CN111676259A - 一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法。本发明以单糖及其衍生物为原料,利用生物酶催化合成糖核苷酸及其衍生物,未反应完的原料和杂质经钡离子选择性沉淀,离心除去沉淀物,最后得到高纯度的糖核苷酸及其衍生物。本发明公开的生物酶来自原核生物,具有蛋白表达量高、底物适应性宽、催化效率高等优点,并且生物酶催化合成具有高效性、高区域选择性等优势。本发明还优化了生物酶的反应浓度,将价廉、易得的单糖及其衍生物高效地合成昂贵的糖核苷酸及其衍生物。本发明还使用离子沉淀法对产物进行纯化,该纯化步骤操作简单易于放大,并且能够降低成本,提高产物收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物合成与纯化技术领域,具体涉及一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法。
背景技术
糖是细胞生命活动所必需的三种生物大分子之一。糖在生命活动过程中发挥着极为重要的作用,是生命活动的能量来源,也是生物体的结构组分。糖能够以游离糖链及与非糖物质,如蛋白质、脂质等形成糖缀合物等形式存在,在正常生命活动如细胞间相互作用、炎症反应、信号转导、受精和发育等诸多过程中发挥着关键作用;此外,糖及糖缀合物也参与了重大疾病的发生发展过程。从糖科学的新视角探索糖链在疾病发生、发展和转移过程中的功能及分子机制是科学研究的热点。化学结构明确糖类化合物的高效获得是制约整个糖科学发展的瓶颈之一。糖基转移酶催化的寡糖合成具有效率高、选择性好、无需对糖底物进行保护等优点,是糖类化合物合成的重要手段之一,但其合成所必需的糖核苷酸供体难于制备和价格昂贵,在一定程度上限制了其在寡糖合成中的应用。
糖核苷酸(sugar nucleotide)在结构上是单糖的还原端与核苷二磷酸或者核苷一磷酸的末端磷酸基团连接而成的化合物,是单糖的活化形式。糖核苷酸是Leloir型糖基转移酶催化寡糖合成所必需的供体底物,是体外复杂寡糖的酶法合成过程的必需供体底物,在研究糖基转移酶的底物识别及其它生化性质方面具有非常重要的作用;糖核苷酸的类似物及衍生物在特异性配体靶向递送及新药研发方面也有广阔应用前景。
以往的文献和专利已公开可通过天然物萃取法、化学合成法、生物合成法,或并用上述方法来制备糖核苷酸。糖核苷酸存在于细胞内生物代谢过程中,但是其在细胞内保持较低的浓度水平,无法通过天然物萃取法获得大量高纯度糖核苷酸用于糖科学研究。目前常用的制备糖核苷酸的方法是化学合成法、生物合成法,或并用上述方法。
Oberthür等在A practical method for the stereoselective generation ofp-2-deoxy glycosylhosphates.([J].Org Lett,2004,6(17):2873-2876)报导了一系列2-脱氧糖的单磷酸化反应,方法是先在二氯甲烷中用草酰氯得到α-氯代的糖,然后用磷酸取代氯原子得到选择性较好的产物。Sawa等在Glycoproteomic probes for fluorescentimaging of fucosylated glycans in vivo.([J].Proc Natl Acad Sci,2006,103(33):12371-12376)报导的方法则是用氢溴酸、四氯化钛体系将糖-溴化,然后在甲苯中用四正丁基磷酸二氢铵(TBAP)进行取代,得到比例很高的单磷酸化产物。Wu等在A retro-evolutionstudy of CDP-6-deoxy-D-glycero-L-threo-4-hexulose-3-dehydrase(E1)fromYersinia pseudotuberculosis:Implications for C-3 deoxygenation in thebiosynthesis of 3,6-dideoxyhexoses.([J].Biochemistry,2007,46(12):3759-3767)用三氯乙腈和碳酸钾在二氯甲烷中活化糖生成三氯乙酰亚胺脂,然后用磷酸二苄酯取代得到构型的产物,最后用钯碳催化加氢脱去苄基得到糖1-磷酸。Müller等在Investigationstowards the synthesis of dTDP-2,6-dideoxy-D-erythro-3-hexulose-A potentialintermediate in the biosynthesis of rare sugars.([J].Tetrahedron Lett.,1997,38(31):5473-5476)使用氯膦酸二乙酯在二异丙基乙基胺(DIPEA)的碱性作用下水解磷酸二乙酯得到产物。Huestis等在Lipophilic sugar nucleotide synthesis by structure-based design of nucleotidylyltransferase substrates.([J].Org Biomol Chem,2008,6(3):477-484)类似的使用了氯膦酸二苯酯得到磷酸化产物。Zhao等在Synthesis ofa deoxysugar dinucleotide containing an exo-difluoromethylene moiety as amechanistic probe for studying enzymes involved in unusual sugarbiosynthesis.([J].J Org Chem,2001,66(20):6810-6815)使用丁基锂作碱,试剂为氯膦酸二苄酯,反应后得到构型产物然后用钯碳加氢脱去磷酸上的苄基。Chen等在Expression,purification,and characterization of two N,N-dimethyltransferases,Ty1M1 andDesVI,involved in the biosynthesis of mycaminose and desosamine.