JPH06510744A - 変性されたシアリルルイスx化合物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なシアリルルイス1類似体、そのような類似体を含有する製剤組成
物、それらの製造法及びそれらの使用法に関する。
2、文献
次の文献は本出願においてその関係部分において参照番号として引用されている
ものである:(1)ホロビッツ(Horowitz)著”グリココンジュゲーツ
(Glycoconjugates)” 、第1−v巻、編集人・ピグマン(P
igman) 、ニュー・ヨーク・アカデミツク・プレス社(New York
Academic Press) (1977年、1978年、1982年、
1983年)。
(2)イッポリト(Ippolito)等の1991年6月IO日の出願に係る
米国特許出願第07/714.161号。
(3)シャウア−(5hauer)纒“細胞生物学のモノグラフ(Cell B
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(4)ンエングルノド(Schengrund)等のJ、 Biol。
Chem、 、264 :13233−13237 (1989)。
(5)N、Y、アカデミツク・プレス社刊、コン(Conn)編“受容体(Th
e Peceptors)”におけるボールマン(Pauison)著“動物ウ
ィルスと細胞表面の受容体との相互作用(Interaction of An
imal Viruses withCell 5urface Recept
ors) ” 、 第 131−219 頁 (1985年)。
(6)フエイジ(Feizi)のTlB5.+6:84−86(1991)。
(7)ブラントレー(Brandley)等のCe1l、63;861−863
(+990)。
(8)ハコモリ(Hakomor i )のAdv、 Cancer Res、
、52:257−331 (1989)。
(9)ハウフトン(Houghton)等の“ガングリオシドと癌に関するノン
ポジューム(Symposium onGaugliosides and C
ancer ) ” 、第233−237頁、VCHパブリソシャーズ社(VC
)l Publishers) (1988年)。
(10)イリー(Ir1e)等の“ガングリオシドと癌に関するシンポジューム
”、第247−257頁、VCHパブリソンヤーズ社(1988年)。
(l l) Rペル(R,Be1l)、G、)リッガニ(G、 Torriga
ni)編、ハワード(Howard)著“より良い炭化水素ワクチンへ(Tow
ards Better CarbohydrateVaccines)” 1
世界健康機構主催の会議の会議録(Proceedings of a Mee
ting Organized by the WorldHealth Or
ga旧zati、on)、第212−236頁、ワイレー、チチェスター社(W
iley、 Chichester) (1987年)。
(12)へニングソン(Henningsson)等のCancerImmun
ol、Immunother 、2 5 : 2 1 3 − 2 4 1 (
1987)。
(13)フアツジ(Fung)等のCancer Res、、50:4308−
43+4 (1990) 。
(14)リビングストン(Livingston)等のProc。
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(15)すオア(Naor)等のProg、 Allergy、 22 :10
7−146 (1977)。
(16)オルショフ(Orshow)等のJ、 Exp、 Med、、149:
669−685 (1979)。
(+7)/<−ソウム(Barsoum)等のMo1. Immunol、、1
8:495−550 (1981)。
(18)ジエニングス(Jan旧ngs)等の米国特許第4゜727.136号
(1985年)。
(19)ホンダ(Honda)等のJ、 Biochem、、(東京)95・+
323−1329 (1984)。
(20)ナカムラ(Nakamura)等のJ、 Biochem、、(東京)
、99:219−226 (1986)。
(21)ヘノソト(Venot)等の米国特許出願第07/77]、007号“
アルファーシアリル化オリゴサ・ソカリトの酵素的合成法(Methods f
or the EnzymaticSynthesis of Alha −5
ialylated OligosaccharideGlycosides)
”、1991年lθ月2日出願。
(22)バルンツク(Pa1cic)等のCarbohydr。
Res、、 l 90 : l−11(1989) 。
(23)ラトクリッフエ(Ratcliffe)等の米国特許出願第07/27
8,106号、1988年11月30日出願。
(24)ワインシュタイン(Weinstein)等のJ、 Biol。
Chem、、257 :13845−13853 (1982)。
(25)クコブスカーラタッcl (Kukowsaka−Latallo)等
のGenes and Development 、4 : l 288−13
03(1990)。
(26)デュマス(Dumas)等のBioorg、 Med、 Letter
s、1:425−428 (1991)。
(27)ブリーエルス(Prieels)等のJ、 Biol、 Chem、、
256 :10456−10463 (1981)。
(28)エラペンバーガー−カストリ(Eppenberger(29)ジョン
ソン(Johnson)等のV[Il th rnt。
Symp、 Glycoconjugates 1ハウストン(Houston
)、ス:212−223 (+985)。
(32)ボールソン(Paulson)等のEur、 J、 Biochem、
、+40:523−539 (+984) 。
(33)ロイター(Reuter)等のGlycoconjugate J、、
5:l33−135 (+988) 。
(34)フアツジ(Jiang)等の米国特許出願第07/848.223号“
GDP−フコースの化学的合成(Chemical 5ynthesis of
G D P −Fucose) ”、1992年3月9日出願。
(35)ラトクリソフエ等の米国特許第5.079゜353号。
(36)ヒガ()liga)等のJ、 Biol、 Chem、、260・88
38−8849 (+985)。
(37)プロラスマー(Brossmer)等のBiOChem。
Biophys、 Acta、、96 :1282−1289 (1980)。
(38)クロス(Gross)等のEur、 j、 Biochem、、1互8
: 595−602 (1987)。
(39)グロス等のEur、 J、 Biochem、、177:583−58
9 (1988)。
(40)クリスチャン(Christian)等のCarbohydr。
Rse、、194:49−61 (+987)。
(41)コンラット(Conrad)等のF E B S Lett、、170
:295−300 (1984)。
(42)クリスチャン等のCarbohydr、 Res、、↓互(43)ハー
バーカンブ(Haverkamp)等のHoppe −3eyler’s Z、
Physiol、Chem、、360 :159−16656(+987) 。
(45)ヘージドーン(Hagedorn)等の“第13回炭水化物シンポジュ
ーム(Xlll Carbohydr、 Symp、) ’、イサ力(Itha
ca)、(1986年)A4゜(46)ズビラル(Zbirai)等のCarb
ohydr、 Res、、+94 :C15−C18(1989) 。
(47)ベノット(Venot)等の米国特許出願第07/771.259号“
ジ−N−アセチルラクトサミニル構造において終わっているモノフコモル化オリ
ゴサ・ソカリトの合成法(Methods for the 5yntesis
ofMonofucosylated Oligosaccahride T
erminating 1nDi−N −Acetyllactosaminy
l 5tructures)″、1991年10月2日出願。
(48)リッター等のInt、 j、 Cancer、182 : 32−43
(1991)。
(49)アブリン(Aplin)等のC,R,C,Cr1t、 Rev。
B i ochem、、第259−306頁(+981)。
(50)クルー(Crue)等線、ベーセル(Basel)、カージーt−−(
Karger)の、上0 : 48−114 (1989)、“微生物学及び免
疫学への寄与、コンジュゲートワクチン(Contributionsto M
icrobiology andlmmunology、 Conjugate
Vaccines) ”におけるディック(Dick)等著の“細菌性炭水化
物抗原のグリココンジュゲート(Glicoconjugates of Ba
cterial CarbohydrateAntigens) ”。
(51)レミオークス(Lemieux)等のJ、 Amer、 Chem。
(53)バーンシュタイン(Bernstein)等の93−201 (197
4)。
(55)ゴクヘール(Gokhale)等のCan、 J、 Che+n、、(
57) スティッチャ−(Sticher)等のBiochem、 J、、(5
9)7ノツト(Mazid)等の米国特許第5,059゜535号“シアリルト
ランスフェラーゼの分離、精製法(Process for the 5epa
ration and Purification ofSialyl Tra
nsferases ) ”、(1991年10月22日発行)。
(60)パルシック等のGlycoconj、 j、、5:49−63(198
8) 。
(61)ブラッドフォード(Bradford)等のAnal。
BiOChem、、72:248−254 (1976)。
(62)ボールソン等のJ、 Biol、 Chem、、252 : 2363
−2371 (1977) 。
(63)ハネシアン(Haness 1an)のCarbohydr、 Res
、、2:86−88 (1966)。
(64)シュミット(Schmidt)等のしiebigs Ann。
Chem、、121−124 (1991)。
(65)ヌネッツ(Nunez)等のCan、 J、 Chem、、旦9:20
86−2095 (1981)。
(66)ビーネマン(Veeneman)等のTetrahedronLett
、、32:6175−6178 (1991)。
(67)チャンドラセカラン(Chandrasekaram)等の5upp1
. to Glycoconj、 J、−グリココンジュゲートに関する第11
回国際シンポジウムの予稿集(Abstractsfor the l l t
h International Symposium onGlycocon
jugates ) (1991年)。
(68)パルシック等のCarbohydr、 Res、、159:315−3
24 (1987)。
(69)グレーグ(Greig)等のJ、 Chem、 Soc、、第879頁
(1961)。
(70)ピーカルスカーパートフゼビツツ(Piekarska−Bartow
zewicz)等のCarbohydr、 Res、、203 + 302−3
07 (1990) 。
(7I)ポダンスッキー(Bodanszky)等著“ペプチド合成の実際(T
he Practice of Peptide 5ynthesis)”、ス
ブリンジャー・ヴアーラグ社(Springer −Verlag)(+984
)。
(72)イナズ(Inazu)等のBull、 Soc、 Chim、。
Jap、、611 :4467 (1988)。
(73)バーノタス(Bernotas)等のBiochem、 J、、270
: 539−540 (1990)。
(74)ツルンテツ(Trumtez)等のCarbohyrr、 Res、、
191 :29−52 (1989)。
(75):+ヴ7 ’/り(kovac)等のCarbohydr、 Res、
、169・23−34 (1987)。
(76)ペチトー(Petitou)等のCarbohydr、 Res、、1
47:221−236 (1986)。
(77)へルコーヤ(Be1khouya)等のTetrahedronLet
ters 、3971−3980 (1991)。
(78)つオーレンバーグ(Wo l Ienberg)等の米国特許第4,6
12,132号。
(79)ベトラコヴy (Petrakova)等のCan、 J。
Chemistry、 70 :233−240 (+992)。
(80)マツモト(Matsumoto)等のAnal、 Biochem、、
116:103−110(1981)。
(81)!クハーグ(εkberg)等のCarbohydr、 Res、、1
10:55−67 (+982)。
(82)ダーメン(Dahmen)等のCarbohydr、 Res、、14
9−157 (1981) 。
(84)アンバムーゾッロ(Amvam −Zollo)等のCarbohyd
r、Res、、 150 :199−212 (1986)。
(85)ボールセン等のCarbohydr、 Res、、104゜195−2
19 (1982) 。
(86)チャーンヤク(Cherunyak)等のCarbohydr。
Res、、 128 :269−282 (+984) 。
(87)フエルナンデツーサンタナ(Fernadez −3antana)等
のJ、 Carbohydr、 Chem、 、8 : 531−537(+9
89)。
(88)り一等のCarbohydr、 Res、、37.第193頁以降(+
974)。
(89)ポズスゲ−(Pozsgay)等のBioorg、 Med。
Chem、 Let、、第1巻、第8号、第391−394頁(1991)。
本明細書において述へられている刊行物及び特許出願は全て本発明か関係する技
術分野の当業者の技術水準を示すものである。これら刊行物及び特許出願は全て
その全体か、その各々の刊行物又は特許出願の全体が引用、参照されるへく特定
的かつ個々に示されたかの如く、それと同程度にここに引用、参照される。
3、技術状態
炭水化物及び/又はオリゴサツカリドは種々の天然及び病理学上のグリココンジ
ュゲート(glycoconjugate)上に存在する1゜特に関心のあるも
のは、特に非還元性糖の末端にシアル酸残基を有する炭水化物及びオリゴサツカ
リドである3゜このようなシアル酸末端基付きの炭水化物及びオリゴサツカリド
は、一部は炭水化物の構造により、及びそれら構造が特定の配位子に結合するこ
とによって運ばれる認識信号の概念に基づ(広範囲の生物学的現象に係わってい
る多数の産生物に存在する。
具体的に述へると、このようなシアル酸末端基付きの炭水化物及びオリゴサツカ
リドは毒素4、病原性剤、例えばウィルス5の結合用受容体であると考えられ、
従ってそれら炭水化物及びオリゴサツカリドは種々のレクチン、特に細胞癒着6
7に伴われるもの等の認識部位である。シアリルルイス” (sialyl L
ewis” )を含めて、血液型決定因子に関係するシアリル化された及びシア
リル化/フコシル化されたオリゴサツカリドの構造も哺乳動物における生体内免
疫変調特性及び寛容特性を持つことか示されている2゜これに関しては、本明細
書に記載される変性ノアツルルイス8化合物も免疫変調特性と寛容特性を有する
。
更に、腫瘍関係抗原にある種特定のシアリル末端基付きオリゴサツカリドが存在
することがこの技術分野で記録されているか8、このような抗原上に存在するオ
リゴサツカリドの構造は、一般に、腫瘍関係抗原の発現を招くように正常なオリ
ゴサツカリドからある種の様式で変性されている1゜黒色腫を持つ患者の、ある
種のシアリル化腫瘍関連抗原、例えばガングリオシド類のGD3、CD、及びG
M tに対して向けられるモノクローナル抗体による受動免疫療法の可能性に
ついての研究が行われているs、+o0シかし、大部分の腫瘍関連抗原は、その
ような腫瘍の成長を抑制するか、妨げると思われる腫瘍特異性抗体を産生させる
ことができない。何等かの理論に限定されるものではないが、これは真の腫瘍特
異性抗原がないことに起因し、そしてそのような抗原の構造が限定された数の正
常組織に発現される同様の構造のそれと交叉反応すると考えられる。加えて、炭
水化物抗原は、一般的には、活性な免疫性における役割を果たすと予想されるT
−細胞性免疫応答をもたらすとは考えられない目。しかし、ある最近の研究は、
場合によっては腫瘍関連炭水化物抗原が抗癌T−細胞免疫性を持っているように
12.13、又は細胞毒性抗体を産生ずるように14振るようことがあることを
示している。
炭水化物の腫瘍関係抗原に細胞毒性の腫瘍特異性抗体を産生させる能力が一般に
ないことに鑑み、天然産の弱い抗原をそれらの抗原性を改善するように化学的に
変性することが提案されている1゜これに関しては、シアリル化された炭水化物
腫瘍関係抗原上の特定の基を化学的に変性する方法が報告されている。
非−又は弱い一免疫原性の天然産抗原に対する化学的変性の焦点の大部分はシア
リル化された炭水化物腫瘍関係抗原のシアル酸残基の誘導体を合成しなければな
らなかった。具体的に言うと、この技術分野において、天然産のシアル酸上に存
在するある種の構造変性はオリゴサツカリドを、選択された宿主において免疫原
性にすると報告されているIL 17.1S目2Gi00人工抗原に関する最近
の研究は、化学的に変性されたシアロント(黒色腫関連糖脂質抗原)はヒトにお
いて抗原性であるか、これらの変性シアロシドによってヒトに生成せしめられた
抗体は天然物質とは交叉反応しないことを示している4110他方、化学的に変
性されたシアリル化抗原は、これらをマウスに注射すると、天然物質と交叉反応
する抗体を産生ずる。従って、マウスに生成せしめられた交叉結合性のモノクロ
ーナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト宿主における天然物質の存在及び/
又は量を測定するための診断検定法の基礎か、又は治療剤に、場合によっては、
カップリングさせることができる抗体によって天然物質が攻撃される病状の抗体
療法の基礎として役立ったろう。
上記のことに関しては、ヘノット等21がシアル酸残基に変性を有する多数のシ
アリル化されたすりゴサノカリト構造を生成させるようにオリゴサツカリドの非
還元性末端基に変性されたノアリル基を有するノアリル化オリコサソカリトの簡
単な化学的/酵素的合成法を開示している。
この合成法の利点にもかかわらず、特にそれらはシアリル単位において変性され
たシアリルルイス8化合物に利用されるものであるので、免疫応答を変調すると
き、及び人工抗原に対する抗体を製造する目的からその人工抗原を製造するとき
の両方において有用な種々の構造を与えるようにシアリルルイス1中のガラクト
ース及び/又はN−アセチルグルコサミンの両サツカリド単位を変性するのが更
に有利であろう。実際上の観点からは、シアル酸単位及びフコース単位を変性さ
れたβQal(1→4)βG]cNAcのタイプII構造にそれぞれ適切なシア
リルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼにより付加させる化学
的/酵素的方法でそのような類似体を製造するのが有利であろう。
シアリルルイス1及びその類似体を製造する場合、適切なシアリルトランスフェ
ラーゼに、シアル酸をガラクトースの3−位に転移させてα(2→3)結合を形
成する、ラットの肝臓から得られる公知のβGa1(1→4)βGIcNAc
α(2→3)シアリルトランスフェラーゼ24がある。適切なフコシルトランス
フェラーゼには、ヒトの乳から容易に得られる公知のβGa1(1−3/4)β
G I cNAc a (1→3/4)フコシルトランスフェラーゼ22.21
.21及びヒトの血清にも見いだされ、βGa1(1→3/4)βGlcNAc
α(1→3/4)フコノルトランスフェラーゼと共に同時に回収されるβGa
l (1−4)βG l cNAc a (2→3)フコシルトランスフェラー
ゼがある。βGa1(1→3/4)βG1cNAc a(1−3/4)フコシル
トランスフェラーゼの組換え体も入手できる3s・1゜これに関し、シアリルル
イス“構造は、従来は、βcal(1→4)βGICNAC・タイプ1■構造を
