CN108130349A - 一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法 - Google Patents

一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法。包括：利用酶法模块化组装1和酶法模块化组装2构建核心骨架化合物(V)～(IX)；再利用酶法模块化组装3构建Lex单聚体、二聚体(I)～(II)；最后利用酶法模块化组装4构建sLex单聚体、二聚体(III)～(IV)。本发明将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，以较高的收率实现了目标分子的合成。且本发明中所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性宽、催化效率高等优点，可用于大量制备。

Description

一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合 成方法
技术领域
本发明涉及糖类物质的合成方法，尤其涉及一种Lewis x(Lex)单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法。
背景技术
Lewis x[Lex,Galβl-4(Fucα1-3)GlcNAcβOR]抗原(如图1所示)与唾液酸化Lewisx[sLex,Neu5Acα2-3Galβl-4(Fucα1-3)GlcNAcβOR]抗原(如图2所示)是核心结构type II(Galβl-4Glc-NAcβOR)(如图3所示)经α1-3岩藻糖化和α2-3唾液酸化修饰得到的寡糖，广泛存在于人乳寡糖、细菌脂多糖、糖脂和哺乳动物细胞表达的许多N-/O-聚糖中。它们在生物体重要的生物识别过程中发挥着关键作用，例如促进肠道菌群中有益菌的生长，促进细胞中信号传导、细胞粘附，肿瘤转移，防止病原体感染，调节肠道上皮细胞应答，免疫调节等。大量研究表明，Lex、sLex抗原可以作为宿主细胞表面受体与微生物或毒素相结合，从而阻止病原体与肠道上皮细胞的结合，预防疾病的发生。例如引起慢性胃炎的幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori可结合sLex的寡糖，从而抑制病原菌对宿主细胞的黏附。此外，含有Lex结构和sLe x结构的寡糖在许多肿瘤细胞中高表达，被称为肿瘤相关糖抗原(TACAs)，它们是细胞黏附分子(cell adhesion molecular,CAM)家族的重要成员，在肿瘤细胞与宿主细胞之间的异质黏附中发挥关键作用，其介导的细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用是恶性肿瘤侵袭转移的关键。因此与肿瘤的发生、发展密切相关，常被作为肿瘤诊断的标志物及肿瘤转移的预后指标，其在血液中的含量可作为鉴别良恶性肿瘤的重要依据。
正是由于TACAs与肿瘤的密切关系，及其主要分布在肿瘤细胞上的特点，提供了肿瘤治疗的新思路，将TACAs作为抗原来刺激机体的免疫系统，使免疫系统识别并产生针对TACAs的抗体，以此产生有靶向性的抗肿瘤疫苗，应用于癌症的治疗。
此外，Lex及sLex抗原能与糖结合蛋白(glycan-binding proteins,GBPs)结合，两者的相互作用在肿瘤细胞免疫调控网络中呈现出多种功能，如促进炎症、免疫抑制、细胞凋亡等。因此设计、合成底物竞争抑制剂或制备亲和性单克隆抗体来阻断两者的结合，为肿瘤的诊断和治疗提供了一个新的解决途径。
鉴于上述情况，大量合成Lex及sLex抗原，发掘其潜在的糖链化合物库，发展以其为先导化合物的抗炎、抗肿瘤新型药物及新型早期诊断试剂具有重大意义。
由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的人乳寡糖用于生物学、药学研究的可能性微乎其微且异常困难。对于化学合成而言，由于糖链本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速、高效的合成方法来解决以上问题。采用酶法模块化组装策略合成目的糖链，为系统研究Lex及sLex抗原作为抗炎、抗肿瘤药物方面的应用奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种核心骨架糖链1的合成方法，
1)利用酶法模块化组装1将N-乙酰氨基葡萄糖β1-3糖苷键偶联到式(V)所示的二糖上，合成式(VI)所示的三糖；
2)利用酶法模块化组装2将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VI)所示的三糖上，合成式(VII)所示的四糖；
其中，式(V)～(VII)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基葡萄糖获得中间体1的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体1和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体2的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体2和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
本发明的第二个方面提供了一种核心骨架糖链2的合成方法，
(1)利用酶法模块化组装1将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖上，合成式(VIII)所示的五糖；
(2)利用酶法模块化组装2将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VIII)所示的五糖上，合成式(IX)所示的六糖；
其中，式(VII)～(IX)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基葡萄糖获得中间体3的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体3和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体4的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体4和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
本发明的第三个方法提供了一种上述方法在制备Lewis x单聚体、二聚体或其唾液酸化衍生物中的应用。
本发明的第四个方面提供了一种含Lex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，利用酶法模块化组装3将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖，合成式(I)所示的五糖；
