BG98713A - Метод за получаване на фукозилирани въглехидратичрез фукозилираща синтеза на захарни нуклеотиди ирегенериране на gdр-фукозата in siтu - Google Patents
Метод за получаване на фукозилирани въглехидратичрез фукозилираща синтеза на захарни нуклеотиди ирегенериране на gdр-фукозата in siтu Download PDFInfo
- Publication number
- BG98713A BG98713A BG98713A BG9871394A BG98713A BG 98713 A BG98713 A BG 98713A BG 98713 A BG98713 A BG 98713A BG 9871394 A BG9871394 A BG 9871394A BG 98713 A BG98713 A BG 98713A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- compound
- group
- fucose
- fucosyltransferase
- carbohydrate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
- C07H5/02—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
- C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретението предлага подобрен метод за ензимно получаване на въглехидрати и по-специално на фукозилирани въглехидрати. Предлага се също подобрена синтеза на гликозил 1или 2-фосфати при използване както на химически, така и на ензимни методи. Фосфорилираните гликозиди се използват за получаване назахарни нуклеотиди, които се използват като донорни захари за гликозилиране на акцепторни въглехидрати. Методът се прилага при фукозилиране.
Description
Област на изобретението
Настоящето изобретение предлага метода за ензимно получаване на въглехидрата, и по-специално на фукозилирани въглехидрати. Изобретението предлага подобрени синтези на гликозил 1или 2-фосфата при използване както на химически, така и на ензимни метода. Тези фос^форилирани гликозида след това се използват за получаване на захарни нуклеотиди, които от своя страна се използват като донорни захари за гликозилиране на акцеп
- 2 торни въглехидрати. Особено предпочетено е използването на предложените методи за фукозилиране.
Резюме на изобретението
Настоящето изобретение предлага метод за получаване на фукозилиран въглехидрат в една единствена реакционна смес, включващ етапите на: използване на фуквзилтрансфераза за образуване на О-гликозидна връзка мевду нуклеозад 5* -дифосфо-фукоза и достъпна хидроксилна група на въглехидратна акцепторна молекула, като се получава фукозилиран въглехидрат и нуклеозид б^дифосфат; и рециклиране in situ на нуклеозида 5'-дифосфат с фукоза, като се образува съответния нуклеозад б'-дифосфофукоза. Предпочитани метода от настоящето изобретение включват използването на гванин като база за нуклеозида, употребата на каталитични количества нуклеозиди, използването на М-ацетилглккозамин, галактоза, II-аце тил гал актоз амин или Н-ацетиллактозашн като въглехидратна акцепторна молекула и използването на сиалилирана въглехидратна акцепторна молекула.
По-нататък това изобретение включва горния метод за получаване на фукозилирана сиалилирана въглехидратна молекула чрез ензимно образуване на гликозвдни връзки в единствена реакционна смес, състоящ се от: образуване на първа гликозидна връзка мевду активиран с дифосфонуклеозид гликозилен донор, като например UBr-Gai и достъпна хидроксилна група на въглехидратна акцепторна молекула, като например GidUc , при използване на първа гликозилтрансфераза, като например в!,4-галактозилтрансфераза при получаването на Galsi,4GicMAc · образуване на втора гликозидна връзка мевду активиран с монофосфонуклеозид сиалилен донор, като например CivP-ЯеиАс и достъпна хцдро-3ксилна група на захарната акцепторна молекула, като например хедроксилната група на трето място в Gal на Saifiit4GlcMAc при използване на оиалилтрансфераза, като например /2,3-сиалилтрснофераза; образуване на трета гликозвдна връзка между активиран с длфосфонуклеозвд фукозилен донор, като например gupiuc и достъпна хидроксилна група на захарната акцепторна молекула, като например хидроксилната група на трето място в GicMAc на Galfli ,4GidAc при използване на фукозилтрансфераза, като например /1,3/4фукозилтрансфераза, при което поне един от етапите (а), (Ь) или (с) по-нататък включва образуването in situ на активиран с фосфонуклеотид гликозилен донор от каталитично количество на съответния монофосфатен и дифосфатен нуклеозид. Особено предпочетени са методите от това изобретение, при които фукозилираният сиалилиран въглехидратен продукт е сиалилиран Люисов лигацц, като например l«x(sl«x) или смалил L«a (SL«a) и при които фукозата се пренася от фукозилен донор към хидроксилна група на Ιί-ацвтилглюкозаминния или галактозния остатък на въглехидратната акцепторна молекула.
Този метод обхваща множество реакции, катализирани с гликозилтрансферази, протичащи в единствена реакционна смес. Предпочитани са тези методи, при които една гликозилтранофераза е сиалилтранофераза, подбрана от групата, състояща се от: G2,3 смалил трансф*ераз а, </2,4 оиалилтрансфераза, 2,6 сиалилгрансфераза и /2,8 оиалилтрансфераза. Изобретението предвижда фукозилирането на слигозахарцц и предпочитани са фукозилтрансферази, подбрани от групата, състояща се от: <41,2 фукозилтрансфераза, ίΖ.1,3/4 фукозилтрансфераза, Gl,3 фукозилтрансфераза, </1,б фукозилтрансфераза и/1,4 фукозилтрансфераза. Особено предпочитаните фукозилтрансферази включват в-галактозвдазa У- 1,2 фукозил- 4 трансфераза, N-ацетилглюкозамин /1,3 фукозилтранофераза, Кацетилглюкозамин /1,4 фукозилтранофераза и П-ацетилглюкозамин /1,6 фукозилтрансфераза·
Въглехидратните акцепторни молекули са действително неограничени, тъй като глккозилтрансферазите не са селективни подалеч от съседните места в захарта. Така, те могат да бъдат всяка заместена въглехидратна молекула, в която въглехидратът е молекула GaiBi,4Gic»Ac или подобна на нея, или завършваща с GaiBi,4GiciiAc-x t където X е органична молекула. Допълнителни въглехидратни акцепторни молекули, които са субстрати за фукоилаза, са аналози на Gei3i,4Gic!Uc и Gaisi,4GieAc-x . Като примери за такива молекули могат да се посочат лактоза, MeuAcZ.1,6GalB1, AGlcMAc, Gal31,JGlclAc, Gal314 ГЛЮКйЛ /ЛаКТал/ N«uAcZ2,5Galfli,4 глюкал, 2-халоген-субституирани реакционни продукти на горните глкжали, Gale 1,4( O-THO)Glo , Gal31,4GlcMAo3-0алил и други подобни. Следва да се подчертае, че въглехидратната акцептсрна молекула трябва да съдържа достъпна хидроксилна група в захарида, към която да се свърже присъединяващата се фукозилна или друга захарна група, и хидроксилът, който трябва да присъства, се определя от използвания в реакцията гликозилтрансферазен ензим.
По-нататък, описаният тук метод включва регенериране на каталитични количества от нуклеотидите, използвани за образуването на нуклеозццните захари. Предпочитани бази за нуклеотидите, използвани в изобретението, са цитидин, гванин или уридин. Йонозахарццните донори са активирани нуклеотвдни захари като цитцдин-б^монофосфо-Н-адетилневраминова киселина, гванадин 51*дифисфо-фукоза и уридин 5'-дифосфо-галактоза.
Освен горните методи настоящето изобретение включва in vitro реакционни системи. Като такива се означават системи о инертен или нереакционноспособен кантейнер, съдържащ реагенти· те, използвани за провеждане на горе посочените реакции. По-специално, тези реакционни системи съдържат най-малко фукозилтрансфераза и ензим, образуващ нуклеозвд дифоофофукоза. Тези реакционни системи могат да съдържат още и гванозин дифоофофукоза пирофосфорилаза като ензим, образуващ GDP-фукоза, киназа, като например пируват киназа или фруктоз»-1,6-дифосфат киназа, ацетилкиназа или фукоза киназа. Други реагенти могат да включват ΝΑ^ίί регенерационна система или гванозин дифоофат маяоза и гванозин дифосфоманоза пирофосфорилаза. Ако присъства МАДРН регенерационна система, тя трябва да включва каталитично количество ШДР, изопропанол от около 1 процент до около 4 процента, за предпочитани около 2 до 4 процента тегло/обем от реакционната система, а също и алкохол дехидрогеназа.
В изобретението са представени също редица методи за синтезиране на олигозахариди. Един от методите включва получаването на гликозил 1- или 2-фоофат чрез взаимодействие на блокиран глккозилен пръстен , който има хидроксилна група в аномерно положение /1- или 2- място/, с тривалентен фосфитилиращ реагент, като се получава блокиран гликозил 1- или 2-фосфит-субституиран пръстен. Блокираният фоофит се окислява и образува съответния фосфат, който се използва при ензимна реакция. Гликозилният пръстен може да включва галактозил, гликозил, фукозил, N-ацетилглюкозил и манозил, както и други захариди. Предпочитани тривалентни фосфитилиращи реагенти са дибензил Н,М-диалкилфссфорамидити, като например дибензил В,Н-диетид>осфорамидит. Такива дивлккли са нисши алкили с 1-5 въглеродни атома включи
- 6 телно и те могат да бъдат еднакви или различни. Освен това, при този метод се използват блокиращи реагенти,като например аце тил или бензил. Гликозилният пръстен може да бъде от групата, състояща се от ми Ь-алдози с четири, пет или шест въглеродни атома или от групата, състояща се от D- или Ь-кетози с четири, пет или шест въглеродни атома, както и захариди с до девет въглеродни атома з захаридната верига.
По-нататък това изобретение включва нови мевдинни съединения /интермедиати/ за получаване на гликозил 1- или 2 фосфати. Предпочитан интермедиат е блокиран фосфитил монозахарид с формула I:
Rg Rg където R^ е арил или нисш алкил;
X е независимо кислород или азот;
Rg е независимо ацилова, бензилова, силилова или алкилова блокираща група;
Ββ е независимо -ΟΗβ, -ORg, -CHgOR^, -CH/OR^-CH/ORg/ или -СНЖ2/ -CH/0R2/ -СН/ORr/;
R^ е водород /Н/, карбоксил или С^-С^ или бензил карбоксилатен естер; и η е 1 или 2
В предпочетената група от съединения с формула I R^_ е водород, така че формула I се превръща в дадената по-долу формула II, в която Rp R2, R3, Хи аса както посочените по-горе.
- 7 II
Ццна група от особено предпочетени съединения са тези, при които монозахаридът е шест-членен пръстен, е Н и всеки X е кислород, като например маноза или фукоза. Предпочитани са съединения, при които R^ е бензил и Rg е бензил или ацетил. Като примери за предпочетени интермедиати могат да се посочат дибензилфосфитил 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-Д-манозид или дибензилфосфитил 2,3,4-три-0-ацетил-Ь-фукозид.
Друга група особено предпочетени съединения са тези, при които монозахаридът е шест-членен пръстен, R|H Rg са както погоре, единият X е азот, а другият - кислород. Като примерни съединения от тази група могат да се посочат GlcSAc, GalNAc и ЬеиАс . Като илюстрация за тези съединения могат да се посочат дибензилфосфитил 2-ацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-0-ацетил-Д-глюкозвд и 2-гацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-0-ацетил-Д-галактозвд.
Като монозахариден аналог може да се посочи също 2,3,4-триО-бензоил-ΰύ-ь -фукопиранозил бромвд.
Дефиниции
Фразата достъпна хидроксилна група означава хидроксил-заместен въглероден атом, образуващ част от пръстена на въглехидратна акцепторна молекула, която може да образува гликозидна връзка при въздействието на гликозилтрансфераза, пренасяща моноили дифосфонуклеозид-активиран гликозилен донор към достъпния
-8въглероден атом. Достъпната хидроксилна група типично се намира на трето място за фукозидиране.
Фразата блокиран гликозилен пръстен се отнася за гликозилни пръстени, при които достъпните аминни или хидроксилни заместители са реагирали с ацилна, бензилна, силилна или алкидна блокиращи групи. Такива групи са описани най-общо в Гриин Т.У., Защитни групи в органичните синтези (Green, T.W., Protective Groups in Organic Synthesis*, J. Wiley and Sons, Inc., 1981.)
Терминът въглехадрат/и/ включва органични молекули, състоящи се от въглехидрати, свързани ковалентно с моксмерни захариди. Те включват дизахариди, олигозахариди, гликолипиди, гликопротеини и неприродни връзки,като например захариди, свързани към органични съединения, неприродно свързани към захари^
С фразата въглехидратна акцепторна молекула” се означава молекула, носеща поне един монозахарид, при което този монозахарид има една или повече достъпни хидроксилни групи за образуване на гликозмдни връзки д моно» или дифосфонуклеозид-активирани гликозилни донори.
С фразата каталитично количество се означава канцентрацията на реагенти, които присъствуват в относително малки количества з сравнение с реагентите, които са в стехиометрични количества, и концентрацията им не намалява съществено в хода на процеса. Тези реагенти, които присъстват в каталитични количества, са типични активиращ реагенти, които след това се регенерират и рециклират в реакционната, смес чрез странични реакции.
С фра.зата гликозидни връзки се означават типичните кислород-зътлеродни връзки, които се образуват между захари. Конфигурацията им може да бъде или (3 и се образуват в резул- 9 тат на реакция на дехидратиране, при която дифосфоиуклеозид-активиран гликозилен донор се пренася към достъпен въглерод на въглехидратна акцепторна молекула при използване на гликозилтрансфераза.
С фразата гликозилен пръстен се означава захар или амино* зехар, съдържаща 5 или 5 въглеродни атома з пръстена. Тук се включват алдози, дезоксиалдози и кетози, без оглед на ориентацията или конфигурацията на връзките на асиметричните въглерод* ни атоми. Такива са захари като рибоза, арабиноза, ксилоза, лжсоза, алоза, алтроза, глккоза, идоза, галактоза, талоза, рибулоза, ксилюлоза, псикоза, К-ацетилглюкозамин, Н-ацетилгалактозамин, П-ацетилманозамин, К-ацетилневраминова киселина, фруктова, сорбоза, тагатоза, рамноза и фукоза.
С термина гликозилтрансфераза се означава семейство от ензими, които свързват гликозилен донор, активиран с моно- или дифосфонуклеозвд, към достъпния въглерод на въглехидратна акцепторна молекула чрез гликозвдна връзка. Тези могат да бъдат пречистени от природни източници, а също и от източници, които са генетично модифицирани, за да представляват такива ензими. Семейството на гликотрансферазата вклгчпг еиолилтрннсферази, Nаце тилглгкозаминил трансферази, N -аце тилгалактозаминилтрансфе рази, фукозилтрянсферази, манозилтрансферази, гапактозилтрансферази и КДО трансферази.
С фразата НАДРНрегеиерационна система се означават допълнителни ензими, които рециклират НАДР, при in situ ензимна реакция, обратно до КАДРИ. В типичния случай, такава система се основава на алкохол дехидрогеназа, която превръща аклохол /изопропанол/ в кетон /ацетон/.
Фразата силилирани Люисови лигацди във функционален сми
- 10 съл означава молекула, способна да с? сзърж към ELAM рецепторни или GMF-140 рецепторни протеини. Химически дефинирани тези лигаади включват природните тетразахародни лиганди ньв х и sl·® и техни производни. Такива производни се получават при малки изменения, като например при заместване на хидроксилни групи с водород, алкилови, ацилоксилови, алкоксилови, халогенни, гликозилни и други подобни групи, гликални молекули, гликозилно циклично съединение, з което кислородът в пръстена е заместен със s или NH и техни алкидни, к^олородсъдържгици или ацилни производни, присъединяване на аиомерен въглероден атом към въглехидрати или органични молекули, изменение в ориентацията или положението на гликозздните връзки или заместването на енантиомери на природните захари.
фразата. стехиометрично съотношение” се означават такива количества от изходния продукт, които са празс пропорционални спрямо продуктите от реакцията. Един реагент е в стехисметрично съотношение към крайните продукти, тъй като той принципно се използва в реакциите, в резултат на които се получава крайният продукт и не се регенерира по време на процеса. Обикновено отехиочетричните съотношения се доближават дс съотношения 111 или 2:1 на изходния продукт към крайния продукт.
С фразата ”тривалентен фосфитилиращ реагент” се означава реагент, който взаимодействува с хидроксилна гр§?па на органично съединение, като образува фосфит-съдържащ продукт, който може да се окисли о помощта на окислител и да се получи фосфатно съединение.
Освен ако изрично не е споменато, всички тези дефиниции следва да. ое разбират както е посочено по-горе.
Съкращения
АгР, аденозин 5' -дифосфат;
ATP, аденозин 5 -трифосфат;
СМР, цитидин 5' -монофосфат;
С1Р, цитидин 5!-дифосфат;
CIP, цитидин o'- трифосфат;
C^P-ituAc, цитвдин 5' -монофосфо-Н-ацетилневраминова киселина;
₽«с , фукоза;
₽к, фукоза киназа;
₽ис-1-Р, фукоза 1-фосфат;
₽ес-Т, фукозилтрансфераза
Gal, галактоза;
GaliАс, м-ацетилгалактозамин;
gtp, гванозин 5*-трифосфат gdp-Puc, гванозин δ'-дифосфофукоза gup, гванозин 5 -дифосфат
GDP-Мап, гванозин 5' -дифосфо-маноза;
GDPManPP, GDP-маноза пирофосфорилаза;
gdpiucPP, GDP-Фукоза пирофосфорилаза
Gie-1-Р, гликоза-1-фосфат;
GicMAo, ж-адетилглккозамин;
МааЖАс, ж-ацетилманозамин;
жанр (маври) , никотинамид аденин динуклеотвд фосфат;
n*uас, м-ацетилневраминова киселина;
ммк, нуклеозид монофосфат киназа;
Ж, миокиназа рра»·, неорганична пирофосфатаза;
РК, пируват киназа;
PSP, фосфо/енол/пируват;
Руг, пируват;
РР1, неорганичен пирофосфат;
Pi, неорганичен фосфат;
Rha, рамноза;
udp, уридин-5' -дифосфат;
итг, уридин 5' -трифосфат;
udp-gic, уридин 5'-дифосфо-гликоза;
UJDR-Gal, уридин 5 -дифосфо-галактоза;
Много от използваните тук структурни формули съдържат само две или три групи, свързани с въглеродните атоми от цикъла. Следвайки установената практика, групите, които не са показани, са водородни атоми и тяхното свързване с въглеродните атоми не е означено, освен когато е необходимо да се представи стереохимията. В други формули,клинообразни плътни линии са използвани за означаване на връзки, които са насочени нагоре от плоскостта на листа, докато връзките, които се отдалечават от плоскостта на листа, са означени с пунктирани клинообразни линии. Вълнообразни линии са използвани за означаване, че и двата типа свързване /както / , така и рб -връзки/ е възможно.
На фигура 1 е представен типичният ход на конверсията на Зч^-маноза в ОДР-фукоза чрез окисление с ХЧАДРН, като се използват измервания на оптичната плътност (аьв)· Крива А: контролна кювета без QDp-маноза. Крива Βι както контролата, с изключение на това, че е прибавен 1 микромол ОДР-маноза. На ординатата са представени оптичните плътности при 340 нанометра, докато абци- 13 сата е в минути.
На. фигура 2, състояща ое от три части - фиг.2-А, 2-В и 2-С, са представени HPLC хроматограми за превръщането на СДР-маноза /а/ в СДР-фукоза /Ь/ при нулево време /2-А/ и съответно около три часа /2-В/ и около шест часа /2-С/ след иницииране на реакцията· На ординатата е представена относителната абсорбция при 254 нанометра, докато абцисата е в минути.
Фигура 3 представлява графика, която илюстрира синергичното прибиране на Zl,3 фукозилтрансфераза с гванозин б^дифосфат /6ДР/ и Съединение 50 в присъствието на 0,2 милимола ^^Ъ-ОДРфукоза и 20 милимола МпС12 при pH 6,2. Символите са както следва: празни триъгълници - без инхибитор; плътни триъгълници » 0,05 милимола 6ДР| празни квадратчета « 34 милимола Съединение 50} и празни кръгчета я 0,05 милимола СДР плюс 34 милимола Съединение 50. На ордината са представени реципрочните стойности на началната скорост на образуване на продукта (1/г) ,а на абциса са дадени реципрочните стойности на концентрацията на Н-ацетиллактозамин /ьасйАс)
Подробно описание на изобретението настоящето изобретение се отнася за in situ мултиензимен процес, при който въглехидратна акцепторна молекула се фукозилира с нуклеозвд 5^-дифоофофукоза при използване на фукозилтрансфераза, като нуклеозидът 5'-дифосфофукоза за предпочитане се генерира ензишо от каталитични количества нуклеотиди. Шж най-общо дадените по-долу схеми 1 и 2.
По-специално, това изобретеЛВ^йЩЙрени начини за получаване на предшествуван^ /прекурсорни/ нуклеотвдни захари, кои- 14 M;>nNAc
SUBSTITUTE SHEET ’Чш15
Scheme 2
то действуват като донорни субстрата за реакциите на гликозилтрансферази. Тези методи включват химични и ензимни начини. Хи· мическото подобрение се отнася до повищен добив и стабилност на мевдинните съединения на блокираните захари, изполвани за получаване на гликозил 1- или 2-фосфати, които от своя страна се окисляват до фосфата, които кондензират с нуклеозцдни моно· фосфати, като се получават нуклеозид 5'· дифосфо захари или нуклеотадни захари.
/фут аспект на това изобретение е разработването на мултиензимна система, обхващаща повече от една реакция на гликозил· трансфераза за синтез на въглехидрата, при което едно подобрение се основава на използването на каталитични количества нуклеотвди. Нуклеотвдите се регенерират от моно· или дифосфатна форма до трифосфатна форма, като едновременно с гликозилтрансфуразните реакции се използват jn 8ццензимни реакции. Могат да се използват каталитични количества нуклеотцц поради инхибиращия ефект на нуклеотидате върху гликозилтрансферазите»
Следващите патентни заявки на САЩ са тематично свързани с описаното изобретение! САЩ сериен i 07/670,701 от 18 март 1991; САЩ сериен К 07/707,600 от 30 май 1991 г; САЩ сериен К 07/738, 211 от 30 юли 1991 г, озаглавен ’’Олигозахарцдни ензимни субстрати и инхибитори: методи и състави; САЩ аериен И- 07/852,409 от 16 март 1992 г. и САЩ сериен '1' 07/889,652 от 26 май 1992 г. Всяка от тези пет патентни заявки е включена тук като цитат.
А. Фукозилидане
Един аспект от това изобретение фокусира върху използването на описаната и цитирана по-горе технология за фукозилирвне на въглехидрати. Фукизилирането е обичайна крайна модификация
- 17 за много биологично активни въглехидрати, като например Люисови антигени както оиалилирани, така и несиалилирани.
/1/ Фукозилтрансферази
Фукозилирането протича под въздействието на фукозилтрансфераза. Фукозилтраноферазите са добре известни и обзорна статия върху тях е публикувана в дду. Вп»удо1.. Sgs 44-56 /1981/. Въглеродният атом на акцепторния въглехидрат типично е член на цикъла на глюкоза, галактоза или N-ацетилглюкозашн, или техен аналог· О-гликозвдната връзка най-често е в с4,-ориентация. Най·обичайните места са 2-, 3- или 6-хцдроксилната група на галактоза, 3·, 4- или б-хидроксилната група на Н^ацетилглюкозамин или 3· или 4-хидроксилната група на глюкоза, Глюкал- и /5-тио/ глккоза-съдържащи захарвди също могат да бъдат приемащото захарвдно звено на акцепторен въглехидрат за фукозилтрансфмразни ензими.
Фукозилтрансферази могат да се изолират от природни източници или от рекомбинантни микроорганизми, които са се променили генетично така, че да представляват фукозилтрансферази. Пречистени природни фукозилтрансферази са описани от roster, J, Biol, Chem. 266:3526-5531 (1991)i Muramatsu, Bur. J. Biochia 157:71-75 (1986); Prieele et al., J. Biol, Chea., 256:1045610465 (1981). Фуквзилтрансферазни гени като клонирани и изразени са докладвани ОТ Campbell et al., J, Biol, Chem., 259: 11208-11214 (1984)» Larsen et al., Proc, Natl, Acad, Sol.. U.S.A.. 87:6674-6678 (1990); Kukowska-Latallo et al., Penes and Level.. ^:1288-1305 (1990); Weston et al., J, Biol. Chea.. 267:4152 (1992).
Обикновено фукозилтрансферазите са мембранно свързани. Следователно, непроменените фукозилтренсферази са неразтворими във воден разтвор. За да се улесни използването им при методите и реакционните системи от това изобретение, за предпочитане е използването на разтворими ензими, като неразтворимата цитоплазмена опашка се изчиства или се прави по-хидрофилна чрез селективно изчистване или добавяне на полярни аминокиселини. Природните, непроменени фукозилтрансферази, обаче,могат да се използват в настоящето изобретение чрез прибавянето на малки количества нейоногенни повърхностно-активни вещества като Тритон Х-100.
Фукозилтраноферазите са специфичен тип гликозилтрансферази. Активираната донорна молекула обикновено е нуклеотвд 5' дифосфофукоза. Реакцията генерира нуклеотида като жива група, а също и фукоза, притежаваща реакционно способен карбониев йон, който образува гликозидна връзка с достъпната хидроксилна група на акцепторната молекула.
/2/ Реакционни условия и субстрати при фукозилирането
Фукозилтраноферазите обикновено са гликозилази и еа относително твърди ензими. Реакционните условия, които оа подходящи за повечето гликозилтрвнсферази, са подходящи и за фукозилтрансферазите. Така например, подходящите реакционни условия включват температурен интервал от около 10° до 40°, като буфери могат да се използват органични и неорганични буфер!, като тяхното рй трябва да бъде във физиологичната pH област. Приемлив интервал на pH е от около 4 до около 9. Концентрацията на соли е от около 0 до 200 милимола. Когато ензимите не са разтворими във водната фукозилираща среда, се използват около 0,1 до около 1,0 процент нейоногенен детергент /напр. Тритон
- 19 X—100/. Често са необходими двувалентни катиони катомп2\ Въглехидратните акцепторни молекули са действително неограничени. Начинът не свързване е описан по-гореj обаче, остатъкът на въглехидратната акцепторна молекула не е критичен. Фукозилтрансфер&зите ся твърде толерантни към субстрата и освен акцепторната зжер, върху която е прикрепена фукозата и захарите в непосредствено съседство до акцепторната захар, останалата структура не субстрата няма съществено значение. Акцепторните въглехидратни молекули могат да бвдат построени изключително от захарни остатъци, включително монозахариди, от гликопротеини, от гликолипвди» от неприродни съединения, при които захарта, приемаща фукозата, е свързана към съединения като арил, хетероцикли, циклоалкани и ациклени въглеводороди.
Предпочитана въглехидратна акцепторна молекула завършва с Galfii,4Glc«Ac-x , където X е органична молекула. Примери за групите X са дадени по-нататък в текста. Като примери за въглехидратни акцепторни молекули могат да се посочат GalB1,4GlcSAc » Лактоза, Me u Ac 2,6Galfl1,4G1C»A®, Galfi1,5Glc MAc, GalBl,4глюкал /лактал/^cuAc 2,?ва1А1,4ГЛккал, 2-халосубс татуираните реакционни продукти на горните вшсали, GalB1,4(5-TMO JGlc, Gal21,4GlcHAcB-O-аЛИЛ.
SLex или£1еа аналогът може по този начин да включват халогенен атом нс. мястото на адиа от хидроксилните групи в пръстена. Намерен е нов метод за получаване на 3*или 3-хало- моно- и олигозахариди от техните съответни гликали при използването на хлорпероксвдаза. Получените 2/3/-дезокси-2/3/-халозахариди могат тогава да ое използват в синтезите, обсъждани другаде в това изобретение.
В съответствие с този метод, гликал се смесва с водороден
- 20 пероксвд, избран халогенен йон /хлорад, бромвд или йсдцц/ и каталитично количество хлорпероксвдаза /ЕС 1.11*10/ във воден буфер с pH стойност от около 2,5 до около 3,5 и се образува реакционната смес. След това получената реакционна смес се държи, докато се образува желаният продукт. Както е добре известно за специалистите, концентрациите на различните реагенти могат да варират. Примерни концентрации и синтези са дадени по-нататък. Така полученият халохидрояов продукт за предпочитане се извлича^ /изолира/.
Типични реакционни времена при стайна температура са около 15 минути до 2-4 дни. йодадьт ре&гира най-бързо, а хлоридът реагира най-бавно.
Обикновено се получават термадинамично предпочетените продукти, с изключение когато 1,3-диаксиалии взаимодействия предотвратяват образузането на 2-аксиално субституиран продукт. Когато в реагиралия гликал съществуват 1,3-диаксиални взаимодействия, в халохидратния продукт се наблюдава стереосяецифичност по отношение на или ^ориентацията на халогеняата група, като се образуват също и двата аномера на 1- или 2хидроксилната група, примерни синтези на 2- или 3-халогенирани въглехидратни акцепторни молекули и техни предшественици са илюстрирани по-долу в схеми 3, 4 и 4а.