適切なグリコジルトランスフェラーゼにより逐次的にシアリル化及びフコシル化
することを伴う組み合わせ化学的/酵素的方法で製造された。具体的に述へると
、βGa1(l→4)βG1cNAc・タイプ11構造のシアリル化は、この構
造を適切なシアリルトランスフェラーゼの存在下でCMP−Ne u 5Acと
そのNeu5Ac基をガラクトースの3−位に入れて、αNeu5Ac (2→
3)βGal (1−4)βG1cNAcを形成させるα(2→3)結合を形成
するように接触させることを含む。
次に、この化合物を適切なフコシルトランスフェラーゼの存在下てGDP−フコ
ースとフコース基をG1cNAC単位の4−位に入れて、crNeu5Ac (
2+3)βGa I (1−”4)[αFLJC(1−3)]βGlcNAC(
即ち、シアリルルイス1)を形成させるα(l→3)結合を形成するように接触
させることによってフコシル化を達成する。
上記の点に関しては、シアリルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラ
ーゼの使用が最も容易なシアリルルイス′の合成法を与える。それは、これらの
条件下ではシアリル化及びフコシル化はオリゴサツカリド構造の他の部位にある
反応性部分を、化学的合成では一般的である如きに保護/脱保護する必要がない
からである。
更に、シアリルトランスフェラーゼは、もしそれを用いなければアノマー特異性
に関して高収率で形成させるのが難しいα(2→3)結合を容易に形成する。
これに関し、この技術分野では、ある種特定の変性はβGal (1−4)βG
lcNAcのガラクトース構造の2−位及び3−位上のβGa1(1→3/4)
βG1cNAc α(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼによって耐性と
され得るが、ガラクトースの6−位におけるNeu5Ac又はデオキシ基の存在
はこの酵素によっては耐性とはされ得ないことが認められている。この技術分野
ではまた、βGa1(1−”4)βG1cNACジサッカリドのGlcNAc単
位上の2−NAc基の、赤道ヒドロキシル基による置換の結果として得られる化
合物はこの酵素の良好な受容体であるのに対して、GLcNAc上のNAc基の
軸性ヒドロキシル基による置換の結果として得られる化合物はこの酵素の受容体
ではないことも認められている129゜いずれにしても、この技術は、βGa1
(1−”4)βG1cNAcジサッカリド又はαNeu5Ac (243)βG
al (1−”4)βG I cNAc )リサッカリドのGLcNAc構造に
対する他の変性がβGa1(1→3/4)βGIcNAc1 α(l→3/4)
フコシルトランスフェラーゼによって耐性とされることがあっても、それが何で
あるかに関しては欠けている。
この技術分野ではまた、βQal(1→4)βGlcNAc α(l→3)フコ
シルトランスフェラーゼがガラクトース単位の2−及び3−位の変性を耐性とす
るが、ラクトース[βGa1(1→4)βGlc]を基質として受け入れないこ
とが認められている21゜予備的データーもこのフコシルトランスフェラーゼが
L−フコースを、末端ガラクトースの2゛−13゛−及び6′−位及びGLcN
Acの6−位においてサルフェート基で置換されたタイプII受容体に転移させ
ることが可能であることを示している@7゜
同様に、この技術分野においては、従来から、βGa1(1−3/4)βG I
cNAc a (2→3)シアリルトランスフェラーゼはNeu5AcをβG
a1.(1→4)[αFuc (1−3)]βG1cNAc−構造のガラクトー
ス単位のα(2→3)−位には転移させないが”、Neu5AcをβGa1(1
−4)[サツカリド(+−6)]βGIcNAc−構造のガラクトース単位のα
(2→3)−位には転移させる1ことが明らかにされているけれども、βGa1
(1−=4)βGIcNAc・タイプ11構造上の池の変性はβcal(1→3
/4)βGIcNAc α(2→3)シアリルトランスフェラーゼによって耐性
とされることがあっても、その変性が何であるかは知られていない。
この不確かな状態は、βGa1(1→3/4)βGlcNAc α(2→3)シ
アリルトランスフェラーゼを使用し、次いでβGa 1 (1→3/4)βG1
cNAcα(1→3/4)フコシルトランスフェラーゼ又はその他入手可能な許
容し得るトランスフェラーゼを使用することによってβGa1(1−=4)βG
IcNAc・タイプII構造を逐次的にシアリル化及びフコシル化することを期
待して、上記タイプII構造のガラクトース単位及び/又はN−アセチルグルコ
サミン単位を変性する合理的な方法を与えるのを困難にするものであった。
上記の技術状態に鑑み、免疫変調特性及び寛容特性を存すると共に、人工抗原に
対する抗原決定因子として使用してモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体
を生成させることができるだろう変性されたシアリルルイス1構造を開発するこ
とが特にを利なことであろう。これらの変性されたシアリルルイス8構造が、変
性されたβGa1(1−”4)βGIcNAc構造を適切なシアリルトランスフ
ェラーゼ及び適切なフコシルトランスフェラーゼにより逐次的にシアリル化及び
フコシル化することによって容易に製造することができるならば、これも更に存
利なことてあろう。
発明の概要
本発明は、一部は、本明細書に記載される変性されたシアリルルイス゛化合物が
生体内での抗原に対する細胞性免疫応答をその抗原からの後の対抗に対して耐性
を与えっつ変調し、そして人工抗原を製造してこれら構造に指向する抗体を産生
させることの両者において有用であると言う発見に関する。これに関し、(特に
マウスにおける)これら人工抗原に対抗して作り出されるモノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体はシアリルルイス1構造のヒト宿主における存在を測定す
るための診断上の検定法において有用である。更に、これら抗体は、抗体が病気
に罹った粒子(例えば、癌細胞)上のシアリルルイス1構造プの抗原構造を攻撃
するだろう病状に対する抗体療法において有用であるとも考えられる。
本発明はシアリルルイス8のガラクトース単位及び/又はN−アセチルグルコサ
ミン単位に対してなされた変性が、特定のシアリルトランスフェラーゼ及びフコ
シルトランスフェラーゼと適合性があり、このためこれら化合物のシアリル残基
及びフコシル残基が逐次的酵素法で容易に作られると言う更なる発見に関する。
具体的に述へると、βGa I (1→3/4)βGlcNAc α(2→3)
シアリルトランスフェラーゼはN−アセチルグルコサミン単位の2−及び6−位
に対して広範な変性を受け入れることができると共に、βGa1(l→4)βG
IcNAc・タイプ11構造のガラクトース単位の2−位の一部変性をも受け入
れることができ、また更にシアル酸をガラクトースの3−位に容易に転移させて
ガラク)・−スサソカリド上にα(2→3)結合を形成させることができること
がここに発見されたのである。同様に、βGa 1 (1−”3/4)βGIC
NACα(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼはN−アセチルグルコサミ
ン単位の6−位に対して広範な変性を、またそのアセチルグルコサミン単位の2
−位に対して一部変性を受け入れることができると共に、βGa1(1→4)β
G]cNAc・タイプ11構造のガラクトースサツカリドの2−位における非酸
素含有変性も受け入れることができ、また更にL−フコースを容易に転移させて
N−アセチルグルコサミン構造上にα(l→3)フコース残基を形成することが
できることがここに発見されたのである。
これらの発見の故に、本発明者はβGa1(1→3/4)βGIcNAc α(
2→3)シアリルトランスフェラーゼ及びβGa l (1→3/4)βG1c
NAcα(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼによって可能にされた変性
の重なりがN−アセドルグルコサミンの2−及び6−位とβGa1(1→4)β
G1cNAc・タイプ11構造のガラクトース単位の2−位における変性を可能
にし、そして更にそれぞれのトランスフェラーゼによる逐次的シアリル化とフコ
シル化を可能にすると結論したのである。
従って、本発明は、その組成面の1つの態様において、式I
て表される、哺乳動物における抗原に対する細胞性免疫応答を変調する際の使用
に適した化合物、及びその製剤上許容し1qる塩に関する。
たたし、上記の式において:
Rは水素、サツカリド、オリゴサツカリド又は少なくとも1個の炭素原子を有す
るアグリコンより成る群から選択され;
R1は水素、−NR2、−N、 、−NHSO3H,−NR,C(0)R@ 、
−N=C(R7)2、−NHCH(R7)、 、−N (R,)2、−0 (C
(0>)、R,、−3R,、フルオロ、クロロ、ブロモ及びサルフェートよりな
る群から選択され、ここで
場合によってヒドロキシ、クロロ、ブロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、
フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜
4個のアルコキシ、クロロ、ブロモ及びサルフエ−1・よりなる群から選択され
る1〜3個の置換基て置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2
個以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル、
アミノ酸残基又はポリペブチジル残基、−OR,。(ただし、R1゜は炭素原子
数1〜4個のアルキル、又はヒドロキシル基で置換された炭素原子数2〜4個の
アルキルである)、及び−NR,、R,2(たたし、R8及びR12は独立に水
素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択される)
よりなる群から選択され、
各R7は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され
、
R,は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され、
場合によってヒドロキシ、クロロ、ブロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、
フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜
4個のアルコキシ、クロロ、ブロモ及びサルフェートよりなる群から選択される
1〜3個の置換基で置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2個
以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル
よりなる群から選択され、そして
pは0又は1に等しい整数であり。
R1は水素、−Ns、−NH,、−NH3O,Hl−NR+sC(0)RIB、
N = C(R14)−1−NHCH(R,、)2、 N(Rli)z、−0
(C(0)) 、R,、、フルオロ、クロロ、ブロモ及びサルフェートよりなる
群から選択され、ただし
場合によってヒドロキシ、クロロ、ブロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ
よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子
数1〜4個のアルキル、
アミノ酸残基又はポリペブチジル残基、OR+□(ただし、R1□は炭素原子数
1〜4個のアルキル、又はヒドロキシ基で置換された炭素原子数2〜4個のアル
キルである)、及び
N R+sR+9(ただし、RIB及びR11は独立に水素及び炭素原子数1〜
4個のアルキルよりなる群から選択される)
よりなる群から選択され、
各RI4は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ
れ、
各R+sは独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ
れ、
RIBは
場合によってヒドロキシ、クロロ、ブロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ
よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子
数1〜4個のアルキル
よりなる群から選択され、そして
qは0又はlに等しい整数であり:
R8は水素、フルオロ及びヒドロキシよりなる群から選択され。
R4はシアリルであり:
R6はし一フコシルであり;そして
YはO,S、−NH−及び結合よりなる群から選択され;
ただし、R1がヒドロキシルであり、かっR2が−NHC(0)CH2であると
き、R3はヒドロキシルではなく、また
R、及びR2がヒドロキシルであるとき、R8はヒドロキシルではない。
式Iにおいて、R1はヒドロキシル、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、クロロ
、ブロモ又はフルオロであるのか好ましい。R7は−NH2、NHC(0)R+
)又は−N2であるのが好ましい。R2はヒドロキシルであるのが好ましい。
式Iの化合物は細胞性免疫炎症応答を変調するときに特に有用である。
本発明は、その組成面のもう1つの態様において、製剤上不活性なキャリアー及
び有効量の式Iの化合物を含んで成る、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与してそ
の哺乳動物における細胞性免疫応答を変調するのに適した製剤組成物に関する。
Rがキャリアーに結合することができるアグリコンであるとき、式Iの化合物は
人工抗原を製造する際にも有用である。従って、本発明は、その組成面の更にも
う1つの態様において、抗原性キャリアーに結合することができるアグリコン部
分を含有する式Iの化合物から製造される人工抗原に関する。
本発明は、その組成面の更にもう1つの態様において、式Iの化合物の製造にお
いて有用な新規な中間体に関する。
本発明は、その方法面の1つの態様において、細胞性免疫応答を変調するときに
存効な量の式Iの化合物を哺乳動物に投与することから成る、その哺乳動物にお
ける細胞性免疫応答を変調する方法に関する。
本発明は、その方法面のもう1つの態様において、次の
(a)式(]
(式中、R,R,、R,、R,及びYは前記で定義された通りである。)
の化合物を選択し。
(b)前記化合物をそのガラクトース部分の3位においてβGa 1 (1−3
/ 4)βG I cNAc a (2→3)シアリルトランスフェラーゼによ
りシアリル化してガラクトース単位の3−位においてシアリル残基をα(2→3
)シアリル結合に入れ:そして(C)工程(b)で製造された化合物をN−アセ
チルグルコサミン部分の3位においてβGa1(1→3/4)βGlcNAc
α(l→3/4)フコシルトランスフェラーセによりフコシル化してN−アセチ
ルグルコサミン単位上の3−位においてフルコシル残基をα(l→3)結合に入
れる
工程から成る、式Iの化合物の製造法に関する。
図面の簡単な説明
図1はN−アセチルグルコサミン単位の2−位に置換基を存するシアリルルイス
”類似体(化合物12b−d)のシアリルルイス8 (化合物l)及びそのシア
リルルイス1類似体を製造する際に使用される中間体(化合物11b−d)の構
造を説明ものである。
図2はAcがアセチルを表し、Bnがベンジルを表し、そしてRが−(CH2)
、Co、CH,を表す図1に記載されるシアリルルイス1類似体(12b−d)
の化学−酵素的合成の一般反応式を説明するものである。
図3はN−アセチルグルコサミン単位のC−2及び/又はC−6位において変性
されたシアリルルイス3類似体のもう1つ別の化学−酵素的合成を説明するもの
である。
図4及び5はシアリルルイス゛類似体を製造するときに使用される出発物質の合
成の一般反応式を説明するものである。
図6はN−アセチルグルコサミン単位のC−6位において変性されたシアリルル
イス1類似体の化学−酵素的合成の一般反応式を説明するものである。
図7はN−アセチルグルコサミン単位のC−2位において変性されたシアリルル
イス8類似体の全化学合成の一般反応式を説明するものである。
図8はG1cNAcサツカリド単位の6−アジド誘導体を製造するための一般反
応式を説明するものである。
図9は6−アルコキシ誘導体をGlcNAcサツカリド単位の6−位に導入する
ための一般反応式を説明する上記のように、本発明は、一部は、哺乳動物におい
て細胞性免疫応答の生体内変調に有用な新規なシアリルルイス1類似体の発見に
関する。更に、適切なアグリコンを採用すると、これらのシアリルルイス8類似
体はシアリルルイス8に対してモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を生
成させる人工抗原を製造するのにも使用することができる。
本発明は、更に、一部は、シアリルルイス1類似体の新規な合成法に関する。
しかし、本発明を更に詳細に検討する前に、まず次の用語についてその定義を与
えることとする。
定義
本明細書において使用されている次の用語は以下に与えられる定義を有する:
“哺乳動物における抗原に対する細胞性免疫応答”なる用語は、細胞−細胞間相
互作用によって仲介されるそのような哺乳動物の免疫応答を意味する。この用語
にはDTH応答等の対抗原−細胞性炎症応答のみならず、心筋梗塞形成、ウィル
ス誘発肺炎、ショック及び後遺症(例えば、多発性器官不全)、成人の呼吸困難
症候群、乾癖、関節炎等に由来する細胞性炎症応答が含まれる。
細胞性免疫応答は白血球仲介応答であるのが好ましい。
“シアリルルイス1“ (場合によっては、“SLe””と称される)なる用語
は、次の構造:を有するテトラサツカリドを意味する。シアリルルイス1の芯体
であるβGa1(1−”4)βGIcNAc構造は、血液型決定因子に対するそ
の関係の故に、“タイプ11構造”と称されることが多い。
“オリゴサツカリド”なる用語は、2〜約lθ個のサツカリド単位を有する炭水
化物構造を意味する。採用される個々のサツカリド単位は重要ではなく、例とし
て挙げると、グルコース、ガラクトース、N−アセチルグルコサミン、N−アセ
チルガラクトサミン、フコース、シアル酸、3−デオキシ−D、L−オクッロソ
ン酸等の天然及び合成の全誘導体かある。
本明細書に記載される全てのサツカリド単位は、それらのピラノース体として存
在していることに加えて、L体として存在しているフコースを除けば、それらの
0体としても?’F在している。
”シアル酸”又は“シアリル”なる用語は、CMP−誘導体としてβGa1(1
−3/4)βG]cNAcα(2→3)シアリルトランスフエラーゼと適合性が
ある、シアル酸及びその類似体の全天然構造を意味する。
これに関して、CMP−誘導体としてこのシアリルトランスフエララーゼを結合
させるようにこの酵素によって認識され、次いて前記式IIの化合物への転移に
利用できるようになるものであれば、いかなるシアル酸もシアリルトランスフエ
ララーゼと適合性があると言われる。
シアル酸の天然産構造には、例として挙げると、5−アセトアミド−3,5−ジ
デオキシ−D−グリセロ−D−がラクト−ノヌロピラノシロン酸(“Neu5A
c“)、N−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)及び9−0−アセチルノ
イラミン酸(Neu5,9ACx)がある。
今日まで知られている天然産シアル酸の完全なリストはシャウアーによって与え
られている3゜シアル酸の類似体とは、シアル酸の天然産構造の類似体を意味し
、これにはシアル酸単位が1個又は2個以上の官能基をそのような構造に導入し
、及び/又はそのような構造から除去するように化学的に変性されたものが含ま
れる。例えば、そのような変性は−OH官能基の除去、アミン官能基の導入、ハ