或，利用酶法模块化组装3将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(IX)所示的六糖上，合成式(II)所示的八糖；
其中，式(VII)、式(IX)、式(I)～(II)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装3中改性岩藻糖获得中间体5的酶为岩藻糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体5和多糖合成的酶为α1-3岩藻糖转移酶。
本发明的第五个方面提供了一种含sLex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，利用酶法模块化组装4将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(I)所示的五糖，平行合成式(III)所示的六糖；
或，利用酶法模块化组装4将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(II)所示的八糖上，合成式(IV)所示的九糖；
其中，式(I)～(IV)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装4中改性唾液酸获得中间体6的酶为糖核苷生成酶，催化中间体6和多糖合成的酶为α2-3岩藻糖转移酶。
需要说明的是，糖链的生物合成过程为非模板驱动过程，是在多种糖基转移酶和糖苷酶的共同作用下催化组装而成，这导致生物膜表面的糖链结构表现出高度不均一性，因此很难从自然界获得足量、均一且结构确定的糖链及糖缀合物，这也成为糖合成和糖功能性研究的制约瓶颈。虽然酶法模块化组装策略是一种高效的复杂寡糖的合成方法，但是，针对不同的合成目标，需要有针对性的制定合成策略，并非是简单地在不同酶的催化下，将不同单糖简单地连接在一起。
本发明针对合成Lewis x(Lex)及唾液酸化Lewis x(sLex)单聚体、二聚体的寡糖设计了酶法模块化组装策略。首先，对拟合成的目标分子进行分析，其单糖的组成、连接顺序以及糖苷键构型，确定了合成目标寡糖所需要的关键酶；然后对关键酶进行了优化筛选，根据酶的催化活性、酶对底物的区域选择性、立体选择性等因素，有针对性地构建不同寡糖分子所需的酶法模块；最后探究了酶法反应最适的金属离子、底物浓度、反应温度、反应时间、体系pH等，保证了本发明酶法模块中酶的高效能发挥，并最终实现了目标分子的快速、高效合成。
本发明的有益效果：
1.本发明通过酶法模块化组装策略，巧妙地结合了细菌来源的糖核苷生成酶和糖基转移酶，实现了具有重要生物学活性的Lex及sLex单聚体、二聚体的寡糖的制备级合成。本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点，因而以其为基础的酶法模块化组装效率高，且适于大量制备；利用糖核苷酸生成酶可以从价廉、易得的单糖出发高效的转化为昂贵的核苷活化的糖基供体，大大降低了生产成本；相对于步骤繁琐、产率较低的化学合成法，酶法合成在空间和立体化学特异性方面具有明显的优势，大大简化了反应步骤，提高反应的总体收率。
2.本发明发展的高效的酶法模块化组装策略，为相关糖结构和生物学功能研究所需的糖链及其缀合物样品的获得提供了可行性极高的途径，还可在分子水平上深入研究这些糖链与受体的相互作用机制及构效关系，为相关疾病病理学机制的阐明和未来的诊断治疗奠定了基础。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：Lex抗原寡糖结构；
图2：sLex抗原寡糖结构；
图3：type II核心结构；
图4：酶法模块化组装1的合成过程示意图；
图5：酶法模块化组装2的合成过程示意图；
图6：酶法模块化组装3的合成过程示意图；
图7：酶法模块化组装4的合成过程示意图；
图8：化学法合成β-构型的乳糖化合物1的反应方程式；
图9：酶法模块化合成三糖化合物2的反应方程式；
图10：酶法模块化合成四糖化合物3的反应方程式；
图11：酶法模块化合成五糖化合物4的反应方程式；
图12：酶法模块化合成六糖化合物5的反应方程式；
图13：酶法模块化合成五糖化合物6的反应方程式；
图14：酶法模块化合成八糖化合物7的反应方程式。
图15：酶法模块化合成六糖化合物8的反应方程式。
图16：酶法模块化合成九糖化合物9的反应方程式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本申请所述的酶法模块化组装主要是指采用一组酶的作用下对单糖进行改性形成中间体，然后在另一组酶的催化作用下使中间体与多糖进行合成反应，从而使得单糖偶联至多糖。
除非另外指出，本申请中的“当量”是指物质相互作用时的物质的量的比值，如：N-乙酰氨基葡萄糖(1.2-5.0当量)的含义即为：N-乙酰氨基葡萄糖与式(II)所示的乳糖苷的物质的量的比为1.2-5.0。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在化学合成方法反应步骤多、总体收率低的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种核心骨架糖链1的合成方法，
1)利用酶法模块化组装1将N-乙酰氨基葡萄糖β1-3糖苷键偶联到式(V)所示的二糖上，合成式(VI)所示的三糖；
2)利用酶法模块化组装2将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VI)所示的三糖上，合成式(VII)所示的四糖；
其中，式(V)～(VII)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基葡萄糖获得中间体1的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体1和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体2的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体2和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
优选的，所述酶法模块化组装1中，N-乙酰氨基葡萄糖激酶为NahK，糖核苷生成酶为GlmU，β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶为HpLgtA；
所述酶法模块化组装2中，半乳糖激酶为GalK，糖核苷生成酶为BLUSP，β1-4半乳糖转移酶为NmLgtB。
在本申请的一个具体实施方案中，式(V)所示的β-构型的乳糖苷Galβ(l-4)GlcOR1的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波法将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，最后依次叠氮化和脱保护，即可获得。可作下步酶反应受体的乳糖苷，具体反应方程式如图8所示。
