltransferase besteht.

10. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Fucosyltransferase aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus α1,2-Fucosyltransferase, α1,3-Fucosyltransferase, α1,6-Fucosyltransferase, α1,4-Fucosyltransferase und α1,3/4-Fucosyltransferase besteht.

11. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Kohlenhydrat-Akzeptormolekül ein kohlenhydratsubstituiertes Molekül ist, in dem das Kohlenhydrat mit Galβ1, 4GlcNAc-X endet, wobei X ein organisches Molekül ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Schritte a) und b) im wesentlichen abgeschlossen sind, bevor Schritt c) beginnt.

13. In vitro-Reaktionssystem zur Herstellung eines fucosylierten Kohlenhydrats, das eine Fucosyltransferase und ein nukleosid-diphospho-fucosebildendes Enzym umfaßt.

14. Reaktionssystem gemäß Anspruch 13, das außerdem eine Kinase umfaßt.

15. In vitro-Reaktionssystem gemäß Anspruch 14, das außerdem eine Pyruvatkinase umfaßt.

16. Reaktionssystem gemäß Anspruch 13, das außerdem ein NADPH-Regenerationssystem umfaßt.

17. Reaktionssystem gemäß Anspruch 16, wobei das nukleosid-diphospho-fucosebildende System Guanosin-diphospho-mannose enthält.

18. System gemäß Anspruch 17, wobei Guanosin-diphospho-mannose in situ aus Guanosin-triphosphat und Mannose-1-phosphat erzeugt wird.

19. System gemäß Anspruch 18, das außerdem Pyruvatkinase und Guanosindiphospho-mannose-Pyrophosphorylase umfaßt.