ロ官能基の導入等をもたらすことが可能である。
シアル酸のある種特定の類似体はこの技術分野で公知であって、例としては9−
アジド−Neu5Ac、9−アミツーNeu5Ac、9−デオキシ−Neu5A
c。
9−フルオロ−Neu5Ac、9−ブロモ−Neu5Ac、7−ゾオキシーNe
u5Ac17−ニピーNeu5Ac、7,8−ビス−エピ−Neu5Ac、4−
0−メチルーNeu5Ac、4−N−アセチル−Neu5Ac。
4,7−シーゾオキシーNeu5Ac、4−才キソーNeu5Ac並びにNeu
5Acの6−チオ類似体がある。
シアル酸の類似体を記述するときに本明細書で採用された命名法はロイター等が
記載する通りである33゜シアル酸のCMP−ヌクレオチド誘導体は、天然産シ
アル酸又はその類似体のシチジン−5゛ −モノホスフェート誘導体を意味する
。シアル酸がNeu5Acである場合、CMP誘導体は式:
“フコース”又は“フコシル”なる用語は、GDP−誘導体としてβGa1(1
→3/4)βGIcNAcα(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼと適合
性があるし一フコース及びその類似体s5を意味する。以下に記されるように、
このフコシルトランスフェラーゼはヒトの乳から容易に単離される22゜更に、
これらのフコース又はフコシル化合物は適切な特異性を有する他のフコシルトラ
ンスフェラーゼ、例えばクローンされたフコシルトランスフェラーゼと適合性が
あると考えられる上記の点に関して、GDP−誘導体として、βGa1(1→3
/4)βG1cNAc α(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼに結合さ
せるようにこの酵素によって認識され、次いで式III :
(式中、R4はシアリル又は水素である。)の化合物への転移に利用できるよう
になるものであれば、いかなるフコース化合物もこのフコシルトランスフェラー
ゼと適合性があると言われる。
フコースの類似体とはフコースの天然産及び合成の類似体を意味し、それにはフ
コース単位が1個又は2個以上の官能基をこの構造に導入し、及び/又はその構
造から除去するように化学的に変性されたものが含まれる。
例えば、そのような変性は−OH官能基の除去、アミン官能基の導入、ハロ官能
基の導入等をもたらすことが可能である。
フコースのある種特定の適合性類似体はこの技術分野で公知であって、例として
は3−デオキシ−フコース、アラビノース等がある55゜
フコースのGDP−誘導体は式:
を有するグアノシン 5′−(β−L−フコピラノシル)ジホスフェート及びそ
の何等かのそして全ての適合性塩を意味する。GDP−フコースの製造法はこの
技術分野で公知である。しかし、GDP−フコースは、ジアング等34が本明細
書で全体が引用、参照される米国特許出願第07/848.223号明細書に記
載する方法で製造するのが好ましい。
グアノシン 5° −(β−L−フコピラノシル)ジホスフェートについて使用
される通り、“適合性塩″なる用語は、対イオン(即ち、カチオン)を容易に形
成し、かつ意図した反応及び/又は精製に適合性があるグアノシン 5′ −(
β−L−フコピラノシル)ジホスフェートのそのような塩を意味する。適当な適
合性の塩に、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、ア
ンモニウム、モノ−、ジー、トリー又はテトラ−アルキルアンモニウム、鉄、亜
鉛等のような対イオンから製造されたものがある。
“アミノ酸残基又はポリペブチジル残基”なる用語1よ、適切な形のアミノ酸又
はポリペプチドを式Iのオリゴサツカリドグリコシドと、又は図1のオリゴサツ
カリドグリコンドを製造するのに用いられ、そしてそのGlcNAc単位の2−
又は6−位にアミン官能基(NH2)を存する中間体と、そのアミンが上記アミ
ノ酸又はポリペプチド上のカルボキシル基又は活性化されたカルボキシル基と反
応してアミド結合を形成する条件下で反応させることによって得られる生成物を
意味する。使用される個々のアミノ酸又はポリペプチドは重要ではない。しかし
、好ましい態様において、ポリペプチドは約2〜約5個、好ましくは約2〜3個
のアミノ酸を含有するものである。
“製剤上許容し得る塩”なる用語には、この技術分野で周知である種々の有機及
び無機の対温から誘導される、式Iの化合物の製剤上許容し得る付加塩が包含さ
れ、それには、例として示すだけであるが、ナトリウム、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等がある。
“除去可能な11鎖基(blocking group) ”なる用語は、ガラ
クトース、N−アセチルグルコサミンの1個又は2個以上のヒドロキシル基に結
合されると、シアリルルイス8部分のシアル酸(カルボン酸部分のヒドロキシル
基を含む)東位及び/叉はフコース単位がこれらのヒドロキシル基において反応
か起こるのを妨げ、そして保護基が慣用の化学的工程又は酵素的工程で除去され
てヒドロキシル基を再生することができる任意の基を意味する。
採用される個々の除去可能な封鎖基は重要ではなく、そして好ましい除去可能な
ヒドロキシル封鎖基は通常の置換基、例えばヘンジル、アセチル、クロロアセチ
ル、ベンジリジン、t−ブチルジフェニルシリル及びヒドロキシル官能基に酵素
的にか、又は化学的に導入可能で、かつ後に生成物の性質に適合した温和な条件
下で酵素的方法又は化学的方法で選択的に除去可能な他の任意の基を包含する。
1つのそのような追加の意図された封鎖基はα−ガラクトンダーセで酵素的に除
去することができるα−ガラクトースである。
“少なくとも1個の炭素原子を有するアグリコン”なる用8hは、少なくとも1
個の炭素原子を有する非サツカリド含有残基を意味する。アグリコンは−(A)
−Zより成る群から選択される。ただし、上記式中のAは結合、炭素原子数2〜
10個のアルキレン基及び−(CH2−CR20G )−−なる形の部分(たた
し、nは1〜5に等しい整数であり、R2oは水素、メチル又はエチルより成る
群から選択され、そしてGは水素、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素、フェニル、並
びにアミン、ヒドロキシル、ハロ、炭素原子数1〜4個のアルキル及び炭素原子
数1〜4個のアルコキシより成る群から選択される1〜3個の置換基で置換され
たフェニルより成る群から選択される)を表し、そしてZは水素、メチルフェニ
ル及びニトロフェニルより成る群から選択され、またGが酸素、硫黄又は窒素で
はなく、かつAが結合ではないとき、Zは一0H1−3H1−NH2、−NHR
,□、 N(R21L、−C(0)OH1−C(0) 0R21、−C(0)N
H−NH2、−C(0)NH2,−C(0)NHR2,、−C(0) N (R
2,)2及び−0R2□(ただし、各R21は独立に炭素原子数1〜4個のアル
キルであり、そしてR72は炭素原子数3〜10個のアルケニル基である)より
成る群からも選択される。
アルファーンアリル化されたオリゴサツカリドグリコントを人工コンンユゲ−1
・の製造に用いると、アグリコン、即ちRはキャリアーに結合させることができ
る基のR23となる。R23は、好ましくは、−(A) −Z’ より成る群か
ら選択される。ただし、上記式中のAは炭素原子数2〜IO個のアルキレン基及
び−(CH2−CR,4G)。−なる形の部分(ただし、nは1〜5に等しい整
数であり、R24は水素、メチル又はエチルより成る群から選択され、モしてG
は水素、酸素、硫黄、窒素、フェニル、並びにアミン、ヒドロキシル、ハロ、炭
素原子数1〜4個のアルキル及び炭素原子数1〜4個のアルコキシより成る群か
ら選択される1〜3個の置換基で置換されたフェニルより成る群から選択される
)より成る群から選択され、そしてZoは水素及びニトロフェニルより成る群か
ら選択され、またGが酸素、硫黄又は窒素でないとき、Zo は−0H1−3H
1−NH2、−NHR,、、−C(0)OH1−C(0) 0Rts、−C(0
)NHN11□及び−OR2g(たたし、各R2,は独立に炭素原子数1〜4個
のアルキルであり、そしてR2,は炭素原子数3〜IO個のアルケニル基である
)より成る群からも選択され、たたしAが結合であるとき、Zoは水素ではない
。
このような場合、基−(A)−Z’ はキャリアーに結合させることかできる基
を表すか、又はキャリアーに結合させることかできる基に誘導体化することかで
きる基である。適切なキャリアーを選択することが免疫原性特性を高めるときに
有用である。
無数のアグリコンかこの技術分野で知られている。例えは、パラーニl−ロフェ
ニル基を含む結合腕(即ち、−YR−−QC,H4pNO2)かエフバーブ等に
よって明らかにされている11゜合成中の適切な時間に、そのニトロ基はN−)
リフルオロアセトアミドとして保護することかできるアミノ基に還元される。支
持体にカップリングさせる前に、そのトリフルオロアセトアミされ、それによっ
てマスクが取れてアミノ基が現れる。
硫黄を含有する結合腕はダーメン等によって明らかにされているI2。1体的に
述へると、この結合腕は、請求核基との置換反応において種々の末端官能基、例
えば−OCH2(l(2SCH2Co2CH.及び−OCH。
CH2 SC6 Hl−1)NH2を有する結合腕をもたらすことが示されてい
る2−ブロモエチル基から誘導される。
ラナ等s3はトリフルオロアセトアミド保護基を除去するとマスクが取れてカッ
プリングに使用される第一アミノ基を現出させることかできる6−ドリフルオロ
アセトアミトーヘキシル結合腕( 0 (CH2)@ NHCOCF.)を開示
している。
公知の結合腕の他の例を挙げるど、7−メドキシカルポニルー3.6−ジオキサ
へブチル結合腕84(−0CH2−CH2)2 0CH2Co.CH.); 2
−(4−メトキシ力ルポニルブタンカルポキサミト)エチルs5(−0CH2C
H2NHC (0)(CH2)4 CotCHa);適切なモノマーとのラジカ
ル共重合によってコポリマーをもたらすアリル結合腕”(OCH2CH=CH2
)+[−0 (CH2 CH2 0)2CH2CH=CH2 ]として知られる
他のアリル結合腕I7かある。更に、アリル結合腕は2−アミノエタンチオール
の存在下で誘導体化して1結合腕−OCH2 CHz CH2 SCH.CH。
NH2を与えることができる。
更に、ラトクリッフエ等23によって示されるように、基Rは還元性の糖末端基
の所に結合腕を有する追加のサツカリド又はオリゴサツカリドであることができ
る。
アグリコン部分は、好ましくは、疎水性基であり、そして最も好ましくは−(C
H.)s COOCH. 、−(CH2)、OCH2CH=CH2及び−(CH
2)。
CH20Hより成る群から選択される疎水性基である。
特に、疎水性基、最も特別には基−(CH,)、COOCH3又は−(CH,)
a 0CH2CH=CH,又は−(CH2)、CH,OHの使用がこのシアリル
トランスフェラーゼによりシアル酸を転移させるために受容体特性をある程度向
上させることができる。
キャリアーは、蛍光標識、放射性標識、ビオチン又は光可変性結合腕或いは被標
的部分に対する結合を含む低分子量又は高分子量の非免疫原性又は抗原性のキャ
リアーである。キャリアーは抗原性キャリアーである方が好ましく、従って人工
コンジュゲートは人工抗原である。
場合によっては、非免疫原性キャリアーを用いるのが有利である。
他方、キャリアーは低分子量キャリアー、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチ
レンジアミン、トリス(2−アミノエチル)アミン、L−リシルリシン、ポリー
L−リシン及び様々の分子量を有するポリマーであることができる。
“抗原性キャリアー”なる用語は式■(ただし、R=R23)のオリゴサツカリ
ドグリコシドのキャリアーに対する結合を可能にし、そして特定のキャリアーが
内因性でない動物に注射したとき抗原応答を生む1種又は2種以上の官能基を存
するキャリアーを意味する。このようなキャリアーは蛋白質[例えば、ウシの血
清アルブミン(BSA)、ヒトの血清アルブミン(H3A) 、ジフテリア又は
破傷風のトキソイド、S一層等]であることができ、そして本明細書において、
これらキャリアーは、場合によって、“Ag”なる略号で称される。
人工抗原を製造する際に使用するために選択される個々の抗原性キャリアーは、
もしキャリアーがそのようなオリゴサツカリドグリコシドのキャリアーに対する
結合を可能にする1種又は2種以上の官能基を含有するか、又は含有するように
誘導体化することができるならば、重要ではない。適当な官能基に、例としてで
あるが、カルホン酸基、アミン基(第一アミン及び第二アミンを含む)、ヒドロ
キシル基、チオ基等がある。このような官能基は一般に抗原性キャリアー上に見
いだされ(例えば、蛋白質は無数のそのような官能基を存する)、及び/又はそ
のようなキャリアーにこの技術分野で認められている方法で導入することができ
る。
式Iのオリゴサツカリドグルコシドの1種又は2種以上の抗原性キャリアーに対
するカップリングで本明細書において“人工抗原”と記載される生成物がもたら
される。これは、この人工抗原が動物に注射されると1種又は2種以上の天然産
オリゴサツカリドグルコシドの決定因子を有することとなるからである。こうし
て製造される人工抗原は式。
[オリゴサツカリド−Y Rz*]−Agて表すのが好ましい。たたし、式中の
オリゴサツカリド−Yは前記式Iの化合物(ただし、RはRoである)を表し、
Agは上記定義の通りであり、そしてpは少なくともlに等しい整数である。こ
の態様において、人工抗原Agはアグリコン基、即ち基R23上の相補性官能基
にカンブリングする抗原上の官能基を介してオリゴサツカリドグルコシドに結合
されている。
“抗体“なる用語は表面上に、又は他の分子に特定的に結合し、そのためにその
分子の特定の空間的及び極性上の組織と相補性であると定義されるキャビティー
の中に1つの領域を有する免疫グロブリン又はその誘導体を意味する。抗体はモ
ノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよく、そし
てこれはこの技術分野で周知の方法で、例えば宿主の免疫化及び血清の採集又は
雑種細胞系統技術て製造することができる。
これに関して、上記の人工抗原は、シアリルルイス′決定因子を含めて抗原上の
抗原決定因子を認識し、かつそれに相補性であり、しかも天然物質と交叉反応す
る抗体を生成させるときに有用である。
“天然物質”なる用語は、物質が1種又は2種以上のシアリルルイス8類似体を
含有し、かつ物質が病気に罹っている哺乳動物において非免疫原性であるか、又
は弱い免疫原性である、定義された病状と関連している天然産物質(例えは、腫
瘍関連炭水化物抗原)を意味する。
B 方法論
前記のように、本発明は、一部は、抗原に対する細胞性免疫応答を変調すること
と、抗体生成用の人工抗原を提供することの両者において有用なシアリルルイス
°の新規な類似体に関する。シアリルルイス8のこれらの新規な類似体は図面に
記載される種々の合成経路で製造することができる。
1つの好ましい態様において、式Iに記載されるシアリルルイス8の類似体はN
−アセチルグルコサミン単位の2−及び/又は6−位において、及び/又はガラ
クトース単位の2−位において誘導体化されたβGa1(1→4)βGlcNA
c−OR骨格をまず合成することによって製造される。この骨格は次にβGa1
(1→3/4)βGIcNAc α(2→3)シアリルトランスフェラーゼ及び
βGa I (1−”3/4)βGIcNAcα(l→3/4)フコンルトラン
スフェラーゼを用いて逐次的にシアリル化及びフコシル化される。
このようなシアリルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフエラーセの使用
はシアリル基及び/又はフコシル基の上に変性を有するものを含めてシアリルル
イス1類似体を容易に合成させる。例えば、これらのトランスフェラーゼを使用
すると、Neu5Ac又はその類似体の骨格構造への転移のみならず、フコース
及びその類縁体のこの骨格構造への転移も可能となる。
しかし、全化学的合成に頼る方法や一部だけ酵素的合成に頼る方法を含めてこれ
ら化合物を製造する別法かある。今度は、シアリルルイス0類似体又はその中間
体の製造のための図2〜9に示される一般反応式を更に詳細に議論する。
シアリルルイス6類似体が人工抗原を製造するために使用されるべき場合、これ
らの類似体を抗原キャリアーにカップリングさせ、次いで適切な動物に注射して
抗体を生成させる。
B1.N−アセチルグルコサミンのC−2又はC−6位において変性されている
シアリル
ルイス8テトラサツカリドの化学−酵素的合成図2に示されるトリサツカリド4
は公知の化合物であって、ラトクリッフェ等によって明らかにされている3s0
この化合物を次にこの技術分野で周知の慣用工程で誘導体化して図1に記載され
るトリサツカリドllb、11C及びlidを与える。
具体的に述へると、トリサツカリド4のベンジルエステル(−COOBn)の、
炭素担持5%パラジウム(Pd/C)の存在下、酢酸エチル(CH= CO2C
2Hs )中ての大気圧における水素化(R2)とそれに続くメタノール中ナト
リウムメトキシド(CHs ONa、CHs OH)による脱0−アセチル化で
トリサツカリドIlbが得られた。2−アジド基を不変のままにして置(ために
この第一工程では溶剤として酢酸エチルの使用が推奨される。この工程では非常
に少量の、慣用の分離技術(例えば、クロマトグラフィー)で分離することがで
きる不純物しか形成されない。
別に、トリサツカリド4の2−アシド基の、ピリジン、水及びトリエチルアミン
の混合物中ての硫化水素(H,S)による還元で2−アミノトリサツカリド9が
得られた。上記ベンジルエステル(−COOBn)の還元とそれに続く脱0−ア
セチル化(上記)でトリサツカリドllcがもたらされる。
トリサツカリドlidはまずトリサツカリド9のN−プロピオニル化をメタノー
ル(CH,OH)で無水プロピオン酸[(CHI GH,Co)to]を使用し
て実施し、トリサツカリドlOを与えることによって製造される。
トリサツカリドIOには慣用の分離技術(例えば、クロマトグラフィー)で分離
することができる少量の対応する3−0−プロピオニル化物質が随伴していた。
前記のようにアシル保護基及びベンジル保護基を除去すると、トリサツカリドl
idが得られた。
トリサツカリドIlcも−NHC(0)R+i、−NH3O3Hl N = C
(R14)!、 N HCH(R14)!、−N(R16)!及びアミノ酸残基
誘導体又はポリペブチジル残基誘導体を与える常用の方法で誘導体化することが
できる。例えば、−NH,基は慣用技術を用いて次の化合物と反応させることが
できるニ
ーカルホン酸、酸無水物又は酸クロリド;これは前記基−NR2との反応てアミ
ドを与える(例えば、トリサツカリド7dのプロピオン酸アミドの形成による)
;別法として、所望とされる酸を、イナズ等が報告するように72活性化し、次
いてアミノ基と反応させることができる;このカルボン酸、酸無水物、酸クロリ
ド又は活性化された酸は水素、又は場合によってヒドロキシ、クロロ、ブロモ及
び炭素原子数1〜4個のアルコキシより成る群から選択される1種又は2種以上
の置換基(好ましくは1種又は2種の置換基)で置換された炭素原子数1〜4個
のアルキルである基R13(即ち、置換基−NHC(0)R13の一部としての
基)を与えるように選択される。
一ボダンスツキー等によって報告されている71、酸基の所で活性化されている
適当な形のアミノ酸部分又はポリペプチド部分。
一アルデヒド又はケトン(炭素原子数1〜4個):これらは前記基−NR2との
制御されたpHにおける反応で、還元すると(例えは、シアノ硼水素化ナトリウ
ムにより)ハーノータス等が報告する73アルキルアミン置換基[即ち、−NH
CH(R,、)2]を与えるイミン[−N二C(R,、)2]を形成する;
一つオーレンハーグ等73によって米国特許第4,612.132号明細書に報
告される、前記アミンと反応すると開環して、アルキレンが炭素原子数2〜4個