([J].Biochemistry,2002,41(29):9165-9183)和Lazarevi等在Artificial N-functionalizedUDP-glucosamine analogues as modified substrates for N-acetylglucosaminyltransferases.([J].Carbohydr.Res,2006,341(5):569-576)都使用亚磷酰胺在四氮唑的活化下直接与糖反应得到糖1-亚磷酸二苄酯,再用间氯过氧苯甲酸(mCPBA)将亚磷酸酯氧化成磷酸酯后脱去苄基得到产物。Moffatt等在The synthesis and some reactions ofnucleoside-5'phosphoromorpholidates and related compounds.Improved methodsfor the preparation of nucleoside-5'polyphosphates.([J].J Am Chem Soc,1961,83(3):649-658)报导了将核苷单磷酸(NMP)与吗啡啉在二环己基碳二亚胺(DCC)缩合下生成NMP磷酰吗啡啉。Wittmann等在1H-tetrazole as catalyst in phosphomorpholidatecoupling reactions:Efficient synthesis of GDP-fucose,GDP-mannose,and UDP-galactose.([J].J Org Chem 1997,62(7):2144-2147)报导了将糖1-磷酸与NMP在无水吡啶中加入四氮唑偶联反应,再将糖核苷二磷酸的保护基脱去,得到糖磷酸化产物。
化学合成的糖核苷酸的缺点:糖核苷酸带有一定的极性,在有机溶剂中不易溶解,导致化学合成糖核苷酸的产率较低;此外,化学反应条件比较剧烈,糖核苷酸在酸碱或温度过高的情况下容易发生分解。
Jiang等在A general enzymatic method for the synthesis of natural and'unnatural'UDP-and TDP-nucleotide sugars.([J].J Am Chem Soc,2000,122(28):6803-6804)从肠道沙门氏菌中提取了一种胸苷转移酶,然后在大肠杆菌中过量表达,通过体外酶反应将多种糖1-磷酸转化成糖胸苷二磷酸。Marchesan等在Chemoenzymatic synthesisGDP-azidodeoxymannoses Non-radioactive probes for mannosyltransferaseactivity([J].Chem Commun,2008,36,4321-4323)使用鸟苷转移酶得到GDP-甘露糖衍生物的产物。Zhang等在Exploiting the reversibility of natural productglycosyltransferase-catalyzed reactions([J].Science,2006,313(5791):1291-1294)发现了糖基转移酶还可以催化逆反应的发生,即从含有糖基的产物中水解下糖基并得到糖基化的反应物——糖核苷酸。
生物合成法,在体外模拟生物体内糖核苷酸及其衍生物的合成途径,目前已经成为糖核苷酸合成的主流途径;由于反应体系中起始底物和产物具有相似的理化性质和接近的分子量分布,目前糖核苷酸及其衍生物的纯化依赖于分子筛层析、制备型HPLC等纯化手段,过程复杂、收率较低、成本较高,批次只能获得毫克级产物,严重阻碍了复杂寡糖的酶法合成及糖基转移酶催化反应机理等方面的研究工作。
针对现有技术的不足,为了解决制约糖核苷酸及其衍生物合成的瓶颈问题,本发明提供了一种生物酶催化合成方法,还提供了一种通用的不依赖柱层析的离子沉淀法,旨在克级水平上大量获得高纯化的糖核苷酸及其衍生物,推动复杂寡糖的酶法合成及糖类药物的研发。
发明内容
本发明的目的是解决制约糖核苷酸及其衍生物合成的瓶颈问题,提供克级水平上大量获得高纯度糖核苷酸及其衍生物,推动复杂寡糖的合成及糖类药物的研发。
为了实现上述目的,本发明提供了一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,所述的制备方法包括:
步骤(1)利用生物酶催化单糖及其衍生物合成糖核苷酸及其衍生物粗产物;
步骤(2)利用离子沉淀法纯化得到糖核苷酸及其衍生物:
所述糖核苷酸及其衍生物的结构为通式Ⅰ:
糖基选自单糖及其衍生物脱去一分子羟基后剩余的基团,
含氮碱基选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或尿嘧啶,
n选自1、2;
优选地,所述离子沉淀法选自钡离子沉淀法。
进一步地,所述步骤(2)包括:将步骤(1)得到的含有糖核苷酸或其衍生物粗产物的混合液进行蛋白变性去除处理,然后加入盐溶液进行选择性沉淀,收集上清液,再使用离子交换树脂介质吸附杂质,处理后的上清液冻干获得糖核苷酸或其衍生物。
更进一步地,所述盐溶液为含有金属离子的溶液;优选地,所述金属离子的溶液为含有钡离子的溶液;更优选地,所述钡离子溶液为氯化钡溶液;更优选地,所述钡离子溶液为氯化钡溶液;所述钡离子能够与核苷三磷酸、核苷二磷酸形成络合物沉淀。
更进一步地,所述步骤(2)中的有机溶剂选自:甲醇、乙醇、丙酮;优选地,有机溶剂为乙醇;更优选地,有机溶剂为冰乙醇;将冰乙醇加入混合液中,4℃下静止10-60min,蛋白变性沉淀,去除蛋白。
更进一步地,所述步骤(2)中混合液在4-10℃下离心,收集上清液。
更进一步地,所述步骤(2)中离子交换树脂介质为强酸型阳离子交换树脂介质。
进一步地,糖基选自
含氮碱基选自胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶。
进一步地,所述的糖核苷酸及其衍生物选自:
式Ⅳ中的R1选自甲基、叠氮取代甲基、三氟取代甲基;
式Ⅴ中的R2选自甲基、叠氮取代甲基、三氟取代甲基。
更进一步地,所述步骤(1)包括:将单糖或其衍生物、核苷三磷酸配制成溶液,调节pH,然后添加生物酶,反应12-24h后,终止反应,得到含有糖核苷酸或其衍生物的混合液。