Ерсюидратирането на сиалил Lex молекула, съдържаща краен глик^л /съединение Зс в схема 4а/, която има конференция в разтвор, подобна на тази на сиадад Lex, дава продуктите съединения 37а и 37b. ’1'ези продукти имат същата коаформация, какте съединениз 36 и сиалил Lex в свързващата доменна област, състояща се от MtuAc-Gal-Fue , както показват Ν0Ε изслед ванията.
- 21 Бромирани захариди могат да се получат също при използване на N-бромзукцинимвд /НВб/ в разтворител ацетонитрил-вода. Този метод може да се използва за изменение на съотношенията на образуваните продукти; така например съединенията 32 и 33 се получават в еднакви количества при ензимната реакция и в съотношение 1:2,5 /32:33/ при използване на MBS. 3-хало съединението 35 и неговият изомерен халохмдратиран продукт съединение 35а се получават в съотношение 2:3 /35:35а/ при използване на реакцията с NBS, докато при използване на ензимната реакция се получава единствен изомер - съединение 35.
Схема 3 илюстрира бромкидратирането на Д-глккал, Д-галактал и Д-фукал и образуването на съответните 2-деокси-2-броммонозахариди * съединения 20, 21, 22 и 23. На дъното на схема 3 също е показано бромхидратирането на сиалал, съединение 34, с хлорпероксидаза /СРО/, при което се образува съответната
З-деокси-З-бромсиалова киселина.
Схема 4 илюстрира хлор- и йодхидратиране то на галактал с образуването на съединения 25, 26 и 27. Също на схема 4 е показано бромхидратирането нааац,з глккал /съединение 28/ и Gal 1,4 глккал /съединение 31/, при което се образуват съответните Λ- и Дй-деокси-2-бром-съединения, съединения 29 и 30, съответно съединения 32 и 33.
Scheme 3
(83% общ добив)
соон
Scheme 4
15$ добив, а/а=з основен продукт, ' о7% добив
СРОЛ2О2, ΚΙ, рНЗ мин със или без хлорпероксидаза
63% yield β/α = 3
(32/33=1)
SUBSTITUTE SHEET
Активираният донор на фукоза, нуклеозед 5 -дифосфофукоза, най-често съдържа гванозин; съществуват обаче и алтернативни донори,като например нуклеотвд, съдържащ всякаква Lrsaxap, като L-рамноза и L-идоза.
За да се свърже фукозилтрансферазната реакция с втора гликозилтрансферазна реакция, просто се използва предимството, че оптималните реакционни условия за повечето гликозилтрансферази съвпадат. Така, дадените реакционни условия за която и да е гликозилтрансфераза позволяват действието на известните фукозилтрансферази. Като се използват реакционните условия, дадени по-горе за фукозилтрансферазите и като се използва рутинно титруване, могат да се уточнят реакционни условия, подходящи за синтез на фукозилиран олигозахарвд при използване само на монозахариди·
Обикновено при подбора на реакционните условия за множествени гликозилтрансферазни реакции в единствена реакционна смес, трябва да се вземат предвид температурата, pH, осмотичната активност и йонния състав на разтворителя, както беше посочено по-горе. Когато една от гликозилтрансферазите е фукозилтрансфераза, приемливите реакционни условия включват интервал на pH за предпочитане мевду около 6,0 до около 8,5 и най-предпочетено мевду около 7,0 и о. оло 7,5. Могат да се използват двувалентни катиони катомпк* а «елатообразуващи агенти за двувалентни йони не са необходими.
Буферите не са критични. Подходящи са водни буфери като например НЕРЕЗ . Осмотичната активност на буфера е мевду 100 т08Ш до около ЗООтовш.
Горните условия, при които действуват ензимите, се означават з това изобретение като биологични реакционни условия.
Реакционните времена варират със субстратите, ензимите и температурите. Обикновено реакционните времена са от 24 до 96 часа.
При определени обстоятелства, когато се използва галактозилтрансфераза и монозахарадният акцептор има агликон в едно положение на глккозата в (/-ориентация, реакционните условия могат да включват лакталбумин, за предпочитане <У-лактолбумин.
Например, реакцията със сиалилтрансфераза, описана от iChikawa et al., J, Amer, Chea, Soc.. JU*4698-4700 (1991), може да се свърже с рекомбинантна човешка Люисова ,/(1,3/4) фукозилтрансфераза, както е описано от Kukoweka-Latallo et al. Genes and Bev·1.. 4: 1288 (1990) · Използва се основната реакционна смес на воден буфер (hepes) с pH в интервала 7,07,5, подходяща концентрация на соята е 50-200 милимола. Реакцията се провежда при около 37¾.
В. Специфичност на субстрата и изучаване на инхибирането Η9..^ΜΚ03.Μ.ΐ^Η^βρ&3Π
1.3/4₽чсТ. Фукозилтрансферазата, която може да пренесе £ис-частта от gdp-euc към хидроксилните групи на 3- ш4- място в gicBac , за да се получи Lex или ь»а е оС1,3/4₽чсТ. (Fukowska-Lattallo et al., Gene & Development. 4:1288 (1990); Dumas et al., Cheat, Lett.. 1 :425(i3?o)> Както се визда от таблица 1 по-долу, ензимът катализира фукозилирането на Galfil, 5G1CKAC по-бързо /V0TH 580/, ОТКОЛКОТО на GalB1,4Gle»Ac (LacN нс) Аота 100/ /Къ 1 и 4 в таблица 1/ при концентрация на въглехидратния акцептор 10 милимола. Силалилиран LacMAo Л 7/ също е субстрат за този ензим, който дава зъзможност за синтезиране (-uumas et al., Bioorg. * bed. Chea. Lett.. 1:425 (1991))
- 26 на смалил Lex. Интересно е, че GalB1 ,4(5-tmo)gi© (GautheronLe harvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Connnun., 1130 (1991);
Wong et al., J, Am, Chem. Soc., 113:8137-8245 (1991))e ПО-ДОбър субстрат, отколкото съответния дизахарид, лактоза /W 2 и 3/ при тези условия. Всеки от субстратите от таблица 1 съдържа като съставна част въглехидратен акцептор за фукоза, пренасяна от фукозилния донор с помощта на този ензим. GalBi,4дезоксинойримицин (Gautheron-Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem.
Commun.. 1130 (1991); Wong et al., J, Am. Chem. Soc.. 113:81378245 (199D) ( № 11?, обаче е инхибитор /IC§q 40 милимола/. Поради ограниченото подаване на У1,3/Рцс не бяха проведени понататъшни изследвания.
СХЕМА 4а
37a(Ri«H,Rl=Br) 37b (Ri=Br, RJ=H)
- 27 Таблица 1
Дизахариди и тризахариди като субстрати или инхибитори за /11,3/4 фукозилтрансфераза
i | C у 6 c t p ат и | va OTH |
1. | GalS1,4UlolAc | 100 |
2. | Gal£1,4Glc | 120 |
3. | GalS1,4(5-TMO Gle)® | 310 |
4. | GalB1,3GleJiAe | 580 |
5. | GlcMAeS 1,40101 Ac | 23 |
6. | Galfl1,4GalBAc | 27 |
7. | ii euAc od 2,3GalS1,4G lol Acd | 60 |
8. | Fuc^Z 1,2GalB1,4Glo* | 250 |
9. | GlclAcSI ,6GalS1,4Gle® | 13 |
Инхибитори | I050 (.И) | |
10. | GalS 1,4( 3-ДвОКСИ )GlelAeGQd№A ® | >125 |
11. | G alfl 1,4 деоксинойримицин ® | 46 |
12. | GalS1,4 ГЛЮКаЛ0’1 | >125 |
Относителни скорости с 0,20 mM gdi-Fu® 20 тМ мпС12и 10 акцептор. Специфична активност · 2 и/eg (1U« 1 pmol udp -fuc консумиран за час/. концентрация на инхибитора, която е необходима за получаване на 50$-но инхибиране с 0,2 щм gup-Fuc.
®Gautheron-Lelarror, С et al., J, Chea, Soc, Chea, Coaaun..
4991» 1130? Wong, C.-H. et al., J. Am, Chea, Spc..1991, 113 6137. d Продава се ОТ Oxford GlyeoSystems, Inc., Rosedale, lew York. *Продава се от Sigma, St.Louis, MO. fhawort,WK. et al., J. Chea, Soo., 1930, 2644.
- 28 1.3¾ сТ. Ензимът, който е отговорен за получаването на сиалил1ех . е човешка плазма тип 1,3½ сТ, който напоследък беше клониран, преекспресиран (Weston et al., J, Biol, Chea.» 267:4152 (1992)) и използван при синтези. Специфичността на субстрата посочва /таблица по-долу/, както може да се очаква, че ензимът е по-специфичен заЬасилс (v/Kffi 2,9 , 1), отколкото заGalB 1,30101 Ao (v/ijg о,22 , 5). Подобно на резултатите за с/1,3/4₽исТ 3 в таблица 1/, GalBl,4 ( 5-thq)gic също е субстрат за«Д₽исТ /!?3 в таблица 2/. За разлика от ензима/1,3/4 лактал /Ж 6/ е субстрат за ензима .<1,3 ·
Тризахаридът J»eiiAoZ2,3Galfi1,4GlelAc /^7/, прекурсор /предшественик/ за сиалилъ·* » е най-добрият субстрат с относително максимална скорост от 620 процента спрямо LaciAc . /2,6-свързаният сиалозид / 10/ е около 50 пъти по-слабо активен като субстрат в сравнение с ei2,3 - изомера. Трябва да се отбележи, че ензимът може също де пренася фукоза към глюкалсвдържащ сиалилиран тризахарвд /VQTH 330 процента, « 9/.
По отношение на свързването, ензимът има по-висок афинитет към дизахариди / ВБ 1, 3, 4, 6/, отколкото към тризахариди. Наблюдавано е повишаване на афинитета, когато oiciAc частта на LaelAo се замести С 5-ТИО- Gic, глюкал (Haworth et al., J. Chea.Sec.. 2644(1990) или алил. Лактозата, обаче, има много слаб афинитет, въпреки че относителната скорост при ^мако е твъРде висока /130 процента/. Всеки от субстратите от таблица 2 е въглехидратен акцептор за фукоза от фукозилния донор при използване на този ензим.
-29ТАБЛИЦА 2
Дизахариди и тризахариди като субстрати за 1,3фукозилтранофераза
i | Субстрати | Kffi (ай) | V& OTH |
1. | GalB1,4GlcNAo | 35 | 100 |
2. | GalS1,4Glc | 500 | 150 |
3. | GalS1,4(5-fHO Glc)b | 12 | 51 |
4. | Gal8l,4&lcMAcuO НЛИЛ 0 | 16 | 64 |
>. | GalS1,3G1oNAc | 600 | 130 |
u. | Galal, 4ГЛ1Жал b»d | 34 | 10 |
7. | NeuAc Z2,3GalS1,4GlcNAc· | 100 | 620 |
8. | NeuAc t<2,3,GalBl,4GlcNAcB0 ВЛИЯ* | 280 | 380 |
2» . | NeuAc c<2,3GalB1,4 Глюкал* | 64 | 330 |
10. | NeuAc <<c,6Gala1,4GlcNAc® | 70 | 13 |
Относителни максимални скорости с 0,^ gdp-Fuc · 10nt Μηθΐ£ и 10mh Gaifli ,4GicKAc .Специфична активност « 2t6U/mg (1U 1 jMnol OTGDP-fuc, консумиран за един час). bGautheron-Le Narror,
С., et al. J, Chem, Soc, Chem. Cowman., 1991. 1130.; Wong, C.
H. et al.. J, Am. Chem. Soc, 1991. 113, 8137. dHaworth, W.N. et al., J, Chem. Soo., 1930, 2b44. * Предлага се от oxford Glycoeysteme, Inc. Rosedale, New York.* Получен е ензимно в настоящето изследване при използване на X 2,3сиалилтранофераза от Cjrt.l Co. eIohlkawa, V.«t al., J, to, Ch.m. Soo.
15,91. 113, 469b.
- 30 При валето изследване на шфибирането на χ1,3₽αοΤ /таблица 3, по-долу/, наблюдението, че з'-деокси- ЬасКАсЗОалил (Gauthегон-Ιλ herror et al. , J. Chem, Soo, Chem. Commun,, 1130 (1991)ί-Wong et al., J. Am. Chem. Soc. , 113:6137-6245 (1991)) е слаб инхибитор 5/, е в съгласие с предишното съобщение върху деоксигенирани олигозахариди за гликозилтрансферази. (Hindsgaul et al., J, Biol, Chem. 266:17656 (1991)1 Мевду изследваните акцепторни въглехидратни субстрати най-мощният инхибитор © Gaisi,4 деоксинойримицин Λ 4, ICgQ » 8 милимола/.
Две аза захари (Kajimoto et al. . J. Chem. Soc..113: ьб79 (1991)) , за които е известно, че са мощни Z-фукозидазни ипхибитори, бяха изпитани като акцепторни аналози /й 8 и 9/ и беше установено, че те са умерени инхибитори спрямо ЬасЬАс за Fuel /10 около 34 до около 52 милимола/. Деоксинойримицин, обаче, беше субстрат за Zl,4GalT. Uong et al., J. Am. Chem, Soc..113:8137-8145 (1991)) .GDP-Man също е мощен инхибитор на (Zl,3Fucr /ΙΟ^θ 2 милимола/.
При изучаване на инхибирането нашето внимание беше съсредоточено върху отделяния се нуклеозид дифосфат.спг е страничен продукт на ензимното фукозилиране и е много мощен инхибитор спрямо lacNAc (κιχ* О,13вм, κ1β» 0,16п& , Н? 10), без всякаква конкуренция. Друг нуклеозвд дифосфат,ивг , който се отделя при ензимното галактозилиране, също е много мощен инхибитор на Gall (к± » 0,46»м) . Gur-buc е мощен инхибитор на </l,3PucI при концентрация над 0,2 милимола з присъствието на 10 милимола lacNAc · Той обаче не е инхибитор на ^зДУисТ.
Освен аза захарите № 8 и 9 в таблица 3, други аза захари като съединения 51, 52 и 53, дадени по-долу, също инхибират активността на Z-фукозидаза, също както и съединение 50 Д 9 от
- 31 таблица 3/. Съединения 50-53 имат Kj_ стойности с този ензим съответно 4, 22, 8 и 1,4 микромола. (Виж също Dumas et al., Bioorg. a Med.. Chem. Lett., 2:35 (1992).)
Освен съединение 50, сега беше установено, че съединение 53 също е конкурентен инхибитор на Z-1,3 фукозилтрансфераза от типа на човешка плазма. ΙΟ^θ стойността спрямо ЬасКАс беше 80 милимола. Освен това, GDP , който се образува по време на реакцията на фукозилиране от Ш-Рис и е неконкурентоспособен инхибитор, когато присъствува в неговата ΙΟ^θ концентрация от 0,05 милимола, проявява подчертан синергичен ефект на инхибиране в присъствието на съединения 50 или 53. Примерни данни от изследване на инхибирането при използване на съединение 50 са представени на фигура 3. Този синергичен ефект може да се дължи на взаимодействието между GDP и аза захарта в активната частица на ензима, така че да се образува комплекс, който наподобява структурата на преходното състояние на реакцията на фукозилен пренос.
Горните резултати предлагат процес за инхибиране на гликозилтрансферазна реакция, като например фукозилтрансферазна реакция. Съгласно този процес, гликозилтранофераза, като напри
- 32 мер oZ1,3-фукозиятранофераза от типа на човешка плазма, въглехидратна акцепторна молекула, като например LacN Ас , активирана гликозилна донорна молекула, като например gdp-Iuc и инхибирацо количество от аза захар, като например съединение 50 или 53, се смесват във водна среда и се поддържат при условия на биологична реакция за период от време, достатъчен за инхибирането на гликозилтраноферазната реакция.
По-предпочетено е присъствието също на лнхибиращо количество от нуклеозвд дафоофатен продукт от реакцията на гликозилиране, като например 1Ш иливв? , където гликозилиращият донор е GDP-Fuc . Инхибпращите количества на аза захарта и на нуклеозвд дифосфат, когато те присъствузат, трябва да бъдат най-малко 10 процента от техните индивидуални IC^q-стойнооти, а още по-предпочетено е тези количества да бедат най-малко 50 процента от техните индивидуални стойности на IC^q, измерени in vitro , както се обсъжда по-нататък за инхибирането на дадена гликозилираща реакция. Могат да се използват също и концентрации повисоки от стойностите на ΙΟ,^θ. Тази реакция на гликози^иране обикновено се инхибира най-малко с 25 процента и по-предпочетене най-малко с 50 процента.
Инхибирането на гликозилирането може да протича in vitro или vivo . Примерно изследване на in vitro инхибиране е илюстрирано по-надолу. При in vivo приложение, ензимът, гликозилните донорни и акцепторни молекули и gdp присъстват в опитно млекопитаещо същество, което може да бъде лабораторна мишка, плъх или заек, а също и човек. Аза захарта се въвежда в опитното животно при използване на обикновените методи за въвеждане на лекарства, които са добре иззест ги на специалистите. При желание могат да се въвеждат допълнителни количества GDp
GalpMGlcNAc
GaipUGalNAc
GlcNAcpl,4GlcNAc
GDP-Мм
Gaipi,4Glucalb
G aip 1,4Deoxynojirimycinb
Galp 1,4(3-deoxy)GlcNAcPOallylb
ТАБЛИЦА 3
Инхибиране на <£1 ,.3FucT δΐ
Инхибитори IC§o
NT
N1 >100
710
N1
0.05* концентрация на инхибитора, необходима за постигане на 50$ инхибиране с 0,1шМ GDP-Fuc, ЮшМ Мп2+ и 10шМ ЬасКАпри pH 6,2 и 37°С.bGautheron-Le Narvor, С. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 11 3O.cHe се наблюдава инхибиране при концентрация на инхибитора до 50тМ. dKajimoto, т. et al., J. Am. Chem. Soc.,1991. 113, 6679.
eKi= 19 + 3 mM. еКи = 0,15 +0,05 mM, Κ£β = 0,16 + 0,06 mM
- 34 Условията на биологичната реакция ое определят от тялото на опитното животно /или човека/. Добавената аза захар се поддържа в организма на опитното животно,докато се изхвърли или катаболизира.
С. Химически и ензимни начини за получаване на
Реакцията на фукозилтрамоферазния цикъл може да се води или чрез добавяне на стехиометрични количества от подходящ захарен нуклеотид, като например СДР-Фуиоза, или , за предпочитане, захарният нуклеотид може да се генерира от каталитични количества РЕР и Ман -1-Р или ₽ио-1-Р·
СДР-фукоза е предпочитаният активиран захарен донор за известната фукозилтрансфераза. Тя се произвежда трудно и е скъпа и за другите реакционни цикли, описани тук, се предпочита нейната синтеза да включва Bittt регенериране на нейния нуклеотидни предшественици. Общата схема е представена в цикъла на фукозата на схема 1.
Химическите синтези на СДР-&с се основават на свързването на фукоза 1-фосфат и активиран G14P, като например №-морфолидат. Виж най-общо (a) Kochetkov et al., Ad», Carbohydr, Chem. giochem., 28:307 (1973); (b) Molfat, Methods Znsymol.. 8:156 (19bb); and (c) Roseman et al., Am. Chea. Soc., 82.:659 (1961), Поради относително високата лабилност на фукоза 1-фосфат и ОДР-₽чс( химическите добиви, които се съобщават за синтеза на ₽ис-1-Р и реакцията на свързване на ₽ис-1-Р и GMP-производното, са ниски. Докладвани са различни синтези на фукоза 1-фосфат. Тъй като от захарните нуклеотиди само ₽чс-1-Р притежава термо
- 35 динамично нестабилна β -фосфатна част върху аномерния център на фукозата, трудно може да се осъдестви контрол върху стереохимията на аномерния център. 3 това изобретение се предлагат два ефективни начина за G-ДР-Яис: един чрез химически, а друг по ензимен метод·
Първият химически синтез на СДР-Fuc е проведен от групата на Barker (Kunes et al., Can. J. Chea.. ^:2086 (1881)) ·
За получаването на фукоза 1-фосфат те използват 2,3,4-три-Оацетил-/-L-фукоза, получена от съответно бройно производно, със следваща фракционна кристализация и фосфорилиране на получения/-аномер. Групата HaHind.gaul Ifiokhal·, Can. J, №... o3:1063( 199Q) използва реакция на гликозилиране на ецетофукозилбрсмвд и дибензилфосфат тетрабутиламсниева сол за получаване на сравнително нестабилен гликозил фосфат /< 10 мин при хроиатографиа със силикагел/.Sohmldt ,t (Seteidt et al11.01«, Ann. Ch.».· 121’121(1^) използва фукозилимидат и получава продукта на гаикозидиране с висок добив без използване на Люисова киселина като катализатор. Групата наУап Boom (Weaterduinn et al., Теtrahedron Lett.. *ίΖ*·ΐ211 /986)) използва тривалентен фосфитилиращ агент върху 2,3,4-три-0-бензил-фукоза и я превръща в /-фукозил фосфат.
Тук са описани два подобрени подхода за химически синтез на ОДР-фукоза /виж схеми 5-7 по долу/. Единият подход, схема 5, използва реакция на гликозилиране на бензоилиран (Вя^ фукозилбромид /съединение 3/ и дибензилфосфат. Използването на бензоилна група като защитна група, вместо ацетилна, дозезда до повишена стабилност на фукозилното производно и подобряване на стереоселективността на реакцията на гликозилиране. Гликозилир&нето на съединение 3 и либензилфссфатщд^^ а1
Res., 2QQ. 119 /1991// протича много гладко и присъединителният продукт се получава като единствен продукт с добив от 95 процента. Както се очаква, съединение 4 е достатъчно стабилно, за да бъде пречистено в колона от силикагел />3 часа/; пречистеният материал, обаче, е нестабилен. Когато пречистеният продукт /съединение 4/ се остави през нощта при стайна температура, се наблщцава известно разлагане и аномеризация на съединение 4. Трябва да се отбележи, че пречистеното съединение 4 се използваше веднага в следващия етап. Отстраняването на защитните бензилни (в») групи от фосфата и на бензоилните групи се провеждаше степенно, както е описано в предишно съобщение (Gokhale et al., Can J, Chem.. 68:1063 (1990).
При другия използван подход тривалентен фосфитилиращ реагент, като например дибензил М, N-диетилфоофороамидит /ДДР/ се използва за получаването на дихидроксиацетилфосфат /ДНАР/ /Виж схема 6 по-долу/. (Pederson et al., Tetrahedron, 2643 (19ь1)) · Така, 2,3,4-три-О-ацетил фукоза, съединение 7, получено чрез химическо или ензимно деацетилиране (Hennen et al., J» Ore, Chea.. 53:4943 (1988)), се фосфинира с ДДР в присъствие на тетразол. Реакцията протича гладко, като се получава със 79 процента добив съединение 8, съединение с формули I и II, което се окислява до съответния фосфат - съединение 9. Отстраняването на защитните групи от съединение 9 се провежда по начин, подобен на получаването на съединение б от съединение 4.
Реакцията на фосфитилиране при използване на (вмо2 )иш2 /да/, илюстрирана на схема 6, е твърде полезна за получаване на различни фосфити и съответни фосфати с високи добиви. Други примерни съединения и подробности се обсъждат по-нататък в
- 37 СХЕМА
(ВлО),Р(О)ОН AfcCO,
CH,CI,-Ei,O· CHjCN
1) H^Pd-C INNaHCO, ЕЮН
H3C “Р(0)(0Вп)5
ΓοΒζ
ΒϊΟ
2) aq.NaOH
3) Oowax 1-Χ8 [НСО,·]
HjC
Ο- Ρ(Ο)(ΟΗ)2
^OAc £oac | |
AcO °Ac | |
i |
BnNH/THF orPPL
H)c5 | Г-о- | W-OH ?0Ac | (BnOhPNEi, |
THF | |||
AcO | OAc | ||
7 |
THF
30» HjOj
1) Hj/Pd-C EtOH-Ν NaHCOj
2) NaOH/HjO
раздел Η.
₽цс-1-Р ефективно се активира чрез превръщане в триалкиламониевата сол чрез взаимодействие с гванозин-5 -монофосфоморфолидат /1:2/ в разтворител, като например пиридин. Продуктът GflP-Fuc, съединение 12, се пречиства при използване на конвенционална колонна хроматография. Тези реакции са представени в долната схема 7 .
GDP-Fuc /2/ Ензимно получаване на G-ДР-фукоза
За ензимно получаване на &ДР-фукоза се съобщава от Schacter et al., Methods of Enzymol. , > 28^285 (1972), като се използва фукоза киназа и G-ДР-фукоза пирофосфорилаза от свински черен дроб.
Както лесно можем да си представим, тази многоензимна реая кция може да се постигне при използване на комбинация от ; -----
- 39 различни ензими и субстрати с висока енергия. Примери за тази многоензимна система са представени в реакционния цикъл на фуг козата, показан на схеми 1 и 8. При него фукоза се добавя в стехиометрично количество заедно с РЕР. Каталитични количества РК, РК и G/P-PucPP се добавят заедно с АДР и G-ДР. Реакцион ните условия са подобни на тези, описани по-горе за трансфера зите.
СХЕМА 8
/3/ Маноза като изходен материал
Алтернативно, G-ДР-Рис може да се получи ефективно при приготвяне на 8ДР-маноза и следващо ензимно превръщане в G-ДР-Рис. Предшественикът на G-ДР-Маи е Man-1-P, съединение 18. Маи-1-Р се получава при използване на същия подход, както беше описано при получаването на фукоза -1-Р. Предпочита се използването на ацетилни блокиращи групи, както е показано по-долу в схема 9.
- 40 Алтернативно, Man-1-P може да се получи ензимно по начин, аналогичен на Gic-1-Р.
(BnO)jPNElj
THF
30% H2Oj
THF
OP(OBn)j
15·
OPOfOBrOj π
1) Hj/Pd-C EtOH-Ν NaHCOj
2) NaQB/HjO
Ензимната синтеза на G-ДР-фукоза от маноза 1-фосфат с in situ генериране на G-ДР-маноза се постига чрез комбинирането на две ензимни системи: G-ДР-маноза пирофосфорилаза и G-ДР фукоза синтетични ензими. За образуване на ОДР-фукоза е необходимо регенериране на ИАДРН. Таково регенериране може да се постигне при използването на МАДРН зависим-а алкохолна дехидрогеназа от Thermoanaerobacterium brokii в присъствието на изопропанол или на гликоза фосфат дехидрогеназа в присъствието на гликоза. вДР-маноза пирофосфорилаза може да се получи от дрозщи, както е описано по-долу; описани са, обаче, също и други източници, като например Arthrobacter (Preise et al.,
- 41 ., phgm., 2½%:5119 (1964)), IflgfafXlShlt Mil (Liberman et a1·» J» Bact.. 101 i 965 (1970)), както и от млекопитаещи (Smoot et al., Bur, J, Biochem.. 148:83 (1985)).
Превръщането на G-ДР-фукоза от ОДР-маноза за пърди път се съобщава ОТ Ginsburg и Kirkman (Ginsburg et. al..JJAm.Chem.Scc. ^2:3481(1958 )). Ензимът е пречистен частично и е използван за демонстриране на превръщането на G-ДР-маноза в ОДР-фукоза от
A.aerogenes /АТСС 12656/, който понастоящем е преименуван в Klebsiella pneumoniae (Ginsburg. J, Biol, Chem.. 235:2196
I960 · Реакцията е ПАДРН зависима. Yamamoto и др. също съобщават за синтеза на СДР-фукоза от СДР-маноза при използване на ензим, получен от Aqrobaoterium radiobaster (Yamamoto et. al. , Aqric. Biol, Chem.. 48:823 (1984)).
Тутс c описано превръщането на маноза-1-фосфат в (ЗДР-фукоза с in situ генериране на G-ДР-маноза. Маноза-1-фосфат се превръща в ОДр-фукоза чрез съчетаване на две ензимни системи, 6ДР-маноза пирофосфорилаза и ОДР-фукоза синтетичен ензим с регенериране на КАДРИ. Въпреки че първоначалните резултати показват, че добивите са ниски, може да се очаква, обаче, че при постигане на по-висека активност на ензима, добивът може съществено да се повиши. Тези реакции са представени на схеми 10 и 11.
За синтезата на фукозилиран слигозахарид беше използвана съвместно действуваща регенерационна система, в която отделеният ОДР се превръщаше в GTP с помощта на фосфоенолпируват /РЕР/ и пируват киназа /РК/ и полученият КАДР се превръщаше в КАДРИ с 2-пропанол в присъствието на алкохол дехидрогеназа. При използване на 1,3/4 фукозилтрансфераза GaiBi,3Gi©MAo се превръщаше в GalBl,5(i‘ucc/.l,4)GicNAc (Dumas et al., Biomsd,
Chem. Lett., 1.:425 (1991)).