のものであるHO−アルキレン−〇C(0)NH−置換基を有するカルバメート
基を形成するエチレンカーボネート又はブロビレンカーホネートのような環式カ
ーボネート;−クロロホルメート(即ぢ、CI C(0) OR+、) :これ
は、グレーグ等によって開示されるように69反応せしめられる。この場合、ク
ロロホルメートは炭素原子数1〜4個のアルキルである基R17を有するニー活
性化された中間体をもたらO=C(OC@ H4−1)No□)2 、その中間
体は、ビーカルスカーパートフセヒッツ等が記載するように70、次いでアミン
(HNR、、R、、)と反応して尿素[−NHC(0)N R++R+*]を与
える;
−トリメチルアミン、三酸化硫黄(So、);これらは前記アミンと、ペチトー
76が記載するように基−NHSO3Hを形成するように反応せしめられる;及
び
一誘導体化された蟻酸又はその他の物質、これらは前記アミンとの反応によって
ホルムアミド(−NH−CHO)74を形成し、これは更にイソシアノ(−N=
C=0)に官能化され、そして水素化トリブチル錫(B u tSnH)74に
よりデオキシ誘導体に還元される。
トリサツカリドflb、Ilc及びlid並びにそれらトリサツカリドに由来す
る誘導体は次にその適切なトリサツカリドをβGa1(1→3/4)βGIcN
Acα(1−3/4)フコシルトランスフェラーゼとGDP−フコースの存在下
で、シアリルルイス1の類似体であるテトラサツカリド12b、12c及び12
dを与えるように接触させることによってフコシル化される。
図3は適切に誘導体化されたβQal(1→4)βGlcNAc構造からこの構
造の逐次酵素的シアリル化とフコシル化によって本発明のシアリルルイス1類似
体を製造する一般反応式を説明するものである。図3はN−アセチルグルコサミ
ン(G I cNAc)構造の2−又は6−位における変性を説明しているだけ
である。しかし、これらの変性はN−アセチルグルコサミンの2−及び6−位の
両位置において変性させるべ(組み合わせ得ることが分かる。図3はガラクトー
スの2−位にあるヒドロキシル基だけを説明しているが、この位置は水素又はフ
ルオロで置換されていてもよいことも更に分かる。このような置換ガラクトース
化合物はこの技術分野で公知である。これらガラクトース化合物の図3に示され
る諸反応での置換はシアリルルイス8類似体にこれら変性ガラクトース単位をも
たらす。
酵素的シアリル化
図3において、シアリル化はβGa1(1→3/4)βG]cNAc α(2→
3)シアリルトランスフェラーゼ[即ち、βGa1(1→3/4)βG1cNA
cα(2−3)ST]の使用によって達成される。α−シアル(2−3)βGa
lを形成するガラクトースの3−位へのシアル酸の酵素的転移はそのヌクレオチ
ド(CMP)誘導体・\の前合成(即ち、活性化)を必要とする。
シアル酸の活性化は、通常、容易に入手てきる酵素CMP−ノアル酸シンターセ
を使用することによって行われ、そして文献はシアル酸の種々の類似体、例えば
9−置換Neu5Ac36373s” 、7−ニビーNeu5Ac”、7.8−
ヒス−エピ−Neu5Ac4t、4−0−メチル−Neu5Ac42.4−デオ
キシ−Neu5Ac”、4−アセトアミド−Neu5Ac”、7−ジオキシ−N
eu5Ac”、4.7−シブオキシ−Neu5Ac40、Ne u 5Acの6
−千オ誘導体4′及びNeu50H(KDN)の活性化の例を与えている。
得られたCMP−シアル酸類似体(これは図3においてNeu5AcのCMP誘
導体、即ちCMP−Neu5Acとして説明されている)は次にβGa1(1→
3/4)βG1cNAc α(2→3)シアリルトランスフェラーゼの存在下、
シアル酸がガラクトースの3−位に転移されてαNeu5Ac (2−+3)β
Gal結合を形成する条件下で、誘導体化βGa1(1→4)βGlcNAc−
OR化合物と結合される。この技術分野で公知の適当な条件は、適切な緩衝液、
例えば0.1 Mナトリウム力コジレート(sodium cagodylat
e)中、適切なpHと温度の条件、例えばp)16.5〜7.5及び温度25〜
45℃、好ましくは35〜40℃での上記誘導体化βGa1(1→4)βGIc
NAc−OR化合物と上記CMP−シアル酸との混合物に対するシアリルトラン
スフェラーゼの付加を含み、そのとき同時に12時間乃至4日間のインキュベー
ションか行われる。得られたシアリル化生成物はこれを単離し、HPLC、イオ
ン交換−、ゲル−1逆相−又は吸着クロマトグラフィーから成る慣用の方法を用
いて精製することができる。
上記の点に関して、βGa1(1→3/4)βGlcNAc α(2→3)シア
リルトランスフェラーゼにより、βGa1(1−”4)βGIcNAcfl造の
G1cNAc基の3−位におけるα−フコース基の置換はNeu5Acの末端が
ラクト−スへの転移を妨げることが示されている。他方、βGa1(1→4)β
G1cNAc構造のG]cNAc基の6−位におけるサツカリドの置換はNe
u 5Acのこのシアリルトランスフェラーゼによる末端ガラクトースへの転移
を可能にすると報告されている1゜検定の諸反応において、ラットの肝臓からの
親和性精製されたβGa I (1→3/4)βG1cNAcα(2→3)シア
リルトランスフェラーゼは、シアル酸をβGa1(1−4)βG]cNAcのG
IcNAc単位の2−位(R2)又は6−位(R3)において変性されたガラク
トース(化合物22b、c、d ; 15b、g)の3−位に効率的に転移させ
ることがここに見いだされた。
これらの検定は実施例に記載されるが、これら検定反応の結果を以下の表1に示
す。
表I
βGa I (1−3/4)βGIcNAc (2(2表Iに示されるデーター
はG]cNAcの2−又は6−位において変性されているβGa1(1→4)β
GlcNAc−OR構造の誘導体はガラクトース単位の3−位においてシアル酸
を受容し、かつシアル酸基をガラクトースのα(2→3)位に入れるようにこの
シアリルトランスフェラーゼにより活性化されることを示している。
二のデーターは更に、場合によってはシアル酸の変性βGal (1−4)βG
I c N A c構造−\の転移の相対速度は未変性の構造のそれよりも驚
くほど高いことを示している。
酵素的フコシル化
図3において、フコツル化はβGa1(1→3/4)βG1cNAc α(l→
3/4)フコシルトランスフェラーゼ[即ち、βGa1(1−3/4)βGlc
NACα(l→3/4)FT]の使用によって達成される。
aFuc (1−+3)βGlcNAcを形成するGIcNAcの3−位へのフ
コースの酵素的転移はそのヌクレオチド(GDP)誘導体の前合成を必要とする
。GDP−フコースの合成はジアング等が記載し34、そして後記の実施例にお
いて実証されるようにして達成するのが好ましい。
GDP−フコース(GDP−Fuc)は次に、βGa1(1→3/4)βGIc
NAc α(l→3/4)フコシルトランスフェラーゼの存在下、フコースがシ
アリル化されたβGal (1→4)βG1cNAc−OR化合物のGIcNA
c単位の3−位に転移してβGa1(l→4)βGIcNAc骨格において誘導
体化されたαNeu5Ac (2−”3)βGal (1→4)[cr’Fuc
(l→3)]βGIcNAc−OR化合物(シアル酸かαNe u 5Acであ
る場合)を形成する条件下で、そのシアリル化βGa1(1→4)βGIcNA
c−OR化合物と結合せしめられる。この技術分野て公知の適当な条件は、適切
な緩衝液、例えば50mMカコジル酸ナトリウム中、適切なpHと温度の条件、
例えばpH6,5及び温度30〜45°C1好ましくは35〜40°Cでの上記
誘導体化αNeu5Ac (2→3)βGa1(1→4)βGl cNAc−O
R化合物(シアル酸がαNeu5Acである場合)と上記GDP−フコースとの
混合物に対するフコシルトランスフェラーゼの付加を含み、そのとき同時に12
時間乃至4日間のインキュベーションが行われる。得られたシアリル化及びフコ
シル化された生成物はこれを単離し、HPLC、イオン交換−、ゲル−1逆相−
又は吸着−クロマトグラフィーを含む慣用の方法を用いて精製することができる
。
トリサツカリドl1b−dの場合、これらトリサツカリドの予備フコシル化をパ
ルシック等!2に従って行った。
生成物はその文献に記載されるように精製した。トリサツカリド1lb−dの構
造は300 MHzでの’H−n。
m、r、により(表!I)、また得られたシアリルルイス1化合物+2b−dの
構造は500 MHzでの’H−n。
m、r、により(表II)以下の通り確認した。
aNeu5Ac (2→3) βGa1(1−4) βG1cNAc−OR又は
βGa1(1−”4)βG1cNAc−ORのN−アセチルグルコサミンの2−
文は6−位の変性に起因して起こるN−アセチルグルコサミンの4−位における
酵素的フコシル化に対する効果を確認するために、化合物11a、llb、ll
c及びlid並びに化合物15gのフコシル化の相対速度を分析した。これに関
して、化合物15gはパルシック等の手法■に従って合成した。
ヒトの乳に由来するβGa1(1→3/4)βGlcNAc α(l→3/4)
フコシルトランスフェラーゼによるし一フコースの化合物11a−d及び15g
への相対転移速度を2mMの受容体濃度においてパルシック等22に従って測定
した。これらの検定は実施例において説明されている。これら検定反応の結果を
以下の表IIIに要約して示す:
表111
ヒトの乳から単離されたフコシル
上記のデーターは、タイプII構造[βGa1(1→4)βG l cNAc]
のGlcNAcの2−及び6−位における変性はβGa ] (1−”3/4)
βGlcNAcα(1→3/4)フコシルトランスフェラーゼ(こよって受け入
れられることを証明している。加えて、末端ガラクトースの6−位に遊離ヒドロ
キシル基か必要なこと(よ以前から報告されている47oシかし、L−フコース
(よこのβ−ガラクトースの2−13−及び4−位におけるOHか、例えは特定
の糖単位によって置換され、これらの位置に結合されている場合にタイプII構
造の誘導体(こ転移させることができる。このことは、このフコシルトランスフ
ェラーゼを使用すると置換が末端β−ガラクトースの2−及び3−位、そして多
分4−位のヒドロキシルにおいて可能であることを示している。
更に、GlcNAcのC−2位置において変性されたシアリル化トリサツカリド
は対応するアシアロ(asialo)−ジサッカリドよりこのフコシルトランス
フェラーゼに対する蔦くほど良好な受容体である。
しかして、誘導体化されたβGaJ(1→4)βG1cNAc構造のG1cNA
c単位の3−位へのし一フコースの転移に対してこのフコシルトランスフェラー
ゼにより必要とされる三次元トポグラフィ−は(1)ガラクトース単位上には6
−ヒドロキシル基を、またGlcNAc上には3−ヒドロキシル基を含むことで
ある。βcal(1−3/4)βG]cNAc (Z(1−3/4)フコシルト
ランスフェラーゼ又は他の起源に由来する同様のフコシルトランスフェラーゼの
βGa1(1→4)βGIcNAcジサッカリドに対する特異性のこの知識は合
成目的に対する変化し易い酵素の作用性を劇的に高める。
従って、表1−111のデーターは、これらを合わせると、GlcNAcの2−
及び/又は6−位において変性されたβGa1(1−”4)βG 1 cNAc
−ORへのシアル酸とL−フコースの逐次酵素的転移は、未変性の(天然)構造
の場合のように進行することを証明している。従って、βGa1(1−”4)β
GIcNAcのGlcNAc単位の2−及び6−位における化学的変性はシアリ
ルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼの基質である化合物をも
たらすだろう。
以下に示されるように、GIcNAc単位の2−及び/又は6−位において変性
されたシアリルルイス8類似体もこれら化合物の全化学的合成によって製造する
ことができる。
図4はサツカリドモノマーを最初とする出発物質βcal(1→4)βG]cN
Acの特定のジサッカリド誘導体の化学合成を説明するものである。これに関し
、ガラクト−ス単位とGIcNAc単位との化学的カップリングではβGa I
(1−=3)βG1cNAc(タイプI骨烙)とβGa I (1→4)βG
IcNAc(タイプII骨格)の両者か形成され、この両者は慣用の精製技術(
即ち、クロマトグラフィー)で分離することができる。
具体的に述へると、図4において、公知36の2−アジド化合fjJ+6はその
6−位において除去可能な保護基(即ち、S l (Cs H6)2 t B
u)て慣用技術ff6により保護される。この誘導体17は次にガラクトースの
完全にアノル化された誘導体18とトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホ
ネート(TMSOTf)の存在下で結合せしめられる。その後、回収された生成
物を別個の工程でテトラヒドロフラン中において塩化アンモニウム(NH,CI
)、弗化カリウム(KF)を用いて処理する。この反応でβGa1(1−=3)
βGIcNs−OR誘導体及びβGa1(1−”4)βGIcN* OR誘導体
19及び21の混合物が生成し、これら両誘導体をクロマトグラフィー等の慣用
の方法で分離する。
誘導体21を次にナトリウムメトキシドのメタノール中混合物(CH= ON
a / CH* OH)を用いて脱保護して誘導体22bを得る。この誘導体2
2bは、トリサツカリドllc及びlldについて前記された同様の手法を遂行
すると、そのアミン誘導体22cか又はそのプロピオネート(P r)誘導体2
2dのいずれかに転化させることができる。
別法として、誘導体21はこれを慣用技術でトシル化してGIcNz誘導体の6
−位にトシル基を与えることができる。このトシル誘導体は次に適切な核試薬を
使用する置換反応により6−ハロ置換基を形成するのに用いることかできる。誘
導体21はビス−トリブチル錫オキシドの存在下でのハロゲン化アルキルによる
アルキル化で6−アルコキシ置換基に転化させることができる。
更に、図4には示されないか、ツルンテツ等が記載する合成反応式74と同様の
合成反応式を用いると、2−デオキシ(R,=H)誘導体及び2−アルコキシグ
ルコース誘導体か製造される。具体的に述へると、グルコースの公知の3.4.
6−)リアシル化1.2−オルトエステルを常用の条件下で脱アシル化してグル
コースの1゜2−オルトエステルを得る。この化合物を次に慣用技術を用いてグ
ルコースの3.4.6−1−リベンジル l。
2−オルトエステルに転化させる。得られた化合物のこのI、2−オルトエステ
ルを次に慣用技術により開環させて、保護されたグリコジル供与体、例えばグル
コースの1α−ブロモ−2−アセチル−3,4,6−1−リベンジル誘導体を得
る。このlα−ブロモ誘導体を次に慣用技術でグリコシド(−OR)に転化させ
、次いでその2−アセチル基を除去する。この2−位は今や慣用法、例えばまず
1当量の塩基の存在下で二硫化炭素及び沃化メチルで処理して−C(S)SCH
,誘導体を形成し、続いて水素化トリブチル錫と反応させることによって封鎖さ
れた2−デオキシを形成させることができるようになっているか、又は封鎖され
た2−アルコキシを製造することができるようになっている。その封鎖基は慣用
技術で除去される。
図5は6−デオキシβGa l (1−”4)Gl cNAc−OR1即ち化合
物15b及び6−ブロモβGa1(1−4)G ] cNAc−OR1即ち化合
物15aの合成を説明するものである。6−デオキシ化合物15bは、除去可能
なヘンジイル封鎖基(Bz)で3−ヒドロキシ位において無水安息香酸とのピリ
ジン中ての反応により保護されている、ベンジリデン環が封鎖された公知のサツ
カリド(8−メトキシカルボニルオクチル 2−アセトアミド−4,6−0−ベ
ンジリデン−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド) 61から合成される
。上記化合物を四塩化炭素(CCV、)中、65°CにおいてN−ブロモスクシ
ンイミド及び炭酸バリウムと反応させることによって更に転化させると、それは
3.4−ジベンゾイル−6−ブロモ−GIcNAc化合物となる。この化合物は
、順次、AIBN(アブビスイソブチロニトリル)の存在下、70〜90°Cに
おけ6 (C4Hs)s SnHトc7)反応、続いてメタノール/ナトリウム
メトキシドによる処理によって6−ジオキシ−GIcNAcに転化せしめられる
。得られた6−ゾオキシーG1cNAcグリコシドを1−位にβ結合の形成を可
能にする適切な残留基を有するガラクトースの公知の2.3.4.6−チトラア
シル化誘導体と反応させる。適当な残留基(leavinggroup)はα−
ブロモ及びα−トリクロロ−アセトアミデート[(2−QC(=NH)CCl−
] を包含スル。コノ反応はβ結合の形成を促進する触媒の存在下で行われる。
適当な触媒に、前駆体がガラクトシルプロミドである場合にテトラ−N−メチル
尿素の存在下におけるトリフルオロメタンスルホン酸銀;及び供与体がガラクト
シルトリクロロアセトアミデートである場合に三弗化硼素エーテレートがある。
この反応でβGa1(1→3)βGlcNAc−OR及びβGa l (1→4
)GlcNAc−ORて保護された化合物がもたらされ、これらは慣用技術(例
えば、クロマトグラフィー)で単離及び分離することができる。次いで、除去可
能な保護基の除去で化合物15bがもたらされる。
また図5に示されるように、脱ベンゾイル化された6−ブロモ−G I cNA
cグリコシド前駆体は、1−位に当該6−ブロモ化合物へのルートを与えるよう
にβ結合の形成を可能にする適切な残留基を存するガラクトースの公知の2.3
,4.6−チトラアシル化誘導体と反応させることかできる。適当な残留基には
α0C(=NH)CCl 3があり、その反応は化合物15bを製造するのに用
いられる反応と同様にして行われる。
図6及び7はGIcNAc誘導体の6−位(図6)又は2−位(図7)が変性さ
れた、ラトクリッフエ等に記載される手法3Sの1つを用いることによるα−シ
アリル(2−3)βGa1(1−4)βG1cNAc−OR誘導体の化学合成を
説明するものである。
具体的に説明すると、図6に説明されるように、GlcNAcの適切な6−置換
誘導体を公知の51グリコシド27か、又は上記で詳細に説明した図5に示され
る公知の、ベンジリデン環が封鎖されたサツカリドの保護された形のもの(グリ
コシド27から誘導される)のいずれかから上記のようにして製造する。この6
−誘導体化された封鎖物質(図5に示される)を次に慣用の方法を用いて脱封鎖
してGIcNAcの6=誘導体である化合物28を得る。
化合物28を次にこの技術分野で公知の方法でジサッカリI’ 29 bと結合
させてNeu5Ac単位及びガラクト−ス単位の上に常用の除去可能な封鎖基を
有するトリサツカリド30及び3Iを得る。具体的に述べると、化合物29bを
ジサッカリド29a”から公知の方法で合成し、次いて適切な触媒、例えば[B
F、、(CzHs)0]の存在下で化合物28と反応させてそれぞれ対応するβ
(l→3)又はβ(l→4)結合したトリサツカリド30及び31の混合物を得
る。化合物30:31の比率は置換基R,の性質と反応条件に依存する。いずれ
にしても、トリサツカリド3o及び31は、典型的には、クロマトグラフィーを
含めて慣用の技術で分離、晴製される。トリサツカリド31上の封鎖基の除去も
慣用法(即ち、炭素担持パラジウムの存在下における水素の付加、それに続くメ
タノールの存在下におけるナトリウムメトキシドによる処理)で行われ、それに
よってトリサツカリド・aNe u 5Ac (2−+3)βGa1(1−4)
βG]cNAc25かもたららされる。このトリサツカリド25のフコンル化は
βGa1(1→3/4)βG]cNAc α(l→3/4)フコシルトランスフ
エラーセ[βGa1(1−3/4)βGIcNAc a(1−3/4)FT]の
存在下でGDP−フコース(GDP−Fuc)を用いて行ってGlcNAc単位
の6−位において変性されたシアリルルイス8類似体をもたらすようにするのが
好ましい。
置換基R1がアンド(−N、−m:の合成は後記において説明される)であると