在本申请的一个具体实施方案中，式(VI)所示的三糖的合成方法为：将式(V)所示的乳糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖生成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VI)所示的三糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图9所示。
在本申请的一个具体实施方案中，式(VII)所示的四糖的合成方法为：将式(VI)所示的三糖、半乳糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VII)所示四糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图10所示。
本申请的另一种实施方式，提供一种核心骨架糖链2的合成方法，
(1)利用酶法模块化组装1(如图4所示)将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖上，合成式(VIII)所示的五糖；
(2)利用酶法模块化组装2(如图5所示)将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VIII)所示的五糖上，合成式(IX)所示的六糖；
其中，式(VII)～(IX)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基葡萄糖获得中间体3的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体3和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体4的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体4和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
优选的，所述酶法模块化组装1中，N-乙酰氨基葡萄糖激酶为NahK，糖核苷生成酶为GlmU，β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶为HpLgtA；
所述酶法模块化组装2中，半乳糖激酶为GalK，糖核苷生成酶为BLUSP，β1-4半乳糖转移酶为NmLgtB。
在本申请的一个具体实施方案中，式(VIII)所示的五糖的合成方法为：将式(VII)所示的四糖、N-乙酰氨基葡萄糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖生成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VIII)所示的五糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图11所示。
在本申请的一个具体实施方案中，式(IX)所示的六糖的合成方法为：将式(VIII)所示的五糖、半乳糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(IX)所示六糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图12所示。
本申请的第三种实施方式，提供了一种上述方法在制备Lewis x单聚体、二聚体或其唾液酸化衍生物中的应用。
本申请的第四种实施方式，提供了一种含Lex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，利用酶法模块化组装3(如图6所示)将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖，合成式(I)所示的五糖；
或，利用酶法模块化组装3将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(IX)所示的六糖上，合成式(II)所示的八糖；
其中，式(VII)、式(IX)、式(I)～(II)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装3中改性岩藻糖获得中间体5的酶为岩藻糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体5和多糖合成的酶为α1-3岩藻糖转移酶。
优选的，酶法模块化组装3中，岩藻糖激酶为FKP，糖核苷生成酶为FKP，α1-3岩藻糖转移酶为Hpα1-3FucT。
在本发明的一个具体实施方案中，式(I)所示的五糖的合成方法为：将式(VII)所示的四糖、岩藻糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(FKP)以及α1-3岩藻糖转移酶(Hpα1-3FucT)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(I)所示的五糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图13所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(II)所示的八糖的合成方法为：将式(IX)所示的六糖、岩藻糖(1.2～5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2～5.0当量)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(FKP)以及α1-3岩藻糖转移酶(Hpα1-3FucT)，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(II)所示的八糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图14所示
本申请的第五种实施方式，提供了一种含sLex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，利用酶法模块化组装4(如图7所示)将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(I)所示的五糖，平行合成式(III)所示的六糖；
或，利用酶法模块化组装4将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(II)所示的八糖上，合成式(IV)所示的九糖；
其中，式(I)～(IV)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装4中改性唾液酸获得中间体6的酶为糖核苷生成酶，催化中间体6和多糖合成的酶为α2-3岩藻糖转移酶。
优选的，酶法模块化组装4中，糖核苷生成酶为NmCSS，α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D。