Scheme 10
GDP-Man pyrophosphorylue
isopropanol acetone
Scheme 11
NADPH
O-GDP
°*CDP Intermediates междинни съединения
- 4j Д. Рециклиране на нуклеотиди
Тъй като гликозилтрансферазите често се инхибират от нуклеотиди, предпочита се концентрацията на нуклеотида да се поддържа минимална. Регенерацията на нуклеозид трифосфати от нуклеотидни донорни захари позволява използването на каталитични количества нуклеотиди, което ефективно елиминира несвоевременното инхибиране на активността на гликозилтраноферазата. Регенерирането на нуклео-тидите е благоприятно, тъй като връзките с висока енергия на молекулите на нуклеотидния фукозилен донор налагат изискването реакционните условия да бъдат благоприятни за ензимните реакции както на пируват киназа, така и на гванозин 5 -дифосфофукоза пирофосфорилаза. Примери за рециклиращи се системи са показани по-долу в схема 12.
СХЕМА 12
Тези регенерационни системи на активирани донорни лонсзахариди поддържат реакциите на гликозилтрансфераза. Регенерационни те системи включват активиран донорен монозахарид и ензимите за регенериране на активирания нуклеотиден захарен донор от съответния фосфатен донор, нуклеотид и захарен донор. Ензимите в регенерационната система включват кинази, като например пируват киназа, ацетилкиназа и 1,6-дафосфо фруктокиназа, и нуклеотвдзахар-фосфорилази, като например G£P-₽uc-PP. Фосфатните донори включват РЕР, ацетилфосфат и Д-фруктоза 1,6-дифосфат.
Някои фосфатни донори могат да иадбират активността ма други ензими в системата и затова донорите трябва да се подбират внимателно. Нуклеотидът, който се фосфорилира от киназата, трябва да се избере така, че да действа като подходр., субстрат за нуклеотвд-захар-фосфорилазата·
Регенерационната система, описана по-горе, може да се инхибира по механизма на подаване в обратна посока, ако концен. трацията на неорганичен пирофосфат е висока. Използването ма каталитични количества от неорганични пирсфосфатази дава, възможност за коригиране на този проблем.
Е. Сиалилни Лхясови лиганди
Предпочитаните крайни продукти, получени по методите, описани в това изобретение, са фармацевтично активни въглехидрати. Тези продукти включват сиалилни Люисови лигаяди./Виж схеми 1 и 13· Групата R на схема 13 може да бш водород или органична група X, както беше отбелязано по-горе/. Сиелилните лиганди се дефинират като съединения, които се свързват към избирателен рецептор, както е описано от Polley, et al., ггос.к&и. Acad, Sol., U.S.A.. 88:6224-6228 (1991) . Т®ЗИ ЛИГаеди се
NeuAca23Gaipi.4GlcNAcpOR отличават о техните крайни структури, съдържащи анална киселина и фукоза, намерени върху глижопротеини и гликолипида· Тези лнгацди включват природните лиганди сиалилЬех (SLex) и смалил Lea (8Ьеа) . Тези лигавди по-нататък включват неприродни ана» лози, които са свързани по подобен начин към природните рецептори на лигавдитв. Така например, лигацдни аналози могат да ое получат о акцепторни олигозахарвдни анолези за гликозилтранвферали. Добре известни са различни акцепторни аналози и те включват деокоигенираните олигозахариди, опивани от Bindagaul et al., J, Biol, Che·.. j&fce17858-17862 (1991).
Лигавдни аналози могат лесно да ое получат при използване на описаните по-горе реакционни методи и те лесно могат да се изпитат при използване на анализите, описани по-долу. Така например, рецепторите различават лигавд, който е модифициран в природната си част чрез реакция на егшмеризация fот С1сйас в GaiUAc) , или промяната в ориентацията на една от гликозидните връзки /от/2,6 в Л2,6 връзка/. Примерни методики са описани по-долу.
Гммиюзитмм». Разработени са две многоензимни системи за синтез на ЬаоИАв чрез in eltu регенериране. Едната започва с с1с—1—1? и използва vdp-gi© пирофоофорилаза (вс 2.7.7. 9, UDPGJ?) (Wong et al., 4, Ora. Che».. ££:5416 (1982); Aug· et al., Carbohydr, Ko».. 151:147 (1986); Thlea et al., Amtew. C&tffx-JPt...BdtKngjLj, JO: 1165 (1991); Thle· et al., Щ&ШЛ 141 (1992)). Това е показано на схема 14 по-долу, където ЪАоь1овоалил /съединение 40; X е О-алил/ е използван като примерен акцептор за Gali . ииг-галактоза ое получава от ubt-gi© с и mi ; обаче, това равновесно дозезда до образуването на ид?-б1о и затова gio-1-ϊ трябва да ое получи отделно. Gic-1-р i
wf
- 47 СХЕМА 14
2Pi може да се получи при използване на реакцията на фосфитилиране, обсъдена в това изобретение.
Другата използва Gal вместо Gic-1-Р като донорен предшественик и uppgp, галактокиназа (GK; EC 2.7.1.6) и Gai-1-Р уридилтрансфераза (Gal-1-Р UT; ЕС 2.7.7.12). Това е показано на долната схема 15 при използване на 1- C-Gal, което е показано на схемата с плътната точка в положение 1. GK е специфична за галактоза, като дава възможност за прякото получаване на Gal1-Р, която се превръща в UDP-Gai с Gal-1-Р ит и UDP-Cic. Показано е, че последната система е подходяща за получаване на (Gal-1-13C)-LacNAc.
PPasc
X
- 49 Многоензишата система /схема 15/ започва с 1-13С- Ga^, /99 атомни процента, предлагана от ie©t·· ine.t Miaaleburg. OH/, GleBAeBOaJOU /съединение 40/ » (L«· et al., c&rbohydr. &JU. 22’193 < 1974)X фоофоенолпируват /РЕР/ и каталитични количества Sbe-IP, ATP и иир t иде ce превръща в ит? с пируват киназа /РК; ВС 2.7.1.40/ и PEP, а взаимодейства о 61« -W под каталитичното действие на , като се получава vdp61« . Страничният продукт неорганичен пирофосфат (??1)се разлага от неорганична пирофосфатаза (РРаее ; ВС 3.6.I.D. CGai-1-Р ит , илр-Gic реагира с ^%-Gal -1·Ρ, генериран от ^ба1и АТР в присъствието наб! , като се получава UDP-13c-Gai и @1·-
1-Р. *%-ва!частта на Ш№-13с-Са1 се прехвърля върху акцептора (GieiieBO алил) с помощта на 6<ιτ , като се получава (Gai-1 -^^С)-съдържащ ЬаеЯАеа о алил /съединение 41/.Полученият шм? отново се превръща в VTP чрез взаимодействие на РК и РЕР, които реагират с освободения 61c -1-Р, като се регенерира оп₽Gio . При използването на тази многоензимна система (Gal-1-Ц) ЬаеМАеВО алил се получава с добив 54 процента. Същата методика беше използвана също и за получаването на небалязан ЬаеЖДе и аналози. Примерни аналози 41а-о са илюстрирани в схемата.
Сиалилиоане. ^дна ююгоензимна система за сиалилиране започва сМвмАо, (Gai-i-15c)-ia· мдев о алил, РЕР и каталитични количества от АТР и СМР, както е показано на долната схема 16. СИР се превръща в СДР с помощта на нуклеозвд монофосфат киназа /ЕС 2.7.4.4., НКС/ в присъствието на АТР, който се регенерира от неговия страничен продукт АДР, катализирано от РК в присъствието на РЕР, след това до СТР с РЕР о помощта на РК. След това СТР реагира сиеиде с СМР-веиАс синтетаза /ЕС 2.7.7.43/
- 50 като се получава СЖ*- м«идо · Страничният продукт m ое хидролизира до ух о помощта на»а·· . Сиалилирането на LadАеаоадал се извършва с CW’-KauAe и <2,3сиалилтранофераза / 2,$1аТ ; SC 2.4.99.6/. Отделеният СМР след това ое превръща в СДР, CUP и накрая до СЖ*- ituAe. ири използване на тави система бюха получени (Gal-1-13C)HeuAe ^2,5Gal31,40loMAea0 алил /съединение 42/, а сцо и набелязан тркзахарцд.
* 52 Интересно е, че лахтал (Gaia 1,4глюкал също е добър субстрат за 2t3siaT t което дава възможност за синтезиране на MeuAo ^,3Gaiai ,4 глякал /съединение 43, показано на схема 16/ о добив 21 процента· Лактал се получава или химично (Haworth а1» 4 а......fffrfPt.....s?*·» 26« (1930)) или ензижо при използване на Gall И глшал. (Gauthsron-De Jiarvor at al., J, Ohsa, Sec.
.........$»»*, 1130 (1991)) Wong et al., £.. M................Itb... Ш a 137-8245 (1991)). Гликал-съдържащ олигозахарвд, като например съединение 43 може да се превърне в други сиалил ьех производни при прилагане на химията, разработена от Danishefsky at al. (Griffith at al., J. Am. Chea. Soo.. 112’5811 (1990); Halcomb •t al., .....Sgct> 111:6661 (1989); Kessler et al.,
Phea* 1st. 3d. fail.. 2^:425 (1990); Thiea et al., Synthesis. 696 (1978).) Съединение 43 може също да ое халогенира, както се обсъжда в това изобретение, като се получават
2-хало-2-деожси- Gie производни.
При използване на процедура, подобна на тази, показана на схема 16, при използване на </. 2,6 оиалилтрансфераза /НС 2,4· 99,1/ о GaiBi ,4GieHAs мато акцепторен въглехидрат, след взаимодействие в продължение на два дни при стайна температура, ое получава с добив 22 процента MeuAc 2,6Gal3l,4GicHAc.
фукомиипя^а. Кдонираният човешки ензим се използва за фукозилиране при стехиометрична употреба кавир-Уис /99 атомш процента, предлаган от Isotsc Inc., Miamisburg, OH /, Μ®· то е показано на долната схема 17.
Scheme 17
>ьс о4 Така, при фукозилиране на сиалил LacNAcBO алил /съединение 42/, след пречистване със силикагел и BioGel Р-2 се получава сиалил Lex съединение 44. ЬасНАсВСалил /съединение 41/ и сиалил гликалът, съединение 43, също се фукозилират, като се получават съответно Lex тризахарвд съединение 45 и сиалил Ьехгликал съединение 46. Последните две съединения са показани на схема 16. Интересно е, че oZ.l,3-FucT и Z 1,3/4 ВисТприемат GalB1,4( 5-тио)й1с,като се получава аналогът на (5-тио)й1с-Ьех а именно GaiBi ,4(fuc Z1 ,ЗИ5-тио)С1с , както е показано на долната схема 18.
СХЕМА 18
Що се отнася до in situ регенерирането на GDP-Euc , превръщането наМап-1-Р до GDP-Fuc чрез GDP-Man , основаващо се на биологичната синтеза на gdp-Fuc в микроорганизми, беше изследвано за първи път, както е показано на схема 19. АкцепторОН на схеми 19 и 20 /която е дадена по-нататък/ представлява хидроксилна група на въглехидратния акцепторен субстрат, като тези, посочени в горната таблица 2.
- 5b <Ί
-i ’
но
OH ΙΟ
Бяха използвани микробиални ензими, тъй като те са лесно достъпни. Освен това, тази система позволява регенерирането на GDP-Man. GDI?-Man пирофосфорилаза (GDP-Man PP) беше намерена в дрОВДИ (Munch-Реt erson, Methods in Enzymol., ^:171 (1962); Simon et al., J. Org. Chem., ££:1834 (1990)) и е известно, че GDP-Puc генериращи ензими присъстват в бактерията Klebsiella pneumonia (Ginsburg, J. Biol. Chem., 235:2196 (I960); Ginsburg, Methods in Enzymol., 8:293 (1966)). При тази регенерация *** СТР се генерира от СДР в присъствието на РЕР и РК. lan-1-Р реагира с СТР, като се получава СДР-Man е помощта на СДР-Man РР от клетките на сушени дрожди. СДР-МаР- се превръща в СДР-Puc в присъствието на ПАДРН и СДР-₽ис генериращи ензими, частично пречистени от бактерията. Окисленият ПАДР се рециклира обратно до 11АДРН с Ihermoanaerobium brockii алкохол дехидрогеназа /ТАДН/ /ЕС 1.1.1.1./ и изопропанол. Получаването на СДР-Мап и СДР-Ric се потвърждава с помощта на НРЬС и се постига фукозилиране на LacNAcSO алил и съединение 42 , като се получават 5-10 милиграма от съединения 45 и 44. Препаративна. синтеза на
сиалил Lex с in situ регенериране на GDP-Fuc при използване на пречистени ензими е в ход понастоящем.
Алтернативен метод е да се започне с Fuc-1-Р , който се превръща в GDP-Fuc под каталитичното действие на GDP-Fuc пиродосфорилаза / GDP-Fuc 2/, както е показано на долната схема 20. (Ishihara et al., J. Biol. Chem., 243:1103 (1968); Ishihara et al., J. Biol. Chem,, 243:1110 (1968); Schachter et al., Methods in Enzymol.. 28:285 (1972); Richards et al., Biochim.
Biophys. Acta, 484:353 (1977); Kilker et al., Biochim. Biophys Acta,570:271 (1979)). GDP-Fuc P беше частично пречистен от свински черен дроб, (Ishihara et al., J. Biol. Chem.. 243:1110 ( 1968)) и беше показано, че регенерационната система, представена на схема 20, действува в аналитичен мащаб за синтезата на Lex и сиалил Lex.
СХЕМА 20
PEP PYR
X Q
Освен сиалилните Люисови антигени, SLe , SLe и съответни· те им аналози, важни олигозахариди са също и антигените от АВН кръвна група. Настоящето изобретение предлага бързи и икономии· ни начини за получаване на всички тези съединения. Така например, за да се получи SLea, който има структура HaNeuAc-12,3 Gal 81,3 iFucoi.1,4) GicNAc , се съчетават следните три глико• 57 зилтрансферази: p 1»3 галахтоздатранофераза, 2,3 фераза и <1,4 фукозилтрансфераза. Реакционните условия и допълнителните ензими за регенериране на захарните нуклеотцци са тези, посочени по-горе.
За Н-активни олигозахарцди, антиген от 0-кръвна група, които имат структура in·1,2ба1в-в , където r да бъде ei»3 GieMAc-n или 31,3 GaiRA»-Ri и където R1 е ограничен ода* гозахарцд, могат да се комбинират следните гликозилтраноферазш уЗ 1.3 галактозилтрансфераза и Λ 1.2 фувозилтранофераза о подходящите спомагателни реакционни компоненти и условия, както са посочени по-горе за зьех или su* , за да се подули уие <1, 2Gaiai,3Gi«RAe-Ri « Групата R1 на О-крквна група, следователно представлява друга група X. обсъждана по-горе, както е и R1 групата за А-и В- кръвни групи.
За А-активни олигозахарцди, антиген от А-кръвна група, който има структура GaliAe <1,3(?ис <1,2) Galfl -R · KWTO R може да бъде bi,3gi®ma«-ri или bgjllha· - ri и където R1 е ограничен олигозахарцц, могат да се комбинират следните гликозилтранзферазш а т.згалактозилтранофераза, <<1,2 фукозилтранофераза,^1,ЗК-ацетилгалактозаминилтранофераза, и като се използват реакционните условия,посочени по-горе, да се получи GalMAe <1,3 U«e <1,2)G<131,3GloIAc-R1.
За В-активни олигозахарцди, антиген от В-кръвна група, който има структура Gai с/1.3 (Τ®·<1,2) Gai а - R, квдето R може да бъде R1,3 aieMAe-R1 ИЛИ В 1,3 GalNAc -R1 и където R1 е ограничен олигозахарад, могат да се комбинират следните гликозилтраноферази:/31,3 галактозилтрансфераза, <1.2 фукозидтранофераза, <1,3 галактозилтрансфераза, с подходящи спомагателни реакционни компоненти и при използване на условията, по- 58 сочени по-горе, да се получи Gal , 3( Уис ,2 )Galfi 1, JGleMAeЖ1.
Така, проведени са ензимно-катализирани степенни синтези на олигозахариди, включително фухозилирани и фухозилирани сиалилирани въглехидратни молекули, при които продуктите от всяка реакция на гликоанлиране ое изолират преда следващия етап на гликозилиране. При тези реакции на г лиране може, и за пред почитане е действително да се използват етапите на рециклиране, обсадени по-горе.
Проведени са също многократни глихозилирания в единствена реакционна смес, за да се получа* същите фухозилирани и фухозилирани сиалилирани въглехидратни молекули. Тук са използвани също реакциите на рециклиране, обсадени по-горе. Освен това, за да се установят концентрациите на реагентите с цел да се доведат до минимум страничните реакции, са използвани данните за Кт и VQ , като тези, посочени в таблици 1 и 2, а също и публикувани стойности. За контролиране на образуването на продуктите могат също да се използват инхибиторите, които са показани в таблица 3.
Проведени са също многоетапни реакции на гликозилиране в единствена реакционна смес, за да се получат горе посочените продукти, но в които един ензим или реактант , необходими за гликозилиране то, се прибавят след като другите реакции са прин ципно завъртали, така че едната реакция на гликозилиране започва, след като поне една, а за предпочитане две други реакции на гликозилиране са принципно завършили. При една примерна синтеза всички реагенти и ензими, показани на схема 1, с изключение на фукозилтрансферава /Fuel/, се прибавят към реакционната смес и се образува KtuAe щ2,30^1,agioa©-or · θ показано на • 59 схема 16 за образуване на съединение 42, кадето R е алил. След образуването на тисово съединение, като например съединение 42 от охема 16, ое прибавя ₽«оТ, като например с/1,3фукозижтранофе* раза или ^1,3/4 фукозилтранофераза, и се образува фукозилиран сиалилиран въглехидрат,като например съединение 44 от охема 17. В алтернативен вариант, ензимът ₽исТ може да присъствува, а може да не ое добавя предшественикът на фукозилния донор, като например фукоза. Подобно на това, фукоза може да присъотвува без нейния фосфорилиращ ензим фукоза киназа.
₽. Дериватизиране на фукозилираните продукта за образуване ШИЕММ______________________ вписаните по-горе фукозилирани продукта действуват най-добре като лигавди, свързани с големи молекули· Като такива големи молекули могат да се посочат протеини, гликопротеини, гликолипиди и небиологични аналози на такива молекули. Обикновено редуциращият край на захарта ое овързва към свободен амин или меркаптан чрез гликозвдна връзка. Липозоми могат да се използват за получаване на многовалентни макромолекули. Известни са различни методи за получаване на липозоми, както е описано например в s«ok& et al., Адд. Kev. Biophye, Bio«n«. .2 >467 /I960/, САЩ патента Я? 4,236871, 4,501,728 и 4,837,028, които оа включени тук като цитати.
С. Июиямйе на ажяаносгг. и» оиалилсм ймоови лигмии
Ццна от целите на това изобретение е свързана с получаването на е иали^£аЛиссови антигени както в природни форми, така и форми, които ги наподобяват или техни аналози. Тези антигени играят роля в междуклетъчната адхезия, а също и при възпалител- 60 ни и други болестни състояния при човека и млекопитаещите. За да се улесни производството на тези антигени при използване на описаното тук изобретение, полезно би било да се изпитва способ ността на получаващите се продукти да се свързват към природни сиалилирани Люисови антигенни рецептори, като например ©АМ и СФ 140 рецепторите. Такива анализи подробно са описани в
Bolley et al.,
.....м^.Ш<к,МА1.
p* s<- 4., 88:6244-6228 (1991) и Phillip» et al., Science, 2§0:Ц30-1132 (199СЙ , ко ито са включени тук като цитати.
Въпреки че са предложени голям брой различни анализи, при предпочетения анализ се измерва способността на антигените да блокират или инхибират свързването на клетките, носещи подходя щите адхезионни рецептори и клетки, изпращащи съответнииссиалилиран Люмсов антиген. Свързването се оценява визуално под микроскоп. Предпочетени клетки, изпращащи рецептори, са активирани пластинки и евдотелиални клетки. Рецепторите са част от фамилията, известна като селектини или lbc-cams и вхркчват lkc-cam-i ilam-i, сив -но и CD62 · Лигавдите са намерени върху неутрофили, мсноцити и туморни клетки.
При типичен анализ неутрофили са изолирани чрез наслояване на хепаринизирана кръв върху моно-поли разделяща среда (Mono» Boly Hesolving Medium, ficoll-Hypaque-flow Laboratories) СЬО следващо центрофугиране в продължение на 25 минути при 2000 оборота в минута и след това още 25 минути при 2500 оборота в шг нута.
Пластинки могат да се изолират при използване на следната процедура. От нормален човевки донор й*вииш кръв в спринцовка, стдържаща АСД .антикоагулант /декстроза 2,0 г; натриев цитрат 2,49 г.;и лимонена киселина 1,25 г; до 100 мк о dHgO/ при съотношение 6 части кръв към 1 част антикоагулант. Кръвта се центрофугира при 800 об/мин /приблизително 90 х ^/ в продължение на 15 минути при стайна температура. Горният слой ое събира и ое центрофугира при 1200 об/мин /приблизително 400 х j/ в продължение на 6 минути· Горният слой ое отделя и се центрофугира при 2000 об/мин /1200 х <j / в продължение на 10 минути, за да станат пластинките на топка. Топката от пластинки ое промива Двукратно о буфер Tyrode-HJEPIS , който има pH 6,5 /маС18,0 г; КС10,2 Г| ИаН2>О4.И2О О.О57Г ; MgCl2.6H2O 0,184? I MaHCOj 0,1 г / декотроза 1,0 г, и hspzs 2,383 П довежда се до 1 литър о дестилирана вода, a pH се довежда до 6,5 с 1 N ПаОН/ със следващо еднократно промиване в PBS ♦ Пластинките ое суспендират в РВ£ до концентрация 108/мд и се активират чрез инкубиране в продължение на 20 минути при стайна температура е тромбин до крайна концентрация 0,25 ν /мл.
За провеждането на анализа 20 микролитра от суспензията на Q пластинките /2x10 /мл/ ое поставят в центрофужна епруветка на ippsndorf · Прибавя се равен обем от олигозахаридните препараи ти о концентрации от 200 мшфограма на милилипр до 0,3 ма на милилитър, или гликолипвд-липозомни препарати /получени както © описано по-горе/ с концентрации от 2 до 0,25 микрограма на милилитър и епруветките се оставят да престоят при стайна температура в продължение на 20 минути. След това се прибавят 20 микролитра от неутрофилния препарат /2х1Лмл/ и епруветките ое оставят да престоят още 20 минути при стайна температура.
Адхезията на активираните пластинки към неутрофилите се оценява микроокопоки. Обикновено се оценяват ото неутрофила. Те се оценяват положително, ако оа прикрепени две или повече плаотин- ό2 ки л отрицателно, ако са свързани по-малко от две пластинки.
Н. Подобрени начини за получаване на гликозил 1- или 2-Р
Дссфорилирани захари, притежаващи фосфатна група върху аномерния въглероден атом /1- или 2-положение/, са ценни като междинни продукти при реакциите, описани в това изобретение, като редица от тях са търговски продукти. Това изобретение предлага подобрени начини за селективно фосфорилиране на този въглерод ен атом на монозахаридите. Подобрението включва използването на тривалентен фосфитилиращ реагент, за да се прехвърли фосфитилна група върху желания въглероден атом. Образуваният фосфит след това се използва за получаване на съответен фосфат, който пък се използва в описаните вече ензимни реакции.
Блокиран фосфитил монозахарид може да се представи с долната формула I:
Където всяко R^ е еднакво или различно и представлява арилна група, като например фенилова или бензилова, или C^-Cg нисша алкилова група;
X е независимо кислород или азот;
е независимо ацилова, бензилова, силилова или алкилова блокираща група, или X-Rg заедно отсъствуват или пък са заместени с водород;
Rg е независимо водород (-Н), -СН^, -or2> -CH2OR2,
-63-CH(CR2)-CH(0R2) , -CH(0R2)-CH(0R2)-CH(0R2), -NH2 или -NHR2;
е водород /Н/, карбоксилоза или C-yCg алкилова или бензил карбоксилатна група; и η е 1 или 2, за предпочитане 2.
По този начин,получаващите се блокирани фосфитил монозаха риди включват производни на сиалова киселина, КДО, КДКЕ и подобни съединения, където R^ е карбоксилна или карбоксилат естерна група. В предпочетената група от съединения с формула I R^ е водород. Б този случай формула I се превръща във формула II, дадена по-долу, където R1, R2> X и и са,както са дефинирани по-горе:
R2
II r2
Ясно е, че всяка група може да бъде различна от другата. Това се дължи на факта, че фосфитилиращият реагент може да се получи чрез взаимодействие на РС1^ с вторичен амин, като например диизопропиламин и два мола алкохол. Така, чрез смесване на алкохолната част на реакционната смес може да се приготви фосфитилиращ реагент и фосфит, който може да има две различни R^ групи, като например бензилова и етилова. За предпочитане е двете R^ групи да бъдат еднакви, а най-много се предпочита и дзете групи да бъдат бензилови или фенилови групи, като тези групи могат да се отстранят чрез хидрогенолиза.
Трябва да се разбере също, че всяко X може да бъде кислород или азот, като особено предпочетени са съединения, в които присъстват и двете групи, като например блокиран сиалил дибензил64 фосфат, съединение 97· Rg блокиращите групи включват ацилни групи, като например С|-С& ацилни групи като формюна, ацетилна, пивалоилна и пентаноилна групи, бензоилна и фталоилна групи, алкилови блокиращи групи и сиалилни групи· Примерни алкидни групи включват алкилови групи, като например метилова, етилова, изопропилова, трет.-бутилова, циклопентилова и пектилова групи· Ацетали и кетали, образувани от СрCg алкилкетони или алдехиди, като например особено предпочетените ацетон и формалдехад, могат също да образуват алкидна блокираща група» От бенааадехед оъщо може да се получи ацетал-образуваща блокираща група. Такива кетали и ацетали са добре известни блокиращи групи в химията на захарвдите. Като примерни оилилни блокиращи групи могат да се посочат три-CpCg алкилсилилни групи, като наприммертриметилсилилна, трет.-бутилдиметилсилилна и други подобни, алкилдифенилсилилни блокиращи групи, като например дифенилметилсилилна група, ди-С^-С^ алкилфенилсилилни блокиращи групи, като например фениадиметилсилилна група и трифенилсилилна блокираща група.
Обикновено се предпочита всички блокиращи групи да бъдат еднакви или , ако са различни, да могат селективно да се отстраняват чрез различни реакции. Така например, бензилна група можа да се отстрани в присъствието на ацетилна група чрез хидрогенолиза, докато ацетилна група може да се отстрани в присъствието на бензилна хрупа чрез обработка с първичен амин, като например с бензиламин. Ацетилната група е особено предпочетена блокираща група, тъй като 0-ацетилната група в аномерното положение /1или 2-мяото/ може лесно да ое отстрани в присъствието на други 0-ацетилни групи на други положения в пръстена чрез обработка о първичен амин.
Трябва да се отбележи също, че X-Rg може Да отсъства и да бъде заместен с водород. Тогава блокираният монозахарвд е деокси монозахарвд, както например съединения 97 и 101 до 113·
Трябва да се разбере оъщр, че когато и «2 във ффиула I, какъвто 9 предпочетеният случай за шестчленни циклични захари, не е необходимо и двете групи /R3-CH/ да бъдат еднакви,и обикновено те са различни. Така например, при блокиран фукозил фосфит, съединение 8, обсъждано по-горе в схема 6, едната Rg група е метилова, докато другата е G-ацетилова /ОАс/. Аналогично, при блокиран манозил фосфит, съединение 16, обсъждано по-горе в охема 9, едната Rg е СН^ОАс група, докато другата е ОАо група.
Формула I може да се изрази алтернативно като формула IA, както е дадена по-долу, където!
всяка е еднаква или различна и представлява арилова група, като например фенилова или бензилова, или нисша алкилова група;
X е независимо кислород или азот;
е независимо ацилова, бензилова, силилова или алкилова блокираща група или пък X-Rg заедно отсъствуват и са заместени с водорсд|
Rg е независимо водород (й), -сн3, о*2, -си2<ж2, -ci^or2)Сй(СЖ2) или -CB(QR2)-CH(OR2)-CH(GR2);
е водород /Н/, карбоксилна или С|-С& алкилна или бензил карбоксилатна група; и иа е нула или 1, така че когато ип е нула групата /СВ-Х-Rg/ отсъства и се образува петчленен пръстен, а когато юп е 1 групата /CH-X-R2/ присъства и монозахаридът има шестчленен пръстен, което е предпочетено.