き、この置換基はモノサツカリドレベル(図6に示される)か又はトリサツカリ
ド31のレベルのいずれかにおいて前記のように他の適切な置換基R1に更に官
能化することができる。例えば、トリサツカリド31の基R3がアジド基である
場合、この基はトリサツカリド31において官能化されてアミノ、アミド、イミ
ノ等の上記置換基をあたえることができる。
いずれにしても、官能化は、一般に、形成予定の官能基か更に意図される反応の
いずれをも妨害しない合成のある時点において行わイ]る。例えば、モノサツカ
リド28の官能基R3がジサッカリド29bとモノサツカリド28とのカップリ
ング反応を妨害するとしたら、この官能基はトリサツカリド31に導入すること
ができる。
図7において、GIcNAc−ORの適切な2−置換、6−保護誘導体、即ち化
合物32は、例えば図4に示される公知の封鎖されたサツカリド17から製造さ
れる。
化合物32を次にラトクリッフエ等が記載する方法35のようなこの技術分野で
公知の方法を用いて、ジサッカリト29a又は29bと結合させてNeu5Ac
単位のり、Gal単位の上及びG1cNAc単位の6−位の上に常用の除去可能
な封鎖基を有するトリサツカリドを得る。具体的に述へると、化合物29bをジ
サッカリド29aから合成し、次いて適切な触媒、例えば[BF*、(C2H,
)O]の存在下で化合物32と反応させてそれぞれ対応するβ(l→3)又はβ
(l→4)結合したトリサツカリドの混合物を与える。β(l→3)化合物対β
(1→4)化合物の比率は置換基R3の性質と反応条件に依存する。いずれにし
ても、これらのトリサツカリドは、典型的には、クロマトグラフィーを含めて慣
用の技術で分離、精製される。この保護されたトリサツカリドのフコシル化を次
にそのトリサツカリドとラトクリッフェ等り5が記載するテトラ−0−ベンジル
−フコピラノシルプロミドのような適切なフコシル供与体との反応により遂行す
る。得られるテトラサツカリド上の封鎖基の除去も慣用法で行われ、それによっ
てG1cNAc単位の2−位において変性されたシアリルルイス0類似体がもた
らされる。
別法として、そして1つの好ましい態様において、フコシル化は脱保護されたト
リサツカリドをβGa1(1→3/4)βGIcNAc cz(1→3/4)フ
コシルトランスフェラーゼ[βGa 1 (1→3/4)βGlcNAc a
(1→3/4)FT]の存在下でGDP−7コース(GDP−Fuc)と接触さ
せてGlcNAc単位の2−位において変性されたシアリルルイス1類似体をも
たらすことによって達成される。
前記のように、置換基R2がアジド(Na)であるとき、この置換基はモノサツ
カリドレベルか又は保護されたトリサツカリドレベルのいずれかにおいて前記の
ように他の適切な置換基R2に更に官能化することができる。
例えば、保護トリサツカリドの基R1がアジド基である場合、この基はこのトリ
サツカリドにおいて官能化されてアミノ、アミド、イミノ等の上記置換基をあた
えることがてきる。官能化は、一般に、形成予定の官能基が更に意図される反応
のいずれをも妨害しない合成の時点において行われる。例えば、モノサツカリド
32の官能基R2がジサッカリド29bとモノサツカリド32とのカップリング
反応を妨害するとしたら、そのときこの官能基は保護トリサツカリドに導入する
ことができる。
GIcNAcの6−位における他の誘導体はこの技術分野で認められている方法
で製造することができ、次いてこれらの化合物はこれをガラクトースにカップリ
ングさせてβGa1(1→3)βG1cNAc−OR誘導体及びβGa1(1→
4)βG1cNAc−OR誘導体を形成することができる。これらの誘導体は慣
用技術(例えば、クロマトグラフィー)で分離することができる。
βGal (+−4)βGIcNAc−OR誘導体は順次、これを(図3を通し
て)前記されるようにシアリル化及びフコシル化して6−位において変性された
シアリルルイス8誘導体を与えることができる。
上記の点に関し、6−位にクロロ、ブロモ又はヨード置換基を有する化合物28
はベルコーヤ等が報告する方法77を用いて未変性GIcNAc−ORの直接ハ
ロゲン化によって製造する二とかできる。
G l c N A c −ORの6−アジド誘導体は図8に記載されるように
して製造することかできる。具体的に述へると、GlcNAc−OR1即ち化合
物27を(CH30LCH−C,H4−p−0CH,との反応により4.6−0
−p−メトキシベンジリジンで封鎖された化合物41に転化させる。この化合物
を次に4−CHi 0−Cs H4−CHt Brとの反応で3−ヒドロキシル
位において保護してXが4 CHs OC@ H4−CH,−である化合物42
を与える。化合物゛42を酢酸(AcOH)との水中、約45°Cにおける反応
により4−及び6−位において一部脱保護して化合物43を得る。化合物43を
ピリジン中のメシルクロリド(mesylchloride: Ms C1/p
y)と反応させることによって6−メシレート(mesylate) 、即ち
化合物44を製造する。次に、ナトリウムアジドとのミメチルホルムアミド(D
M F )中での反応により6−アジド誘導体、即ち化合物45を形成し、そ
してその3−封鎖基をジクロロジシアノキノン(DDQ)により除去することに
よって化合物46を生成させる。
上記6−メシル化合物44は周知の化学的方法によってハロ置換基、アルコキシ
置換基、エステル置換基、サルフェート等を含めて多数の6−置換基のいずれに
も誘導体化することができる。
6−アジド化合物45はトリサツカリド4について前記したようにしてシアリル
ルイス8類似体合成の適切な時点に6−アミノ化合物に誘導体化することができ
る。
この6−アミノ誘導体は次にこれを常用の方法で更に官能化して、常用の方法て
−NHC(0)R,、、−NH3O,Hl N=C(R7)2 、 NHCH(
R−)2、N(R=L及びアミノ酸残基誘導体又はポリペブチジル残基誘導体を
得ることができる。例えば、基−N Htは慣用技術で次の化合物と反応させる
ことができるニーカルボン酸、酸無水物又は酸クロリド:これらは基−NH2と
の反応でアミドを与える(例えば、トリサツカリド7dのプロピオン酸アミドの
形成による):別法として、所望どされる酸をイナズ等が報告するように72活
性化し、次いて前記アミノ基と反応させることができる:このカルボン酸、酸無
水物、酸クロリド又は活性化された酸は水素、又は場合によってヒドロキシ、ク
ロロ、ブロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシより成る群から選択される1
種又は2種以上の置換基(好ましくは1種又は2種の置換基)で置換された炭素
原子数1〜4個のアルキルである基Re(即ち、置換基−NHC(0)R,の一
部としての基)を与えるように選択される。
−ボダンスッキー等によって報告されている71、酸基の所で活性化されている
適当な形のアミノ酸部分又はポリペプチド部分ニ
ーアルデヒド又はケトン(炭素原子数1〜4個);これらは基−NH2との制御
されたpHにおける反応で、還元すると(例えば、シアノ硼水素化ナトリウムに
より)バーノータス等が報告する73アルキルアミン置換基[即ち、−NHCH
(Rt)2 ]を与えるイミン[−’N=C(R7)z]を形成する。
−ウォーレンバーグ等71が米国特許第4,612.132号明細書において報
告する、前記アミンと反応すると開環して、アルキレンが炭素原子数2〜4個の
ものであるHO−アルキレン−〇C(0)NH−置換基を有するカルバメート基
を形成するエチレンカーボネート又はプロピレンカーボネートのような環式カー
ボネートニークロロホルメート(即ち、CI C(0) OR,。);これは前
記アミンとグレーグ等によって開示されるように69反応せしめられる。この場
合、クロロホルメートは炭素原子数1〜4個のアルキルである基RIOを有する
;−活性化された中間体をもたらすO=C(0−C。
H4pNOz)z ;この中間体は、ピーカルスカーバルトスセビツ等が記載す
るように70、次いでアミン(HNRIIRI2)と反応せしめられて尿素[−
NHC(0)NRIIR+2]を与える。
一トリメチルアミン、三酸化硫黄(SOs);これらは前記アミンとpH9,5
において、ペチトーが記載するように76、基−NH3O,Hを形成するように
反応せしめられる:及び
一誘導体化された蟻酸又はその他の物質;これらは前記アミンとの反応によって
ホルムアミド(−NH−CHO)74を形成し、これは更にイソシアノ(−N=
C=0)に官能化され、そして水素化トリブチル錫(ButSnH)74により
デオキシ誘導体に還元される。
GlcNAcの6−アルコキシ誘導体は図9に記載される方法て製造することが
できる。具体的に説明すると、GIcNAc−OR1即ち化合物27を酸性媒体
中のC,H,CH(OCH3)とアセトニトリル中で反応させて4.6−二保護
ベンジリジン化合物47を得る。この化合物47は、順次、ジメチルホルムアミ
ドの存在下、約O″Cにおいてベンジル(Bn)プロミド及び水素化ナトリウム
と反応させてその3−位にベンジル保護基を有する化合物、即ち化合物48を得
ることができる。化合物48を約80〜90°Cにおいて酢酸及び水と接触させ
ることによってその4,6−位において脱保護すると、化合物49が得られる。
化合物49とビス[トリブチル錫]オキシド及びRe Br (Reはアルキル
又は置換アルキルである)との反応は6−アルコキシ化合物5oを与える。その
ベンジル基のパラジウム/炭素上での水素による通常の脱保護は化合物51を生
成させる。
その6−3R,化合物はその6−メシル誘導体、即ち化合物44からチオ酢酸カ
リウムCH! C(0)SK’との反応で製造され6−位におけるチオアセテー
ト誘導体を与える。このチオアセテート誘導体を次に緩和な塩基で処理して6−
3H誘導体を生成させる。この6−SHはハロゲン化アルキル(例えば、CH,
Br)と反応させてその6−3R,誘導体を与えることができ、この誘導体は、
順次、ニオ1を部分的に又は完全に酸化して6−スルホン誘導体又は6−スルホ
キシド誘導体、即ち−S (0)R,及び−3(0)2R,(たたし、R,は炭
素原子数1〜4個のアルキルである)にすることができる。
その6−フルオロ化合物は化合物49をピリジン中で塩化メシルと反応させて6
−メシレートを形成することによって、公知の化学的方法79により製造される
。この6−メシレートはテトラエチルアンモニウムフルオリドと反応すると6−
フルオロ誘導体を与える。そのベンジル基を水素と炭素担持パラジウムにより脱
保護すると、化合物27の6−デオキシ 6−フルオロ誘導体が得られた。
上記の反応式はGIcNAcの多数の2−又は6−置換誘導体を示すものである
。しかし、これらの変性は2−及び6−の再位置に置換基を与えるべく組み合わ
せ得ることは明らかである。ジ置換が所望される場合、これらの変性は互いに適
合し得るように合成の適切な時点で行われる。即ち、2−位におけるその変性は
6−位における変性に対して行われなければならない。これはこの技術の通常の
技能範囲内のものである。
更に、上記のように、2−及び/又は6−位で誘導体化された(特に、2−アジ
ドの)物質に対する所望とされる変性は引き続く反応とは非適合性である官能基
を導入しないように合成ルートの適切な点で行われる。しかし、GIcNAcの
6−置換誘導体の場合、βGa1(l→4)結合はUDP−ガラクト−ス及び市
販のGlcNAc β(l→4)ガラクトシルトランスフエラーゼを用いること
によって形成させることができる。このGlcNAc β(l→4)ガラクトシ
ルトランスフェラーゼは6−位における変性を受け入れることが知られている。
イチ力’7 (Ichikawa)等のAnal、 Biochem、、202
・215−138 (1992)を参照されたい。
B2. シアリルルイス1類似体の抗原性キャリアーに対するカップリング
i、シアリルルイス1誘導体の人工抗原に対するカップリング
人工抗原を形成するように抗原性キャリアーに結合することができる官能基を有
するアグリコンを含有するオリゴサツカリドグルコシドをカップリング(結合)
させる手法は文献4s50に記載されている。このような抗原性キャリアーは、
一般に、アグリコン(又はその誘導体)上の官能基と反応する少なくとも1種の
相補反応性の官能基を有する。官能基と採用されるカップリング手法は使用され
るシアリルルイス8類似体の性質と、特にこの類似体上に存在する官能基(例え
ば、N−アセチルグルコサミン単位の2−及び/又は6−位の官能基、並びにシ
アル酸単位上のカルボキシル基)と確実に適合性となるように注意すべきである
。この技術分野で記録されている1つの適当なカップリング手法は、公知の手法
に従ってアシルアジド(−CON、)に変換されるアグリコン上のエステル官能
基(COOR’ 、ただしR′は残留基であるか、又は例えば炭素原子数1〜6
個のアルキルのような残留基に変換可能である)を採用する方法である。アシル
アジドは次いで公知の手法81.62に従って抗原性キャリアーにカップリング
させることができる。
当業者によって認められているように、アシルアジド法は変性されたシアリルル
イス8類似体がアミン置換基を含有しているときはカップリングに使用すること
ができない。
もう1つの適当な手法はエチレン末端基、好ましくは活性化されたエチレン末端
基、例えばアリルオキシ基−0−CH,CH=CH2(これは次いで、キャリア
ーに対するカップリングを行うために公知の方法63・s4で活性化させるごと
ができる)を有するアグリコン部分を使用するものである。
シアリルルイス1類似体のアグリコン官能基が一旦活性化されてしまうと、カッ
プリング反応は、一般に、モル量又は実質的にモル過剰のこのオリゴサツカリド
グリコシドをキャリアーを含有する組成物に、アグリコン上の官能基又は活性化
された官能基(活性化が必要であるならば)がキャリアー上の相補反応性官能基
と反応する条件下で添加することによって行われる。添加されるシアリルルイス
8類似体の量はキャリアー上の反応部位の数と共に各キャリアーに結合されるそ
のような類似体の数を指定し、そしてこの数は選択されるキャリアーと共に変わ
る。一般に、キャリアー当たり少なくとも1個のそのような置換基を与えるよう
に十分なシアリルルイス1類似体が添加される。置換基の数は、好ましくは各キ
ャリアーにつき1〜約60個、更に好ましくは約1〜約20個である。
以下の実施例は反応性官能基を有するキャリアーをアグリコン部分の上に相補反
応性官能基、又はアグリコン部分の上の相補反応性官能基に活性化(誘導体化)
することができる官能基を存するシアリルルイス1類似体にカップリングさせる
ための手法を与えるものである。これらの実施例は本発明を限定するものではな
い。
ii、 βGa1(1→4)βGIcNAc−OR誘導体の人工抗原へのカップ
リング、それに続くシアリル化とフコシル化
上記のように、シアリルルイス1類似体を人工抗原に結合させる際に有用なカッ
プリング反応は、採用されるカップリング反応がシアリルルイス1類似体上の官
能基に意図されない様式て(例えば、そのシアル酸上の−C00H基において)
影響を及はしてはならないと言うことによって制限される。この制限を回避する
には、初めにβGa1(1−4)βGIcNAc誘導体を抗原性キャリアーにそ
のアグリコン官能基を介してカップリングさせ、次いて逐次的方法てシアル酸及
びフコースを、1個又は2個以上のシアリルルイス1類似体をペンダントに有す
る人工抗原を与えるようにその人工抗原に結合されたβGal (1→4)βG
IcNAc誘導体に酵素的に転移させるのか有利であろう。
この態様において、アシアロオリゴサツカリドグリコシドの抗原性キャリアーに
対するカップリングは上記と同し方法で達成される。同様に、人工抗原に結合さ
れたβGa1(1→4)βG1cNAc誘導体に対するシアル酸とフコース酵素
的転移も上記と同じ方法で達成される。
i i i、抗原性キャリアー以外のキャリアーに対するカップリング
小さい分子量のキャリアーは高められた抑制効力を持つ二価、三価又は多価のハ
ブテンを与えることができるだろう。適切なシアリル化ルイス8の高分子キャリ
アー又はシアリルルイス8モノマーと適切なモノマーとの共重合は非免疫原性の
又は生物適合性の生成物をもたらすことができるだろう。人工のリポソーム又は
ミセルは抗原、薬物キャリアー又は多価の阻害物質として使用することができる
だろう。従って、本明細書に記載されるシアリルルイス1類似体は、抗原性キャ
リアーにカップリングすることに加えて、これを他のキャリアーにカップリング
又は他のキャリアーと合体させることができる。
例えば、そのようなオリゴサツカリドグリコシドのアグリコン部分が疎水性基を
含有するならば、そのオリゴサツカリドグリコシドをミセル及びリポソームに組
み込ませることができる。
シアリルルイス1類似体を含有するリポソーム及びミセルは細胞付着現象/ター
ゲティングの抗原又は阻害物質に有用である。
同様に、使用されるキャリアーは1種又は2種以上の反応性官能基を存する固相
粒子であることができ、これは、その固相粒子が少なくとも1種のコンジュゲー
ト化されたシアリルルイス3類似体を含有するように固相粒子にカップリングさ
せるアグリコン上の相補反応性官能基を含有する1種又は2種以上のシアリルル
イス軍類似体と反応させることができる。このようなカップリングは上記のカッ
プリング反応と同様に進行するだろう。この態様において、得られる固相粒子は
酵素(シアリルトランスフェラーゼに非ず)、レクチン又は他の生物学的受容体
をそのような物質を含有する水溶液から単離する際に有用てあろう。反応性官能
基を含有する固相粒子はこの技術分野で周知であり、これには活性化されたセフ
ァロース(Sephrose) 、アミノプロピル−シリカ、アミノプロピル−
CPG (気孔が制御されたガラス)、アミノエチルセルロース、トリサクリル
’ (Trisacryl” ) −NH、ガラスピーズ、ポリアクリルアミド
粒子等がある。
シアリルルイス8類似体はまた、非免疫原性、生物適合性及びキャリア一分子当
たり無数のシアリルルイス1類似体を含むことの能力等の性質について選ばれる
、高分子の性質を持つもっと大きな分子量のキャリアーにもカップリングさせる
ことができる。
1種又は2種以上のシアリルルイス8類似体を含有する固相又は高分子性のキャ
リアーはまた、例えばそれらが天然物質を含有している疑いがあると見られる試
料に加えられる競争免疫検定においても有用である。試料には次いでシアリルル
イス1類似体に抗して生じせしめられる、天然物質と交叉反応する抗体が添加さ
れる。このような抗体には検出可能な信号を与えるように適切な標識が付けられ
る。標識の付けられた抗体の固相又は高分子性のキャリアーに対する結合の度合
いは試料中に見いだされる天然物質の量に依存する。インキュベーション後、固
相又は高分子性のキャリアーが次に試料から単離され、そのキャリアーに結合し
た抗体の量が信号のレベルを測定することによって確認される。測定された信号
の標準値に対する相関関係は試料中の天然抗原のレベルの査定を可能にする。
更に、非免疫原性コンジュゲートは、多価コンジュゲートが一価のハプテンより
も有効な抑制物質であると考えられる場合に細胞付着現象の抑制物質として有用
であ本明細書に記載されるシアリルルイス1類似体は病気の治療に有用である。
この治療には、例として挙げるものであるが、細胞性炎症応答を変調すること等
を含めて抗原に対する細胞性免疫応答の治療がある。
本明細書に記載されるシアリルルイス1類似体は、これを約0.5〜約50 m
g/ kg一体重、好ましくは約0.5〜約5mg/kg一体重の用量範囲で投
与するとき、抗原に対する細胞性免疫応答を抑制する際に有効である。採用され
る特定の用量は治療されている個々の細胞性免疫応答により、並びに有害な免疫
応答のひどさ、患者の年令及び一般的な病状等のような因子に依存してなされる
主治医の判断により調整される。シアリルルイス1類似体は経口、非経口、経直
腸、経皮等で投与することができる。
シアリルルイス1類似体は非経口投与するのが好ましい。
シアリルルイス8類似体による細胞性免疫応答の抑制は免疫応答の開始を必要と
するので、シアリルルイス8類似体は、一般的に言えば、免疫応答開始の約0.