更进一步地,所述步骤(1)中的生物酶为激酶、糖核苷酸合成酶、焦磷酸化酶中的一种或两种以上组成的组合物;优选地,所述的激酶选自葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)、半乳糖激酶(BiGalK)、N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)、L-岩藻糖激酶/鸟苷二磷酸-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)一种或两种以上;所述的糖核苷酸合成酶选自拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)、多杀巴斯德氏菌N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸尿苷转移酶(PmGlmU)、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(AGX1)、鸟苷二磷酸-甘露糖焦磷酸化酶(PfManC)、L-岩藻糖激酶/鸟苷二磷酸-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)、胞苷一磷酸-唾液酸合成酶(NmCSS)一种或两种以上;所述的焦磷酸酶选自多杀巴斯德氏菌无机焦磷酸酶(PmPPA);更优选地,所述的生物酶的浓度为0.01-2mg/mL。
更进一步地,所述的单糖及其单糖衍生物的浓度为50-500mM。
更进一步地,所述核苷三磷酸及其衍生物的浓度为100-700mM。
更进一步地,所述步骤(1)中反应液的pH为7.0-9.0。
更进一步地,所述步骤(1)中反应温度为10-50℃,反应时间为12-24h。
更进一步地,所述步骤(1)中用有机溶剂终止反应,优选地,有机溶剂为醇类溶剂。
更进一步地,所述的方法包括:将葡萄糖醛酸(GlcA)、腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、MgCl2配制成水溶液,反应体系中GlcA、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)、拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)以及无机焦磷酸酶(PmPPA),反应12~24h,反应期间调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入冰乙醇终止反应;将反应液离心10-20min,使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃条件下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸葡糖醛酸(式Ⅱ)。
优选地,所述的方法包括:将葡萄糖醛酸(GlcA)、腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、MgCl2配制成水溶液,反应体系中GlcA、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.5,然后添加AtGlcAK、AtUSP以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入上清液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸葡糖醛酸(式Ⅱ)。
更进一步地,所述的方法包括:将半乳糖醛酸(GalA)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,GalA、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加半乳糖激酶(BiGalK)、拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应;将反应液离心收集上清液,使用移液器将氯化钡溶液逐次加入上清液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸半乳糖醛酸(式Ⅲ)。
优选地,所述的方法包括:将半乳糖醛酸(GalA)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,GalA、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.5,然后添加BiGalK、AtUSP以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入上清液,将体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸半乳糖醛酸(式Ⅲ)。
更进一步地,所述的方法包括:将N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基葡萄糖、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)、多杀巴斯德氏菌N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸尿苷转移酶(PmGlmU)以及无机焦磷酸酶(PmPPA),反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入冰乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖;
将N-乙酰氨基葡萄糖衍生物、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基葡萄糖衍生物、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加NahK、PmGlmU以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入冰乙醇终止反应;将反应液煮沸10-60min,使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖衍生物。