Като се има предвид предпочитанието за блокирани монозахаридни фосфити с шестчленен пръстен, формула IA може да се изрази като дадената по-горе формула IB, където R^ и X са както във формула IA.
Като се има предвид предпочитанието за съединения, при които е водород, формула II може да се изрази като дадената по-долу формула IIA. Следвайки предпочитанието за шестчленни пръстенни блокирани монозахариди /къдетоm =1/, формула IIA може да се изрази като дадената по-долу формула IIB.
и X са както във формула IA.
Язч1 | Λ °’R1 ( Ур;°-, | ’’’'l | o -°‘R’ /У-Р'О-А, | |
(C^x-R, | x'r2 | |||
X | X | |||
R2 IIA | r2 | IIB |
С изключение на отбелязаните различия в групите R във формули I, II, IA, IB и IIA, означенията за X, ацилна, силилна, алкилна и други подобни групи в тези формули са еднакви.
Тривалентните фосфитилиращи реагенти бяха определени по-рано. Достъпните тривалентни фосфитилиращи реагенти включват ди67 бензил 11,11-»диетиж^осфорамидит, 2-цианоетил II,11,11 ,11 -тетр&изопропилфосфорамидит или 2-цианоетил II ,П-диизопропилхжорфоофорамидмт.
Процесът за получаване на блокиран монозафарндфосфит от незаместен /нсблокиран/ монозахарид е многоетапен процес, започващ о който и да е монозахарид /алдоза или кетоза, без ограничение по отношение на конформацията или ориентацията/. Най-напред монозахаридът се блокира при всяка свободна хидроксилна /или аминна/ група/, като се използва стандартен блокиращ реагент, като например ацилна, бензилна, силилна или алкидна групи, както оа описани по-горе. Блокиращата група, обикновено Ср Cg ацилна или бензилна група, в X- или 2-положение, след това се отстранява селективно, като се използва или липаза от свински панкреас или алкил- или бензиламин в неводен полярен разтворител като тетрахидрофуран или дихлорметан. След тоза тривалентният фоофитилиращ реагент се присъединява към 1- или 2-положение, при анаеробни условия, като се използва кондензиращ агент аромат®! вторичен или третичен амин като 1,^-триазод, имидазол, тетразол или пиридин-р-толуол сулфонат. Понастоящем предпочитани кондензиращи агенти са триазол или тетразол. След това продуктът се окислява при използване на окислител като водороден прекис или трет.-бутилхидропероксид. Получената фосфорилна група се деблокира до фосфатна сол /например натриева/, като при бензиновите производни се използва редукция с водород/паладий, а при цианоетиловите производни се прилага алкална обработка.
Така, при използване на горната реакция бяха получени редеда моногликозил фоофити и съответни фосфати. Примерни съединения като фосфати бяха получени от 2-ацетамвдо-2-деокои-Д-га
- 68 (UaliAe; съединение 89), 2-ацетамедо-2-деокси-Д-гл1«оза(01.е дас съединение 90 , Д-галактоза(Се1, обединение 9ί , Д-глюкоза (Gief съединение 92), Д-маноза (*·>» съединения 18 и 93 х -рамноза (км».съединение 94), х -фукоза (Уи·, съединение δ) и N-ацетил-невраминова киселина (КеиАо, съединение 99) . Тези реакции са представени на долните схеми 21-23· Съгласно процеса, илюстриран на схема 23, беше получен с около 90 процентен добив фосфитьт на 2-фталимцдоил-2-деокси-Д-глгкоза3,4,6-триацетат /съединение 100/·
С
Scheme 21
SUBSTITUTE SHEET
- 70 C X E Al A 23
OPCXOBn),
OPO(ON*)j
COOMe
ЕЮН
AcO OAc
COOMe
AcO' AsHN
AcO
ΧΝβΟΗ/ΗΡ
OAc
1'
AcHN AcO
В таблица 4 по-долу са представени означенията на различните
-4 групи R /R /, използвани в горните схеми. В таблица 5 са дадени добивите и аномерните съотношения за различните съединения от схеми 21-23 и таблица 4.
Беше установено, че разтворителите влияят върху аномерното съотношение на фосфитилираните продукти. Така, когато съедине. ние 70 се фосфитилира в тетрахидрофуран, съотношението е 1:6, докато в хлороформ съотношението се променя в 1:2.
ТАБЛИЦА 4 за схеми 21 и 22
СР· | R1 | В2 | R3 | R4 | СР· | R1 | R2 | R3 | R4 |
61 | Н | NHAc | ОАС | Н | 79 | ОАс | Н | Η | ОАс |
62 | Н | NHAc | Н | ОАс | 80 | Н | ОАс | ОАс | Η |
63 | н | ОАс | ОАс | Н | 81 | ОАс | Н | Η | ОАс |
64 | н | ОАс | Н | ОАс | 82 | Н | NHAc | ОАс | Η |
65 | ОАс | Н | Н | ОАс | 83 | Н | NHAc | Η | ОАс |
66 | Н | ОАс | ОАс | Н | 84 | н | ОАс | ОАс | Η |
67 | ОАс | Н | Н | ОАс | 85 | Н | ОАс | Η | ОАс |
68 | Н | NHAc. | ОАс | Н | 86 | ОАс | Н | Η | ОАс |
69 | Н | NHAc | Н | ОАс | 87 | Н | ОАс | ОАс | Η |
70 | Н | ОАс | ОАс | Н | 88 | ОАс | Н | Η | ОАс |
71 | Н | ОАс | Н | ОАс | 89 | Н | NHAc | OH | Η |
72 | ОАс | Н | Н | ОАс | 90 | Н | NHAc | Η | OH |
73 | Н | ОАс | ОАс | Н | 91 | Н | OH | OH | Η |
74 | ОАС | Н | Н | ОАс | 92 | Н | OH | Η | OH |
75 | Н | NHAc | ОАС | Н | 93 | он | Η | Η | OH |
76 | Н | NHAc' | Н | ОАс | 94 | н | OH | OH | Η |
77 | Н | ОАс | ОАс | Н | 95 | он | Η | Η | OH |
7« | Н | ОАс | Н | ОАс |
* СР* съединение
- 72 ТАБЛИЦА δ
Аномерни съотношения и химически добиви »а етапите
в схеаш 21 · 23 | |||||
с* | ,<1/ | добив,% | с* | 41/ | добив,$ |
68 | само. | 71 | 86 | 311 | 98 |
69 | само 4 | 83 | 87 | 611 | 98 |
70 | 2И | 81 | 99* | само << | 64 |
71 | 3tl | 85 | 90 | само | 39 |
72 | само 4 | 87 | 91 | 112 | 42 |
73 | 1811 | 88 | 92 | 114 | 59 |
75 | 7,411 | 47 | 93 | 311 | 71 |
76 | само 9. | 93 | 94 | 611 | 76 |
77 | 112 | 88 | 97 | само - | 68 |
78 | 114 | 97 | |||
79 | 311 | 80 | 9В | само β> у | 95 |
80 | 611 | 97 | 99 | само /-> | 99 |
82 | само ..х | 93 | |||
83 | с амо 4 | 97 | |||
84 | 1:2 | 94 | |||
85 | 1:4 | 98 |
* С « съединение а Вероятно е грейка в оригинала. Вмеото 99 съединението вероятно е 89 /б.пр·/
Трябза да се отбележи, че съединенията в горните схеми и таблици включват производни на маноза и фукоза, чиито номера е се различават от тези в преднините обсъждания. Тук тези съединения са преномерирани за по-лесно представяне на данните. В следващите примери са посочени и двете номера.
Като се следват реакциите, посочени в схема 23, е проведена синтеза на редица други, специфични монозахарид карбсксилftти с формула I. Тези съединения са свързани е Д-сиалава киселина /съеджение 101/, Д и ь-ю» и D- hl-ido. Формулите на примерни метил естерни /Ме/ представители на тези съединения, където R2 ® ацетил и е бензил, са посочени по-долу като съединения 101-113. Посочените монозахарид карбоксилати могат да се получат като се използват реакциите на сиаша киселина, обсъдени в Gautheron-LeNarvor et al. , J, Ад, Chem. Sec.. 1151 7816 (1991) и Sugai et al., J. Am. Chem. See., под печат.
WO 93/08205
PCI7US92/08789
OAc | ||
АсОш^ | \--OAc | |
CO,Me | ||
AcO— | 113 | 1 OPiOBnb |
След като представихме общ преглед на изобретението и укас зание за съчетаване на реакциите на фукозилтранофераза е генериращите енергия реакции, използващи каталитични количества е|МЯВ1тиуклеотедк, и с други трансферазни реакции, по-надолу са представени прибери, в които са ледени по-нататмни подробности. Тези примери оа ледени само за илюстрация, а не за ограничаване на обхвата на изобретението· Специалистите леоно ще забележат, че много от параметрите не са критични и могат да се варират·
Пример It Химически синтез на фукоза 1-фосфат /ами S в а/__________________ /а/ 1,2,3,4-тетра-О-бензоил-1 -фукоза /амтммам 2/_______________
Бензшхлоред /21,4 г, 152,3 милимола; 17,7 мя/ се прибавя на капки към охладен разтвор на ь -фукоза /5,0 г, 30,5 милимола/ в пирщдин /100 мл/, при 0-5¾ и сместа се разбърква в продължение на 3 часа при стайна температура· Сместа се излива в ледена веда и се βκοτρβχιφβ с етилацетат /EtOAc/. Екстра ктите се промиват последователно с ледено студена разредена солна киселина, воден разтвор на НаНС03 и солна луга /разсол/, суши се над безводен Mgso* и се концентрира· Продуктът се използва в следващия етап без по-нататънно пречистване· /Ь/ Дибензилфоофорил 2,3,4-три-0-бензоила -ь-Фтш...../шдж,
Към охладен разтвор на съединение 2 /2,0 г, 3,44 милимола/ в метиленхлорвд /20 мя/ и оцетен анхедрвд /2 ми/ се приканва 30 процентен НВг-АоСН /8 минути/ при 0-5¾ и сместа се разбъ76 рква в продължение на 2 часа при съайна температура· Сместа се излива в ледена вода и се екстрахира с етилацетат. Екстрактите се промиват последователно с вода, воден разтвор на МаНСО^, и солна луга, сужат се над безводен MgS·* и се концентрират, като се получава съединение 3· Съединение 3 се използва в следващия етап без по-нататъшно пречистване. ^Н- Ш (cucij) 1,36 (5 М, d, J 6,51 Не, 6-СН5), 4,69 (1Н, br д, J 6,56 Hi, Н-5), 5,62 (1Н, dd, J 3,91, 1®,5 Н·, Н-2), 5,84 (1Н, dd, J 0,97» 3,33 Ив, Н-4), 6,01 (1Н, dd, J 3,36, 10,50 Ив, Н-3), 6,94 (Ш, d J 3,92 Mi, Н-1); 13С ММК (CDClj) £ : 15,8, 68,6, 69,2, 70,4,
89,4, 165,4, 165,6, 165,7.
a<2cg3 /1,90 г, 6,8Θ милимола/ ое прибавя в охладен /0-5°С/ разтвор на горното съединение 3, дибензилфоофат /2,88 г, 10,3 милимола/ и молекулно сито ЗК /бг/ в CHgQij-it^o-CHjCi /по 20 мл от всеки/ в облодънна колба, обвита в алуминиево фолио за затъмняване. Сместа ое разбърква в продължение на 10 часа при стайна температура , филтрува се през филтър Οιΐϋβ и филтратът се концентрира. Остатъкът се хроматографира върху силиха· гел с толуол-етилацетат /2,5(1/, като се получава съединение 4 /2,4 г, 95 процента/ като единствен продукт. ЯМР (стр £ : 1,35 (1М, d, J 6,35 Hl, 6-СНр, 4,225 (1Н, br dt, J 5.71, 6,70 Hi, Н-5), 4,77 (1H, dd, J 707, 11,65 Mi бензилш), <,β6 (1H, dd, J 6,60, 1,63 Hi, бензилна ), 5,11 (1H, dd, J 7,51, 11,71 Hl бензилна ), 5,14 (1H, dd J 7,27, 11,70 Hi, бензилна), 5,58 (1H, dd, J 3,48, 10,44 Hi, B-3), 5,69 (1H, dd, J 7,37, 7,89 Hi, H-1), 5,76 (1H. Bd, J 8,03, 3,44 Hi, H-4), 5,90 (1H) dd, J 8,03, 10,45 Hl, H-2); 13c XMR (CDCip S' : 16,12, 69,31, 69,35, 69,54, 69,58, 69,63, 69,70, 70,57, 70,83, 71,70,
- 77 96,97, 97,0®, 127,26, 127,40, 127,69, 128,06, 128,13, 128,26, 126,31, 128,43, 126, 56, 126,66, 128,83, 129,06, 129,67, 129,72, 129,77, 129,93, 133,27, 153,41, 133,51, 165,45, 165,79. 2MR8 ИЗЧИ8ЛШ0 8* c41HJ7o, jpc· (м+с®*) 869,1128, намерено 869,1138.
/о/ £±:........йаш.НШжж, /тжжн
Съединени® 4 /2,32 г, 3,15 милимола/ се хидрира над 5 процента ЗД /С /400 мг/ в етанол /60мд/ и П Иансо^ /15 мл/ в продължение на 10 часа. Катализаторът се филтрува през филпр Ceiite /търговска марка/. Към охладения разтвор на остатъка във вода /20 мл/ се приканва 1* м&зн /20 мл/ при 0-5¾ и сместа се разбърква в продължение на три часа при стайна температура. Сместа се неутрализира внимателно чрез прибавяне на отудена 1 м АсОН до pH 7,5 и неразтворимият материал се отфилтрува през филтър Ceiite . Филтратът се разрежда до 250 мл и се подава към колона с Dowex 1-ХВ /HCOg/ /2 х 15 см/ и се елюира със степенен градиент на НН40Ас2; веда /200 мл/, 0,1 М 11Н40Ас2 /200 мл/, 0,1 И /вероятно грейка в оригинала; вярното е 0,2 М · б.пр./ ΝΗ40Αο2 /200 мл/ и 0,3 М НН4ОАо2 /200 мл/. Фукозата се елюира с веда, а желаното съединение 5 се елюира между 0,2 и 0,3 Μ КН^6е2. След отстраняване на солта се получава съединение 5 /700 мг, 82 процента/. Данните от % ЯМР и ЯМР са в добро съответствие с тези, докладвани от групата на Baker (Минев et аХ«, Can, J. Chea.. ^:2086 (1981)).
/о/ 1,2,3 ,4-тетра-0-ацетмл-ь -фукоза /съединени. 6/
Смес от ь -фукоза /3,0 г, 18,2 милимеда/ и безводен натриев ацетат /50 мг, 0,61 милимола/ в оцетен анхидрид /20 мл/ се разбърква в продължение на 2 часа при стайна температура и след
- ТВ това се нагрява още два часа при 100¾. След охлаждане сместа се излива в ледена вода, разбърква се два часа и се екстрахира о хлороформ. Екстрактите се промиват последозателно о воден разтвор на натриев бикарбонат и вода, сушат се над безводен магнезиев сулфат и се концентрират. Остатъчният оироо се хроматографира върху силикагел с толуол-етилацетат /10:1/ и се получава съединение 6 /5,92 г, 98 процента/ като смео от </ иуб /1:7 , определено с ЯМР слектрескопия/.
/е/ 2,3,4-три-0-ацетил- ь-фукоза /ташвшХл&СШ
1. Химически метод: Разтвор на съединение 6 или 67 /3,0 г, 9,0 милимола/ и бензиламин /1,46 г, 13,5 милимола; 1,47 мл/ в тетрахцдрофуран /35 мл/ се разбърква в продължение на един ден при стайна температура. Сместа се разрежда с хлороформ и ое промива последователно о ледено студена разредена солна киселина, воден разтвор на натриев бикарбонат и вода, суши се над безводен магнезиев сулфат и се концентрира. Полученият оироп ое хро^ матографира върху силикагел с толуол-етилацетат /1:1/ и се получава съединение 7 или 74 /2,40 г, 92 процента/, Дротонният № спектър е в добро съответствие с докладвания в литература»« (В.ПМО at .1,, J. Сга. Cha,.. 4743 (Ι9ββ)).
2. Ензимен метод: Суспензия от съединение 6 или 67 /2,5 г,
7,5 милимола/ и лиша от свински панкреас /5,6 г/ в 13 процентен /обем/обем/ буфер диметилформамцд-фосфат /50 милимола, pH 7/ ое разбърква в продължение на пет дни при ста^а температура, като през това време pH се регулира с II liaOH. Сместа се фмлтрува и филтратът се екстрахира с етилацетат. Екстрактът ое промива с вода и се суши над безводен магнезиев сулфат. Пре*
- 79 чистванетс на продукта ое провежда както е описано по-горе и ое получава съединение 7 или 74 /1,1 г, 48,4 процента/ като смес от / и ^/111/.
Л / Дибензилфосфорил 2,3,4-три-0-ацеяа- Lфукозвд /съединение 9 или 88/__
Дибензил Η,ΙΊ-диетилфосфорамидж» (Pederson st al., Tetrahsdron. 42*2643 (1991)) /|,7 г, 8,5 милимола/ ое приканва към разтвор на съединение 7 или 74 /1,0 г, 3,4 мияимола/ и тетразол /1,0 г, 14,5 милимола/ в тетрахвдрофуран /50 ма/ под азот, при стайна температура и сместа се разбърква в продължение на един час при стайна температура. Към сместа ое прибавя етер /50 мл/ и органичната фаза се промива о ледено студена разредена волна киселина, воден разтвор на натриев бикарбонат и вода, оуяи ое над безводен магнезиев сулфат и ое концентрира. Остатъчният сироп ое хроматографира върху силикагел о хекоан-етилацетат /411/ и се получава съединение 8 или 81 /1,43 г, 79 процента/ във вед на омес от/ и 3 /1110/. аномер: ЯМР (cdci5) S : 1,22 (за, d, J 6,50 и·, 6-СН3), 1,91, 1,99, 2,19 (ЗН «ββ«, в, 5 х (Us), 3,85 (1 И, dq, J 1,00, 6,50 Hi, Н-5), 4,82-4,96 (4Н, а· 6®>»*«Οви протони ), 5,02-5,08 (2Н, m, Н-2, 3), 5,25 (1Н, dd, J 0,50, 3,50 Не, Н-4), 5,32 (1Н, dd, J 8,0, 10,50 Hi, Н-1).
Към охладения разтвор на съединение 8 или 81 /800 мг, 0,9 милимола/ в тетрахвдрофуран /50 мл/ ое прибавя 30 процентен водороден пероксид /7 мл/ в една порция /наведнъж/. Сместа ое оставя да се нагрее до стайна температура и се разбърква в продължение на 90 минути. Сместа се разрежда о етер и ое промива е ледено студен воден разтвор на натриев тиосулфат, воден разтвор на натриев бикарбонат и вода , суши се над магнезиев сулфат и се концентрира, като ое получава съединение 9 или 88 /420 мг,
- 80 81 процента/. То ое използва в следващия етап без по-нататъамо пречистване. *Н W спектърът е в добро съответствие с докладвания В литературата (Sohaldt at al., U»igl Ann, Chea.. ЦЦ: 121 (1991)). Ц W(C3C13) £: 1,22 (ЗН, 3, J Ю,0 На 6-CHj), 1.91, 1,99, 2,19 (ЗН ВСекИ, ·, 3 х ОАс), 3,90 (1Н, dq, J 6,50, 7,50 н», н-5/, 5,οο»5,θ3 (а, н-з, бензилови протони), 5,035,12 (в, бензилови протони ), 5,26 (1Н, dd, J 1,00, 3,50 а·, 8-4), 5,27-5,33 (2Н, а, Н- 1,2). HUMS ИЗЧИСЛСНО 8& c26fi3i°nic· <м*с·) * 683,0658, намерено 683,0658.
ш .....2У
Съединение 9 или 88 /5,0 г, 9,1 милимола/ се хидрира над 5 процента Ро/С /400 мг/ в етанол /70 мл/ и Н натриев бикарбонат /30 мл/ в атмосфера на водород,в лродълаение не три часа ори стайна температура. Катализаторът се филтрува и към студения филтрат се прибавя Н МайН ори 0*5%, докато разтворът стане силно алкален / > pH 13/. Сместа се разбърква в продължение на четири часа при стайна температура и се неутрализира чрез доба» вяне на студена Н оцетна киселина до pH 7,5. Сместа се филтру^ ва, разрежда се до 500 мя, пропуска се през колона със смола Dewex 1-Х8 /НСОО*/, елюира се с линеен градиент на амониев бикарбонат /0 - 0,5 W. Съответните фракции се събират и лиофилизира^злииният амониев бикарбонат се отстранява, като към раз· твор на лиофилизирания прах във вода ое добавя смола Dowex 50 Х8 /^/. Смолата се филтрува и филтратът се лиофнлизира. Разтвор на продукта се прекарва през колона O-Dowex 50 W -Х8 /Па*/ с вода и се лиофиаизира, като се получава съединение 5 или 95 /2,61 г, 99 процента/ във ввд на смес от и /1110/, «пределено с помощта на 41 W. 4ΐ- и спектрите са в добро съответства· е докладваните в литературата (Киа„ et al. Can.
• 81 —
Дх^й1.а«2086 /198V.
Ппимяп 21 Химически синтез на СДР-фукоза /пипни 12/-/«taa.7Z___
Съедашение 5 първо се превръща във вид на триетиламониева сол чрез преминаване през колона с Dowex 50 w-xe иъ^н^форма) с вода и ое лиофилизира. Лиофилизираната ь-фукоза-1-фосфат vpst* етиламониеза соя /съединение 10/ /300 мг, 0,83 милимола/ и гванозин-5 -монофосфат морфоледат /съединение 11/ /600 мг, 0,83 милимола/ се сушат поотделно чрез двукратно съвместно изваряване с пирццин. След това те се прибавят към сух пиридин /20 ма/ и сместа се разбърква в продължение на 5 дни при стайна температу* ра и се концентрира. Продуктът се пречиства двукратно о вода през колона със Sephadex 0-25 /овръхфин/ /3 х 65 см/· Съответните фракции ое събират и прекарват през колона с Dowex 50 wXg $а*)о вода. Фракциите се събират и се лиофилизират, като ое получава съединение 12 /около 300 мг/, съпроводено о малко количеотво C1F /определено по *Н ЯМР/. ЯМР спектърът е в добро съответствие с докладвания в литературата (Gokhaie et al., Pan.Chea.. 68:1063 (1990).
Пишев 3t Ензимни методи и анализи за превръщане на a Wrfcum /«nm frlM__ /а/ Получаване на ОДР-маноз£ м^ефокфбркам за превръщането на -ι-р »,№мдмм
Ензимът за получаване на СДР-маноза е СДР-тюза пирофоофо* рилаза /(ЗДР-МаиРР/, който се получава от дрожди· Повечето от ОДР-МанРР от дрождите се извлича чрез утаяване с амониев сулфат /около 80 процента опрясо суровия несъдържащ клетки екстракт/ със специфична активност около 0,1 единици на милилитьр ензим мен разтвор,
Дроад ЗамЬагмтю certvisa® се отглеждаха з следната среда: /г/л/ екстракт от дрожди, 5$ пептон, 10$ pH 6,0· Културата се отглеждащо при 30°С, като се разклащане в продължение на една над. Клетките се отделяха чрез центрофугиране и се промива ха о 50 милимола трио буфер /рН 7,5/, съдържащ 2 милимола м<С12 и 0,5 милимола ДТТ. Клетките /около 10 г/ ое натрошаваха със стъклени топчета, като се използва топхоза мелнична aead-beat®r (Bioseptic Product®, ок) импулсна, на интервали от една минута, петкратно. След това разтворът ое центрофугираща при 4° С и при 23000 < /земното ускорение/ в продължение на един час. Матерната луга /екстрактът, несъдържащ клетки/ след това ое събираше и се използваше за пречистване на ензима. За частично пречистване на ензима, 40-80 процента /при 0°С/ от утайката с амониев сулфат ое събираше чрез бавно прибавяне на прахообразен амониев сулфат към несъдържаща клетки екстракт до 40 процентно насищане и се центрофугираше при 15000 g в продължение на 30 минути, слеж което към матерната луга се добавяш още амониев сулфат до 80 процентно назищане. След центрофугиране утайката ое събираше и се разтваряше отново в 20 мя 50 милимола трио /рй 7,5/ буфер, съдържащ 2 милимола ивс12 и °»5 милимола ДГГ и се подлагаше на диализа в 4 л от същия буфер в продължение на една нощ /около 18 часа/ при 4°С. Активността на този препарат, определена с помощта на hi-lc анализ, беше 0,1 единици на милилитьр (и/вь).
- 83 /Ь/ Получаване на синтетични ензими за (ЗДРфукоза, предназначени за превръщането на feam.....
Първоначалните опити за използване на частично пречистен G-ДР-фукоза синтетичен ензим /събран след утаяване с амониев сулфат/ за превръщането на ОДР-маноза в вДР-фукоза не бяха успешни поради силното вътрешно окисление на КАДРНц Следващото пречистване на ензима чрез прекарване през ДЕАД- Stpharoe· сь-6® колона доведе до повишаване на активността на ензима, както и до намаляване на окислителната активност на НАДРН. Въз основа иа окислителен анализ на НАДРН активността на ензимния разтвор на този етап беше около 0,05 и/мл·
При използване на нрьс анализ беше установено увеличаване на образуването на СДР-фукоза. След шест часова реакция добивът на СДР-фукоза възлизаше на околс 9 процента спрямо добавения маноза 1-фосфат. Може да се очаква получаването на по-високи , добиви, ако могат да се приготвят ензимни разтвори с по-високи активности. По време на реакцията се наблюдаваше разрушаване на G-ДР-маноза. Това разлагане може да се предотврати чрез добавяне на калиев флуоред. Това се дължи на замърсяването на ензимния препарат с други ензиш. Ако може да се използва чист ензим, може би няма да бъде необходимо добавянето на флуоридаа сол.
Бехтерад pMuttonia АТСС 12358 се отглевдаие в среда от 2 литра, съдържаща 10 г казамино киселина (Difco)> 5 * екстракт от дрожди, 3 г К^НРО^, 1 г КН^РО^ и 5 г Д-глккоза на литър /рН 7,0/, След инкубиране при 37¾ в продължение на 13 часа, клеисите се отделяха чрез центрофугиране /10000 х g, 50 минути, Л/ и се суспендираха отново в 50 милимола трие буфер, съдържащ 0,5 милимола ДТТ /рН 7,5/. Клетките ое разкъсваха с помощта на френска работеща под налягане клетка Prtnch pressure ceil при 16800 паувда на инч. Парчетата от клетките се отделяха чрез центрофугиране при 23000 х g в продължение на 60 минути и матерната луга /несъдържащият клетки екстракт/ се използваше за пречистване на ензима. Несъдържащият клетки екстракт /50 мл/ от 2 литра култура се обработваше с 60 мг протамин сулфат и получената утайка се отделяше чрез центрофугиране. След това при бавно разбъркване се прибавяше твърд амониев сулфат до 70 процента насищане /0,436 г/мл при 0^/. След центрофугирано утайката се събираше и се суспендираше отново в 20 мл буферен разтвор /50 килимсла трие, съдържащ 0,5 милимола ДТТ, рН 7,5/ и се длализир&ше в продължение на около 18 часа при 4°С в 4 литра от същия буфер. Полученият разтвор /20 мл/ след това се прекарваше през ДЕАЕ- Sepharose uL-бж» колона (Pha»aoia)/3 X 30 см/, която преда това беше доведена до равновесно състояние със същия буфер. Ензимът се елю^.раше с линеен градиент от 0 до 1 милимолажаС1 в същия буфер /общо 400 мл/. Активната фракция се събираше и се подлагаше на диализа в 2 л от 50 милимола трие фуфер, съдържащ 0,5 милимола Д1Т /рН 7,5/. Ензимният препарат директно се използваше за синтезата. Активността беше оценена на около 0,5 у /ма е помощта на ИРъС и окислителен анализ.