5時間後、好ましくは1時間後、最も好ましくは少なくとも約5時間後に患者に
投与される。
シアリルルイス1類似体の投与は、抗原に対する細胞性免疫応答を変調すること
に加えて、同じ抗原からの追加の対抗に対しである程度の寛容性も与える。これ
に関し、シアリルルイス1類似体の投与数週間後の同じ抗原による再対抗は著し
く低下した免疫応答(即ち、細胞性免疫応答の抑制)をもたらす。しかして、シ
アリルルイス°類似体の投与は抗原に対する細胞性免疫応答の変調(例えば、抑
制)とその抗原による将来の対抗に対する寛容性を付与する。
本発明の方法は製剤上許容し得るキャリアーとを動量のシアリルルイス′類似体
を含んで成る製剤組成物の使用によるよって一般に達成される。製剤上許容し得
るキャリアーには、例として挙げると、水、緩衝剤入り食塩水等がある。シアリ
ルルイス1類似体の有効量は、患者に投与されるときオリゴサツカリドグリコシ
ドの前記用量を与えるそのような量である。適当な製剤組成物はアジュバント、
防腐剤等のような任意成分を更に含有することができると考えられる。
また、適当な製剤組成物はこの技術分野て周知の経皮性組成物又は包帯類であっ
てもよいと考えられる。
更に、本明細書に記載されるシアリルルイス8類似体は、抗原性キャリアーに結
合される場合、人工抗原としても有用である。従って、このような類似体は人工
抗原の製造において中間体として作用する。
本明細書に記載されるシアリルルイス1類似体を含有する人工抗原はマウスに、
例えば天然物質と交叉反応する抗体を産生させるように、注射することができる
。このような抗体は天然物質を含有している疑いがあるとされる試料中のその天
然物質の存在及び/又はレベルを測定するための免疫検定技術において使用する
ことができる。
上記のことに加えて、このような抗体(特に、モノクローナル抗体)は特定の天
然抗原(即ち、天然物質)に対する抗体療法において使用することができる。具
体的に述・\ると、本明細書に記載される、シアリルルイス8類似体の1種又は
2種以上を含有する人工抗原は、シアリルルイス1類似体上に位置する、天然抗
原における抗原決定因子と同様のものであるだろう1種又は2種以上の抗原決定
因子を有することができる。この人工抗原は、それがマウスに注射されると、天
然抗原と交叉反応する抗体を産生させる。このような抗体は次いでこれらを採集
し、天然抗原に対する抗体治療に使用することができる。これらの抗体はモノク
ローナル抗体であるのが好ましい。シアリルルイス1類似体を含有する人工抗原
の抗原決定因子を認識し、そして天然抗原上の同様の抗原決定因子と交叉反応す
るモノクローナル抗体を生成させるハイブリドーマ細胞系を単離する方法はこの
技術分野において周知である。場合によっては、このような抗体をそれらの治療
効果を高めるべく治療剤にカップリングさせることができる。
同様に、人工抗原以外の人工コンジュゲートの実用性も前記された通りである。
次の実施例は本発明を例証するために与えられるもので、これら実施例をいかな
る意味においても本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
これらの実施例において、以下において特に定義されない限りは、使用されてい
る略号は一般に受け入れられている意味を有するものである。
AB=ABパターン
ATP=アデノシントリー燐酸
aX=軸の
BSA=ウシの血清アルブミン
bt=広いトリブレット
CDP=シチジンジー燐酸
d=ダブレット
dd=ダブレットのダブレット
ddd=ダブレットのダブレットのダブレットDTH=遅延型過敏症
eq=赤道の
i、r、=赤外
KLH=キーホール・リンペット・ヘモシアニン(Keyhole Limpe
t Hemocy anin)m=マルチブレット
t、1.c、=薄層クロマトグラフィーU=単位
AG lX8(ホルメート形)=バイオーラド・ラボラトリーズ社[Bjo−R
ad Laboratories] 、リッチモンド(Richmond) 、
CA]から入手できるイオン交換樹脂・AGIX8(ホルメート形)、ダウエッ
クス(Dowex) 50 W X 8 (H+形)=タウ・ケミカフ1社[D
ow Chemical、ミツドランド(Midland)、M!]から入手で
きるイオン交換樹脂・ダウエックス50WX8(H+形)IRC−50樹脂(H
”形)=ローム・アンド・ハース社[Rohm & Haas、フィラデルフィ
ア(Philadelphia) 、PA]から入手できるイオン交換樹脂・I
RC−50(H″″形)。
市販成分はメーカー名と、適切な場合は発注番号で挙げる。列挙されているメー
カーの幾つかのものは次の通りであるニ
アマージャム社(Amersham) =アマージャム・カナダ社[Amers
ham Canada Li m1ted ;オンタリオ(0ntario)、
カナダ国]
バイオラド社(BioRad) ”バイオ−ラド・ラボラボラトリーズ社、リッ
チモンド、CA
イアトロン社(Iatron) =イアトロン・ラボラボラトリーズ社([at
ron Laboratories :東京、日本国)メルク社(Merk)
=E、メルク社[E、 Merk AG ;ダルムシュタット(Darmsta
dt)、ドイツ国]ミリポア社(Millipore)=ミリボッ社[Mill
iporeCorp、;ペッドフォード(Bedford)、MA]ペルーフリ
ーズ・バイオロジカルス社(Pel−FreezeBiologicals)=
ペルーフリーズ社[Pei Freez ; ロジャース(Rogers) ;
アーカンサス(Arkansas) ]ファーマシア社(Pharmacia)
=ファーマシア・バイオシステムズ社[Pharmacia Biosyst
ems Inc、;ピスキャタウエー(Piscataway) 、N J ]
サーバ社(5erva) =サーバ・ファインバイオへミカ社[5erva F
einbiochemic a ; ハイデルベルグ(Heidelberg)
、ドイツ国]シグマ社(Sigma)=シグマ・ケミカル社[SigmaCh
emical Compan ;セントルイス(St、 Louis )、MS
]
ウォータース社(Water)=ウォータース・アソシェーツ社[Waters
As5ociates、 Inc、 ;ミツドフォード(Milford)、
MA]。
シリカゲル(メルク社、6O−F2.、)の予備塗被板を分析用t、1.c、に
使用し、スポットは硫酸の5%エタノール溶液を噴霧した後炭化する(char
ring)ことによって検出した。カラムクロマトグラフィーにはシリカゲル6
0(メルク社、230〜400メツシユ)を用いた。イアトロビーズ(Iatr
obeads)はイアトロン社からのものであった(発注番号6RS−8060
)。ミレックス(Millex)−GVフィルター(0,22μ)はミリポア社
からのものであった。Cpsセブーパック(5ep−Pak)カートリッジ及び
バルクC1,シリカゲルはウォータース・アソシエーツ社からのものであった。
市販試薬を化学反応において使用し、溶剤は通常の手法に従って精製、乾燥した
。特に明記されなければ、反応混合物はジクロロメタンによる希釈と重炭酸ナト
リウムの希薄溶液、それに続く水による洗浄によって処理した。硫酸マグネシウ
ム上での乾燥後、溶剤を浴温35℃又は必要なときはそれより低い温度を用いる
真空蒸発で除去した。
’H−n、m、r、は、特に明記されなければ、内部標準としてり、o中2.2
25に設定されたCDC1,かアセトンのいずれかの中のテトラメチルシランを
用い、外囲温度において300 MHz又は500 MHzにおいて記録した。
化学シフトとカップリング定数[観察されたスプリッティング(splitti
口g)]はそれらがあたがも−次であるかの如くに報告された。n、m、r、デ
ーターは一部だけを報告する。IC−n、m、r、スペクトルは参考としてD2
0において67.4に設定されたCDC1,又はジオキサン中のテトラメチルシ
ランを用いて75.5 MHzで記録した。
凍結したラットの肝臓はペルーフリーズ・バイオロジカルス社からのものであっ
た。CMP−[”Cl Neu5Acはアマージャム社から入手したものであっ
た。セファロース6B、ダウエックスIX8はファーマシア社からのものであり
、またCMP−Neu5Acはシグマ社から、AC8液体シンチレーション・カ
クテルはアマージャム社からのものであった。GDP−フコースは以下に記載さ
れる化学合成により得た。他の化学薬品は全て分析等級のもので、それらは市販
のものであった。
βGa1(1→3/4)βG l cNAc a (2−)3)シアリルトラン
スフェラーゼ[(EC2,4,99゜5)−場合によっては“α(2→3)ST
”と称される]及びβGa1(1−=4)βG 1 cNAc a C2−+6
)シアリルトランスフェラーゼ[(EC2,4,99゜1)−場合によっては“
α(2→6)ST”と称される]をワインシュタイ等■に従ってトリトン(Tr
iton)CF−54(シグマ社)を用いてラットの肝臓(600g)から抽出
した。トリトン抽出物からの酵素をスティチャー等の方法l′7の報告された修
正法61によりシバクロン・ブルー(Cibacron Blue)F 3 G
A−セファロースで一部精製、濃縮した。その清浄剤抽出物(3L、蛋白質3
、5 mg/ mL)をナトリウム力コディレート(pH6,5) 10mM、
0.15M−NaC1,25%グリセロール、2つの部分に分けた0、1%トリ
トンCF−54(緩衝液A)中で平衡にされたセファロース6B[ディージ(D
ean)とワトソン(Watson”に従って製造]に連結されたシバクロン・
ブルーF3GA(サーバ社)のカラム(8×20 cm)に装填した。緩衝剤A
との間には洗浄工程がある。
二〇カラムを蛋白質がそれ以上溶離しなくなるまで同じ緩衝液で洗浄し、次いで
2.0M−NaC1を含有する緩衝液Aを用いて溶離させた。シアリルトランス
フェラーゼを含有する活性な両分をプールし、アミコン(AmicnPM)ao
膜での限外濾過により濃縮し、そして200容量の緩衝液Aに対して透析した。
α(2−3)STをα(2→6)STから分離し、そしてハブテンII、即ちβ
Ga I (1→3) βG 1 c NA c O(CHt)−C0OHのN
−スクシンイミジルエステルを必要とする当該技術で認められている技術を用い
てマツモト等80が記載するようにそのハブテンを活性化されたセファロースに
共有結合させることにより得られたマトリックス(Le’−セファロース)でマ
ジッド等5@が記載するようにアフィニティークロマトグラフィーによって精製
した。上記の色素クロマトグラフィーで部分的に精製された、α(2−3) S
T ・ml 60mU及びa (2→6) ST ・2゜4U(蛋白誓約860
mg)を含有するシアリルトランスフェラーゼをCD P 2.5 mM金含有
る等容量の緩衝液Aにより流量5 mL/時で希釈した。そのカラムを前記の平
衡用緩衝液で洗浄してゆるく結合している蛋白質を全て除去した。酵素活性を定
量すると、不活性な蛋白質及びα(2→6)STの大部分を溶離させたが、カラ
ムにその適用中、及びそれに続く洗浄工程中に強く吸着されたα(2−3)ST
の溶離は妨害(unretard)されなかった。
次に、そのα(2→3)STを0.2Mラクトースを含有する緩衝液入を用いて
カラムから溶離させた。α(2→3)STを含有する両分(各2 mL)をプー
ルし、アミコンPM30膜で歩容量(〜I mL)まで濃縮した。この濃縮物を
200容量の、50mMナトリウム力コディレート(pH6,5) 、0.25
ki・NaCl、50%グリセロール、0.1%トリトンCl−54に対して透
析し、そして−20°Cて貯蔵した。比活性度2.7 U /mg−蛋白質まで
82゜000倍精製されたこの調製物はβGa1(1→4)βG 1 cNAc
o (CHx)s C00CHs”を受容体として使用する予備的シアリル化を
行い、そして生成物を’H−n、m、r、分光分析法及びt、1.c、で分析し
たときα(2→6)ST活性を持っていないことが示シアリルトランスフェラー
ゼの活性を次の標準的な方法に従って検定した。即ち、α(2→3)ST及びα
(2→6)STの活性を、それぞれ化合物20a及び22a(化合物20aは化
合物22のβGa1(1→3)βG]cNAcに相当する)であるそれらα(2
→3)ST及びα(2→6)STの受容体基質以外は同一の反応混合物において
定量した。インキュベーション混合物は総容量60μL中に、0.5%トリトン
CF−54を含有する25mMナトリウム力コディレート(pne、 5 )中
の9nmolのCMP−[I4Cl Ne u 5Ac (アマーシ士ム社)
(3,340cpm /nmol) 、2mMの受容体基質、1mg/mLのB
SA及び酵素(0−0,2mu)を含有していた。
37°Cでインキュベーション(10〜30分)後、放射性生成物をセダーバッ
クC11カートリツジ5o()オータース社)を用いる手法で単離した。そのカ
ートリッジを背景のカウントが洗浄液中に得られるまて水(30mL)で洗浄し
た。放射線標識された生成物を次にメタノール(2x 5 ml)により溶離し
、そしてACSシンチレーションカクテル(I OmL)中でベックマン(Be
ckman) L S−3801シンチレーシヨンカウンターを用いて定量した
。酵素活性1単位は飽和基質濃度におけるインキュベージ321分当たりに形成
される生成物1μモルと定義される。蛋白質濃度はブラッドフォートの方法61
を用いて評価した。
ソアリルトランスフエラーゼの動力学
ラットの肝臓・α(2→3)STの初期転移速度を一定のオリゴサツカリド受容
体基質濃度(2mM−ミリモル)において報告されている方法s@!2を用いて
測定した。標準のインキュベーション混合物は総容量60μL中に、0.5%ト
リトンCF−54を含有する25mMナトリウム力コディレート緩衝液(pH6
,5)中に560uM (フィクロモル)のCMP−[”CコNeu5Ac(3
0,000c、p、m、) 、2mMの受容体基質、lo+g/mlのBSA及
び360μUの酵素を含有していた。
37°Cにおけるインキュベーションの30分後に10mMのCTP50μLを
添加することによって反応を停止させた。放射線標識された生成物を疎水性の8
−メトキシカルボニルオクチルアグリコンを有する受容体についてはセダーパッ
ク法@0によるか、又はボールマン等6!が記載する池のアグリコンを存する受
容体についてはダウエックスlX8(PO2”−1100〜200メツシユ)に
よるイオン交換クロマトグラフィーによって単離した。
初期速度はα(2→3)STについてβGa1(1→4)βGlcNAc−OR
を用いて得られた値に対する百分率として表される。あらゆる場合に、CMP−
[”C]−Neu5Acの15%未満が生成物に転移され、そして検定は2回ず
つ行った。
この酵素はルイスa+b−共与体から得られたヒトの乳からパルシック等2tが
記載するGDP−ヘキサノールアミンセファロースでのアフィニティークロマト
グラフィーを使用する方法に従って精製した。
フコシルトランスフェラーゼの動力学
フコシルトランスフェラーゼの動力学はパルシック等2鵞か報告するようにして
行った。インキュベーション混合物は、(50μL中に)25mMナトリウム力
コディレート緩衝液(pHe、 5 )中にの10gMのGDP−[”C]−7
コース(77一ン+L社)(25,000c。
1)、m、) 、2mMの受容体サツカリド、lOμUのフコシルトランスフェ
ラーゼ、8mMのMnCl2を含有していた。37°Cにおけるインキュベーシ
ョンの20分後に35mMのEDTAl、0μLを添加することによって反応を
停止させ、そして放射線標識された生成物をセダーパック法@6によって分離し
た。GDP−[目C]−フコースの20%未満が生成物に転移された。初期速度
は表IIIに記載されるようにa N e u 5 A c (2−3)βGa
1(1→4)βGIcNAc−OR又はβGa1(1→4)βG1cNAc−O
Rを用いて得られた値に対する百分率として表される。
実施例1−出発物質の合成/受容体の合成:化合物2゜b、20c、22b、2
2c、22d(図A、8−メトキシカルボニル 2,3.4.6−テトラ−0−
アセチルーβ−D−ガラクトピラノシル−(1→3)−0−2−アジド−2−デ
オキシ−β−D−グルコピラノシド(化合物19)及び8−メトキシカルボニル
2.3.4.6−テトラ−0−アセチルーβ−D−ガラクトピラノシル−(l
→4)−0−2−アジド−2−デすキシーβ−D−グルコピラノシド(化合物2
1)の製造トリメチルシリル)−リフルオロメタンスルホネート(0,460g
、1.94ミリモル)の乾燥塩化メチレン(5mL)中等液を22°Cで撹拌さ
れているジクロロメタン中の化合物17” (1,20g、 1.94ミリモル
)、化合物18 (0,757g、 1.94ミリモル)及び分子篩4人(2g
)の混合物にシリンジで滴下した。2時間後、反応をトリエチルアミンの添加に
より停止させ、その混合物を濾過し、そして常法の通り処理した。回収された物
質を溶離剤としてヘキサン類と酢酸エチルとの3〜1混合物を用いてシリカゲル
(150g)によるクロマトグラフに掛けてβ(l→3)ジサッヵリドとβ(1
→4)ジサッカリドとの混合物(1,10g、60%)を得た。この混合物はこ
の段階では分離することができなかった。
テトラエチルアンモニウムクロリド(0,196g、1゜18ミリモル)及び無
水の弗化カリウム(0,299g。
5、15 ミリモル)を上記ジサッヵリドの混合物(0,460g、0.487
ミリモル)の乾燥アセトニトリル(10mL)中等液に加えた。22°Cで24
時間後、酢酸(1〜5 mL)を加え、そして溶剤を真空蒸発させた。その残分
ヲクooホルム(20mL)に溶解し、重炭酸ナトリウムの希薄溶液で、続いて
水で洗浄した。回収された粗生成物を溶離剤として酢酸エチルとヘキサンとのl
=1混合物を用いてシリカゲル(36g)によるクロマトグラフに掛けてβ(1
−4)ジサッカリド21(157mg、46%)とβ(1→3)ジサッカリド1
9(96mg、28%)を得た。
シサッカリド21 : Ca’) o ”+6.9° (C1,0,CHCL*
) ’H−n、m、r、(CDD l5)5.381(d、IH,Js 43
.5Hz、H4’ ) 、5.222(dd、IH,JI□8.0Hz、tJ2
’、2’ lo、OHz、 H−2°)、5.0I4(dd、IH,H−3’)
、4.628 (d、 IH,H−ビ)、 4.257 (m、 H−1(d。
J I、 2 B−0f(z) ヲ含ムl 、 3.420−3.640 (m
、 CO2CHz (s、3.650)を含む)、2.227(t。
2H,J7.5Hz、CHx Cot)、2.150.2.100(2)、1.
950 (3s、12H,40Ac)、1.600 (m、48. メチレン類
) 、 1.300 (m、8H。
メチレン類)。
ジサッカリド+ 9 ; ((Z) o ”+7.8° (c 1. CHCI
s ) 、’Hn、 m、r、(CDCIg) 5.359(d、IH,Jr、
a 3.2Hz) 、5.225 (dd、IHJl、z 8.0.J2 □
1O)1z、H2’ )、5.013(dd、IH,H−3)、4.524 (
d、IH,H−ビ)、4.300 (d、 Jl、z8.OHz、 Hl)、3
.628 (S、3H,Cot CHt)、2.150.2.080゜2.00
0,1.920 (4s、12H,40AC)、1゜600 (m、4H,メチ
レン類) 、 1.300 (m、8H。
メチレン類)。
同定のために両ジサッカリドをピリジンと無水酢酸との混合物中で過アセチル化
した。
化合物21の過アセチル誘導体:5.314 (dd、IH,Js 43.5.
Ja s <IHz、H4’ )+ 5.047 (dd、IH,Jl 28.
0.Jr、x、IO,OH2゜H−2’ )、4.870−4.970 (m、
2H,inc 1゜H3,4,923(dd、Jz 2. Js 4.10.0
Hz)及びH−3’ (4,903,dd、))、4.420(m、2H,in
c 1.H−1’(d))、4.300 (d。
Jl、t 8.OHz、 H−1)、 1.627 (m、1nc1. C02
CHI (S、3.627))、3.335 (dd、IH。
H2)、2.230 (t、J 7.5)IZ、CH2CO資)2.080.
2.0?0.2.050,2.0 10. 1.980゜1.936 (5s、
188. 6 0Ac)、1.570 (m。
4H,メチレン類) 、 1.210 (m、8H,メチレン類)。
化合物19の過アセチル誘導体:5.l 20 (dd、IH,Js、a 3.