在本申请的一个具体实施方案中，式(III)所示的六糖的合成方法为：将式(I)所示的五糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)(1.2～5.0当量)、胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加糖核苷生成酶(NmCSS)以及α2-3唾液酸转移酶(PmST1M144D)，反应时间为0.5～36小时，待反应完成后，纯化即可获得式(III)所示的六糖。其反应方程式如图15所示。
在本申请的一个具体实施方案中，式(IV)所示的九糖的合成方法为：将式(II)所示的八糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)(1.2～5.0当量)、胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)(1.2～5.0当量)、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10～500mmol、pH 5.0～10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加糖核苷生成酶(NmCSS)以及α2-3唾液酸转移酶(PmST1M144D)，反应时间为0.5～36小时，待反应完成后，纯化即可获得式(IV)所示的九糖。其反应方程式如图16所示。
上述具体实施方案中，反应完成后采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，式(I)、(III)、(V)～(IX)展开剂为EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2和式(II)、(IV)的合成展开剂为nBuOH:MeOH:H2O:HOAc＝2:2:1:1。
上述多糖合成所采用的酶法模块化组装策略中，反应温度为0～37℃，转速为0～240r/min；所述酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0～50分钟。
以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但就目前酶的来源和实际应用的角度来说，合成寡糖链所应用的酶主要分为两类：一种是糖苷酶，该类酶来源丰富、性能稳定、反应简单、底物适应性强，目前在工业上已被采用，但此类酶催化的寡糖合成收率欠佳。此外，由于糖苷酶催化的转糖基反应的区域选择性不高，而且合成反应中还存在水解反应的竞争，导致产物不均一，难于分离纯化，限制了其广泛应用。第二种是糖基转移酶，该类酶具有很高的催化效率及严格的底物选择性。但是天然糖基转移酶的使用也存在着很多限制因素：酶的来源有限；酶的不稳定性、复杂性导致分离纯化困难；酶催化的糖苷化反应需要价格昂贵的核苷活化糖作糖基给体；酶具有严格的底物特异性，对非天然或异常的底物耐受能力较差。以上缺点极大地限制了糖苷酶和糖基转移酶在酶法模块化合成复杂寡糖中的应用。
本发明所采用的酶法模块均含有糖激酶、糖核苷生成酶和糖转移酶三类酶，它们发挥着高效的催化作用，且相互协同，构成一个有机的酶反应体系。在试验过程中对上述所用的酶进行了多次的优化和筛选，结果发现：以NahK/GlmU，Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine-1-kinase(NahK)和E.coli N-acetylglucosamine uridyltransferase(GlmU),以及Helicobacter pyloriβ1–3-N-acetylglucosaminyltransferase(HpLgtA)；E.coli galactokinase(GalK),Bifidobacterium longum UDP-sugar pyrophosphorylase(BLUSP)和Neisseria meningitidesβ1–4-galactosyltransferase(NmLgtB)；Neisseriameningitides CMP-sialic acid synthetase(NmCSS),及Pasteurella multocidamultifunctional 2–3-sialyltransferase 1M144D(PmST1M144D)；Bacteroides fragilisbifunctional L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase(FKP)，和Helicobacterpyloriα1–3-fucosyltransferase(Hpα1-3FucT)作为本发明所采用的酶，其催化效果最佳，合成效率高，纯化简便，而且上述酶均为细菌来源，可在常规的大肠杆菌表达系统中大量表达纯化。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
下述实施例中所提及的化合物1-9分别对应于R1为叠氮取代烷基的通式V-IX、I-IV的化合物。
实施例1：Lex及sLex单聚体、二聚体的寡糖的合成
步骤如下：
(1)化学法合成β-构型的乳糖苷1(Galβ1,4GlcβProN3)
向500mL圆底烧瓶中加入乳糖10(10g,29.23mmol)、醋酐(55mL)和醋酸钠(9.6g)，在160℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱(PE:EA＝1:1)检测反应完全后，旋蒸浓缩。所得固体复溶于250mL二氯甲烷中，用半饱和食盐水萃取两次，饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，双蒸水溶液萃取三次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得淡黄色固体化合物11(18.70g,94％)。
向容积为10mL的微波专用反应管中加入化合物11(1.0g,1.47mmol)、二氯甲烷(5.0mL)、三氟化硼乙醚(0.36mL)和3-氯-1-丙醇(0.25mL)，磁力搅拌，预搅拌2分钟，反应温度为50℃，反应时间为15分钟。按照相同的反应条件，平行开5组。收集反应液，用三乙胺淬灭反应后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得淡黄色固体化合物12(2.75g,53％)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物12(2.40g,3.37mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(40mL)、叠氮钠(1.2g)和四丁基碘化铵(0.12g)，110℃搅拌回流12小时。薄层色谱(PE:EA＝1:1)检测反应完全后，使用硅藻土过滤,再旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得淡黄色固体化合物13(1.93g,90％)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物13(1.50g,2.36mmol)、甲醇(10mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9-10左右，室温搅拌4小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2)反应完全后，用酸性离子交换树脂将反应液的pH值调节到中性，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，得到白色固体化合物1(0.90g,90％)。