/е/ Изтгаваив на аиивноотаа иа ензима
За определяне на образуването на &ДР-М8ноза и ОДР-фукоза се използваше система. Беше използвана колона partisil sax (whatm&n Co.;,4»6 x OM»C Рйзм®Р нв частиците 5 микрона. Подвижният буфер беше 0,1 М фосфатен буфер /рН 3,5/ със око рсст на потока 0,5 мл/минута /налягане 600 паунда на квадратен инч/. Съединенията се определяха с УЕ детектор при 254 нанометра. Времето на задържане за ОДР-маноза беше около 8,9 минути, а
- 85 за ОДР-фук··· беше около 13 минути· Активността на ОДР-маноза пирофоофорилазата беше оценена чрез проследяване на образуването на ОДР-маноза от </-маноза-1-фосфат и СТР с помощта на hplc анали·* Реакцията съдържаше 10 микромола трио- hcl , 1 микромол 1 -маноза 1-фосфат, 1 микромол GTP и частично пречистен ензим в общ обем от 0,5 мл· След инкубиране при 30% за период от време, зависещ от активността на ензша, реактантът /100 микролитра/ се изтегляше от сместа и се центрофугираше през филтър uitrafr·· filter unit (1OOOO MW eetout, Millipore) · Филтратът /5 микролитра/ след това се инжектираше в в>ъс за определяне на образуването на ОДР-маноза. Количественото определяне на ОДР-маноза се извършваше с помощта на стандартен разтвор на ОДР-маноза, приготвен от пречистена СДР-маноза (sigaal Щдна единица се равнява на 1 микромол СДР-мвноза, образувана за една минута при условията на анализа·
Измерванията на активността за оценяване на превръщането на ОДР-Д-маноза в СДР-ь -фукоза могат да се проведат или чрез спектрално определяне на окислението на ШНРН или чрез пряко измерване на образуването на СДР-ь-фукоза по метода на hplc. Тъй като ензимните препарати съдържат активност от ШДРН оксидаза, необходимо е едновременно да се определя скоростта на оки сле^ние на НАДРН в отсъствие на субстрат· В две кювети се добавят: 1 мк от бО мшщокша трио буфер /рН 7,5/, съдържащ 0,2 микромола ШДРН и ензимен разтвор в едната кювета, и 0,1 микромола ОДР-маноза - в другата кювета· Определя се скоростта на намаляван· на оптичната плътност при 340 наномвтра. Разликата в скоростта на окисление на ШДРН е мярка за конверсията. На фиг. 1 е представен типичен анали·, при който линията А на оптичната плътност е за контролната кювета без ОДР-маноза, а линията В • 86 * е за същия разтвор, но задържащ допълнително 1 микромол ОДР-иа^ нова· Здна единица ое равнява на окисление на 1 микромол НАДРН за една минута при условията на анализа·
За MFLC анажиз реакционната среда е 1 ми трие буфер /рН 7,5/, съдържащ 1 микромол СДР-Д-маноза, 0,2 микромола НАДРН, 2 микромола К₽, 2 единици алкохол дехидрогеназа, 10 микролитра изопропанод и подходящия ензимен разтвор· След инкубиране за определен период от време /едан час/, от реактаита се изтеглят 100 микролитра и се центрофугират през uitra.fr·· filter unit (10000 ми cutout* Milliporcj . След това филтратът /5 микролитра/ ое инжектира в ою за определяне на образуването на СДР-фукоза. Количественото определяне на ОДР-фухоза се извършва о помощта на стандарт от СДР-фукоза, приготвен от пречистена ОДР-фукоза (sigma). Щдна единица се равнява на 1 микромол СДР-фукоза, образувана за една минута при условията на анализа. На фиг.2 са представени три примерни криви нвьспри нулево време /А/, около три часа /В/ и около шест часа /С/ след започване на реакцията. Както беше отбелязано по-горе, СДР-маноза се елюира за около 8,9 минути, докато СДР-фукоза се елюира за около 13 минути.
Пример 4s Ензимна синтеза на вДР—фукоза. от маноза
Към δ мл от реакционния разтвар се прибавят 5 микромола Man
1-фосфат, 1 микромол НАДРН, 5 микромола GTP, 5 микромола РЕР, 100 единици пируват киназа, 50 микролитра изопропанол, 5 еди· ници I, Brokii алкохол дехидрогеназа, 1 микромол MgCi2, 100 единици неорганична фоофатаза, 5 микромола KF, 0,1 единици СДРманоза пирофосфатаза /разтвор/ и 0,05 единици СДР-фукоза оките- • 87 тични ензими,и се иикубира при 30¾ в продължение на иеот часа. Образуването на G-ДР-фукоза се определя с помощта на нтъс анализ·
Пример 51 Получаване на Gaia 1,3( fit© <Zi,4)G1b»Ac при използване на in е1шгенериране
Смес от GTP натриева сол /6,0 мг, 10 мжромола/, Man-ii к сол /3,5 мг, 10 микромода/, Galfii,3Gio»Ae /3,8 мг, 10 микро· мола/,Bai /0,42 мг, 10 микромода/, маши /9,4 мг, 10 микро· мола/, PEP К сол /4,1 мг, 20 шпсромола/, м«С12-6н2о /2,6 мг, микромола/, мпС12-4М2о /2 мг, 10 микромода/, 2-пропанол /50 микролитра^ АДН /12 единици/, РК /200 единици/, РРа** /100 еди· ници/, суров ензимен препарат от GflP-маноза пирофоофорилаза /1 мл/ и суров ензжен препарат от ензим, произвеждащ ОДР-фукоза /1 мл/ в 100 милимола трие буфер /рН 7,5/ и се разрежда до 3 мл. ^1,3/4-фукозилтранофераза /0,01 единици/ се прибавя към сместа и сместа се разбърква под аргон в продължение на три дни при стайна температура. Сместа се филтрува и филтратът се подава в колона с ΰονβχ 1-3® /0Н*/ форма, а след това в колона & 50W -Х8 /Н*/ с вода. Фракциите се събират и лиофилизират. Полученият материал се пречиства с колона от Sephadex G-25 /овръкфин/ с вода. Съответните фракции се събират и лиофилизират и се получава GalBi,3(lu©Zl,4)Gi©MA· · Неговият ^Н-ЯМР спектър е в добро съответствие с литературните данни. et al., Bioaed.
Che», Lett.. 1:425 (1991).
- 88 Пример 6: Химически синтез на маноза 1-фосфат /съединение 18 ми 93//oxw 9/ /а/ 1,2,3,4,6-пента-О-ацетил-Дмжноза мн -W_______
Д-маноза /съединение 13; 5,0 г, 27,8 милимола/ се разтваря в безводен пиридин /30 мл/ и се охлажда до 0-5°С в ледена баня· Към разтвора се прибавя бавно оцетен анхидрид /20 мл/ и сместа се разбърква при стайна температура в продължение на осем часа· Сместа се излива в ледена вода и се екстрахира с етилацетат. Екстрактът ое промива последователно със студена солна киселина, вода, студен наситен воден разтвор на натриев бикарбонат, вода, наситен разтвор на натриев хлорид, вода и ое суши над безводен натриев сулфат. Органичният слой се концентрира във вакуум и се използва в следващия етап без по-нататъшно пречистване. Съединение 14 или 65; 10,6 г, добив 98 процента, чист /-изомер.
/6/ 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-Д-маноза
Пентаацетатът /съединение 14 или 65; 10,0 г, 25,6 милимола/ се разтваря в тетрахидрофуран и се прибавят 1,5 еквивалента бензиламин /4,6 мл/. Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на един ден. След това тя се екстрахира с етилацетат и се промива последователно със студена солна киселина, вода, студен наситен разтвор на натриев бикарбонат, вода, студен наситен разтвор на натриев хлорид, вода и се суши над безводен натриев сулфат. Разтворителят се отстранява във вакуум и полученият сироп се хроматографира върху силикагел с етилацетат; хексан 2:3 /обем/обем/ · Получава се съединение 15 или 72 /7,8 г, добив 87 процента, чист <-изомер/. ЧьЖР (CDClj) : 2,00,
- 69 2,05, 2,11, 2,17 (ЗН, ·, 4 x CH^CO), 4,01-4,15 (1Н, в, 5-H), 4,21-4,29 (2В, в, 6-Н), 5,24 (1й, d, 1-Н), 5,26-5,27 (1Н, в,
2-Ь), 5,50-5,34 (1Н, d, J-12,03 Η*, 4-Н), 5,41-5,45 (1Н, dd, J 3,36, 9,99 йз, 5-И).
/с/ Дибеизилфосфитил 2,3,4,6-тетра-0ацетил-Д-манозмд /съединение 16 ШЛ1
Ианоза- тетраацетатът /съединение 15 или 72//1.5Г, 4,31 милимола/ се разтваря в безводен тетрахидрофуран /30 мл/ и се разбърква пс« азот при стайна температура· Към разтвора ое добавя
1,2,4-триазол /1,5 г, 21,7 милимола/ и се разбърква, докато се разтвори. Към разтвора се прибавя дибензил- Н,П-диетил-фоофорамидит /10,0 г, 31 милимола/ и сместа се разбърква в продължение на един час. Към разтвора се добавят 50 мл етер и реакционната смес се екстрахира последователно със студен наситен разтвор на натриев бикарбонат, вода» студен наситен разтвор на натриев хлорид и вода, > се суши над безводен натриев сулфат. След това органичният екстракт се концентрира във вакуум и полученият сироп се пречиства през колона със силикагел с етилацетат-хексан 1:4 /обем/обем/ като разтворител и се получава съединение 16 или 79 /чивТс/ -изомер/.
^Н-ЯМР (CDClj) Si 2,a - 2,3 (12И, 48, 4 х СН^СО), 3,92 3,98 (1Н, dd, 6-На), 4,05 - 4,1 (1Н, ж, 5-Н), 4,18 - 4,24 (1Н, dd, 6-НЬ), 4,85 -5,12 (4И-, ж.ШГИМ, 5,22 - 5,24 (1TH, а, 2-Н),
5,28 - 5,52 (1Н, t, 4-Н), 5,38 -5,42 (1Н, dd, 3-Н), 5,48 - 5,52 (IB, dd, 1-Н).
- 90 /4/ Дибензилфоофорил 2,3,4,6-тетра-0-ацетилСъединение 16 или 79, разтворено в безводен тетрахидрофуран и охладено до -76¾ в баня от оух лед и ацетон, ..ж. 30 процентен водороден пероксад /7 мл/ се прибавя към разтвора в една порция. Разтворът се оставя да се нагрее до стайна температура и се разбърква в продължение на 90 минути, Излишъкът от водороден пероксад се елиминира чрез добавяне на ледено студен натриев тиосулфат. След това се прибавят 100 мл етер и екстраж* цията се провежда, както е описано по-горе. Получава се съединение 17 или 86, което се използва в следващия етап без изпъл нително пречистване.
/·/ /скдииени, 18 или 93/
Съединение 17 или 86 се хадрира над Pd/C /400 мг/ в етанол /30 мл/ и в натриев бикарбонат /10 мл/ във водородна атмосфера в продължение на два часа. Катализаторът се филтрува и филтратът се концентрира. Към този концентрат се приканва разтвор на натриева основа при 0-5¾, докато pH на реакционната смес достигне нед 12, Сместа се разбърква в продължение на три часа при 4¾ и след това се неутрализира чрез добавяне на студена N оцетна киселина до pH 7,2, Сместа се филтрува, разрежда се до 400 мя, подава се в колона с Bewex 1-Х8 /Ж00*/ форма и се елюира с линеен градиент на амониев бикарбонат /0-0,6 Фракциите, съдържащи Д-маноза-1-фосфат; се събират и лиофилизират. Излишъкът от амониев бикарбонат се отщстранява чрез промиване на лиофилизирания прах с Dowex 50W -ХВ /водородна форма/ и се получава съединение 18 или 93 жьв ввд на динатриева сол.
А. Обща процедура за халохидриране, катализирано от яопдевочмм» /ах»м» 3. 4 11 4а/_______
Към реакционна смес, съдържаща 20 мл лимонено кисел · фос фатен буфер /рН 3/> 1 милимол глижал, 5 милимола калиев халогенед и 1170 единици от ензима се прибавят 600 микролитра водороден перовоцд /30 процентен/· Реакцията продължава 36 минута /йодхвдриране/, три часа /бромхвдриране/ или три дни /хлорхидриране/ при стайна температура. Разтворителят се отстранява под вакуум и към остатъка се прибавя метанол. Неразтворимият материал се филтрува и разтворителят се oipawaaa под вакуум. Остатъкът се пречиства хроматографски с С8 обърната фаза силикагелна колона, като се получават 2-деохои-2-хало захари· Продуктите се превръща» в перацетати по ставд«фтеи метод /пирвдин, каталитично количество 4-диметиламинопиридин, оцетен анхидрид, един ден/ и се пречистват хроматографски с колона от силикагел· /V Парапета» на смдинени. 20 ^-ЯИ» (0ЛС1,) Й1/-ИЗО1ИР1 2,04 (м, ·), 2,06 (», 2,10 (5Н, ·), 2,21 (5И, ·), 4,05 (1Н, dd, J · 2,5, 12,5 Ив, В6), 4,08 (1Н, dd, J. 5,5, 11 Ив, Н-2), 4.28 (1Н, ddd, J« 2, 4, 1© Вв, Н-5), 4,31 (1Н, dd, J . 4, 12,5 Hi), И-6), 5,09 (1H, dd, J · 9, 1@ Hi, H-5), 5,52 (1H, dd, J . 9, 11 Hl, H-4),
6,56 (1H, d, J- 5,5 Hi, H-1) ррв.
- 92 £-йзомер: 2.оз (зн, s), 2.09 (зн, s), 2.11 (ЗН, S), 2.18 (ЗН, S), 3.88 (1Н, ddd, J=2.4, 4.5, 10.5
Hz, H-5) | , 3 | .90 | (1H, | dd, J-9, 1C | 1.5 HZ, H-2), 4.11 (1H, |
dd, J=2. | 5, | 12. f | i HZ, | H-6), 4.32 | (1H, dd, J=4.5, 12.5 Hz, |
H-6), 5. | 03 | (1H, | dd, | J«9, 10 HZ, | H-3), 5.34 (1H, dd, J-9, |
10.5 Hz) | , 5 | .81 | (1H, | d, J=9 HZ, | H-l) ppm. 13C-NMR (CDCIj) |
d: 20.52 | -20 | .67 | (4 X | C), 47.50, | 62.10, 68.46, 72.85, |
74.36, 93.11, 167.91-172.10 (4 X С) ppm. HRMS (M+Na*) ; ИЗЧИС.433.0110/435, НЯМер. 433.0112/435.
/2/ Перацетат на съединение 21 ’н-NMR (CDCIj) 5: α-иЗОМер: 2.07 (ЗН, s) , 2.10 (ЗН, s), 2.11 (ЗН, s), 2.17 (ЗН, s), 4.19 (1Н, ddd, J=2.5, 4.5, 10.5 Hz, Н-5), 4.17 (1Н, dd, J=2.5, 10.5 Hz, H-6), 4.23 (1H, dd, J=4.5, 12.5 Hz, H-6), 4.43 (1H, dd, J=2, 4 Hz, H-2), 5.21 (1H, dd, J=4, 9.5 Hz, H-4), 5.45 (1H, t, J=1O Hz, H-4), 6.32 (1H, d, J=2 Hz, H-l) ppm. 13C-NMR (CDCIj) <5: 20.60, 20.66, 20.75, 20.86, 47.77, 61.82, 65.54, 68.75, 71.25, 93.11, 167.20-171.90 (4 X C) ppm.
0-ИЗОМер: 2.07 (ЗН, s), 2.10 (ЗН, S), 2.12 (ЗН, s), 2.18 (ЗН, S), 3.82 (1H, ddd, J=2.5, 5, 9.5 Hz, H-5), 4.13 (1H, dd, J-2.5, 12.5 Hz, H-6), 4.27 (1H, dd, J=5, 10.5 Hz, H-6), 4.60 (1H, dd, J»3.5, 1.5 Hz, H-2), 5.00 (1H, dd, J-4, 9.5 Hz, H-3), 5.43 (1H, t, J-9.5 Hz, H-4), 5.74 (1H, d, J-l.S Hz, Н-I) ppm. ”c-NMR (CDCIj) 6: 20.60-20.85 (4 X C), 51.05, 61.82, 65.27, 71.01, 73.04, 90.01, 167.20-171.90 (4 X C) ppm. HRMS (M+Na*) : ИЗЧИС.433.0110/435, намер.433.0115/435.
(/3/ Перацетат на съединение 22 1H-NMR (CDCIj) 6: Д-ИЗОМерч 2.04 (ЗН, S), 2.07 (ЗН, s), 2.16 (ЗН, s), 2.19 (ЗН, s), 4.08 (1Н, dd, J-9,
11.5 Hz, H-2), 4.10-4.15 (3H, m, 2 X H-6 & H-5), 5.15 (1H, dd, J-3, 11.5 Hz, H-3), 5.35 (1H, d, J=3 Hz, H-4),
35.84 (1Н, d, J«=9 Hz, H-l) ppm. 13C-NMR (CDC13) £: 20.42, 20.52, 20.61, 20.66, 46.35, 60.89, 67.03, 71.94, 72.78, 93.43, 168.31-170.90 (4 X C) ppm. tt-ИЗОМвр: 13C-NMR (CDClj) i: 20.42-20.66 (4 X C), 44.39, 67.04, 67.69, 68.64, 69.39, 91.05, 167.01-170.86 (4 X C) ppm. HRMS (M+Na*) :ИЗЧИС. 433.0110/435, намер. 433.0119/435.
/4/ Съединение 23 1H-NMR (CDClj) , д-изомер: 1.12 (ЗН, d, J»6.5, CH3) , 3.45 (1H, dd, J=l, 3 HZ, H-4), 3.52 (1H, dd, J«=3,
10.5 Hz, H-3), 3.58 (1H, qd, J«l, 6.5 Hz, H-5), 3.69 (1H, dd, J=8.5, 10.5 HZ, H-2), 4.45 (1H, d, J=8.5 Hz, H-l). 13C-NMR (CDClj) , £“И30Мер: 16.71, 58.04, 72.13, 73.56, 76.03, 98.78 ppm. /3-ИЗОМер: 16.71, 54.71, 67.25, 71.13, 74.55, 94.20 ppm. HRMS (M+Na*) : ИЗЧИС . 248.9738/251, ΗΗΜβρ.248,9730/251.
/5/ Перацетат на съединение 25 1H-NMR (CDClj) <5: /3-изомер: 2.05 (ЗН, S) ,2.08 (ЗН, s), 2.16 (ЗН, s), 2.18 (ЗН, s), 4.06 (1Н, dd,J»9,
11.5 Hz, H-2), 4.07-415 (3H, m, 2 X H-6 & H-5), 5.09 (1H, dd, J=3, 11.5 Hz), 5.39 (1H, d, J»3 Hz, H-4),5.75 (1H, d, J=9 Hz, H-l) ppm. nC-NMR (CDC13) , 0-ИЗОМер: 20.21-22.55 (4 X C), 55.30, 60.87, 66.84, 71.86, 72.74, 93.53, 168.20-180.21 (4 X C) ppm. а-ЙЗОМвр: 20.1-22.55 (4 X C), 53.46, 61.04, 67.44, 68.67, 69.51, 90.94, 168.20-180.21 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na*): ИЗЧИС. 389.0615/391, намер. 389.0610/391.
/6/ Дерацетат на съединение 27 ’н-NMR (CDC13) St д-изомер: 2.04 (ЗН, s), 2.07 (ЗН, s), 2.12 (ЗН, S), 2.17 (ЗН, S), 4.06-4.17 (4H, Ш, H-2, 2 X H-6 & H-5), 5.13 (1H, dd, J-3.5, 10 Hz, H-3), 5.25 (1H, d, J«3.5 HZ, H-4), 5.91 (1H, d, J=9.5 Hz, H-l) ppm. 13C-NMR (CDClj), 0-ИЗОМер: 20.5-22.50 (4 X C) , 24.98, 60.94, 67.10, 72.16, 74.10, 94.15, 168.20-179.36 (4 X C) ppm; а-изомер: 20.5-22.50 (4 X C), 29.87, • 94
60,63, 67,68, 68,31, 69,42, 92,16, 168,20-179,36 (4 х 0) ррж. нямб (м*»а*): изчислено 480,9972, намерено 480,9999.
В. Халохадриране на дизахаридаи гликали и сиалал, катализирано о хлора®
/1/ Халохидриране на съединение 28 /схема 4/ микролитра от 30 процентен водороден пероксвд се прибавят към смес от съединение 28 /20 мг, 0,065 милимола/, КВг /38,6 мг, 0,32 милимола/ и хлорпероксидаза /76 единици/ в цитратен буфер /1,4 мл; pH 3/. Реакционната смес се разбърква ба вно в продължение на три часа при стайна температура. Разтво рителят се отстранява под вакуум и към остатъка се прибавя метанол. Неразтворимият материал се отфилтрува и филтратът се концентрира във вакуум. Полученият концентрат се пречиства хроматогрефски с Сребърната фада силикагелна колона и се получава смес от Д-галактопираяозил-/ /1,3/-2-бромо-2-деокси-Д-гл1Ж(Я1ираноза, съединение 29, /10 мг/ и Д-галактопираиозил-71,3/-2бромо-2-деокои-Д-манопираноза, съединени® 30 /10 мг/ с добив 76 процента. Продуктите ее ацетилират с оцетен анхидрид и пиридин в присъствие на каталитично количество ДМАР зе охарактеризи ран».
/2/Халохидриране на 2,3-дехидро-Н-ацетил-невраминова киселина, катализирано с хлорпероксидаза /оъвдикение 36/ /охема 3/____________________
100 микролитра 30 процентен Н202 ое прибавят към смес от съединение 34 (heindi, hoppe-SeylT*» a. fhyeiol. сьеж..^^* 1088 /196©/; 50 мг, 0,17 милимола , КВг /102 мг, 0,857 милимола/ и хлорпероксидаза /200 единици/ в цитратен буфер /3,5 мл; рК 3/ · Реакционната смес се разбърква бавно в продължение на 30 минути при стайна температура. Разтворителят се отстранява
-95 под вакуум и към остатъка се прибавя метанол. Неразтворимият материал се отфилтрува и филтратът се концентрира под вакуум· Полученият продукт се пречиства с колона βι©ο·ι Р-2 и следващо пречистване с помощта на хрвматография с обърната фаза Сд със силикагелна колона; ацетонитрил-вода /511/. Получава се 2-бром-2-деокси-П-ацетилневраминова киселина, съединение 35 /43 мг, 65 процента/. Продуктът се перацетилира с оцетен анхидрид и пиридин в присъствие на каталитично количество ДЖР, със следващо метилиране с Mel и СвСО~ за охарактеризирано.
'
Н-ЯМР (CDOlj) S: 1,95, 2,04, 2,05, 2,10, 2,19, 2,20, (5Н, в, ВОбКИ , ОАс И КНА®), 3,85 (5Н, е, СОООВ,), 4,11 (1Н, ddd, J « 8,7, 10,6, 10,7 Η·, Н-5), 4,22 (1Н, dd, J - 6,4, 12,5 Η», Н-9), 4,52 (1Н, dd, J « 1,6, 10,6 Нж, И-6), 4,57 (1Н, dd, J«5,15 (1Н, ddd, J « 2,4, 5,5, 6,4 Hi, H-8), 5,31 (1H, dd, J. 1,0, 5,5 Hi, Н-7/, 5,43 (1H, d, J « t,7 Hi, Sil), 5,67 (1H, dd, J « 5,8, 1C,7 Hl, H-4). HRMS: ИЗЧИСЛвНО за С22Н508014ВгС1 (>i+CB*) 745,9904/746, намерено 745,9900/746.
/3/ 1,3,β,2*,3*, 4*, 6*-хептаацетил-Д-галактопиранозил- /1,4/-2-бром-2-деокси-гликопираноза /съединение 32/ и -2-деокаиманопираноза /съединеНМ SS/
Съгласно общата процедура смес 111 от съединение 32 и съединение 33 /155 мг, 71 процента/ се получава от Gali(1,4) глюиал /съединение 31//96,5 мг/. Съотношението на съединения 32 и 33 се определя ст интегралното съотношение на аномерните протони на съединения 32 и 33. Съединения 32 и 33 се получават като «тзрми смеси β> : съединение 32 ДХ:/«113/, съединение 33 /X ip* 2:1/.
H1MS на съединение 32 и съединение 33: изчислено за
- 96 C26ri35°17BrCs (b+Cs+) £31,0112/833, намерено 831,0112/833.
хН-ЯмР на сместа от съединения 32 и 33:
(CDC15) ΰ: 1,96, 1,97, 1,98, 1,981, 2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,070, 2,074, 2,075, 2,08, 2,12, 2,13, 2,132, 2,15, 2,16, 2,166 (-OCHj), 3,84 (dd, J = 1,6, 9,0 Hz, Н-2 на Glu на β аномер на съединение 32), 3,73-4,22 (т), 4,40 (dd, J = 2,2, 3,8 Hz, Н-2 на οόаномер на съединение 33), 4,43-4,47 (т), 4,46 (dd, J= 1,0, 7,6 Hz), 4,55 (d, J = 8,0 Hz), 4,57 (dd, J = 1,6, 4,0 Hz, Н-2 на <Z аномер на съединение 53), 4,59 (d, J=8,0 Hz), 4,93 (dd, J= 3,5, 5,1 Hz), 4,96 (dd, J=3,5 4,96 Hz), 4,99 (dd, J=3,5, 10,5 Hz, H-3* наВ аномер на съединение 32), 5,03 (dd, J = 3,8, 8,8 Hz), 4,07-5,12 (m), 5,16 (dd, J=8,0,
10,5 Hz), 5,20-5,26 (m), 5,35-5,38 (m), 5,70 (d, J = 1,6, H-1 на β аномер на съединение33), 5,76 (d, J=9,0 Hz, H-1 нав аномер на съединение 32), 6,26 (d, J=2,2 Hz, H-1 на cZ. аномер на съединение 33), 6,30 (d, J=3,4 Hz, н-1 на аномер ч на съединение 32). С-ЯМР
20. | 65 , | 20.75, | 20 | .80, 20.84, |
48. | 13, | 51.26, | 60 | .77, 60.91, |
62. | 04, | 65.56, | 66 | .62, 66.71, |
69. | 14, | 69.30, | 70 | .68, 70.72, |
70. | 91, | 70.94, | 70 | .98, 71.16, |
74. | 13, | 74.29, | 76 | .32, 76.61, |
100 | .84 | , 101.19 | г | 101.45, 168 |
169 | . 14 | , 169.22 | / | 169.36, 169 |
170 | . 16 | , 170.29 | f | 170.36, 170 |
(CDC1, | .) 20, 52, | 20, 61, |
20.88, | 20.93, 46.27, | 47.95, |
61.08, | 61.49, 61.67, | 61.79, |
66.75, | 68.97, 69.03, | 69.09, |
70.75, | 70.78, 70.82, | 70.86, |
71.73, | 73.44, 73.68, | 73.80, |
89.77, | 90.34, 92.98, | 93.13, |
42, 168.45, 168.53, 168.92,
59, 169.65, 170.08, 170.13,
46.
/4/ 1,3,6,21, 31,4Ζ,6#-хептаацетил-Д-галактопиранозил -3 /1,3/-2-бром-2-деоксиглюкопирано за /съединение 29/ и -2-деоксиманопираноза /съединение 30/
Съгласно общата процедура, смес 1:1 на съединения 29 и 30
- 97 /6о мг, 76 процента/'’ се получава от Gal В (1,.5)глюкал /съедине— ние 28/ / tJO у ό мГ/ . Съединения 22 и 30 се изолират с помощта. на колонна хроматография със силикагел /етилацетат-н-хептан 5:2/ във вид на аномерни смеси : съединение 29 / <<:/3 =1:10/, съединение 30 /^.:/3 = 12:5/.
уЗаномер на съединение 29: ^Η-ΗιΦ (cdci3) б:
1.98, 2.04, 2.07, 2.08, 2.09, 2.15, 2.17 (ЗН,ВСвКИ, S,
OAc X 7), 3.78 (1Н, ddd, J«1.8, 4.6, 9.7 Hz, Н-5 of
Glu), 3.85 (1H, t, J=9.5 Hz, H-2 of Glu), 3.89 (1H, t,
J=7 Hz, H-5of Gal), 3.96 (1H, t, J=10.0 Hz, H-3 of Glu), 4.07 (1H, Π1, H-6 of Gal), 4.09 (1H, dd, J-1.8, 12.4 Hz, Η-б of Glu), 4.13 (1H, dd, J=7.0, 11.1 Hz, H-6 of gal), 4.25 (1H, dd, J=4.6, 12.4 Hz, H-6 of Glu), 4.89 (1H, d, J-7.7HZ, H-l of Gal), 4.97 (1H, t, J-9.6 Hz, H-4 of Glu), 5.03 (1H, dd, J«3.4, 10.0 Hz, H-3 Of Gal), 5.13 (1H, dd, J-7.7, 10.0 HZ, H-2 of Gal), 5.36 (1H, d, J=3.4 HZ, H-4 Of Gal), 5.75 (1H, d, J“9.0 Hz, H-l Of Glu) .
HRMS: ИЗЧИС. за C26H35O17BrCs (M+CS*)
31.0112/8 33 , намер. 831.0112/833.