优选地,所述的方法包括:将N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基葡萄糖、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.0,然后添加NahK、PmGlmU以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖;
将N-乙酰氨基葡萄糖衍生物、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基葡萄糖衍生物、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.0,然后添加NahK、PmGlmU以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖衍生物。
更进一步地,所述的方法包括:N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基半乳糖、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加NahK、N-乙酰氨基半乳糖1-磷酸尿苷转移酶(AGX1)以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖;
将N-乙酰氨基半乳糖衍生物、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基半乳糖衍生物、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加NahK、AGX1以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖衍生物。
优选地,所述的方法包括:N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基半乳糖、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.0,然后添加NahK、AGX1以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖;
将N-乙酰氨基半乳糖衍生物、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,N-乙酰氨基半乳糖衍生物、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.0,然后添加NahK、AGX1以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖衍生物。
更进一步地,所述的方法包括:将岩藻糖(Fuc)、ATP、鸟苷三磷酸(GTP)、MgCl2配制成水溶液,岩藻糖(Fuc)、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、GTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加L-岩藻糖激酶/鸟苷二磷酸-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入冰乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到鸟苷二磷酸岩藻糖(式Ⅵ)。
优选地,所述的方法包括:将岩藻糖(Fuc)、ATP、鸟苷三磷酸(GTP)、MgCl2配制成水溶液,Fuc、MgCl2终浓度为200mM,ATP、GTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.5,然后添加L-岩藻糖激酶/鸟苷二磷酸-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)以及PmPPA,反应124h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到鸟苷二磷酸岩藻糖(式Ⅵ)。
更进一步地,所述的方法包括:将甘露糖(Man)、GTP、MgCl2、配制成水溶液,Man、MgCl2终浓度为100-400mM,GTP终浓度为100-700mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加NahK、鸟苷二磷酸-甘露糖焦磷酸化酶(PfManC)以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到鸟苷二磷酸甘露糖(式Ⅶ)
优选地,所述的方法包括:将甘露糖(Man)、GTP、MgCl2、配制成水溶液,Man、MgCl2终浓度为200mM,GTP终浓度为600mM,然后将反应体系pH调节至8.0,然后添加NahK、PfManC以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至8.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到鸟苷二磷酸甘露糖(式Ⅶ)。
更进一步地,所述的方法包括:将N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、胞苷三磷酸(CTP)、MgCl2、配制成水溶液,Neu5Ac、MgCl2终浓度为100-400mM,CTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加胞苷一磷酸-唾液酸合成酶(NmCSS)以及PmPPA,反应2~4h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸(式Ⅷ)。
优选地,所述的方法包括:将N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、胞苷三磷酸(CTP)、MgCl2、配制成水溶液,Neu5Ac、MgCl2终浓度为200mM,CTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至9.0,然后添加NmCSS以及PmPPA,反应2~4h,反应期间前2h每隔15min调节pH至8.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸(式Ⅷ)。