化合物1的合成路线如图8所示。
(2)酶法模块组装1合成三糖化合物2[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物2[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将乳糖受体化合物1(80mg)、N-乙酰氨基葡萄糖(54mg)、ATP(124mg)、UTP(118mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 8.0)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(1.0-3.0mg)和HpLgtA(0.5-2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过快速硅胶柱分离，获得白色化合物2(105mg,89％)。参数如下：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.16(d,J＝3.0Hz,1H),4.03–3.46(m,20H),3.32(t,J＝8.4Hz,1H),2.05(s,3H),1.93(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.95,102.92,102.84,102.10,81.96,78.34,75.64,74.88,74.76,74.35,73.55,72.79,70.00,69.68,68.33,67.36,60.96,60.47,60.06,55.65,47.87,28.23,22.19。
化合物2的合成路线如图9所示。
(3)酶法模块组装2合成四糖化合物3[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物3[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将三糖化合物2(80mg)、半乳糖(30mg)、ATP(84mg)、UTP(80mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0-4.0mg)、BLUSP(2.0-5.0mg)和NmLgtB(1.0-3.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物3(94mg,93％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.73(d,J＝8.4Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.46(d,J＝8.4Hz,1H),4.17(d,J＝3.6Hz,1H),4.03–3.96(m,3H),3.94(d,J＝3.0Hz,1H),3.87(dd,J＝4.8,12.6Hz,1H),3.84–3.54(m,19H),3.48(t,J＝6.6Hz,2H),3.33(t,J＝8.4Hz,1H),2.05(s,3H),1.93(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.89,102.92,102.84,102.73,102.09,82.05,78.35,78.14,75.33,74.87,74.75,74.53,74.34,72.79,72.49,72.16,70.96,69.95,68.55,68.31,67.36,61.04,60.96,60.06,59.85,55.18,47.87,28.24,22.22。
化合物3的合成路线如图10所示。
(4)酶法模块化1合成五糖化合物4[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物4[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将四糖化合物3(150mg)、N-乙酰氨基葡萄糖(54.6mg)、ATP(135.9mg)、UTP(119.4mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 8.0)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(1.0-3.0mg)和HpLgtA(0.5-2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物4(167.8mg,89％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.67(dd,J＝11.6,8.4Hz,2H),4.46(dd,J＝12.0,7.9Hz,2H),4.42(d,J＝7.9Hz,1H),4.13(d,J＝3.0Hz,2H),4.00–3.87(m,4H),3.82(dd,J＝4.2,12Hz,1H),3.80–3.40(m,26H),3.29(m,J＝8.4Hz,1H),2.02(d,J＝3.0Hz,6H),1.90(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.87,174.82,102.89,102.84,102.81,102.69,102.07,81.98,81.94,78.31,78.13,75.61,74.84,74.82,74.72,74.50,74.31,73.51,72.75,72.12,69.95,69.91,69.64,68.28,67.31,60.92,60.45,60.02,59.82,55.62,55.10,47.84,28.21,22.17。
化合物4的合成路线如图11所示。
(5)酶法模块组装2合成六糖化合物5