13C-NMR (CDC13) 6: 20.55, 20.64, 20.68, 20.71, 20.75, 20.96, 50.11, 60.93, 61.62, 66.73, 68.53, 68.96,' 70.62, 70.82, 72.87, 77.21, 81.30. 92.86, 101.61, 168.77, 169.03, 169.35, 170.13, 170.20, 170.36, 170.67.
аномер на съединение 30: 1h-nmr (cdci3) 6:
4.24 (1H, bd, J=3.0 HZ, H-2 Of Man), 4.55 (1H, d, J«8.0 HZ, H-l of Gal), 5.01 (1H, dd, J=3.4, 10.5 Hz, H-3 of Gal), 5.18 (1H, dd, J=7.8, 10.5 Hz, H-2 of Gal), 5.32 (1H, t, J=8.7 Hz, H-4 of Man), 5.39 (1H, dd, J=1.0, 3.4 HZ, H-4 of Gal, 6.30 (1H, d, J=3.0 Hz, H-l of Man).
β> аномер на съединение 30: 1h-nmr (cdci3) 6:
4.45 (1H, dd, J»2.0, 3.5 Hz, H-2 of Man), 4.55 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l of Gal), 5.01 (1H, dd, J-3.4, 10.5 Hz, H-3 of Gal), 5.20 (1H, dd, J«7.8, 10.5 Hz, H-2 of Gal), 5.30 (1H, t, J=7.4 Hz, H-4 of Man), 5.39 (1H, dd, J«1.0, 3.4 HZ, H-4 Of Gal), 5.80 (1H, d, J»2.0 Hz, H-l of Man).
- 98 HRMS: ИЗЧИС. За C26H35O17BrCs (M+Cs*)
831.0112/833 , намер. 831.0110/833.
13C-NMR 20.57, 20.65, 20.76, 20.87, 20.95,
21.01, 21.04, 48.21, 60.98, 61.19, 62.01, 62.61, 66.75,
66.82, 68.43, 68.52, 70.71, 70.88, 71.05, 72.03, 73.36,
74.74, 75.93, 77.23, 90.08, 92.80, 100.10, 100.24, 168.23, 169.13, 169.22, 169.73, 170.18, 170.40.
/5/ Сиалил / (1,3) GalB( 1,4) (Fuc/(1,3)) -2-бром2-деоксиглюкопираноза /съединение 37а/ и -2-бром-2-деоксиманопираноза /съединение 37Ь/ **' Съгласно общата процедура смес 1:1 на съединения 37а и 37Ь /3,о мг, 5о процента/ се получава от NeuAc(2,3)Galfi(1,4)(Fuc /(1,5)) глюкал, съединение 36 /5,5 мг/. Съотношението на съединения 37а и 37Ь се определя от интегралното съотношение на метиловите протони на фукозата.
на сместа от съединения 37а и 37Ь: %-ЯМР (В20)
1,17 (d, J=6,0 Hz, СНЗ HaFuc), 1,18 (d, J=6,0 Hz, СНЗ на Fuc), 1,80 (t, J=12,7 Hz, H-3ax Ha NeuAc), 2,02 (s, NHAc), 2,75 (dd, J=5,0, 12,7 Hz, H-3 eq HaNeuAc), 3,45-4,13 (m), 4,48 (d, J= 8,0 Hz, H-1 на Gal), 4,49 (d, J=8,0 Hz, H-1 на Gal), 5,0-5,04
1.
(m), 5,18-5,22 (m), 5,38-5,42 (m).
Пример 8: Обща процедура за бромхидриране с (MBS)
Към разтвор на 1 милимол глюкал в смес от 3,6 мл ацетонитрил с 1,5 мл вода се прибавя 1 милимол N-бромсукцинимид (NBS) при стайна температура. Разтворителят се отстранява под вакуум и остатъкът се хроматографира с помощта на. колонна хроматография със силикагел. Продуктите се превръщат в перацетати с пиридин и оцетен анхидрид в присъствие на каталитично количество
4-диметиламинопиридин и се пречистват с колонна хроматография
- 99 със силикагел за охарактеризирана.
/а/ 1,3,6,2’ ,3’ ,4’ ,б’-хептаацетил-Д-галактопиранозил-/’ /1,4/-2-брсм2-деоксиглвкопирансза /съединение 32/ и -З-деокоиманопмрааоза /съединение 33/
Съгласно общата процедура, смес ст 1:2,5 съединение 32 и съединение 33 /30 мг, 78 процента/ се получава от Galfi(i,4) глхжал /съединение 31 /17 кг/. Съотношението на съединения 32 и 33 се определя от интегралното съотношение на еномерните протони. Съединения 32 и 33 ое получават като аномерни смеси/ty3s съединение 32 /хг’ «3:5/, съединение 33 /х :/· 5:2/.
/Ь/ ^етил 5-ацетшцдо-2,4,7,8,9-пента-О-ацетил*
3-бромо-3,5-дидеокси- з-Д-еритро- 1-маио2-нонулопиранозанат /метил перацетил съединение Зо, съединение 35а/ и метил 5-ацетамвдо-2,4,7,8,9-пента-Оацетил-З-бром-З,5-дидеохси- х-Д-еритро- 1-глюко-2-нонулопираносонм /съединение 356/
Химическо брс-жадриране се провежда съгласно общата процедура. Продуктите се превръщат в перацетати със следващо естерифициране с метижйодщд в присъствието на еквимолно количество цезиев карбонат и се получава смес от съединения 35а и 355 /155 мг, 74 процента/. Състнозението на съединения 35а и 355 се определя от интегралното съотношение на метилестерните протони. ^Н-ЯМР спектрите на съединения 35а и 355 са в добро съответствие с докладваните по-рано ·
Съединение 35b:
(СДС13)
И.9С, 2,03, 2,08, 2,10,
2,12, 2,15 (ЗН, », ВСвКИ ОАв И SHA·), 3,78 (ЗН, в, COOCHj), 4,04 (1Н, 44» J-6,0, 12,4 Не, Н-9), 4,09 (1Н, 4, J-10,C He,
Н-Звх), 4,33 (1М, 444, J-10,0, 10,6, 10,7 Hl, Н-5), 4,36 (1Н,
- 10© <H, J. 2,4, 12,4 Hi, И-9*), 5,10 (1И ddd, J.2,4, 6,0, 6,1 Hl, H-8), 5,25 (1H, dd, J-2,5, 10,7 Hi, H-6), 5,30 (1И, dd, J « 10, 10,6 Hi, H-4), 5,38 (1H, dd, J-2,5, 6,1 Hi, M-7)* 5,90 (1H, d, J«10,0 Hi, MH).
Пример 9i Експресия на »а1В1,з/4О1вМА· Z2,3 сиалиятоанз&впам
Ексяресия с видов добив на разтворима ο·131,3/4Ο1·ια· ^2,3 сиалилтранофераза беше продадена в бакуловирусна анатема за експресия при използване на оДШ, кодираща смесен протеин между пре-иноулиновия сигнален пептвд и каталитичния домен на оиалилтраноферазата. сДИА, кодиращ смесения протеин е конструиран ет Via и др. в плазмидния вектор pOIR199 (Ни«м it al., J. Biel. Chai.. £Ц :4940(1986)«3a да се изолира ДКА фрагмент, съдържащ цялата кодираща последователност, единичната Еоо жтмясто в З1края на химерата беше най-напред разтворено, като надвисналата част беше затъпена и синтетичните линкери, съдържащи хм· 1 част бяха свтфзани. Полученият плазмцд беше разтворен с >М· 1, за да освободи смесения протеин сДШ, и този фрагмент беше клониран по единичното мм· 1 място в pBiuohao и трансферния вектор на бакуловируоната експресионна система, под контрола на бакуловирусния полихедрин промотор (Invitrogon; San Diego, СА). Всички рекомбвнантна ДПА манипулации бяха проведени при условията, препоръчани в инструкцията на производителите на ензима, при използване на стандартни протоколи. (Sanbrook ot al., MoioA Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Br···, Plainview, MT (1989)).
Създаването на рекомбинантен бакуловируо се провежда» при използване на МахВас експресионна система (invitrogon) , като
- 101 се следват точно протоколите , препоръчани от производителя. Накратко, плазмвд и вирус ДМА от див тип бяха смесени и използвани за пресичане на $f-9 клетки по калциево фосфатния метод. От траноферираните клепи беие получен рекомбинантен вирус, който беше разпръснат върху културалната среда и повторно пречи™ стен при ограничено разреждане. Изолираните различни клоналш плаки бяха анализирани за способността им да предизвиква* секреция на ос2,3м*вт към инфектираната клетъчна среда , като алихвота от средата се изпитваше директно за ^2,5 Кеш* активност при сиалилтрансферазен анализ. Изолираният продукт, който насочва най-виооките нива на ^г.змвит секреция беве означен като rBr2,?ST и беше увеличен до 500 мл чрез инфекция на просни sf-g клетки. Активността на ^2,3 Квмтбеие определена при използване на видоизменение на публикувания анализ с 0,9 шлимола. Тези манипулации са илюстрирани на долната схема 24.
- 102 -
Nhe I lL_r~T
EcoRI zi SP6 PLS a-2,3 NeuT притъпен
Scheme 24 pLS.пре-инсулинова водеща последователност край и
, c Nhe 1 линкер | |
Nhel | Nhel |
--------—r1 | |
SPS PLS | α·2,3 NeuT |
\ | I Nhe 1 |
Nhel | f Nhe 1 |
4ZE | .......... 'W |
pBlueBac vector
PLS a-2,3NeuT свързване обработка c Nhel свързване ——
Nhel N u 'T a-2,3NeuT PLS
rBv2,3ST
Реком. поел
ETL
Реком. поел
UC(Amp
103
Пример 10:
За получаване на големи количества & ,? кФмтбеше използвано гВт2,?зтза инфектирате на si-9 клетки в монослойна култура, при което обикновено се получаваха 2-3 единици щг,з м©жТ активност, оекретирана на 10® инфектирани клетки при нарастването мм В срала на lxo©U-400 (JRH Bioewiino··, Lenexa, KS). единиците на активност /милимола на минута/ се определят чрез умножаване на резултатите от анализа по коефициент 1,6, за да се подучи активност при Умаиа, Кондиционирана среда от гв^г, 3·ϊ -инфектирани клетки се събираме 72 часа след инфекцията и рекомбинантната zk,3 МемТ се пречистваше частично в един хроматографохи етас· Три литра среда, съдържаща ^2,3 мФит се филтруваха и концентрираха до около 250 мл в система със спирален патрон Anicon CH2PR8 , снабдена с патрон «шо · След то· ва системата се включваше на диафилтрация за обезооляване към концентрираната дута с три обема 10 милимола какодилова киселина, 25 милимола натриев хлорид, 25 процента глицерин, pH 5,3 /буфер А/. След това проби се подаваха в колона /2,5 х 17 cw' от S-Sephar©·* fait yiow (j>harmacia) , доведена до равновесие с буфер А при скорост на потока 2 мл/минута. След вкарване на цялата проба, колоната се промива о буфер А, докато QAggo на изтичащия от колоната поток се върне до базисната линия /1,6 пъти спрямо обема на колоната/·
СДед това /«,3 к©»т се елюираше от колоната с 50 милимсла какодилова киселина, lMiaci · 25 процента глицерин, рй6,5. Фракциите, съдържащи/2, з ИеиТ ое събираха и ое диализираха в продъяжение на около 18 часа срещу 1 л 50 милимола какодилова киселина, 0,5М к«01 , 50 процента глицерин, pH 6,0 и след това се съхраняваха при -20°С ·
Пример Hi
- 104Галактоаилиоане /а/ ьаеЖАевОалилова форма /съединение 41;
_
Смес от съединение 40 (Lee et al., Carbehydr. Mee-.
193 (1974)) /2,0 г, 7,65 милимола/, 01е-1р/2,74 г., 7,65 милимола/, PS? калиева сол /1,6 г, 7,65 микромола/, ШД* /193 мг, 0,25 милимола/, *»С12 .4Н20 /79,2 мг, 0,4 милимола/, м>С12· 6KgO /162,6 мг, 0,8 милимола/ ДТТ /306 мг, 2 милимола/, ici /1,04 г, 15 милимола/, »«»3 /20 мг, 0,31 мюлмола/ и щ>р /90мг, 0,19 милимола/ в нарвв буфер /100 милиМ, pH 7,5; 200 ма/ се довежда до pH 7,5 е помощта на 10 в и в Жаон,и към разтвора ое добавят ензимите тароа (ю и), udpgp (20 0), pi (100 и) , GalT (50) и РРаее (100 0) · Сместа се разбърква бавно в аргонева атмосфера при стайна температура /25°С/ в продължение на пет дни· Сместа се концентрира и ое хроматографира върху силикагел о хлороформ-етилацетат-метанол /от 5ι2ι2 до 5ι2ι3/ и ое получава дизахарвд, който по-нататък се пречиства със Sephadex G-25 0 вода, като се получава ЬаеЖАоВО алил /съединение 41/ /1,7 г, 50 процента/ι ^ΜίΜΡί^ο) 8 i2,o© (за, е, ваде), 3,49 (11, di, J« 7,84, 9,97 Не, Н-2 на Gal), 3,52-3,57 (1H, а, Н-5 HaGleHAe), 3,63 (1Н, dd, 3,31, 10,04 Не, Н-3 Hacal), 3,65-3,75 (8 й, в;, 3,79 (1Н, di, J· 5,10, 12,27 81, Н-ба Gloliae), 3,86 (1М, br i, J- 3,32 He, H-4 HBGal), 3,95 (1Н, ii, J« 2,14, 12,27 Ha, H-6b HaGleBAe), 4,43 (1H, d, J. 7,81 Ml, M-1 HBGal), 4,55 (18, d, J- 8q28 fii, H-1 HaGleMAc), 5,21-
5,29 (2H, в, алилов ), 5,83-5,90 (1H, в, 6ЛИЛ0В ),1 ^J-W/JlgO/
22,6, 55,5, 60,5, 61,5, 69,0, 70,9, 71,4, 72,9, 75,2, 75,8, 78,8, 100,4, 103,3, 118,6, 133,7- 105 /ь/
Разтвор на съединение 40 /1,15 г, 4,4 милимола/, l-1^/99 атомни процента, предлага се OTieotec ino., Miamisburg, <Ж| 800 мг, 4,4 милимола/, PSP К сол /1,82 г, 8,8 милимола, 95 процента/, ирр /90 мг, 0,19 милимола/, АЗР /100 мг, 0,18 милимола/, цистеии /116 мг, 0,96 милимола/, ДТТ /183 мг, 1,2 милимола/, мсС12.бН2о /244 мг, 1,2 милимола/, МпС12.4Н2© /118 мг, 0,6 милимола/, και /179 мг, 2,4 милимола/ и Gia-1-r /77 мг, 0,22 милимола/ в Him буфер /100 милиМ, pH 7,5; 120 мл/ се довежда до pH 7,5 е помощта на 10 ι и и Хаон · Към този разтвор се прибавят ензимите gk (ю и), рк (гое и), ггаае de и), Gai-1-р от do в), (1© о)и ©all (ю и). Сместа се разбърква бавно в аргонова атмосфера при стайна температура /25%/ в продължение на три дни· Сместа се концентрира във вакуум и полученият концентрат се хроматографира върху силикагел с етил* ацетат-метанол /2:1/, като се получава дизахарид, който по-нататък се пречиства с колона със Sephadex G-25 » 0 вода, като се получава съединение 1-^%-41 /106 г, 57 процента/· St 2,60 (ЗН, а, МНАс), 3,48-3,52 (1Н, в, Н-2 на Gal), 4,43 (1Н, dd, н-2 - 8,32 На, no-Г U2·33 йж» Й 1 ™
Gal), 4,54 (1Н, d, J« 8,32 На, Н-1 НВ GlaXAa). HRMS ИЗЧИОЛвНО •а12с1613°й29й®111* 447,1672, ШМеренО 447,1681.
/с/ 2-Деокои-Д-галажтопиранозмл-Ь/1,4/-2ацетамидо-2-деокси-гликопираноза «бишаишй W_____________ /36 процента/1 Както Ijj - ЯМР спектърът на неговия хептаацетат, така и ^-ЯМР спектърът на съединение 41а, са в добро съответствие с тези, докладвани в литературата (тих·· at al.,
- 106
APfitTr 9MPt........Mh........Mt Wm (1991)).
2-Амино-2-деокси-Д-галактопиранозил-Ь/144/· 2-ацетамвдо-2-деожои-глюкопираноза /MffisaatW________________ /12 процента/: ^Н-ЯМР за hoi оол (»2о) $ s 2,022, 2,024 (·, квас на / и d аиомерна gicmao), 3,17-3,23 (1H, в, к-2 на Gali), 4,67 (4, J- 7,53 Не, Н-1Ь И* GleMAs), 5,13 (d, J -1,54 Не, н-1а на GicMAe). HRMS изчислено за ο14η26η2ο10μ* (м+н**) 405,1485, намерено 405,1489. *Н-ЯМР спектърът на ацетатната му форма е в добро съответствие с този, докладван в литературата (Jraleie at al., Gb ο 0 biology. ^.-205 (1991)).
/е/ Ьтил Д-галактопиранозил-Ь/1,4/-2-азидо-2лотюм^гдюодюанйааа /дш1мен1>. -Ш/.......
В този случай ДТТ се елиминира, тъй като 2-азидо групата се редуцира до съответен амин с ДТТ. /15 процента/: IH-fiMP .6 аномер (DgO) д: 1,22 (1Н, t, J- 7,80 He, QCHgCHj), 3,27 (1Н, J-8,33, 9,о4 Ms, H-2 на CloHj), 4,40 (1Н, d, J- 7,81Ms, H1 на Gal), 4,55 (1M, J-8,24 Ms, H-1 Ha GlwMj). hrms изчислено за °14й25йЗ°1ОМа (M+Ha*) 418,1438, намерено 418,1438.
Ахцепторът етил 2-адвдо-2-двокси-Д-глюкопиранозцд ое приготвя както следва: триецетил-Д-глкнал ое азвдонитрира (Lasleux st al.. Can. J. OMsa.. Щ: 1244 ( 1979)) (Na»3 И Ct(MH4)2(H05)6 в CHjCi) и ацетилира /натриев ацетат в оцетна киселина/, като се получава 2-азвдо-1,3,4,6-тетра^О-ацетил-2-деокси-Д-глюкопираноза, която се обработва с Т1Вг4 в метиленхлорвд и етиляцетат, като се получава гликозилбромид, който след това се гликозилира с етанол в присъствието на AgOTf и молекулно сито А в метиленхлорвд, като след О-цеацетилиране с натриев метилат в
107 метанол се получава етил 2-азидо-2-деокси-Д-глккопиранозад /22 процента общ добив/ като смес от рби/ 1:1,5. ^Н-ЯМР (д2о , 1,21 (t, J 7,80 He, ©CHjCHj Hfi В аИОМОр ), 1,22 (t, J 7,80 He, OOHgCKj), 2,99 (dd, J 7,43, 9,83 He, H-2 Ha 3 анОМвр ), 5,11 (d, J 3,58 не, н-ι на oi аномер ). hrks изчиоленс за с8н15н5о5св (K+Cs*) 566,0066, намерено 566,0066.
Пример 12] Сммиюпмм /дхсма 16/ /а/ £мшйм> ftg
Разтвор на съединение 1- 4-41 /210 мг, 0,50 михромола^ KeiUe /160 мг, 0,52 микромола/, РЕР и*5 сол /120 мг, 0,51 милимола/, мвС12.6н2о /20 мг, 0,10 милимола/, ИаС12лн20/4,9 мг, 0,025 милимола/, КС1 /7,5 мг, 0,10 милимола/, СМР /16 мг, 0,05 милимола/, АТР /2,7 мг, 0,005 микромола/ и меркаптоетанол /0,34 мл/ в буфер H2PSS /200 милиМ, pH 7,5$ 3,5 мл/ се довежда до рИ 7,5 с помощта на к Каон,и към разтвора се добавят ензимите км! (5 и), рк doo и), рраве (ю σ), (ЖР-HeuAe синтетаза (е,4 и) и Z2,3Siaf (о, 1 и)· Сместа се разбърква бавно в аргонова атмосфера при стайна температура /25¾ / в продължение на три дай. Сместа ое концентрира и остатъкът се хроматографира върху силикогел с етилацетат-изопропилов алкохол - вода /2: 2:1/, катс се получава тризахарвд, който се пречиства по-нататък с BioGei Р“2 с вода и се получава съединение 42 /86 мг, 24 процента/. ^Н-ЯМР (в.о) £ t 1,©1 (1Н, br t, J 12,02 Hi, h-3axHa heuAo), 2,04 (6B, в, 1НАе «а ОХоКАеИ SeuAc), 2,76 (1Н, dd J 4,57, 12,33 Hl, H-3«q на MiuAe), 3,96 (1Н, br d, J 3,10 Hi, M-4«a Gal), 4,13 (1И, dd, J 5,09, 9,94 Ha, H-3 Ha Gal), 4,56 (1H, dd, 7,83, 162,78 Hi, H-1
Ha Gal), 4,58 (1H, d, J 8,52 Ml, H-1 H3 GlcBAo). HRMS ИЗЧИ108 леко >а с27н44||2019С12 ^-й*+2Св*) 980,0759, намерено 980,0726.
/ь/ оъединааие 45 /8^ мг/ *Н-ЯМР (О2о, 32О*К) : 1,84 (1Н, tor t, J 12,18 Hs, H-5 •q на HtuA·), 2,08 (ЗН, ·, HHAe на MsuAc), 2,82 (1*, dd, J 4,46, 12,32 He, H-3«t Ha 8·ΜΑβ), 4,01 (1H, tor d, J 2,50 Hs, И-4 на Gal)» 4,16 <1H, dd, J 2,50, 9,50 Hi, H-3 на Gal), 4,43 (1H, dt, J 1,18, 6,46 Hs, м-з на ГЛКК8Л ), 4,65 (1H, d, J 7,86 Ms, И-1 HaOai;, 4,88 (1H, dd, J 2,63, 6,0? Hs, Н-2 Ha глюкал ) 6,51 (1H, dd, J 1,45, 6,08 Hs, н-ι на глккшб.
HBMS изчислено за С23Н55МО17М*Св2 (Μ-Η*+20β*) 864,ОО92, намерено 864,ОО66.
Пример 13ι fcntoamrom» /ата 17/ /а/ Смитания 44. 45 и 46
Разтвор на 7и«т /0,02 и ; 2 мл/ се прибавя към разтвор на съединение 42 /23 мг, 0,031 милимола/ и GDP-fuc (Ichikawa at ai. . j.Qyg.Chf'nnn печат) /24 мг, 0,036 милимола/ в буфер hitbs /3 мл; 200 мижмМ, pH 7,6/, съдържащ 5 милиМ АТР, 20 нилиМмп2*. Сместа се разбърква бавно в аргонова атмосфера в продължение на пет дни при стайна температура/25°С/. Подобен резултат беше получен при използване на разтвор на съединение 42 /23 мг; 0,031 милимола/ и Gitf-fue /70 мг, 0,105 милимола/ в буфер Н1Р£8/1мл; 200 милиМ, pH 7,4/, съдържащ Ма2* /20 милиАй/ и разтвор на21»3*»от /0,01 U /, който беше обработен по подобен начин. Сместа беше концентрирана и хроматографирана върху силикагел с етилацетат-изопропилов алкохол - вода /2:2:1/ и беше по лучен тризахарвд, който беше пречистен по-нататък с BioGel р-2 с вода. Елюантът беше прекаран през колона с Dowcx SOw-χθ /Н*/,
2+ елюиран с вода за остраняване наМп катиона, неутрализиран с
К йаСН И
получава
/18
Ή'Τ'.ΤΛ
Шоп I v V чЗ - V
съединение 4о /42 мг/ и съединение 4б /о1 мг/.
Съединение 4*: 1н nmr (D2o) δ: ι.ιι (зн, d, J
6.61 Hz, 6-CHj of Fuc) , 1.73 (1H, br t, J 12.04 Hz,
H-3ax of NeuAc), 1.96 (3H, s, NHAc of GlcNAc), 1.97 (3H, s, NHAc of NeuAc), 2.59 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-3eq
Of NeuAc), 3.46 (1H, dt, J 7.00, 9.68 Hz, H-2 of Gal),
3.71 (1Н br d, | J 3 | . 00 | HZ, | H-4 | of Fuc), 4.02 (1H, dd | , J | |
2.94, 9.78 HZ, | H-3 | of | Gal | ) , 4 | .46 (1H, dd, J1(2 7.90, | ||
162.13 Hz, H-l | of | Gal) | , 4 | .52 | (1H, d, J 8.41 HZ, H-l | of | |
GlcNAc), 5.04 | (1H, | d, | J 3 | .98 | HZ, H-l of Fuc). | ||
Съединение | 45 : | 1H | NMR | (D2o) 6: 1.17 (3H, d, | J |
6.61 HZ, 6-CHj of Fuc), 2.03 (3H, s, NHAc of GlcNAc),
3.50 (1H, ddd, J 6.47, 7.86, 9.86 Hz, H-2 of Gal), 3.80 (1H, br d, J 2.88 Hz, H-4 of Fuc), 4.46 (1H, dd, J1<2 7.79, J13C(t 161.45 Hz, H-l Of Gal), 4.59 (1H, d, J 8.44 Hz, H-l of GlcNAc), 4.84 (1H, br q, J 7.50 Hz, H-5 of Fuc), 5.11 (1H, d, J 3.90 Hz, H-l of Fuc).
Съединение <fi: ή nmr (d2o at 320°κ) δ: ι.ιι (зн, d, J 6.61 Hz, 6-CHj of Fuc;, 1.54 (1H, br t, J 12.00 Hz, H-3ax of NeuAc), 2.08 (3H, s, NHAc of NeuAc), 2.30 (1H, dd, J 4.52, 12.38 Hz, H-3eq of NeuAc), 4.49 (1H, br q, J
7.50 HZ, H-5 Of FUC), 4.64 (1H, d, J 8.0 Hz, H-l of Gal), 5.02 (1H, dd, J 2.5, 6.0 Hz, H-2 of Glucal), 5.09 (1H, d, J 3.98 Hz, H-l of Fuc), 6.51 (1H, dd, J 1.5, 6.0 Hz, H-l of Glucal).
/Ъ/ Galfll,4(Fuc ,/.1,3)-(5-THO)Glc
Разтвор на GaiBi,4(5-тио )Gic /30 мг, 84 милимола /,
GJP-Fuc /60 МГ,Ь4 милимола /И cl 1,3/4 FucT /0,5 и/ В Na кокадилат буфер/5,4 мл; 50 милиМ , рн 6,2/, стдържащ 5 милиМ атр и 20 милиМ MnClg, се разбърква в продължение на два дни при стайна температура? Стойностите на Ry на изходния ма• 110 риал и на продукта са съответно 0,39 и 0,31 в етилацетат· оцетна киселина · вода 3:2:1 върху силикагел. Реакционната смес зе нанася директно върху Sephadex G-25 Superfine /размери на колоната 1,5 х 30 см/ и се елюира с вода· Фракциите, съдържащи продукта,се събират и преминават последователно през колони с QAS-Sephadex И Dowex 5О-Х6 /Н*/ С вода· Изтичащият ПОТОК се събира и се лиофилизира /21 мг/. ^Н-ЯМР (в2о, 20®а) £ :
I, 13 (ЗН, d, J.6,7 На, 6-СН3 НЖУм), 3,40 (1Н, dd, J«6,4,
II, 7 Hi), 3,60 (1Н, dd, J. 3,6, 11,7 Hi), 4,52 (1H, d, J«7,9 Hi), 4,95 (1H, J-2,6 Ha5,34 (1H, d, J«3,8 Ha).
Пример 14: йийшиилвдаиашм на mm /а/ За таат
Процедурата за анализ беше принципно същата, както е описана по-рано (fukowaka - Latallo at al., Gene and Development. 4:1288 (1990)) с някои изменения. Основната смес, съдържаща 0,25 милиМ GDi-14C-Fue /5000 cpm/мл/, 6,25 милиМ АТР, 25 милиМ MnCij)и θ2,5 милиМ буфер натриев какодилат, pH 6,2, се приготвяше пресно и се държеше в лед. Непосредствено преди употреба към този разтвор се добавяше fucT и реакцията се инициираше чрез смесване на 16 микролитра от тази смес с 4 микролитра от 100 милиМ акцептор /общият инкубационен разтвор беше 20 микролитра/. Инкубирането се провеждаше при 37¾ в продължение на 30 до 240 минути в зависимост от изучавания акцептор. За кори гиране на основната хидролиза на бДР-₽и0 се провеждаха отделни анализи в отсъствието на акцептор· След завършване на инкубирането се прибавяха 400 микролитра от 25 процентна /обем/обем^ суспензия на QAk-s«phadex . Тези суспензии се омесваха бавно при стайна температура в продължение на 10 минути, преди центрофуги·
- Ill райе при 13000 оборота/минута в продължение на една минута. 0тматерната луга се отделяха 200 микролитра и Ge смесваха с 10 мл от оцинтилацмонен коктейл. Радиоактивността ое отчиташе с помощта на оцинтилацмонен брояч. Оообено важно изискване при този анализ е по време на инкубационния период да протича по-малко от 10 процента от ензимната реакция. Този анализ даже да се проведе и в отсъствие на АТР.