更进一步地,所述的方法包括:将半乳糖(Gal)、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,半乳糖胺、MgCl2终浓度为100-400mM,ATP、UTP终浓度为100-400mM,然后将反应体系pH调节至7.0-9.0,然后添加半乳糖激酶(BiGalK)、AtUSP以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0-9.0,检测反应完成后,加入等乙醇终止反应;使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4-10℃下离心10-60min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加离子交换树脂介质吸附杂质,得到尿苷二磷酸半乳糖(式Ⅸ)。
优选地,所述的方法包括:将半乳糖、ATP、UTP、MgCl2配制成水溶液,半乳糖胺、MgCl2终浓度为200mM,ATP、UTP终浓度为300mM,然后将反应体系pH调节至7.0,然后添加BiGalK、AtUSP以及PmPPA,反应12~24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0,检测反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液;使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,将反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,吸附去除荷正电物质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干得到尿苷二磷酸半乳糖(式Ⅸ)。
本发明提供了一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,针对不同的制备目标需要有针对性的纯化策略,并非是简单的在不同的酶的催化下,将单糖及其衍生物简单地转化成糖核苷酸及其衍生物。
本发明提供的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,提高了细菌来源单糖激酶及糖核苷酸合成酶的催化反应效果,采用不依赖柱层析的后处理策略,大幅度简化了纯化流程,实现了高附加值糖核苷酸及其衍生物的规模化纯化制备。本发明涉及的糖核苷酸合成酶以及糖激酶均为原核生物来源,具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点,以其为基础的高浓度生物酶法合成转化效率高,从价廉的单糖为原料,高效的转化为昂贵的糖核苷酸,大大降低了生产成本;离子沉淀法用于产物的后纯化过程,避免了柱层析等色谱纯化操作,降低了纯化步骤的成本,易于体系放大,提高了合成收率。
本发明提供的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,可以用于糖核苷酸及其衍生物的大量制备,为分子水平上深入研究以糖核苷酸为供体的糖链与受体的相互作用机制及构效关系以及疾病制的阐明和诊断治疗奠定了基础。
附图说明
图1是12种糖核苷酸及其衍生物化学结构式。
图2是高浓度酶法合成-离子沉淀法制备策略过程示意图。
图3是合成尿苷二磷酸葡糖醛酸的反应方程式。
图4是合成尿苷二磷酸半乳糖醛酸的反应方程式。
图5是合成尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的反应方程式。
图6是合成尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖及其衍生物的反应方程式。
图7是合成鸟苷二磷酸岩藻糖的反应方程式。
图8是合成鸟苷二磷酸甘露糖的反应方程式。
图9是合成胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸的反应方程式。
图10是合成尿苷磷酸半乳糖的反应方程式。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、葡萄糖醛酸(0.77g)、ATP.2Na(3.31g)、UTP.3Na(3.30g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.5。继续震荡至反应底物全部溶解。加入AtGlcAK(4mg)、AtUSP(4mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育12h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物Ⅱ(1.62g,收率69%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.96(d,J=8.1Hz,1H),6.02-5.95(m,2H),5.63(dd,J=7.6,3.5Hz,1H),4.39-4.36(m,2H),4.29(s,1H),4.26-4.22(m,1H),4.19(ddd,J=11.8,5.4,2.7Hz,1H),4.15(d,J=10.2Hz,1H),3.79(t,J=9.5Hz,1H),3.58(dt,J=9.8,3.1Hz,1H),3.51(t,J=9.7Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ176.29(s),166.13(s),151.72(s),141.41(s),102.55(s),95.21(d,J=6.5Hz),88.09(s),83.15(d,J=9.2Hz),73.64(s),72.87(s),72.41(s),71.69(s),71.21(d,J=8.4Hz),69.50(s),64.80(d,J=5.2Hz).