[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物5[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将五糖化合物4(150mg)、半乳糖(32.6mg)、ATP(99.8mg)、UTP(87.7mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0-4.0mg)、BLUSP(2.0-5.0mg)和NmLgtB(1.0-3.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物5(160.5mg,92％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.65(d,J＝7.8Hz,2H),4.45(d,J＝7.2Hz,1H),4.43(d,J＝6.6Hz,1H),4.42(d,J＝7.8Hz,1H),4.39(d,J＝7.8Hz,1H),4.11(d,J＝3.0Hz,2H),3.98–3.48(m,35H),3.42(t,J＝6.6Hz,2H),3.27(t,J＝8.4Hz,1H),1.99(s,6H),1.87(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.77,102.81,102.75,102.72,102.65,102.63,101.98,81.94,81.90,78.17,77.97,75.22,74.74,74.64,74.41,74.22,72.65,72.36,72.04,70.83,69.82,68.41,68.20,67.23,60.91,60.83,59.90,59.70,55.05,55.01,47.73,28.10,22.04。
化合物5的合成路线如图12所示。
(6)酶法模块组装3合成五糖化合物6[Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物6[Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将四糖化合物3(160mg)、岩藻糖(49mg)、ATP(152mg)、GTP(180mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入FKP(2.0-4.0mg)、Hpα1-3FucT(2.0-5.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育15小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物6(174mg,92％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.12(d,J＝3.6Hz,1H),4.84(m,1H)，4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.42(d,J＝8.4Hz,1H),4.15(d,J＝3.0Hz,1H),4.05–3.56(m,26H),3.48(dd,J＝7.9,9.6Hz,1H),3.46(t，J＝6.6Hz,2H)，3.30(t,J＝8.5Hz,1H),2.02(s,3H),1.91(p,J＝6.5Hz,2H),1.17(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.58,102.84,102.43,102.01,101.67,98.51,81.97,78.24,75.01,74.80,74.76,74.66,74.26,72.96,72.69,72.38,71.81,70.95,69.85,69.10,68.25,68.20,67.61,67.26,66.59,61.40,60.87,59.97,59.54,55.86,47.78,28.15,22.18,15.25。
化合物6的合成路线如图13所示。
(7)酶法模块组装3合成八糖化合物7[Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物7[Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将六糖化合物5(80mg)、岩藻糖(17mg)、ATP(52.7mg)、GTP(61.8mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入FKP(2.0-4.0mg)、Hpα1-3FucT(2.0-5.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育15小时。薄层色谱(nBuOH:MeOH:H2O:EtOH＝2:2:1:1)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物7(88.2mg,88％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.13(d,J＝3.6Hz,1H),5.11(d,J＝4.2Hz,1H),4.72(d,J＝5.4Hz,1H),4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.47(d,J＝7.8Hz,1H),4.44(t,J＝7.2Hz,2H),4.15(d,J＝3.0Hz,1H),4.10(d,J＝3.0Hz,1H),4.02–3.48(m,43H),3.46(t,J＝6.6Hz,2H),3.31(t,J＝8.4Hz,1H),2.02(s,3H),2.02(s,3H),1.91(p,J＝6.6Hz,2H),1.18(d,J＝6.6Hz,3H),1.15(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.69,174.63,102.92,102.50,102.47,102.09,101.72,101.71,98.68,98.57,82.04,81.59,78.31,75.07,75.04,74.89,74.84,74.74,74.42,74.33,73.00,72.77,72.74,72.45,71.89,71.83,71.03,70.50,69.93,69.17,69.15,68.33,68.28,68.21,67.68,67.62,67.35,66.66,61.49,61.44,60.93,60.04,59.61,59.42,55.93,47.85,28.21,22.23,15.30,15.26。
化合物7的合成路线如图14所示。
(8)酶法模块组装4合成六糖化合物8
[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物8[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的
合成方法如下：