М .....
Началните скорости на ензимната реакция ое определяха чрез измерване на скоростта на образуване на ьаоМАс при използване на методиката, предложена от pitret и др. (ρι.γο· et al., Anal. Biechem.. 102*441 (1980)) c леко видоизменение. Всички реакции се провеждаха в 100 милиМ какодилатен буфер /рН 7,5/ с фиксирани концентрации на ип 2+ /9,3 мили^ и υΰΡ-Gai /0Д милиМ| 58,5 opm/pmoi °* VD₽-Uo-Gal в 100 мя разтвор. Реакцията се инициираше чрез прибавяне на gut /0,05 и , 120 мг протеин! от sigma / и сместа се оставяше да престои при 20°С в продължение на 30 минути. Неспецифичната з
лиза на uup-Gai се измерваше с помощта на контролна реакция в отсъствие на gut · Реакцията се спираше чрез прекарване през колона о QAB-sephadex /700 мл/ и се елюираше при слабо налягане на въздух с цел отделяне на нереагиралата unF-Gai · Реакционният съд се изплакваше двукратно с по 400 мл вода и този разтвор се прекарваше през колоната със смола. Филтратите ое събираха и директно се прехвърляха в сцинтилационния озд. В съда се добавяше сцинтилационната теч ност и радиоактивността ое отчиташе с помощта на течен сцинтилационен брояч. Данните се представяха графично в двойни реципрочни координати и се получаваше К* /1,5 милиМ за с1вкдв / / falole .t al.. Carb.tata.lt., (1987; съобщават стой- 112 ност от 1,3 $ 1милиМ/ и Κχ /0,46 + 0,06 милиМ/ защ» · По аналогичен начин, при използване на различни концентрации на ипг беше определена отойгоотта на ΧΟ^θ наисг за Gali.
Пример 151 црр-Уиа генериращ ензим, използван з aamJS
БатериятаЦ.ь.1.11» »МЮИй» , АТСС 186®, ое отгледжаае в 2 л орела, съдържаща 10 г казамино киселина (Difco) , 5 г екстракт от дрожди, 3 г KgHP04, 1 г KIL^ и 5 г Дтллжоза на литър /рН 7,0/, След инкубиране при 37¾ в продължение на 18 часа клетките се отделяха чрез центрофугирано /10000 х g , 50 минути, 4%/ и ое оуспевдираха отново в трио буфер /50 милиМ/, съдържащ 0,5 милиМ ДТТ. Клетките ое разкъсваха при използване на френска преса French рг··· с налягане 16000 паувда на инч. Остатъкът от клетките ое отделяме чрез цеитрофугиране при 23000 х с в продължение на 60 минути и матерната лута /екстрактът, който не съдържа клетки/ ое използваше за пречистване на ензима· 50 мл от несъдържащия клетки екстракт, предназначен за 2 литра култура, ое обработваше о 60 мг протамимсулфат и получената утайка ое отделяше чрез центрофугиране· След това се добавяше при бавно разбърквано натриево-амониев сулфат, докато ое достигне 70 процента насищане /0,436 г/мл при 0%/· След центрофугиране утайката ое оъбираше и се суспендираше отново в 20 мл буфер /50 милиМ трио, съдържащ 0,5 милдо ДТТ, рН 7,5/ и ое подлагаше на диализа през нощта при 4¾ в 4 литра от същия буфер.
Останалият разтвор /20 мл/ след това ое прекарваше през колона DAi-bepharoe· сь-бв (fharaacia) /3 х 30 ом/, която предва- 113 рително беше доведена до равновесие със ew буфер. Ензимът се едюираше с линеен гредиент на натриев хлорид от 0 до 1 милиМ в съиря буфер /общо 400 мж/. Активните фракции се събираха и се подлагаха на диализа в 2 литра от 50 милиМ трие буфер, съдържащ 0,5 милиМ ДТТ /рН 7,5/. Така полученият ензим аву-уш» g ое използваше за получаване на ввр-Уи· · Активността възлизаме на около 0,05 и/мл въз основа на нуьс и цца окислителен анализ.
/о/ Ензимно получаване и регенериране на бМ?гУ.иа 91 Man·!»?*......ШМбиЖ.......................
Разтвор на имидазол /10 милиМ/, мап-1-р /10 милиМ/, gbp /10 милиМ/, РЕР /10 милиМ/, К₽ /5 милиМ/, /10 милиМ/, ιοί /20 милиМ/, цар /2 милиМ/, idta /6 мили^, изопропилов алкохол /2 процента/, РК /80 и /, ТВДН /32 о /» клетки от дрожди /$. oerevisae 52 мг, лиофилизирани от 50 милиМ трио буфер» pH 7,5/, GDP-iue s генериращ ензим /400 мл/ в hipis буфер/рН 7,5//общ обем на разтвора 2 милилитра/ ое инкубираше при 37°С в аргонова атмосфера в продължение на 13 часа.
Беше използванаoiiC колона paxtigU 5 SAX (Whatman Co.) 0,46 х 12,5 см с размер на частиците 5 мм. Подвижната фаза беше 0,1 М фосфатен буфер /рН 3,5/ със скорост на потока 0,5 мл в минута /налягане 600 паувда на квадратен инч/. Съединенията се определяха с УВ детектор при 245 нанометра. Времената на задържане за GUP-Mam и GBP-Уше бяха съответно 9,92 и 13,4 минута. kplc анализите показаха, че се образуват свр-Уи» /5 процента/ Ивх^-иа» /30 процента/.
Разтвор на съединение 41 или 42 /10 милиМ в 2 мл буфер с рН 7,5, съдържащ 5 мили Μ АТР и 20 милиМ MaCl2 / ое прибавя след това и сместа се разбърква в продължение на пет дни. Тънкослойна хроматография върху плоча от силикагел! -0,28 за
114 съединение 45 и 0,50 за съединение 41 с етилацетат!оцетна киоелинаавода · 4t2s 1 /обем/обем/; и 0,56 за съединение 44 и 0,63 за съединение 42 ο IM ΚΗ^ΟΗι изопропилов алкохол * 1!2,4 /об· ем/обем/. Съединения 45 и 44 /8 и 4 мг всяко/ бяха изолирани и пречистени, както е описано по-горе·
Пример 16s Пречистване на -фукоза пирофосфориСвиноки черен дроб /4 кг/ се хомогенизира в ледено студен 10 милиМ мота , pH 7,5, с по 1 мг/мл антипейн /обезболяващо/, апротинин, химостатки, левпептин и пепотатин, в смесител waring /пет включвания по 15 секунди на вноски обороти/· Остатъците от клетките се отстраняват чрез центрофугиране при 8000 х g в продължение на 20 минути при 4°С, Към матерната луга ое прибавя 1 л 2 процентен разтвор на протамин сулфат. Сместа ое разбърква в продължение на пет минути и утайката се отделя чрез центрофугиране, както по-горе· Към матерната луга се прибавя бавно твърд амониев сулфат до 50 процентно насищане /0,291 г/мл при ОЯс/· След центрофугиране, както е описано по-горе, утайката се събира и се суспендира отново в 1600 мл 1,2 М амониев сулфат·
Пробата се смесва със суспензия на фенил sepharose мл/, която е доведена до равновесие в 1,2 М амониев сулфат· Снелата със свързания ензим се промива с 1,2 И амониев сулфат /1,5 л/ и ензимната активност се елюира с 0,4 М амониев сулфат /750 мл/. Процесът се повтаря, докато голямата част от ензимната активност се отстрани от пробата. Част от елюата /200 мл/ ое подлага на диализа срещу 10 милиМ МОР8 , pH 7,5, и се прекарва през колона ДЕАЕ 5 PW/15 ом х 21,5 мм/, доведена до ра- 115 вновесие в същия буфер. 8 материала, който протича през колоната се набладава ензимна активност и той се концентрира с помощта на ултрафилтрационно устройство Amioon ,
След това пробата се подлага на гелова филтрация о колона isk о«1 зооо 8»9 /30 см х 21,5 мм/, доведена до равновесие и работеща с 50 .милЛ mops , рН 7,5 и 180 милиМ και . Активните фракции се събират и съхраняват във вид на 50 процентна суспензия на амониев сулфат. Пе време на пречистването gdp-Puo пирофосфорилазата се анализираше съгласно метода наХаЬАМага и Health (lehlhara et al., J.Bloc.Chen.. 243 И11© (1968) ).
Една единица активност означава включването на 1 милимол неорганичен З^р-пирофосфат в от* за една минута.
/Ь/ Регенерация на<и» -фукоза при използване на gdp -фукоза пирофоофорилаза, схема 20, Синтез на смалил Лиис-х
Разтвор намота ,рН 7,5 /50 мили^, ₽«· 1-Р /10 милиМ/, ор /1 милиМ/, РЕР /10 милиМ/, К₽ /5 милиМ/,Mg2*/10 милиМ( ми2* /10нилиМ/, РК /аг /, сиелил-/ЗН/-ьаеМАоа-о-(ан2)6со2Ме /10 милиМ/ ,^1,3Jud /0,1п /, неорганична пирофосфатаза /5и /, и GDbBue пирофоофорилаза /0,1и / се смесват в обем от 100 ма. Реакцията се инкубира в тръбен смесител при стайна температура в продължение на 60 часа. Продуктите се събират в колона seplac С1В и се елюират с 50 процентен метанол. Пробата се оуаи чрез изпаряване във вакуум, суспендира се отново във вода и се анализира с помощта на тънкослойна хроматография върху плочи от силикагел с изопропанол/1М амониев ацетат /6x1/ като разтворител. Сиалил Люис-х се образува с добив около 30 процента, определен о помощта на сцинтилационен брояч.
• 116Пример 17s (2М)-Штал-(5в)-хидроксиметал-(зк|4К)
А.
Цио-2,3-епокои*1,4-бутан*диол се получаваше от 1,4-дихидрокси-2-бутен съгласно методика, публикувана в литературата (Nelson st al.., зл Med. СЖеа.. Jg: 153 (1976) ), c изключение на това, че реакцията ое провеждаше при стайна температура в продължение на 36 часа,
в.
Разтвор, съдържащ цис-2,3-епскои-1,4-бутан-диол /1,62 грама, 17,50 милимола/, натриев азид /к«к? S 5,68 грама, 5 еквивалента/ и амониев хлорид /o^ci · 4,68 грама, 5 еквивалента/ в 100 мл метанол и 12 мл вода ое нагрява на обратен хладния в продължение на 24 часа. Разтворителят се отстранява под вакуум, след което се добавя етанол и утайката се филтрува· Процедурата по утаяването ое повтаря няколко пъта, за да се отстрани излишъкът от натриев азвд и амониев хлорвд. Получава се 2-азидо-2-деокси-треитол във вид на жълта течност /90 процента; r · 0,28 * -1 /етилацетат 100 процента/; инфрачервена ивица при 2109 см (-»,), ^-ЯМР (CijCOCi^ S1 5,49 (Ш, И), 5,59 (да, в), 3,79 (5Н, ), 4,03 (1В, t, J-6,5 Hi), 4,19 (Ш, d, J«5,5 Hi),
4,30 (1H, t, J-5,5 Hi) pp*. HRMS (М*Н*) изчислено 148,0722, намерено 148,072,
0. 5-азидо-5-деокси- l -ксило-хексулоза-1Mt__________
Разтвор, съдържащ 2-азидо-2-деокси-треитол, подучен както е описано по-горе, /47Б милиграма, 3,24 милимола/ в 10 мя вода се охлажда до 0¾ и се пробавя натриев перйодат / 3aio4 ; 762 милиграма, 1,1 еквивалента/ · След 10 минути изходният материал
- 117 изчезва напъдно и се появява ново петно при тънкослойната хроматография /Р-^· 0,5, етилацетат/. След това към разтвора се прибавя бариев хлорид /ьао12.2Н2о i 670 иг, 1,1 еквивалента/ и утайката се филтрува. Разтворът се подкиоелява до pH 1 е Dowex 50 /Н*/. Полученият по този начин рацемичен 2-азидо-З-хвдроксипропионаддехад не се изолира.
След филтруване, pH на разтвора, съдържащ рацемата, се довежда до 7 о натриев хидроокис /10 нормален/. След това се прибавя дахидроксиацетсн фосфат /1,5 милимола/ и разтворът отново cs довежда до pH 7 с 10 нормална натриева основа. Към този разтвор се добавя ГДР аддолаза /500 единици/ от заежи мускул и разтворът се разбърза бавно в продължение на два дни. Ензимният анализ показва, че целият ДНАР е консумирай.
Горе посоченото в заглавието съединение за първи път се изолира като бариева сол чрез добавяне на два еквивалента ВаС12» <&2о към реакционната смес. Разтворът се поддържа при -20% в продължение на около 18 часа. Утайката се отделя и се обработва с Oewex 50 /Н*/ в дестилирана вода, за да се отстранят бариевите катиони. След филтруване pH на разтвора се довежда до 7 и разтворът се лиофилизира, за да се получи пречистеното съединение, посочено в заглавието /75 процента/. 1н-ний (D2o) 5,13 (1Н, d, J-9,5 Hi, н-з), 3,14 (1Н, ddd, J« 9,5, 5, 11 Hi, Н-5),
5,20 (1H, t, J- 11 Hi, H-6&), 3,31 (1H, t, J-9,5 Hi, H-4), 5,37 (1H, dd, J= 6, 11 He, Н-6·/, 3,40-3,44 (2H, ю, 2 x H-1) PP«. WC-MMR (P2O) b: 61,78, 63,36, 67,35, 70,95, 97,67 (d, J»y,5 bi) ppa. HHMS (m-4H4+ Зйа^) изчислено 295,9540, намерено 395,9538.
Д. Разтвор на 5*азвдо-5-деокси- Ь-ксило-хексулоза-1-фосфат /100 мг, 0,35 милимола/ в 5 мл вода се хцдрира с 20 мг 10 про- 118 центен паладий-въглерод (Pd-c) под наляган· на водород 40 паунда на квадратен инч в продължение на един ден. Катализаторът се отделя чрез филтруване и филтратът се концентира във вакуум. Остатъкът се хроматографира с колона ст силикагел /метанол:хлороформ: вода · 6:4:2/ и се получава съединение 50 /40 милиграма, добив 78 процента, 2Я:26 6Я/. ^Н-ЯМР (р2о у. if31 (Зй| d, J«7 ме, 2&-СН3), 1,27 d, J«6,5 К», 28-CHj), 3,36 (1H, *, 6-2), 3,36 (1Η, a, n-5), 3,74-3,61 (2H, a, 2 x H-5), 3,85 (1n, a, b-3), 4,08 (16, dd, J.2,5, 4,5 He. , H-4) ppa$ 15C-HMR U2o) os 16,58 (С-2»), 57,96 (C-5‘)» 61,50, 63,44, 75,62, 67,09 ppa. hmhs (н+н+) изчислено 148,0974, намерено 148,0974.
Пример 18» Получаване на РисТинхибитор съединения 51-53
Янхибиторните съединения 51-53 се получават обикновено както е показано по-долу в схема 25·
За синтеза на съединения 51-53, азидоаддехвдите (s)*^ и &) -54 бяха избрани като акцептори за катализираните с авдолаза реакции с дихидроксиацетон фосфат /етап д, фукоза-1-фосфат алдолаза| етап &, фруктоза^1,б-ди*)осфат аддолаза от заешки мускул, така че да се образуват междинни фосфати, които първо се обработват с кисела фосфатоза и след това се аминират редукционно /етап £» Hg/Pd-C, 50 паувда на квадратен инч/, за да се образуват крайните продукти, които съдържат два допълнителни хирални центъра на 3- и 4- положение·
Съединения (s)*54 и (r)*54 се получават от 2-бутин-1-ол чрез реакция с Ливдларов катализатор, със следващо епоксадира?· не и доидно атварянегз& да се получат съответните енантиомерни 2- и 3-азадодиоли в съотношение съответно 6:1. След това
- 119 -
разделянето на 2-азидодиола се провеждаше при използване на липаза от Pseudomonas вр. и винилацетат като ацетилиращ агент (Wang et al., J. Org. Chem., 53:3127 (1988); Wang et al., J. Am. Chem, Soc.. 110:7200 1980 . Получаваха се (2R,3S)
2-азидо-3-хидрокси-4-ацетат и (23,зи)-2-азидо-3,4-диацетат с висока оптична чистота, както беше установено с помощта на О ^Н-ЯМР в присъствието на Bu(hfc)^. Пречистените азидохидроксиацетат и азидодиацетат се хидролизираха поотделно и се образуваха съответни диоли, които след това се подлагаха на окислително разкъсване с натриев перйодат и се образуваха съединения (S)-54 и (R) -54.
По-долу са представени физични данни за съединения 51 - 53.
- 120 -
53: ГаП25+21.8с (c=1.0, CH,OH) ; Rf=0.20 (CHCl3/CH3OH/H2O/NH,Oh’=5/4/l/0.08) ; ’Η NMR (500 MHz, CD.OD/TMS) : S 1.140 (2H, d, J = 6 Hz, CHj) , 2.34-2.45 (1H, П,. CHN) , 2.47-2.55 (1H, П, CHN), 3.656 (1H, dd, J=4 Hz and 11 Hz. CH.O) . 3.744 (1H, dd, J=5 Hz and 11 Hz, CHbO), 3.876 (1H, dd, J-5 Hz and 5 Hz, CHO), 4.268 (1H, dd, J=5 Hz and 8 Hz, CHO). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) : 5 12.98, 60.56, 65.24, 70.95, 72.14, 73.88. HRMS (M+H*) ИЗЧИСЛ.:148.0974,НЯМвр.: 148.0968.
52: [c]0 25+22.7° (c=1.2, CH3OH) ; Rf=0.19 (CHCl3/CH3OH/H2O/NH4O?^5/4/l/0.08) ; 1H NMR (500 MHz, CD3OD/TMS) : 6 1.162 (3H, d, J=6.5 Hz, CH-) , 2.915 (1H, dt, J=4 and 4.5 Hz CHN), 3.213 (1H, dq, J=4 and 6.5 Hz,
CHN) , 3.650 (1H, dd, J=5 Hz and 11 Hz, CHaO) , 3.685 (1H, dd, J=5 Hz and 11 Hz, CH&0), 3.741 (1H, dd, J=1.5 Hz and 4 Hz, CHO), 3.835 (1H, dd, J=1.5 Hz and 4 Hz, CHO). 13C NMR (125 MHZ, CD3OD) : <5 13.72, 57.85, 63.07, 68.60, 80.60, 81.54. hrms (M+K*) изчисл. 148·09741 намер.: 148.0964.
51: [α]β 25+39 .Γ (c=0.8, CHjOH) ; Rf=0.19 (CHCl3/CH3OH/H2O/NH4OH=5/4/l/0.08) ; 1H NMR (500 MHz, CD3OD/TMS) : 6 1.193 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3) , 2.920 (1H, dt, J=6.5 and 7.5 Hz, CHN), 2.982 (1H, ddd, J=4.5, 6.5 and 6.5 Hz, CHN), 3.500 (1H, dd, J=6.5 Hz and 7.5 Hz,
CHO) , 3.572 (1H, dd, J=6 Hz and 11 Hz, CH/3) , 3.644 (1H, dd, J=4.5 Hz and 11 Hz, CHfcO) , 3.751 (1H, dd, J=6.5 Hz and 6.5 Hz, CHO). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) : δ 18.83, 58.07, 63.61, 64.36, 79.83, 84.88. HRMS (M+H*) ИЗЧИСЛ.J 148.0974,намер.: 148.0971.
пример 19: Синтези и данни зя съединенията от схеми 21-23 Съединенията 61-99 и техните синтези бяха обсъдени във
1-връзка със схеми 21-23. Подбрани Н-ЖР и hrms за съединенията от тези схеми са представени в следващите таблици 6-8. Подолу се предлагат специфични синтетични детайли за някои при121 мерни съединения, в допълнение към тези, които вече бяха обсъдени.
Описаните по-долу процедури бяха приложени също и към другите гликозил-1-фосфати, съединения 89-95. Единственото изменение се въвеадаяе само в етапа на пречистване на съединения 66, 69, 75 и 76. При съединения 66 и 69 като елюент се използваше етилацетат; при съединение 75 елюентът беше етилацетат! хексан /2«3/ > а при съединение 76 елюентът беше хлороформ1етил ацетатвметанож /15ιΟ,5ιΟ,2Ζ.
А. 2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-Д-глюкоза /о-ьадинвнм 71/
Разтвор от пентаацетат съединение 64 /5,0 г, 12,8 милимола/ и BnlBj /19,2 милимола/ в тетрахидрофуран /30 мл/ се поддържаше при стайна температура през нощта /около 18 часа/. Сместа ое разреждаше със студена вода и се екстрахираше с хлороформ /Зх 50 мл/. Комбинираният органичен слой успешно се промиваше с ледено студена разредена солна киселина, наситен разтвор на натриев бикарбонат и се концентрираше във вакуум. Полученият сироп се пречистваме хроматографски със силикагел и етилацетат-хексан /2(3/ и се получаваше съединение 71 /3,80 г, 85 процента/ като смес от<£. аномери в съотношение 3:1, както беше уста* новено с помощта на Н-ШР (cdoIj).
В. Дибензилфосфинил 2,3,4,6-тетра-О-ацетилДибензил П,М-диетилфосфорамвдит /0,86 г, 7,3 милимола/ ое прибавя към разтвор не съединение 71 /1,0 г, 2,9 милимола/ и
1,2,4-триазол /0,8 г, 11,5 милимола/ в безводен метиленхлорид, в азотна атмосфера при стайна температура. Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 1-2 часа и след това
- 122 ое разреждаше c етер· Сместа се промиваше последователно о ледено студен насита разтвор на натриев бикарбонат, наситен разтвор на натриев хлорид и вода, сушеше се над безводен натриев сулфит и ое концентрираше зъл вакуум, Получежят сироп се хроматографираше със силикагел и с етилацетат-хексаи /1(4/. Поду* чава ое съединение 78 /1,73 г, 97 проданта/ като смес на / и / /1(4/, определено с помощта на ^Н-ЯМР (сж3).
С. Дибензилфосфорил 2,3,4,6-тетра*0-ацетилД-глгкоз» /огяпинвни» 25/
Към разтвор на съединение 78 /1,2 г, 2,2 милимола/ в тетрахидрофуран /50 мл/, охладен до *78°С в баня от сух лед и ацетон, ое добавя на капки 30 процентен водороден пероксид /10 мл/ и сместа се оставя да се нагрее до стайна температура. Сместа ое разрежда с етер и се промива последователно с ледено студен натриев тиовулфат /наситен разтвор/, наситен разтвор на натриев бикарбонат, наситен разтвор на натриев хлорид и вода. Органичната фаза се суши над безводен натриев сулфат и се концентрира. Получава се смес у : / /1(4/ от съединение 85 /1,36 г, 98 процента/, което се установява с помощта на *Н-ЯМР (0ВС15>.Този продукт ое използва в следващия етап без по-нататъшно пречистване.
Д. lantoa.-lHbootbaT /оъелшмни. 92/
Съединение 85 /1,0 г, 1,8 милимола/ ое хцдрира /14,7 паувда на квадратен инч/ над 5 процентен Pd/C /200 мг/ в етанол /30 мл/ и 10 процентен натриев бикарбонат /20 мл/ в продължение на 10 часа при стайна температура. Сместа се филтрува и филтратът се концентрира. Остатъкът се обработва с 1 я МаОК /10 мл/ при стайна температура в продължение на 3 часа. Сместа се неутрализира с ледено студена 1 оцетна киселина до pH 7,5 и неразтвори123 мкят материал ое отстранява чрез филтруване· При друг вариант вместо разтвор на натриева основа ое използва разтвор метанол: вода /1st обем/обем/ в 10* триеталамин, така че следващият етап на неутрализация ое елиминира· Филтратът се концентрира, разрежда ое е вода и ое прекарва през колона е в»мх 5W-xe (Жа*) /1 х 15 ом/, а като елюент ое използва вода· Съответните фракции ое събират, лиофилизират се й се получава съединение 92· Понякога ое получава малко количество дефоофоридиран продукт· Той ое отстранява чрез прекарване на разредения филтрат през колона о Bowex 1*-X8 /НСО£/ /1 х 30 ом/· Колоната първо ое завира с вода, за да ое отстрани неутралният продукт, а олод това о линеен гредиент на амониев бикарбонат /0,1 М - 0,3 М/, за да ое отмие каленият продукт· Съответните фракции ое събират и се лиофилизират· Лиофилизираният прах ое раатваря във вода /10 мл/, охлажда ое до 0% и ое неутрализира до рй 7,0 о Bowex sow-xa смола· Смолата ое отфилтрува и филтратът се лиофилизира отново, като се получава съединение 92 /0,30 г, 59 процента/ във вид на омео /1в4/, както беше установено с помощта на %-ЙМР
Е· Метил 5-ацетамидо-4,7,8,9*тетра-0-ацетил3,5-дидеокси- g- p-глицеро- в-гаяакто-2_
Това съединение ое получава по метода на Marr* и др· СагbohytLr. Re »..1904 317 (1989 ). При друг вариант, омео от метал 2-хлор-5-ацетамждо-4,7,8,9-тетра-0*ацетив-дндеокои- в-в -глицеро-в-галакто-2-иоиулопиранозат (Xuhn et al., Ohem. Ber.99:611 (1966 ) /0,67 r, 1,3 милимола/ и сребърен карбонат /0,363 г, 1,3 милимола/ в ацетон /5 мл/ - вода /0,5 мл/ ое разбъркват в продължение на 10 часа при стайна температура. Суспензията ое
- 124филтруза чрез прекарване през слой от Ceiit·** 545 и филтратът се изпарява до сухо* Остатъкът се разрежда о хлороформ, промива се с вода и разсол, и след това се супи над натриев сулфат. Разтворът се изпарява във вакуум и ое получава суровият матеркал, който се хроматографира с колона от силикагел /хлороформметанол 2511/ и се получава съединение 96 /0,568 г , 88 процента/ във зид на бели иглички.
^•Н-Я&Р (CDCLj) ¢:1,90, 2,02, 2рЗ, 2,10, 2,14 (ЗИ 8С6КИ , ·, 4хОАе «НАв), 2,17 (Ш, dd, 3 5,04, 12,72 И·, H-3eq), 2,29 (1И, dd, J 11,52, 12,72 Ив, Н-Звх), 3,87 (ЗН, в, СОСИе), 4,02 (1В, dd, 3 7,04, 12,4 Не, И-9), 4,12 (1М, dd, 3 2,1, 7,8 Нв, В-6), 4,13 (1В, d, 3 7,8 He, 1Н), 4,17 (1М, ddd, 3 7,8, 9.8, 10,28 Ив, 8-5), 4,42 (1Н, dd, J 1,92, 12,4 Нв, Н-9’), 5,20 5,26 (2Н, а, Н-4 Н-8), 5,32 (1М dd, J 2,1, 6,50 8Z, В-7), 5,37 (1Н, Ъв, ОН).
Метил 5-ацетамвдо-4,7,8,9-те1ра-0-ацетил2-/дибензилфосфитил/-3,5-дидеокои-а *в глицеро-а-галакто-2-нонулопиранозат /тдмнсши W_________________
Дибензил Н,Н-даетилфосфоамвдат /0,25 г, 0,78 милимола/ се прибавя на капки към разтвор на съединение 96 /0,166 г, 0,34 милимола/ и 1Н-тетразол /0,10 г, 1,43 милимола/ в тетрахидрофуран /5 мл/ в азотна атмосфера. Сместа се поддържа при стайна температура в продължение на четири часа. Към сместа се прибавя дихлорметан /10 мл/ и органичната фаза се промива с ледено студена разредена солна киселина, воден разтвор на натриев бикарбонат и ледено студена вода, а след това се суши над безводен натриев сулфат. Разтворът се изпарява във вакуум и се получава суровият материал, който се хроматографира в колона със
- 125 силикагел о етилацетат-хексан /5:1/. Получава ое съединение 97 /0,17 г, 68 процента/ във вид на безцветен сироп· (С1Ю13) Si 20,7, 20,8, 20,9, 21,0, 23,1, 36,0, 49,5, 53,5, 62,6, 67,3, 67,4, 67,8, 69,3, 70,8, 94,8, 128,0, 128,7, 135,5, 141,8, 153,0, 169,1, 170,2, 170,4, 170,8, 171,0. HRMS ι изчислено за а34н42мо15РС» (м+с·*) 868,1346, намерено 868,1346·
Метил 5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-0-ацетил2-/дибензилфосфорил/-3,5-дидеокои- в-рглицеро-D-галакто-2-нонулопиранозат /9MMHWM W
Към охладен разтвор на съединение 97 /0,13 г, 0,17 милимола/ в тетрахидрофуран /2 мл/ се прибавя t-BuO^H /0,4 мя/ при -10¾ и сместа ое оставя да се нагрее до стайна температура, след което се разбърква в продължение на един час при стайна температура· Сместа се разрежда с метилекхлорвд и се промива с ледено студен воден разтвор на натриев бикарбонат и вода, след което се суши върху безводен натриев сулфат· Органичната фаза ое изпарява във вакуум и се получава суровият материал, който се хроматографира върху силикагел с хлороформ-метанол /2511/· Получава се съединение 98 /0,126 г, 95 процента/ във вид на безцветен сироп, sans * изчислено за с34и42жо1бгс· (м+с·*) 884,1396, намерено 884,1305·
Н. Метил 5-ацетамвдо-4,7,8,9-те«ра-0-ацетил3,5-дидеокеи- β -р -глицеро- р -галакто-2нонулопиранозат 2-фосфорна киселжа /йжиашяй.. ......штша JggfflZ_______
Съединение 98 /0,22 г, 0,25 милимола/ се хидрира /14,7 пауцца на квадратен инч/ над 5 процентен Pd/C /10 мг/ във водородна атмосфера в продължение на 7 часа при стайна температура.