5.JS4.1.OHz、H4°)、5.080 (dd、IH1J+1.r
7.8+ Jl、s、10.0Hz。
H−2’ )、4.980 (dd、IH,H−3’ )、4.875 (dd
、I H,JS、4−Ja、s −10,0Hz、 H−4)4.715 (d
、IH,H−1’ )、4.257 (d。
IH,Jl、2 8.OH2,H1) 、3.827 (s、3H9CO2CH
s)3.320 (d d、I H,Jt、s 10.OHz。
H2) 、 2.230 (t、 J 7.5Hz、CHz COり、2゜08
0.2.050.2.020.2.010.1.970゜(6s、18H,60
Ac)、1.600 (m、4H。
メチレン類)、1.250 (m+ 88. メチレン類)。
8.8−メトキシカルボニルオクチル β−D−ガラクトピラノシル−(l→3
)−0−2−アジド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(化合物20b
)の製造
触媒量の、ナトリウムメトキシドのメタノール中希薄溶液を化合物19(0,0
45g、0.064ミリモル)のメタノール(2mL)中溶液に加えた。22°
Cで5時間後、ダウエックス50WX8(Hゝ形)による中和、及び濾過を行い
、その溶剤を真空蒸発させると、純粋な20b(30mg188%)が得られた
: [α]。ロー11.7゜(c O,65,H20)’H−n、m、r、(C
Ds CD、DOH;4.80);δ4.45 (d、IH,J 7.0Hz)
及び4.34 (d、IH,87,5Hz) ;H−1及びH−1’ 3.61
(s、Cot CH,)、2.27 (t、2H。
J 7.5Hz、CH,C02)、 1.58 (m、4H,’)及び1゜30
(m、8H):メチレン類。
C,8−メトキシカルボニルオクチル β−D−ガラクトピラノシル−(l→3
)−0−2−アミノ−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(化合物20C
)の製造
化合物20b (0,018g、0.034ミリモル)をメタノール(2mL)
中、炭素担持5%パラジウムの存在下で大気圧において6時間水素化した。セラ
イト(Celi te)を通して濾過した後、溶剤を蒸発させ、その残分を溶離
剤としてクロロホルムとメタノールとの混合物を用いてイアトロビーズ(2g)
によるクロマトグラフに掛けると、純粋な化合物20cが得られた; 〔α)
DlG−4,2° (c O,48,Hz O) ’H−n、m、r。
(D、o;於4.80);δ4.56及び4.48(2d、各々IH,、J 7
.5Hz) :H−1及びH−]’ 3.70 (s。
CO□CH,)、 2.90 (〜t+ I−I(+ J 9.5Hz、H−2
) 、 2.42 (t、2H,J 7.5H2,CH2C02)。
1.62 (m、4H,)及び1.35 (m、8H):メチレン類。
D、8−メトキシカルボニルオクチル β−D−ガラクトピラノシル−(l→4
)−0−2−アジド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(化合物22b
)の製造
触媒量の、ナトリウムメトキシドのメタノール中希薄溶液を化合物21 (0,
027g、 0.38ミリモル)のメタノール(2mL)中溶液に加えた。22
°Cで5時間後、ダウエックス50WX 8 (H”形)による中和及び濾過を
行い、その溶剤を真空蒸発させた。その残分を溶離剤としてクロロホルムとメタ
ノールとの65 : 35混合物を用いてイアトロビーズによるクロマトグラフ
に掛けると化合物22b(0,019g、92%)が得られた:(α)”o 1
2.4° (c O,73,CHs OH) ;’H−n、m、r、(CDs
OD、DOH:於4.80):δ4.32 (d、IH,J 7.5)1z)及
び4.30(d。
IH,J 8.0Hz) :H−1及びH−1’ 、 3.60 (s。
C02CHs)、3.13 (dd、Jl、s 8.OJl、$ 10゜0Hz
、 H−2) 、 2.47 (t、2H,J 7.5Hz。
CHz Cot)、1.56 (m、4H,)及び1.29(m。
8H):メチレン類。
E、8−メトキシカルボニルオクチル β−D−ガラクトピラノシル−(l→4
)−0−2−アミノ−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド(化合物22C
)の製造
化合物22b (0,016g、0.29ミリモル)をメタノール(5mL)中
、炭素担持5%パラジウム(10mg)の存在下で22°Cにおいて5時間水素
化した。セライトを通して濾過した後、溶剤を蒸発させ、その残分を溶離剤とし
てクロロホルムとメタノールとの8:2混合物を用いてイアトロビーズ(2,5
g)によるクロマトグラフに掛けると、純粋な22c(0,013g、86%)
が得られた。[α]2°I、2.8° (c、0.42、H2O)。
F、8−メトキシカルボニルオクチル β−D−ガラクトピラノシル−(l→4
)−0−2−デオキシ−2−プロピオンアミド−β−D−グルコピラノシト(化
合物22d)の製造
化合物21 (0,017g、 0.032ミリモル)をメタノール(8mL)
中、炭素担持5%パラジウム(5mg)の存在下で大気圧において8時間水素化
した。セライトを通して濾過し、そして溶剤を蒸発させた後、その残分を若干の
トリエチルアミン(0,150mL>を含有するメタノール(3mL)に溶解し
た。無水プロピオン酸(0,150mL)を加え、その混合物を22°Cにおい
て4時間撹拌し、その後溶剤を蒸発させ、乾固させた。その残分をピリジンと無
水酢酸との2=1混合物(4mL)中で22°Cにおいて18時間アセチル化し
た。メタノールの添加後、その混合物を常法の如く処理し、そして溶剤を蒸発さ
せた後にその残分を溶離剤として酢酸エチルとへキサンとのl:l混合物を用い
てシリカゲルによるクロマトグラフに掛けると、化合物22dの純粋なヘキサ−
0−アセテートが得られた; ’H−n、m、r、(CDCLI):5.50
(d、IH,J 9.5Hz、 NH) 、 5.32 (〜d。
J、<’ 3.5Hz、 H−4’ ) 、 5.07 (m、2H,H−2′
及びH−3)、4.93 (dd、IH,J2.、、.10゜0Hz、 H−3
’ ) 、 4.25 (m、3H,H−1及びH−17を含ム) 、3.63
(s、Cox CHz)、2.257ct、2H,J 7.5.CH2C02
)、2.137 (dq。
Jl、0及び7.5Hz、NHCHz)、 2.11.2.07.2゜02 (
3)、1.93 (4s、1.2H,60Az)、1゜540 (m、4H)及
び1.25 (m、8H):メチレン類、1.09 (t、2H,NHCHz
CH,)。
上記のジサッカリドを触媒量のナトリウムメトキシド溶液を含有する乾燥メタノ
ール(l mM)中で脱0−アセチル化した。ダウエックス50WX8(H+形
)樹脂による中和及び濾過後、溶剤を蒸発させると、後に純粋な22dが残った
; Ca) ”o −18,0’ (c O,43゜CHs OH); ’H−
n、m、r、(CDs OD、D。
H=於4.80):δ4.36 (d、I H,J 8.0f(z)及び4.3
3 (d、IH,J 7.5Hz) :H−1及びH−F、 3.60 (s、
Cow CH,)、 2.26 (t、 2H。
J 7.5Hz、CHt C02)、 2.18 (Q、2H,J 7゜5H2
,NHCOCH2)、1.51 (m、4H,)及び1.26 (m、8H):
メチレン類、 1.09 (t、3H,NHCOCH2CHz)。
実施例2−シアリル化トリサツカリド(化合物11b、11c及び1id)の合
成
A、8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミド−3,5−ジデオキシ
−D−グリセロ−α−D−ガラクト−2−ノヌロピラノシロン酸(nonulo
pyranosylonic acid) ) −(2−$ 3 ) −〇−(
β−D−ガラクトピラノシル)−(I→4)−0−(2−アジド−2−デオキシ
−β−り一グルコピラノシト(トリサツカリド1lb)の製造
トリサツカリド4(28,8mg、0.24ミリモル)を酢酸エチル(1,5m
L)中、炭素担持5%パラジウムの存在下で22°Cにおいて1時間水素化して
中間体遊離酸を得た。[α]D2018.6° (c、0.3、クロロホルム)
。
この生成物を触媒量のナトリウムメトキシドを用いてメタノール中、22°Cに
おいて16時間脱0−アセチル化し、そして回収された物質をバイオゲル(Bi
oGel) P 2によるクロマトグラフに掛けると、トリサツカリド11b(
10,4mg、55%)が得られた。[α]D20−6.5° (c、0.17
、水)。’H−n、m、r、データーは前記表I+に示される。
8.8−メトキシカルボニルオクチル(ベンジル−5−アセトアミド−4,7,
8,9−テトラ−〇−アセチルー3.5−ジデオキシ−D−グリセロ−α−D−
ガラクトー2−ノヌロピラノシロネート)−(2→3)−0−(2,4,6−ト
リー〇−アセチルーβ−D−ガラクトピラノシル)−(l→4)−0−(6−0
−アセチル−2−アミノ−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシド)(トリサ
ツカリド9)の製造
ピリジン(32mL)、水(4,8mL)及びトリエチルアミン(1,3mL>
の混合物中のトリサツカリド4(400mg、0.32ミリモル)の溶液に硫化
水素を通して泡立てる。22°Cにおいて16時間後、この混合物を乾固するま
で蒸発させ、次いてトルエンと共に同時蒸発を行って粗トリサツカリド(430
g)を得る。この物質の一部(85,9mg、0.07ミリモル)をクロマトグ
ラフ(lO・lトルエン:エタノール)に掛けると、トリサツカリド9(55m
g、70%)が得られる。〔α)、+25゜9° (c O,22,chlor
oform) ; ’H−n、 m、r。
(CDC1,):δ5.480 (m、H−8” 、 5.42 (d。
J 12.5 Hzと重り合う、ベンジル化合物)、5.340(dd、IH,
Jg−7・2.5. Jtl、s−8,5Hz、 H−7” )、5.052
(m、ベンジル化合物(d)及びH−2’ dd (J+ 28.0.J221
0.OHzを含む)5゜000 (dd、IH,、L 43.5Hz、H−4’
)、4゜490 (d、IH,J lO,OHz、NH)、4.860(dd
d、IH,J3−−−.4− 4.5.、L、−4,12,0゜J4−6− 1
1.0Hz、 H4” ) 、4.640 (m、、2H。
H−1゛及びH−3°を含む) 、 3.660 (s、3H。
0CHs)、2.780 (d d、Jt、s 8.5Hz H2) 。
2.604 (d d、l H9Js−−−、s・−13,0Hz)、2.30
0 (t、J 7. 5Hz、CHt cot)、2.260. 2.170.
2.115,2.080 (3)、2.050,1.985゜1.830 (7
s、27H,80Ac、I NAc)。
1.67 (t、IH,Js、−、、s−、、12,5)1z、J H3ax)
、1.600 (m、6H,メチレン類)、1.240(m、8H,メチレン類
)。
0.8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミド−3,5−ジデオキシ
−D−グリセロ−α−D−ガラクトー2−ノヌロピラノシロン酸)−(2→3)
−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−(l→4)−0−(2−アミノ−2−
デオキシ−β−D−グルコピラノシド(トリサツカリド1lc)の製造
純粋なトリサツカリド9(53mg、0.04ミリモル)の溶液をメタノール中
、炭素担持5%パラジウムの存在下、22°Cにおいて1時間水素化する。触媒
を濾過し、メタノールを蒸発させると酸中量体(44mg)が得られる。[ff
]o+11.3° (c、0.22、水)。この化合物を触媒量のナトリウムメ
トキシドを用いてメタノール中、22°Cにおいて24時間脱0−アセチル化す
る。酢酸による中和後に得られる溶液を蒸発させると後に物質か残り、これをバ
イオゲルP2によるクロマトグラフィーで精製してl・リサッカリド11 c
(29,5mg、99%)を得る。[cr]o 5.5° (c、0.22、水
)。
’H−n、m、r、のデーターは前記の表IIに示される。
D、8−メトキシカルボニルオクチル(ベンジル−5−アセトアミド−4,7,
8,9−テトラ−〇=ニアセチル−3,5−ジデオキシD−グリセロ−α−D−
ガラクトー2−ノヌロビラノシロネー))−(2→3)−0−(2,4,6−)
ソー0−アセチルーβ−D−ガラクトピラノシル)−(l→4)−0−(6−0
−アセチル−2−デオキシ−2−N−プロピオンアミド−β−D−グルコピラノ
シド)(トリサツカリド10)の製造粗アミノ化合物9 (98mg、 0.0
8ミリモル)をピリジンと水との混合物(ピリジン/水比、約10:1)中のそ
のトリサツカリド化合物9の溶液に無水プロピオン酸を10分間にわたり滴下す
ることによってN−プロピオネート化する。この混合物を22℃において一晩撹
拌し、真空蒸発させ、そしてトルエンと同時蒸発させると後に残分が残り、これ
をクロマトグラフ(100:10のトルエン:エタノール)に掛けるとトリサツ
カリドl0(75,4mg、71%)が得られる。((Z) o +10゜3°
(c O,17,りooホルム); ’H−n、m、r。
(CDCIg):δ7.400 (m、5H,芳香族化合物)。
5.543 (d、IH,J 7.5Hz、 NH)、 5.480(m、IH
,H−8”)、5.440 (d、IH,J 12、5 Hzベンジル化合物)
と重り合う、 5.341 (dd。
IH,Ja・7− 2.5. Jt−、*−8,5Hz、 H7” ) 、49
0−5.000 (m、3H,ベンジル化合物(5,051゜d、J 12.5
Hz)、H−2’ (5,038,dd。
Jl 28.09 Jt 810.0Hz)、及びNH(d、Jl 0、5 H
z)を含む)、4.859 (ddd、IH。
Jl−**、4− 4.6.Jl−am、4−12.5.Ja−、*210.5
Hz。
H−4” ) 、 4.610−4.69 (m、 2H,H−ビ(d)及びH
−3’ (dd)を含む) 、 3.58−3.70(m、2H,OCH* (
s、3.668)を含む)、2.602 (d d、I HlJ x、**、s
、−12−5Hz、H3”eQ)、2.150−2.330 (m、IOH,1
nch、。
CH2CO2(t、J 7.5Hz)、NHCOCHz (q。
J 7.5 Hz)及びアセチル化合物(2,260,2,+ 80゜2s))
、2.088 (4)2.068,1.987.1.838 (4s、21H,
アセチレン化合物)、1.662 (t。
IH,H−3” ax)、1.570 (m、6H,メチレン類) 、 1.2
40 (m、8H,メチレン類)、1.130(t、3H,CHC2CHI)。
E、8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミl’−3,5−ジデオキ
シ−D−グリセロ−α−D−ガラクトー2−ノヌロピラノシロン酸)−(2→3
)−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−(l→4)−0−(2−デオキシ−
2−N−プロピオンアミド−β−D−グルコピラノシド(lid)の製造
トリサツカリド10 (71mg、 0.055ミリモル)をトリサツカリドl
lcの合成において示したのと同じようにして水素化して中間体生成物(64m
g、97%)を得る。[α1.−22.6° (c、0.23、クロロホルム)
。この物質を常法の通りに脱O−アセチル化し、その回収された物質をバイオゲ
ルP2によるクロマトグラフに掛けると、トリサツカリドlid(39mg、8
3%)が得られる。[α]、−8,5° (c、0.2、水)。
’H−n、m、r、のデーターは前記の表1■に示される。
実施例3−予備フコシル化
i、GDP−フコースの合成
テトラ−n−ブチルアンモニウムヒドロキシド(40%w/w水溶液、約150
g)を燐酸(85%w / w水溶液、18g、0.155ミリモル)の水(
150mL)中溶液にpHが7に達するまで滴下した。次いで、水を真空蒸発さ
せてシロップを得、これを乾燥アセトニトリル(2x400mL)、続いて乾燥
トルエン(2X400mL)と共に同時蒸発させた。得られた白色固体(75g
)を真空乾燥し、使用時まで五酸化燐上で真空の下において貯蔵した。
ビス(テトラ−n−ブチルアンモニウム)水素ホスフェ−1−(58g、127
.8ミリモル)の乾燥アセトニトリル(300mL)中溶液を分子篩(4人、2
0g)の存在下、窒素の下で室温において約1時間撹拌した。トリー〇−アセチ
ル フコシル−1−プロミド(ヌネッッ等66の方法でL−フコーステトラアセ
テート31g、93ミリモルから製造したばかりのもの)の乾燥トルエン(10
0mL)中溶液を0°Cにおいて冷却された上記の溶液に約0.5時間で滴下し
た。O″Cにおいて1時間以上経過した後、その混合物を室温にもたらし、3時
間撹拌した。t、1.C,(1:1のトルエン:酢酸エチル)は基線(base
1ine)上に主スポットを、そして幾つかのもっと早く移動するもっと小さ
いスポットを示した。
この混合物をセライトのパッド(アセトニトリルで更に洗浄したもの)を介して
濾過し、そしてその溶剤を真空蒸発させて赤色のシロップを得た。この物質を水
(400mL)に溶解し、そして酢酸エチル(250mL、2回)て抽出した。
次に、その水性層を真空蒸発させると後に黄色がかったシロップが残り、これに
水酸化アンモニウム溶液(25%水溶液、200 mL)を加えた。この混合物
を室温で3時間撹拌し、その後t、1.c、(65:35:8のクロロホルム:
メタノール:水)は基線スポットを示した。その溶剤を真空蒸発させて黄色がか
ったシロップを得、これを水(400mL)で希釈した。
この溶液のpHをチェックし、必要あれば少量の塩化水素の添加によりI)H7
にした。この溶液をイオン交換樹脂・ダウエックス2×80カラム[200〜4
00メツシユ、5X45cm、この樹脂のメタノール(800mL)、水(12
00mL)、重炭酸アンモニウム(IM、1600mL)及び水(1200mL
)による逐次洗浄によって調製された重炭酸塩形コにゆっくり吸着させた。次に
、このカラムを通して水(1000mL)、続いて重炭酸アンモニウム溶液(0
,5M、2.3 mL/分、−晩)を流した。溶離液を複数画分(15mL)に
分けて採集し、生成物をt。
1、c、プレート上にスポットを形成させた後炭化させることによって検出した
。両分20〜57をプールし、真空蒸発させると後に白色固体が残った。この固
体を更に水(3X300ml)と共に同時蒸発させ、最後の501111を凍結
乾燥し、次いでその残分を真空ポンプを用いて乾燥してβ−L−フコピラノシル
ー1−ホスフェート(9,5g、40%)を、 ’H−n、m、r、スペクトル
中、δ=1.940におけるシングレットによって同定される若干の酢酸アンモ
ニウムを含有するβアノマーとαアノマーとの12:1混合物として得た。この
生成物をダウエックス5×8樹l1l(100〜200メツシユ、トリエチルア
ンモニウム形)のカラムを通してゆっくり流し、そして水で溶離させると、溶離
液の凍結乾燥後β−L−フコピラノシル−1−ホスフェートのビス−トリエチル
アンモニウム塩が粘着性のガムとして得られた。
’H−n、m、r、δ:4.840 (dd、Jl、2 =J+、p =7.5
Hz、Hl) 、3.82 (Q、I H,Js、s6.5Hz、H5)、3.