将五糖化合物6(80mg)、Neu5Ac(22mg)、CTP(37.6mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 8.0)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NmCSS(2.0-4.0mg)、PmST1M144D(2.0-5.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育3小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物8(62.5mg,62％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.08(d,J＝4.2Hz,1H),4.67(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝8.4Hz,1H),4.40(d,J＝7.8Hz,1H),4.13(d,J＝3.0Hz,1H),4.05(dd,J＝2.6,9.8Hz,1H),4.04(d,J＝2.4Hz,1H),4.00–3.52(m,33H),3.49(t,J＝8.8Hz,1H),3.43(t,J＝6.6Hz,2H),3.30(t,J＝8.4Hz,1H),2.73(dd,J＝4.2,12.6Hz,1H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.88(p,J＝6.6Hz,2H),1.76(t,J＝12.0Hz,1H),1.13(d,J＝6.6Hz,3H)；13CNMR(151MHz,D2O)δ174.88,174.55,173.74,102.81,102.47,101.97,101.42,99.51,98.46,81.97,78.19,75.52,74.89,74.79,74.76,74.64,74.51,74.23,72.88,72.78,72.65,71.77,71.73,69.82,69.13,69.04,68.17,67.96,67.57,67.23,67.18,66.53,62.46,61.37,60.85,59.92,59.37,59.18,55.83,51.56,47.73,39.65,28.11,22.12,21.90,15.16。
化合物8的合成路线如图15所示。
(9)酶法模块组装4合成九糖化合物9
[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物9[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)Glc-NAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成方法如下：
将八糖化合物7(50mg)、Neu5Ac(16mg)、CTP(27.3mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 8.0)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NmCSS(2.0-4.0mg)、PmST1M144D(2.0-5.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育3小时。薄层色谱(nBuOH:MeOH:H2O:EtOH＝2:2:1:1)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物9(32.8mg,50％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.07(dd,J＝7.7,3.9Hz,2H),4.65(t,J＝8.6Hz,2H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.39(t,J＝7.4Hz,2H),4.11(d,J＝3.2Hz,1H),4.06-4.02(m,2H),3.98-3.38(m,51H),3.26(dd,J＝10.6,6.2Hz,1H),2.71(dd,J＝12.7,4.7Hz,1H),2.00(s,9H)1.86(p,J＝6.6Hz,2H),1.75(t,J＝12.1Hz,1H),1.11(dd,J＝12.4,6.5Hz,6H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.65,174.57,102.86,102.48,102.04,101.65,101.45,99.57,98.65,98.50,82.00,81.56,78.21,75.58,75.02,74.90,74.85,74.80,74.70,74.57,74.39,74.27,72.92,72.83,72.71,72.64,71.84,71.79,71.68,70.45,69.89,69.20,69.09,68.24,68.17,68.00,67.63,67.55,67.29,66.62,66.59,62.51,61.44,60.89,59.96,59.54,59.42,55.88,51.77,51.61,47.78,46.56,39.70,28.16,22.18,21.97,15.35,15.22。
化合物9的合成路线如图16所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核心骨架糖链1的合成方法，其特征是，
1)利用酶法模块化组装1将N-乙酰氨基葡萄糖β1-3糖苷键偶联到式(V)所示的二糖上，合成式(VI)所示的三糖；
2)利用酶法模块化组装2将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VI)所示的三糖上，合成式(VII)所示的四糖；
其中，式(V)～(VII)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基c葡萄糖获得中间体1的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体1和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体2的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体2和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征是，所述酶法模块化组装1中，N-乙酰氨基葡萄糖激酶为NahK，糖核苷生成酶为GlmU，β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶为HpLgtA；
所述酶法模块化组装2中，半乳糖激酶为GalK，糖核苷生成酶为BLUSP，β1-4半乳糖转移酶为NmLgtB；
优选的，式(V)所示的二糖的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波法将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，最后依次叠氮化和脱保护，即可获得；
优选的，式(VI)所示的三糖的合成方法为：将式(V)所示的乳糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、腺嘌呤核苷三磷酸尿嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加NahK、GlmU以及HpLgtA，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VI)所示的三糖；