- 126 Катализаторът се отфилтрува през слой от cent·®1 545 и филтратът се концентрира във вакуум. Суровият материал се хроматографира с колона от силикагел с обърната фаза с ацетонитрил-вода /5:1/. Получава се съединение 99, водородна форма /0,164 г, 99 процента/ във вид на безцветен сироп, hrms : изчислено за С20Н30М0иРС» (м+Са) 704,0356, намерено 704,0356.
127
1.06, 2.00(4·) | <*4 « • X χ © CM M | 4 CM m | si ci ci |
r* — — o | 10. 05. | = 8 | S3 |
CM CM | (M <4 | ci ci | CM ci |
v>
^*7
«л —
X •0
I =i «М cm E8 <N<N
cti | aS |
Рч | |
K | tQ Eh |
s | K |
Ф | |
Д | c |
cti Eh | o |
O . K N | (4 |
ОД | CD |
« | § |
S Д | n |
z-X | s |
*3 | Pm |
• *«✓ | M |
fl ИЛ . CD P.S | o |
. m | Pm |
ftS | C |
ffl’S S CD Ct
CD tf 05 Я Ο p.
л
C
O CO | o |
cd pq | K |
S | cd |
Eh O | |
o m | CD |
o | l=t |
o Ж | CD |
w s | Ph |
o c | C |
CD O | o |
F 1 | |
S K | CD |
s s | |
s c | CD |
N o | K |
«· ··
aS n
ТАБЛИЦА 6 /продължение/
- 123 -
tг*·
гШ | 00 оч | cti co | CH t— СЙ |
оч | t— | M- | CO |
о | Τ- | 43 | |
* | Α | r- | M3 |
м- | 'd- | o | 43 |
см | T~ | * | b~ |
£~~ | 43 | Ш | o |
о | o | CM c- | •k in CM |
PC | PC | o | ι- |
ф | CD | K | |
Рч | Рч | CD | Ε |
Ф | Ф | Рч | |
S3 | CD S | •ч co | |
PC | PC | TO | b- |
•ъ | ·* | PC | Oj CD |
хГ | c- | •t | |
СМ | 43 | M· | o |
сн | c- | <o | 43 |
о | T~ | b- | O- |
«ь | * | O | o |
·< | |||
СМ | T~ | in | tft; |
о | 43 | CM | CM |
*-> | i>- | Г- | |
+ | + | z~S | |
ю | 01 | + | |
о | 55 | « | |
+ | + | o | |
Я | + | ||
£ | |||
ю о | co to | «0 | |
to | to | o | |
ν— | |||
V— | τ- | Τ- | |
о | Ο | Ο | |
Ad | Ad | Ad | |
м· | ’St | m | |
tn | Ш | tn | |
Д | X | PH | |
co | oo | 00 | |
см | CM | CM | |
о | o | o | |
сб | aJ | СЙ | |
<d | co | CD | |
о | o | O | |
Щ | PC | PC | |
ф | CD | CD | |
ч | 4 | 4 | |
о | o | O | |
S | s | s | |
(5· | P | t? | |
CO | co | co | |
S | s | S | |
co | CO | CO | |
з4 |
- 129 -
sL
-д ri -ί
si ei *·
«ч «
F? — q © ri ci
8 ci ri si ei —
8
Г4 ri
: Данните от Н-ЯМР са в добро съгласие с литературните данни
- 130 -
е-<2 е ве е Se *1 ® S X — 3 « С4 ¥ « Ч ff η Ч — е. гч ' <ч <м » «R «Ч 4*1 ** »4 | е 3= г* η 2 « η | о S- Й ч 2! м ч |
е» | е- | |
•R | — | |
1 1 | О и «0 мМ Г* ^04 я· ·? о* | л II «е V ·ί*Γ* |
е «г> е <п е·**! «*·*) < Г> t- <»Ί f {* Ч Ч J Ч ч | ш е $3 2 f чч | ςΊ8 5ri Р> § ч ч |
» · * ♦ | * | е |
<4 O’
S t=i m <4 H
C\2 W
o o
131
I
s = | © | © 3 X | © 52 |
А й | 2 Ч • ш | *- и *ϊ ш |
«5 Д e*
I
не е определено поради припокриване на спектъра
HRMS изчислено за с2бн31Р0ЮСв (M+Cs+) 557,1555, намерено 557,1542 Данните от ^Н-ЯМР са в добро съгласие с докладваните в литературата
aj X> q Ή co
132
Ф X o &< o co << tzT
S
PO <
Еч dJ
S
K
Ф §
o сб co s
¢4
I Ж
Рч
- 133 Горното описание и примерите са предназначени за илюстриране на изобретението и не трябва да ое приемат като ограничаващи. Възможни са и други вариации в духа и обхвата на това изобретение и специалистите, работещи в областта, могат лесно да си ги представят.
Claims (31)
1* Метод за получаване на фукозилираи въглехидрат в единствена реакционна омес, състоящ ое от етапите на!
/а/ при използване на фужозилтрансфераза да се образува О-гликозидна връзка между нуклеозвд 5’-дифоофофукоза и достъпна хидроксилна група на въглехидратна акцепторна молекула, за да ое получи фукозилираи въглехидрат и нуклеозвд 5*-дифоофат| и /б/ рециклиране in »itu на нуклеозвд 5*-дифоофат о фухоза, за да се получи съответния нуклеозвд 5’-дифоофо-фукоза.
2· Методът съгласно претенция 1, при който базата на нукпеозида е гвании.
3· Методът съгласно претенция 1, при който нуклеозвд 5’«дафосфатът присъствува в каталитично количество·
4. Методът съгласно претенция 1, при който хидроксилната група на въглехидратната акцепторна молекула е част от Н-ацетилглхкозамин, галактоза или N-ацетилгалактозамин·
5. Методът съгласно претенция 1, при който въглехидратната акцепторна молекула е сиалилирана·
6. Методът съгласно претенция 1 за получаване на фукозилирана сиалилирана въглехидратна молекула чрез ензимно образуване на гликозидни връзки в единствена реакционна смес, състоящ се ότι /а/ образуване на първа гликозвдна връзка между активиран с дифосфонуклеозвд гликозилен донор и достъпна хидроксилна
- 135 група на въглехидратна акцепторна молекула при използване на първа гликозилтранофераза;
/б/ образуване на втора гликозвдна връзка между активиран е монофоофонуклеозцд сиалилен донор и достъпна хидроксилна група на въглехидратна акцепторна молекула при използване на сиалилтрансфераза; и /в/ образуване на трета гликозцдна връзка между активиран о дифосфонуклеозвд фукозилен донор и достъпна хидроксилна група на въглехидратна акцепторна молекула при използване на метода от претенция 1, като посочените гликозцдни връзки в етапите /а/, /б/ и /в/ ое образуват в единствена реакционна смес.
?· Матади пиши яретря 6, при който фухозилиравата анализирана въглехидратна част в оиалилиран Лхмоов лигацц.
8· Методът съгласно претенция 7, при който сиалилираният Люисов лигацд е 5Ьв*илм sLt a.
9. Методът съгласно претенция 6, при който фукозата ое пренася от фукозилен донор към хидроксилна група на Н-ацетилглюкозаминен остатък на въглехидратната акцепторна молекула·
10· Методът съгласно претенция 9, при който фукозилният донор пренася фукоза кш хидроксилна група на въглерод 3 на Нацетилглпсозаиина·
11· Методът съгласно претенция 6, при който фукозилният донор пренася фукоза към хидроксилна група на галактозен оотатък
136 на въглехидратната акцепторна молекула·
12. Методът съгласно претенция 6, при който сиалилтраноферазата е подбрана от групата, състояща се от <2,3 сиалилтраясфераза, <2,4 сиалилтрансфераза, <2,6 сиалилтранофераза и <2,3 сиалилтрансфераза.
13« Методът съгласно претенция 6, при който фукозилтраноферазата е подбрана от групата, състояща се от <1,2 фукозилтрансфераза, < 1,3 фукозилтранофераза, <1,6 фукозилтрансфераза, <1,4 фукозилтранофераза и <1,3/4 фукозилтранофераза.
14. Методът съгласно претенция 6, при който фукозиятраноферазата е подбрана от групата, състояща се от / -галактозцдаза <1,2 фукозилтранофераза, М-ацетилглхкозамин <1,3 фукозилтр ансфераза, Н-ацетилглккозамин <1,4 фукозилтранофераза· Н-ацетилглмжозамин <1,6 фукозилтранофераза и Н-ацетилглюкозамин <1,3/4 фукозилтранофераза.
1о. Методът съгласно претенция 6, при който въглехидратната акцепторна молекула е въглехидратна заместена молекула, при която въглехидратът завърива ο Gaiai,4GiciUo-x · х ® органична молекула.
16· Методът съгласно претенция 6, при който базата поне на един нуклеозад е цитидин или уридин·
17. Методът съгласно претенция 6, при който активираният с монофосфонуклеозцд сиалилен донор е цитидин 5*-ΜθΗθφοοφο-Ν·
- 137 ацетил-невраминова киселина.
18. Методът съгласно претенция 6, при който активираният с дифосфоцужлеозад фукозияен донор е гваиозии-5*-дифосфо-фукоза.
19. Методът съгласно претенция 6, при който гликозилният донор от етап /а/ е активиран с дифосфонуклеозад галактозилан донор, който е уридин 5*-дифосфо-галактоза.
20. Методът съгласно претенция 6, при който етапите /а/ и /б/ принципно са завървили, преди да започне етап /в/.
21. Реакционна система χη vitro , съдържаща фукозилтранофераза и ензим, образуващ иуклеозвд-дифосфо фукоза.
22. Реакционната система от претенция 21, при която ензимът, образуващ нуклеозид-дифоофо фукоза, е гванозин дифосфо-фукоза пирофосфорилаза.
23. Реакционната система съгласно претенция 21, която съдържа още и киназа.
24. Реакционната сискема ia vitro съгласно претенция 23, която съдържа и пируват киназа.
25. Реакционната система съгласно претенция 22, при която киназата е фукоза киназа.
26. Реакционната система съгласно претенция 22, съдържаща
- 138 още м регемрациоина система НАДРН.
27. Реакционната система съгласно претенция 26, при която системата образуваща нухлеозцд дифосфо фукоза, съдържа гванозин дифосфо-маноза.
28..Системата съгласно претенция 27, при която гваиозии дафосфат маноза се генерира in situ от гванозин трифоофат и маноза 1-фосфат.
С
29. Сиотемата съгласно претенция 28, която оъкняа още и пщруват киназа и гванозин дифоофо-маноза пирофоофорилаза.
30. Метод за получаване на гликозил 1- или 2-фоофит, който се състои лъв взаимодействие на блокиран гликозилен пръстен, съдържащ хидроксилна група в аномерното положение, о тривалентен фоофитилиращ реагент, като се получава блокиран гликозил 1- иди 2- фосфит заместен пръстен.
С
31. Методът съгласно претенция 30, при който глижозихният пръстен е подбран от групата, състояща се от галахтозил, гдюкозил, фукозил, N-ацетилглюкозаминмл, манозил и 8* или ©-въглеродни захари, притежаващи х^рбохоилна или Cj-Cg алкидна или бензияхарбохоилатна естерна група в 1-положение.
32. Методът съгласно претенция 30, при който гликозилиият пръстен е фукозилен.
33. Методът съгласно претенция 31, при който тривалентният
- 138 още и регенирационка система НАДРН.
27. Реакционната система съгласно претенция 26, при която системата образуваща нуклвозад дафосфо фукоза, съдържа гвано зин дифосфо-маноза.
28».Системата съгласно претенция 27, при която гванозин дифосфат маноза се генерира in iita от гванозин трифосфат и маноза 1-фосфат.
29. Системата съгласно претенция 28, която съдържа още и пируват кжаза и гванозин дифосфо-маноза пирофооформлаза.
30. Метод за получаване на гликозил 1- или 2-фосфит, който се състои във взаимодействие на блокиран гликозилен пръстен, съдържащ хидроксилна група в аномерното положение, о тривалентен фосфитилиращ реагент, като се получава блокиран гликозил 1- или 2- фосфит заместен пръстен.
31. Методът съгласно претенция 30, при който гликозилният пръстен е подбран от групата, състояща се от галажтозил, глюкозил, фукозил, М-ацетилглюкозаминил, манозил и 8- или 9-въглеродни захари, притежаващи карбоксилна или С|-С§ алкидна или бензилхарбоксилатна естерна група в 1-положение.
32. Методът съгласно претенция 30, при който гликозилният пръвтен е фукозилен.
33. Методът съгласно претенция 31, при който тривалентният
- 140въдзто всяко е еднакво или различно и представлява арилна група или C^-Cg нисша алкидна група;
X е независимо кислород или азот;
Pg е независимо ацилна, бензилна, силилна или алкидна блокираща група иди Х-Pg заедно отсъстват и са заместени с водород;
₽3 е независимо водород, -си,, -qr2, -си2«ж2, -ch(or2)сн(од2) или -аж(од2)-од(ой2)-сн(са2){ *4 е водород, карбоксилна или C|-Cg алкидна или бендалкарбокСилатна група; и а е нула или 1·
40. Съединение съгласно претенция 39, при което е 1 и всяко X е кислород.
41. Съединение съгласно претенция 39, при което монозахаридът е подбран от групата, състояща ое от маноза, фукоза, галактоза, гликоза и рамноза.
42« Съединението съгласно претенция 39, при което я е 1, единият X е азот, а другите Х-ово са кислород.
43. Съединението съгласно претенция 42, при което монозахаридът е подбран от групата, състояща се от 2-ацетамидо-2-деокси-галактоза, 2-ацетамидо-2-двокси-глюкоза, Н-ацетил-невраминова киселина и 2-фалимидоил-2-деокси-глгкоза.
44. Съединението съгласно претенция 39, при което е бекзил.
- 141 46. Съединението съгласно претенция 39, при което ₽2 9 **** зил или ацетил.
46· Съединението съгласно претенция 39, което е подбрано от групата, състояща ое от:
дибензилфоофинил 2,3,4,6-тетра-0-ацетил- -р-манозад, дабензилфоофинил 2,3,4-три-О-ацетил-в -1-фукозцд, дибензилфоофинил 2-ацетамвдо-2-деожси-3,4,6-три-0-ацетил- в -галактозвд, дибензилфоофинил 2-ецетамвдо-2-део1Юи-3,4,6-три-0ацетил-о -глюкоза, дибензилфоофинил 2,3,4,6-тотра-О*ацетил- о-галактозцд, дибензилфоофинил ^,3,4,6-твтра-О-ацетил-р-глккозид, дибензилфоофинил 2,3,4-три-Оацетил- ь -рамгозод, дибензилфосфинил 2-фталимвдоил-2-деокси-3-4-6-три-0ацетилт)- глккозщд, и метил 5-ацетамидо-4,7,8,9-теира^0-ацетил-2-/дибензилфосфитил/-3,5-двдеокси- а -р -глицероер -галакто-2-нонулопиразонат.
47· Съединение, което е 2,3,4-три-О-бензоил- - р-фукопиранозил бромид·
48· Процес на халохадриране , който с© състои в:
/а/ смесване на гликал о водороден пероксид, халаден йон, подбран от групата, състояща ое от хлориден, бромиден и йодиден, и катвлитично количество ензим хлорпероксидаза във воден буфер с pH стойност от около 2,5 до около 3,5, при което се образува реакционната смес; и
- 142 /б/ Поддържане на така образуваната реакционна смес достатъчно продължително време, за да протече хелохидрирането и да се образува продукт халохидрин.
49« Процесът съгласно претенция 48, включващ следващия етап на извжчане на халохидрина.
50· Продуктът на процеса съгласно претенция 48«
51. Гликозилхалохвдрюц притежаващ формула, подбрана от групата, състояща се от
143
WO 93/08205
1/3
PCT/OS92/08789
Fig. 1
WO 93/08205
2/3
PCT/US92/08789
Fig. 2B
Абсорбция /2о4 нм/
ΙΟΟη
90807060504030-
0-»---г6.00
Л -Ί-------!-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------Г8.00 Ю.00 1200 14.00 16.00
Време на задържане
WO 93/08205
3/3
PCT/US92/08789
FIG. 3
1/v (min/cpm)
0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15
1Д LacN Ac](mM’1)
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US77766291A | 1991-10-15 | 1991-10-15 | |
US90126092A | 1992-06-19 | 1992-06-19 | |
US91061292A | 1992-07-08 | 1992-07-08 | |
US07/961,076 US6319695B1 (en) | 1991-10-15 | 1992-10-14 | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose |
PCT/US1992/008789 WO1993008205A1 (en) | 1991-10-15 | 1992-10-15 | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of gdp-fucose |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG98713A true BG98713A (bg) | 1995-05-31 |
Family
ID=27505746
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG98713A BG98713A (bg) | 1991-10-15 | 1994-04-13 | Метод за получаване на фукозилирани въглехидратичрез фукозилираща синтеза на захарни нуклеотиди ирегенериране на gdр-фукозата in siтu |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6518418B1 (bg) |
EP (1) | EP0642526B1 (bg) |
JP (1) | JPH07500248A (bg) |
AT (1) | ATE174925T1 (bg) |
AU (1) | AU675209B2 (bg) |
BG (1) | BG98713A (bg) |
CA (1) | CA2121365C (bg) |
DE (1) | DE69228005T2 (bg) |
ES (1) | ES2129458T3 (bg) |
FI (1) | FI941732A (bg) |
RO (1) | RO118132B1 (bg) |
SK (1) | SK42594A3 (bg) |
WO (1) | WO1993008205A1 (bg) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2121365C (en) | 1991-10-15 | 2000-11-28 | Chi-Huey Wong | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of gdp-fucose |
IT1268954B1 (it) * | 1994-03-11 | 1997-03-18 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Processo per la preparazione di acido ialuronico mediante sintesienzimatica e relative composizioni farmaceutiche |
JP3231791B2 (ja) * | 1996-09-11 | 2001-11-26 | ヤマサ醤油株式会社 | 糖ヌクレオチドの製造法 |
WO1998022614A1 (fr) * | 1996-11-19 | 1998-05-28 | Yamasa Corporation | Procede pour produire des nucleosides 5'-triphosphates et utilisation desdits nucleosides |
US6274725B1 (en) * | 1998-06-02 | 2001-08-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Activators for oligonucleotide synthesis |
DE19908712C2 (de) * | 1999-03-01 | 2002-02-07 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines ·1··8·F-markierten Glykosylierungsreagenz |
AU2009242453B2 (en) | 2008-05-02 | 2014-12-04 | Seagen Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
AU2011285490B2 (en) | 2010-08-05 | 2016-04-21 | Seagen Inc. | Methods of inhibition of protein fucosylation in vivo using fucose analogs |
CN103429604A (zh) * | 2011-02-21 | 2013-12-04 | 格礼卡姆股份公司 | 寡糖前体的混合物的组合物的催化氢解及其用途 |
JP6000948B2 (ja) * | 2011-06-09 | 2016-10-05 | 三洋化成工業株式会社 | 多糖の製造方法 |
EP2887947B1 (en) | 2012-08-23 | 2019-06-05 | Seattle Genetics, Inc. | Fucose analogues for the treatment of sickle cell disease |
CN104876977A (zh) * | 2013-07-17 | 2015-09-02 | 张家港威胜生物医药有限公司 | 一种制备1-溴-2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖的方法 |
CN108251474A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-07-06 | 山东大学 | Abh人血型抗原的合成方法 |
AU2019324170A1 (en) | 2018-08-23 | 2021-02-18 | Seagen, Inc. | Anti-TIGIT antibodies |
EP3719135A1 (en) * | 2019-04-01 | 2020-10-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Enzymatic method for preparation of gdp-fucose |
CN116261597A (zh) * | 2020-08-10 | 2023-06-13 | 因比奥斯公司 | α-1,3糖基化形式的Fuc-a1,2-Gal-R的产生 |
CN112915565B (zh) * | 2021-03-04 | 2022-04-08 | 安徽金禾实业股份有限公司 | 一种旋转式蔗糖-6-酯连续生产设备及生产方法 |
CN114990175B (zh) * | 2021-10-22 | 2023-03-31 | 岩唐生物科技(杭州)有限责任公司 | 一种岩藻糖衍生物的合成方法 |
CN113960232B (zh) * | 2021-10-28 | 2024-02-20 | 苏州大学 | 一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱及其检测方法和应用 |
WO2023225102A1 (en) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Glycomine, Inc. | Continuous flow methods for producing mannose-1-phosphate, polymorphs of mannose-1-phosphate, and compositions and uses related thereto |
WO2023225364A1 (en) * | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Zymtronix Catalytic Systems, Inc. | Biomanufacturing of oligosaccharides and derivatives from simple sugars |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1544908A (en) * | 1975-07-08 | 1979-04-25 | Chembiomed Ltd | Artificial oligosaccharide antigenic determinants |
US4178210A (en) * | 1977-03-07 | 1979-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Accellular synthesis of cephalosporins |
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4973679A (en) * | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
FR2509313A1 (fr) * | 1981-07-08 | 1983-01-14 | Choay Sa | Derives de 3-fucosyl-n-acetyl lactosamine, leur preparation et leurs applications biologiques |
DE3220427A1 (de) * | 1982-05-29 | 1983-12-01 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Ss-d-galactosederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
US4770994A (en) * | 1982-07-30 | 1988-09-13 | Abbott Laboratories | Determination of carbohydrate acceptors |
US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
EP0263533A3 (en) * | 1983-03-01 | 1990-05-30 | C.R.C. Compagnia di Ricerca Chimica S.p.A. | A method for preparing the cytidine monophosphate of 5-acetamido-3,5-dideoxy-d-glycero-d-galactononulosaminic acid |
US4925796A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
AU597574B2 (en) | 1986-03-07 | 1990-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
DE3626915A1 (de) * | 1986-08-08 | 1988-02-11 | Hoechst Ag | Verfahren zur enzymatischen synthese eines n-acetylneuraminsaeure-haltigen trisaccharids |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5079353A (en) * | 1987-12-02 | 1992-01-07 | Chembiomed, Ltd. | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
US5344870A (en) | 1987-12-02 | 1994-09-06 | Alberta Research Council | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
SE466403B (sv) | 1988-03-24 | 1992-02-10 | Kurt G I Nilsson | Saett att syntetisera oligosackarider |
US5109126A (en) * | 1988-12-06 | 1992-04-28 | Worcester Foundation For Experimental Biology | 5'[2'(3')-O-(2,4,6-trinitrophenyl) pyprimidine nucleoside]diphosphate 1-glycosides |
US5180674A (en) | 1990-04-16 | 1993-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis |
US5278299A (en) | 1991-03-18 | 1994-01-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds |
EP0576592B1 (en) * | 1991-03-18 | 2000-05-31 | The Scripps Research Institute | Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions |
TW213952B (bg) | 1991-04-09 | 1993-10-01 | Hoechst Ag | |
US5352670A (en) | 1991-06-10 | 1994-10-04 | Alberta Research Council | Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides |
CA2121365C (en) | 1991-10-15 | 2000-11-28 | Chi-Huey Wong | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of gdp-fucose |
US5220008A (en) | 1991-11-22 | 1993-06-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Oligosaccharide inhibitors for influenza virus |
-
1992
- 1992-10-15 CA CA002121365A patent/CA2121365C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-15 AU AU27854/92A patent/AU675209B2/en not_active Ceased
- 1992-10-15 ES ES92921939T patent/ES2129458T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-15 AT AT92921939T patent/ATE174925T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-15 EP EP92921939A patent/EP0642526B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-15 DE DE69228005T patent/DE69228005T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-15 WO PCT/US1992/008789 patent/WO1993008205A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-10-15 SK SK425-94A patent/SK42594A3/sk unknown
- 1992-10-15 JP JP5507791A patent/JPH07500248A/ja active Pending
- 1992-10-15 RO RO94-00636A patent/RO118132B1/ro unknown
- 1992-12-10 US US07/991,182 patent/US6518418B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-04-13 BG BG98713A patent/BG98713A/bg unknown
- 1994-04-14 FI FI941732A patent/FI941732A/fi unknown
-
2001
- 2001-11-19 US US09/992,680 patent/US7335500B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI941732A0 (fi) | 1994-04-14 |
EP0642526B1 (en) | 1998-12-23 |
US7335500B2 (en) | 2008-02-26 |
ATE174925T1 (de) | 1999-01-15 |
JPH07500248A (ja) | 1995-01-12 |
US6518418B1 (en) | 2003-02-11 |
US20020068331A1 (en) | 2002-06-06 |
CA2121365A1 (en) | 1993-04-29 |
SK42594A3 (en) | 1994-10-05 |
ES2129458T3 (es) | 1999-06-16 |
RO118132B1 (ro) | 2003-02-28 |
AU675209B2 (en) | 1997-01-30 |
AU2785492A (en) | 1993-05-21 |
EP0642526A4 (en) | 1996-04-10 |
FI941732A (fi) | 1994-06-14 |
EP0642526A1 (en) | 1995-03-15 |
DE69228005T2 (de) | 1999-07-15 |
CA2121365C (en) | 2000-11-28 |
DE69228005D1 (de) | 1999-02-04 |
WO1993008205A1 (en) | 1993-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6319695B1 (en) | Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose | |
BG98713A (bg) | Метод за получаване на фукозилирани въглехидратичрез фукозилираща синтеза на захарни нуклеотиди ирегенериране на gdр-фукозата in siтu | |
CA2110386C (en) | Method for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides | |
US5374655A (en) | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures | |
EP2900829B1 (en) | Glycoconjugate synthesis | |
Downey et al. | Strategies toward protecting group-free glycosylation through selective activation of the anomeric center | |
CA2110797C (en) | Modified sialyl lewis x compounds | |
CN108130349A (zh) | 一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法 | |
CN111235128B (zh) | 一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法 | |
CN111909910B (zh) | 一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法 | |
CN108251474A (zh) | Abh人血型抗原的合成方法 | |
US5714587A (en) | Synthesis of anti-inflammatory compounds, and novel trisaccharides useful in the synthesis of anti-inflammatory compounds | |
CN105886571A (zh) | 人血型抗原p1五糖的合成方法 | |
Xu et al. | Diversity-oriented chemoenzymatic synthesis of sulfated and nonsulfated core 2 O-GalNAc glycans | |
Kajimoto et al. | Synthesis of glycosyltransferase inhibitors | |
CA2110582C (en) | Modified sialyl lewis a compounds | |
RU2125092C1 (ru) | Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro | |
EP0643718A1 (en) | IMMUNOSUPPRESSIVE AND TOLEROGENIC MODIFIED LEWIS?C AND LacNAc COMPOUNDS | |
EP0591254A1 (en) | Immunosuppressive and tolerogenic modified lewis?x and lewis?a compounds | |
JP4910091B2 (ja) | 4位ハロゲン化ガラクトース含有糖鎖及びその応用 | |
Guo | One-Pot Enzymatic Synthesis of UDP-GlcA and UDP-GalA and Chemoenzymatic Synthesis of a Library of Human Milk Oligosaccharides and Enzymatic Synthsis of O-antigen from P. aeruginosa serotype O11 | |
Huang | Chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides and carbohydrate mimetics: Applications to the study of cell-adhesion events | |
Fang | Chemo-enzymatic synthesis of alpha-Gal oligosaccharides | |
Zhang | Chemical, Enzymatic and Chemo-enzymatic Synthesis of Complex Oligosaccharides as Probes of Glycan Functions | |
JP2001019698A (ja) | 硫酸化オリゴ糖化合物およびその合成法 |