750 (dd、IH,Js、< 3.5゜J、、、1.0)1z、H−4)
、3.679 (dd、I H。
+2.2 +0.OH2,H3) 、3.520 (dd、 IH,H−2)
、 1.940 (S、アセテート)、 1.26 (d、 H−6)、3.2
0 (q、+7.4Hz、NC旦、)と1゜280及び1.260 (NCH2
CHs及びH−6)における信号の積分はその生成物が大規模に乾燥すると一部
のトリエチルアンモニウムを放す可能性のあるビス−トリエチルアンモニウム塩
であることを示している。+”C−n、m、r、δ: 98.3 (d、Jc、
、P 3.4H2,C−1)、72.8 (d、JC,2P 7.5H2,C−
2)、16.4(C−6); ”P−n、m、r、δ;+2.6(S)。
β−L−フコピラノシルー1−ホスフェートは水中、22°Cにおいて長期間貯
蔵すると(1日以上)ゆっくり分解して行く模様であり、従ってこの物質は22
°C以上の温度において水溶液として放置し、取り扱い又は貯蔵すべきてはない
。本発明の場合、この物質を一18°Cに保ち、五酸化燐上て真空乾燥した後火
の工程で使用した。
グアノシン 5“−(β−1−フコピラノシル)−ジホスフェートはβ−L−フ
コピラノシルー1−ホスフェートから以下に記載するこの技術分野で認められて
いる2つの異なる手法を用いて製造した。
手法#l
β−L−フコピラノシルー1−ホスフェートとグアノシン 5′−モノ−ホスホ
モルホリゾート[4−モルホリン−N、N“ −ジシクロへキシル−カルボキサ
ミジン塩、ミズーリー州(Missouri) 、セントルイスのシグマ社から
入手、“GMP−モルホリゾート”]とをヌネッツの元々の手法66の最近の修
正法@466に記載されるように反応させた。よって、トリーn−オクチルアミ
ン[0,800g、ウィスコンシン州(Wiscons in)、ミルウォーキ
ー(Mi Iwaukee)のアルドリッチ・ケミカル社(Ardrich C
hemical Company)から入手]をβ−L−フコピラノシルー1−
ホスフェート(トリエチルアンモニウム塩、1.oOg、約2.20ミリモル)
の乾燥ピリジン(10mL)中温合物に窒素下で加え、次いで溶剤を真空下で除
去した。このプロセスを乾燥空気だけがそのフラスコに入るように注意しながら
3回繰り返した。GMP−モルホリゾート(2,4g、約3.30ミリモル)を
乾燥ジメチルホルムアミドとピリジンとのl:1混合物(lOmL)に溶解させ
た。それら溶剤を真空蒸発させ、そしてこの手順を上記のように3回繰り返した
。その残分を同し溶剤混合物(20mL)に溶解し、その溶液を粉砕された分子
篩(2g、4人)が加えられた前記の反応フラスコに加えた。この混合物を窒素
下、室温において撹拌した。t、1.C,(水酸化アンモニウム、イソプロパツ
ール及び水の3:5:2の25%水溶液)は出発GMp −モ/I、ホリデート
(Rf−0,8、U、V、) 、グアノシン 5゛−(β−1−フコピラノシル
)−ジホスフェート(Rf〜0.5、U、V、及び炭化)に相当するスポットを
、続いて出発フコース−1−ホスフェート(Rf〜0.44、炭化)の尾引きス
ポットを示した。U、V。
活性の追加スポットも僅かに存在していた。室温において4日間撹拌した後、そ
の黄色がかった混合物をトルエンと共に同時真空蒸発させ、そしてその黄色がが
った残分を更に真空ポンプて一晩乾燥すると後に粘稠な残分(2,43g)が残
った。次に、そのフラスコに水(10mL)を加えて黄色の曇った溶液を得、こ
れをAG50W−XI2(バイオラド社から入手)樹脂のカラム(100〜20
0メツシユ、25 Xl、 5cm、 Na”形)の頂部に加えた。生成物を気
孔率後に水で溶離させた。t、1゜C,プレート上にスポットを形成させた後に
U、V、と炭化の両者により両分(これは活性であった)を回収し、その溶液を
真空下で一晩凍結乾燥すると粗製物質(1,96g)か得られた。
この残分を水(10mL、総量)に溶解し、そして水、メタノール及び水(各2
50+nL)で洗浄することによって状態調節された疎水性C11シリカゲルの
カラム(ウォータース社、2.5 x 30 cm)にゆっくり吸着させた。次
に、二〇カラムを通して水を流しく0.4 mL/分)、溶離液を複数画分(0
,8mL)として採集し、それら画分をt。
1、c、(水酸化アンモニウム、イソプロパツール及び水の3:5:2の25%
水溶液)でチェックした。β−L−フ:lピラ)シル−1−ホスフェート(Rf
−0,54、炭化)は両分29〜45に溶離された。強いU、V、活性スポット
(Rf−0,51)を示す生成物は主として両分46〜65に溶離させた。Rf
が以上のものより大きいか又は小さいその他の少量のU、V、活性スポットが観
察された。グアノシン 5′ =(β−■−フコピラノシル)−ジホスフェート
(Rf〜0.62)を含有する両分59〜86はまた狭いU、V、活性スポット
(Rf〜0.57)を示した。両分59〜86をプールし、−晩凍結乾燥すると
グアノシン 5゛−(β−1−フコピラノシル)−ジホスフェートに富んだ物質
0.353 gが得られた。 ’H−n、m、r、は、この物質はδ=4.12
及びδ=5.05に信号を与える少量の不純物で汚染されていることを示した。
画分29〜45及び画分47〜57を別個にプールし、凍結乾燥するとβ−L−
フコピラノシルー■−ホスフェート(それぞれ0.264 g及び0.223g
、これらにおいて第二両分は若干の不純物を含有している)が回収された。適切
な両分をプールすると、時には、若干量のグアノシン 5′ =(β−1−フコ
ピラノシル)−ジホスフェートが高純度(’H−n、m、r、)で得られた。
一般的には、グアノシン 5° −(β−1−フコピラノシル)−ジホスフエ−
1・に富んだ物質を全て最低量の水に溶解し、大量のメタノールで、続いて水で
洗浄することによって再生された同じカラムに流した。精製されたグアノシン
5゛−(β−1−フコピラノシル)−ジホスフェー1− (t、1.c、)を含
有する両分をプールし、真空下で凍結乾燥すると後に白色のふあふあした物質(
187g、16%)が残った。 ’H−n、m、r、は前記で報告したデーター
55と同一であった。
手法#2
β−L−フコピラノシル=1−ホスフェート及びグアノシン 5′−モノホスモ
ルホリゾート(4−モルホリン−N、N’ −ジシクロへキシル−カルボキサミ
ジン塩−“G M P−モルホリゾート”)を前記の元々の手法$5に示される
通りに乾燥ピリジン中で反応させた。よって、β−L−フコピラノシルー1−ホ
スフェート(トリエチルアンモニウム塩、0.528g、約1.18ミリモル)
を乾燥ピリジン(20mL)に溶解し、そして溶剤を真空下で除去した。このプ
ロセスを乾燥空気だけがそのフラスコに入るように注意しなから3回繰り返した
。GMP−モルホリゾート(1,2g、約1.65ミリモル)及びピリジン(2
0mL)をその反応フラスコに加え、その溶剤を真空蒸発させ、そしてこのプロ
セスを上記のように3回繰り返した。その最終残分にピリジン(20mL)を加
え、その不均質混合物を窒素下、室温において3〜4日間撹拌した。この結果、
不溶物か形成され、これは時には音波処理で粉砕しなければならなかった。
この反応の後にt、1.c、を行い、そして第一手法に示したように処理してG
DP−フコース(120mg。
16%)を得た。
ii、酵素反応条件
βGa1(1→3/4)βGIcNAc α(1−+3/4)フコシルトランス
フェラーゼをパルシック等■が記載するGDP−ヘキサノールアミンセファロー
スによるアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法に従ってヒトの乳から
精製した。この酵素反応はプラスチック管中で37°Cにおいてナトリウム力コ
ディレート緩衝液(100mM、 pH6,5) 、MnC12(10mM)
、ATP (1,6mM) 、 NaN2(1,6mM)を用いて行った。最終
反応混合物をH20(5mL)で希釈し、そして既報■のようにCI8セブーパ
ックカートリッジに適用した。
H20(30mL)で洗浄後、その生成物をCHtOHで溶離させ、それらの溶
剤を蒸発させた。その残分をCHCl5 、CH20H及びH,Oの65 :
35 : 5混合物に溶解し、そしてイアトロビーズ(0,200〜0.500
g)の小さなカラムに適用した。同じ溶剤混合物で洗浄した後、生成物を同じ溶
剤の65 : 35 : 8混合物適切な両分(t、1.c、)をプールし、溶
剤を真空蒸発させ、その残分をH,O中のAC30WX8 (Na”形)(バイ
オラド社)の小さなカラムを通して流し、そして生成物を真空下での凍結乾燥後
に回収した。それらテトラサツカリドの’H−n、m、r、データーは前記の表
IIに示されている。
i i i、 フコシル化反応
A、8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミド−3,5−ジ−デオキ
シ−D−グリセロ−α−D−ガラクトー2−ノヌロピラノシロン酸)−(2→3
)−0−[β−D−ガラクトピラノシル]−(l→4)−0−[α−L−フコピ
ラノシル−(l→3)−0] −(2−アジド−2−デオキシ−β−D−グルコ
ピラノシド)(テトラサツカリド12b)の製造
トリサツカリドl l b (7,7mg) 、GDP−フコース(18mg)
、フコシルトランスフェラーゼ(20mu)及び子ウシの腸のアルカリ性ホスフ
ァターゼ(IOU)を緩衝液(2mL)中て72時間インキュベートした。単離
及び精製するとテトラサツカリド12b(2,84mg)が得られた。
8.8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミド−3,5−ジ−デオキ
シ−D−グリセロ−α−D−ガラクトー2−ノヌロピラノシロン酸)−(2→3
)−0−[β−D−ガラクトピラノシル]−(l→4)−0−[α−L−フコピ
ラノシル−(l→3) −0] −(2−アミノ−2−デオキシ−β−D−グル
コピラノシド)(テトラサツカリド12C)の製造
トリサツカリドl 1 c (8,4mg) 、GDP−フコース(18mg)
、フコシルトランスフェラーゼ(20mU)及び子ウシの腸のアルカリ性ホスフ
ァターゼ(IOU)を緩衝液(2mL)中で67時間インキュベートした。単離
及び精製するとテトラサツカリド12 C(2,46o+g)が得られた。
C,8−メトキシカルボニルオクチル(5−アセトアミド−3,5−ジ−デオキ
シ−D−グリセロ−α−D−ガラクトー2−ノヌロピラノシロン酸)−(2→3
)−0−[β−D−ガラクトピラノシル]−(l→4)−0−[α−L−フコピ
ラノシル−(l→3)−01−(2−N−プロピオンアミド−2−デオキシ−β
−D−グルコピラノシド)(テトラサツカリド12d)の製造トリサツカリド1
1 d (8,3mg) 、 GDP−フコース(18mg)、フコシルトラン
スフェラーゼ(18ml)及び子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ(IOU
)を緩衝液(2mL)中で72時間インキュベートした。単離及び精製するとテ
トラサツカリド12 d (6,17mg)が得られた。
実施例5−人工抗原の合成
グリコシド部分に適切な官能基を有するシアリルルイス1類似体は1種又は2種
以上の相補性官能基を有する抗原性キャリアーにこの技術分野で公知の手法に従
ってコンジュゲートさせることができる。使用される結合化学的方法に依存して
、シアリル基及びフコシル基をコンジュゲートされるべきサツカリドに含めるこ
とができ、即ちβGal (1−”4)βGlcNAc誘導体をコンジュゲート
させ、得られたコンジュゲートをシアリル化及びフコシル化してシアリルルイス
1類似体をあたえることができる。
具体的に述べると、構造22bのようなジサッカリドグリコシドのBSA、KL
H又は他のキャリアーへのコンジュゲート化はレミオークス等及びピント等の“
アシルアジド”法61s2のような手法で達成される。得られるコンジュゲート
を次に前記の方法と同様の方法でシアリル化及びフコシル化し、その生成物を限
外濾過とゲル−濾過との組み合わせで精製して1種又は2種以上のシアリルルイ
ス1類似体が結合された人工抗原を得る。
同様に、人工抗原を創製するのにKLH、ヒト血清アルブミン(H3A) 、ジ
フテリア又は破傷風の毒素、S一層等を含めて他の抗原性キャリアーを用いるこ
とができる。同様に、βGal (1−4)βG1cNAcの他の誘導体を化合
物22bに代えて用いられる抗原性キャリアーにコンジュゲート(カップリング
)させることができるだろう。
別法として、テトラサツカリド+2bを1種又は2種以上の相補性官能基を有す
る抗原性キャリアーにこの技術分野で公知の手法に従って直接コンジュゲートさ
せることができる。例えば、テトラサツカリド12bの−(CH2)、CO,C
H□アグリコンはこれをヒドラジンとN2O4との反応で変性してそのエステル
(COOCH,)をアシルアジド(−C(0)N、)に転化させることができる
。アシルアジドは次いで抗原性キャリアー上のアミノ官能基との反応で置換され
、その結果アルファーシアリル化オリゴサツカリドグリコシドはアミド結合を介
してキャリアーに結合せしめられる。
キャリアーは無数のアミン基を含有していることができるので、キャリアーは1
種より多いシアリルルイス8誘導体を付加することができる。
実施例6−シアリルルイス3類似体を含有するアグレゲート(aggregat
e)の合成
リポソーム及びミセルのようなアグリゲートはシアリルルイス8類似体を組み込
むように製造することができる。具体的に述べると、シアリルルイス8類似体の
そのようなアグリゲートへの組み込みはアグリコン部分がそのようなアグリゲー
トに組み込まれるべく十分に疎水性であることを要する。このような疎水性アグ
リコンは、サツカリドをアグリゲートに組み込む能力を改善すると思われるナフ
チル、置換ナフチル、オクチル等のような種々の部分で延長されているー(CH
t)* C00CH。
を含むことができると考えられる。
このようなアグリゲートにおいて、シアリルルイス1類似体の疎水性アグリコン
基はアグリゲートの脂質部分に分配されて行き、これに対してテトラサツカリド
基は一般に水性相に分配される。
このようなアグリゲートの製造法はこの技術分野で周知である。例えば、本明細
書において引用、参照するものとする米国特許第4,522.803号明細書を
参照されたい。
更に、シアリルルイス1類似体は、代理人のドケットNo、000475−01
1として、本出願と同時に出願された、“変性されたシアリルルイス8化合物”
と題される米国特許出願第07/887,747号明細書に開示される。上記の
ように、この出願は本出願と同時に出願されたもので、その全体を本明細書にお
いて引用、参照するものとする。
以上、本発明をここに十分に説明したが、当業者であれば、本発明はその範囲と
精神又は本発明の任意の態様に影響を及ぼすことなく、広いかつ均等な条件、パ
ラメーター等の範囲内で実施することができることは分かるだろう。
本発明の前記実施方法の、医学、化学、生化学、免疫学及び/又は関連分野の当
業者に自明な修正は以下の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
Figure 5
胚
Figure 8
↓
柘
Figure 9
B、−1アルキル
補正書の写しく翻訳文)提出書(曲性@184条の8)平成5年12月9日
Claims (15)
- 1.式I ▲数式、化学式、表等があります▼I で表される化合物及びその製剤上許容し得る塩:ただし、式中の Rは水素、サッカリド、オリゴサッカリド又は少なくとも1個の炭素原子を有す るアグリコンより成る群から選択され; R1は水素、−NH2、−N2、−NHSO3H、−NR8C(O)R6、−N =C(R7)2、−NHCH(R7)2、−N(R8)2、−SR6、−O(C (O))pR9、フルオロ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選 択され、ここでR6は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、 フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜 4個のアルコキシ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選択される 1〜3個の置換基で置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2個 以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル、 アミノ酸残基又はポリペプチジル残基、−OR10(ただし、R10は炭素原子 数1〜4個のアルキル、又はヒドロキシル基で置換された炭素原子数2〜4個の アルキルである)、及び−NR11R12(ただし、R11及びR12は独立に 水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択される) よりなる群から選択され、 端R7は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され 、 R3は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され、 R3は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、 フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜 4個のアルコキシ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選択される 1〜3個の置換基で置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2個 以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル よりなる群から選択され、そして pは0又は1に等しい整数であり; R2は水素、−N3、−NH2、−NHSO2H、−NR15C(O)R12、 −N=C(R14)2、−NHCH(R14)2、−N(R16)2、−O(C (O))qR16、フルオロ、クロロ及びサルフェートよりなる群から選択され 、ここで R13は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子 数1〜4個のアルキル、 アミノ酸残基又はポリペプチジル残基、−OR17(ただし、R17は炭素原子 数1〜4個のアルキル、又はヒドロキシ基で置換された炭素原子数2〜4個のア ルキルである)、及び −NR18R19(ただし、R18及びR19は独立に水素及び炭素原子数1〜 4個のアルキルよりなる群から選択される) よりなる群から選択され、 各R14は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ れ、 各R15は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ れ、 R16は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子 数1〜4個のアルキル よりなる群から選択され、そして qは0又は1に等しい整数であり; R3は水素、フルオロ及びヒドロキシよりなる群から選択され; R4はシアリルであり; R5はし−フコシルであり;そして YはO、S、−NH−及び結合よりなる群から選択されり; ただし、R1がヒドロキシルであり、かつR2が−NHC(O)CH3であると き、R3はヒドロキシではない。
- 2.R3がヒドロキシルである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 3.R1がヒドロキシル、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、フルオロ、クロロ 又はプロモである、請求の範囲第2項に記載の化合物。
- 4.R2が−NH2、−NHC(O)R13又は−N3よりなる群から選択され る、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 5.R4がNeu5Acである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 6.R5がフコースである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 7.R1がヒドロキシであり、R2がアジドであり、R3がヒドロキシであり、 R4がNeu5Acであり、そしてR5がフコースである、請求の範囲第1項に 記載の化合物。
- 8.R1がヒドロキシであり、R2が−NH2であり、R3がヒドロキシであり 、R4がNeu5Acであり、そしてR5がフコースである、請求の範囲第1項 に記載の化合物。
- 9.R1がクロロであり、R2が −NHC(O)CH3であり、R3がヒドロキシであり、R4がNeu5Acで あり、そしてR5がフコースである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 10.R1がプロモであり、R2が −NHC(O)CH3であり、R3がヒドロキシであり、R4がNeu5Acで あり、そしてR5がフコースである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 11.R1がフルオロであり、R2が −NHC(O)CH3であり、R3がヒドロキシであり、R4がNeu5Acで あり、そしてR5がフコースである、請求の範囲第1項に記載の化合物。
- 12.製剤上不活性なキャリアー及び有効量の請求の範囲第1項に記載の化合物 を含んで成る、哺乳動物に投与して該哺乳動物における細胞性免疫応答を変調す るのに適した製剤組成物。
- 13.細胞性免疫応答を変調する際に有効な量の請求の範囲第1項に記載の化合 物を哺乳動物に投与することから成る、該哺乳動物における該免疫応答を変調す る方法。
- 14.次の: (a)式II ▲数式、化学式、表等があります▼II(式中、R、R1、R2、R3及びYは 前記で定義された通りである。) の化合物を選択し; (b)該化合物をそのガラクトース部分の3位においてβGal(1→3/4) βGlcNAcα(2→3)−シアリルトランスフェラーゼ及びβGal(1→ 3)βGalNAcα(2→3)−シアリルトランスフェラーゼより成る群から 選択されるシアリルトランスフェラーゼによりシアリル化してα(2→3)シア リル残基をガラクトース単位上に入れ;そして(c)工程(b)で製造された化 合物をそのN−アセチルグルコサミン部分の4位においてβGal(1→3/4 )βGlcNAcα(1→3/4)フコシルトランスフェラーゼによりフコシル 化してN−アセチルグルコサミン単位上にα(1→4)フルコシル残基を形成す る 工程を含んで成る、請求の範囲第1項に記載の化合物の製造法。
- 15.式 [オリゴサッカリド−Y−R23]p−Agで表される人工抗原:ただし、オリ ゴサッカリドは式I▲数式、化学式、表等があります▼I で表される化合物であり;式中の R1は水素、−NH2、−N3、−NHSO3H、−NR8C(O)R6、−N =C(R7)2、−NHCH(R7)2、−N(R8)2、−SR8、−O(C (O))pR9、フルオロ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選 択され、ここでR6は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、 フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜 4個のアルコキシ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選択される 1〜3個の置換基で置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2個 以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル、 アミノ酸残基又はポリペプチジル残基、−OR10(ただし、R10は炭素原子 数1〜4個のアルキル、又はヒドロキシ基で置換された炭素原子数2〜4個のア ルキルである)、及び −NR11R12(ただし、R11及びR12は独立に水素及び炭素原子数1〜 4個のアルキルよりなる群から選択される) よりなる群から選択され、 端R7は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され 、 R8は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択され、 R9は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ、炭素原子数1〜4個のアルコキシ、 フェニル、並びにヒドロキシ、炭素原子数1〜4個のアルキル、炭素原子数1〜 4個のアルコキシ、クロロ、プロモ及びサルフェートよりなる群から選択される 1〜3個の置換基で置換されたフェニルよりなる群から選択される1個又は2個 以上の置換基で置換されている炭素原子数1〜4個のアルキル よりなる群から選択され、そして pは0又は1に等しい整数であり; R2は水素、−N3、−NH2、−NHSO2H、−NR15C(O)R13、 −N=C(R14)2、−NHCH(R14)2、−N(R15)2、−O(C (O))qR16フルオロ、クロロ及びサルフェートよりなる群から選択され、 ここで R13は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子 数1〜4個のアルキル、 アミノ酸残基又はポリペプチジル残基、−OR17(ただし、R17は炭素原子 数1〜4個のアルキル、又はヒドロキシル基で置換された炭素原子数2〜4個の アルキルである)、及び−NR18R19(ただし、R18及びR19は独立に 水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択される) よりなる群から選択され、 各R14は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ れ、 各R15は独立に水素及び炭素原子数1〜4個のアルキルよりなる群から選択さ れ、 R16は 水素、 場合によってヒドロキシ、クロロ、プロモ及び炭素原子数1〜4個のアルコキシ よりなる群から選択される1個又は2個以上の置換基で置換されている炭素原子 数1〜4個のアルキル よりなる群から選択され、そして qは0又は1に等しい整数であり; R2は水素、フルオロ及びヒドロキシよりなる群から選択され; R4はシアリルであり; R5はL−フコシルであり;そして YはO、S、−NH−及び結合よりなる群から選択され; R23は抗原性キャリアーに結合され得るアグリコン部分であり; pは少なくとも1に等しい整数であり;そしてAgは抗原性キャリアーである。
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