优选的，式(VII)所示的四糖的合成方法为：将式(VI)所示的三糖、半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加GalK、BLUSP以及NmLgtB，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VII)所示四糖。
3.一种核心骨架糖链2的合成方法，其特征是，
(1)利用酶法模块化组装1将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖上，合成式(VIII)所示的五糖；
(2)利用酶法模块化组装2将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(VIII)所示的五糖上，合成式(IX)所示的六糖；
其中，式(VII)～(IX)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装1中改性N-乙酰氨基葡萄糖获得中间体3的酶为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体3和多糖合成的酶为β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
所述酶法模块化组装1中改性半乳糖获得中间体4的酶为半乳糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体4和多糖合成的酶为β1-4半乳糖转移酶。
4.如权利要求3所述的合成方法，其特征是，所述酶法模块化组装1中，N-乙酰氨基葡萄糖激酶为NahK，糖核苷生成酶为GlmU，β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶为HpLgtA；
所述酶法模块化组装2中，半乳糖激酶为GalK，糖核苷生成酶为BLUSP，β1-4半乳糖转移酶为NmLgtB；
优选的，式(VIII)所示的五糖的合成方法为：将式(VII)所示的四糖、N-乙酰氨基葡萄糖、腺嘌呤核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加NahK、GlmU以及HpLgtA，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(VIII)所示的五糖；
优选的，式(IX)所示的六糖的合成方法为：将式(VIII)所示的五糖、半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加GalK、BLUSP以及NmLgtB，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(IX)所示六糖。
5.一种权利要求1～4任一所述的合成方法在制备Lewis x单聚体、二聚体或其唾液酸化衍生物中的应用。
6.一种含Lex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，其特征是，利用酶法模块化组装3将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(VII)所示的四糖，合成式(I)所示的五糖；
或，利用酶法模块化组装3将岩藻糖以α1-3糖苷键偶联到式(IX)所示的六糖上，合成式(II)所示的八糖；
其中，式(VII)、式(IX)、式(I)～(II)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装3中改性岩藻糖获得中间体5的酶为岩藻糖激酶和糖核苷生成酶，催化中间体5和多糖合成的酶为α1-3岩藻糖转移酶。
7.如权利要求6所述的合成方法，其特征是，酶法模块化组装3中，岩藻糖激酶为FKP，糖核苷生成酶为FKP，α1-3岩藻糖转移酶为Hpα1-3FucT；
优选的，式(I)所示的五糖的合成方法为：将式(VII)所示的四糖、岩藻糖、腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加FKP以及Hpα1-3FucT，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(I)所示的五糖；
优选的，式(II)所示的八糖的合成方法为：将式(IX)所示的六糖、岩藻糖、腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、MgCl2(5～100mmol)、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加FKP以及Hpα1-3FucT，反应时间为3～72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(II)所示的八糖。
8.一种含sLex单聚体结构或二聚体结构的糖链的合成方法，其特征是，利用酶法模块化组装4将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(I)所示的五糖，平行合成式(III)所示的六糖；
或，利用酶法模块化组装4将唾液酸以α2-3糖苷键偶联到式(II)所示的八糖上，合成式(IV)所示的九糖；
其中，式(I)～(IV)中的R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述酶法模块化组装4中改性唾液酸获得中间体6的酶为糖核苷生成酶，催化中间体6和多糖合成的酶为α2-3岩藻糖转移酶。
9.如权利要求8所述的合成方法，其特征是，酶法模块化组装4中，糖核苷生成酶为NmCSS，α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D；
优选的，式(III)所示的六糖的合成方法为：将式(I)所示的五糖、N-乙酰神经氨酸、胞嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加NmCSS以及PmST1M144D，反应时间为0.5～36小时，待反应完成后，纯化即可获得式(III)所示的六糖；
优选的，式(IV)所示的九糖的合成方法为：将式(II)所示的八糖、N-乙酰神经氨酸、胞嘧啶核苷三磷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5～8.5，然后添加NmCSS以及PmST1M144D，反应时间为0.5～36小时，待反应完成后，纯化即可获得式(IV)所示的九糖。
10.如权利要求1～9任一所述的合成方法，其特征是，采用的酶法模块化组装的条件为，反应温度为0～37℃，转速为0～240r/min；所述酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0～50分钟。
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