实施例2:尿苷二磷酸半乳糖醛酸的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、葡萄糖醛酸(0.77g)、ATP.2Na(3.31g)、UTP.3Na(3.30g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.5。继续震荡至底物全部溶解。加入BiGalK(4mg)、AtUSP(4mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育12h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物Ⅲ(1.51g,收率64%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.79(d,J=8.1Hz,1H),5.82(dd,J=7.8,6.4Hz,2H),5.51(dd,J=7.2,3.6Hz,1H),4.34(d,J=1.2Hz,1H),4.22-4.19(m,2H),4.15(dd,J=3.4,1.4Hz,1H),4.12(dt,J=5.2,2.6Hz,1H),4.07(ddd,J=11.7,4.6,2.5Hz,1H),4.01(ddd,J=11.8,5.5,2.8Hz,1H),3.82(dd,J=10.3,3.4Hz,1H),3.69-3.65(m,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ175.20(s),166.22(s),151.83(s),141.58(s),102.65(s),95.69(d,J=6.8Hz),88.31(s),83.25(d,J=8.9Hz),73.77(s),72.76(s),70.60(s),69.62(s),69.35(s),68.03(d,J=8.2Hz),64.91(d,J=5.6Hz).
实施例3:尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、N-乙酰氨基葡萄糖(0.88g)、ATP.2Na(3.31g)、UTP.3Na(3.30g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.0。继续震荡至底物全部溶解。加入NahK(4mg)、PmGlmU(4mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育12h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(2.04g,收率80%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.88(d,J=8.1Hz,1H),5.90(dd,J=7.8,6.4Hz,2H),5.44(dd,J=7.3,3.3Hz,1H),4.31-4.27(m,2H),4.22-4.20(m,1H),4.17(ddd,J=11.7,4.6,2.6Hz,1H),4.11(ddd,J=11.8,5.6,3.1Hz,1H),3.91(dt,J=10.5,3.0Hz,1H),3.85(ddd,J=10.1,4.4,2.3Hz,1H),3.81-3.78(m,1H),3.75-3.71(m,2H),3.47(dd,J=10.0,9.3Hz,1H),2.00(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ176.29(s),166.13(s),151.72(s),141.41(s),102.55(s),95.21(d,J=6.5Hz),88.09(s),83.15(d,J=9.2Hz),73.64(s),72.87(s),72.41(s),71.69(s),71.21(d,J=8.4Hz),69.50(s),64.80(d,J=5.2Hz).
实施例4:尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、N-乙酰氨基半乳糖(0.88g)、ATP.2Na(3.31g)、UTP.3Na(3.30g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.0。继续震荡至底物全部溶解。加入NahK(4mg)、AGX1(4mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育12h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.0。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(2.00g,收率80%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.76(d,J=8.1Hz,1H),5.78(dd,J=10.4,6.2Hz,2H),5.35(dd,J=7.1,3.2Hz,1H),4.17(t,J=6.2Hz,2H),4.09(s,1H),4.05(d,J=11.1Hz,2H),4.01-3.98(m,2H),3.77(dd,J=11.0,2.7Hz,1H),3.60-3.52(m,3H),1.88(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.82(s),166.11(s),151.66(s),141.51(s),102.48(s),94.54(d,J=6.5Hz),88.35(s),83.05(d,J=9.1Hz),73.64(s),71.95(s),69.49(s),68.21(s),67.46(s),64.84(d,J=5.3Hz),60.91(s),49.61(d,J=8.4Hz),22.00(s).
实施例5:鸟苷二磷酸岩藻糖的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、岩藻糖(0.65g)、ATP.2Na(3.31g)、GTP.3Na(3.41g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.5。继续震荡至底物全部溶解。加入FKP(8mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育24h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:2.5:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物Ⅵ(1.6g,收率68%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.91(s,1H),5.72(d,J=6.1Hz,1H),4.73(d,J=8.0Hz,1H),4.57(t,J=5.6Hz,1H),4.35-4.32(m,1H),4.15(s,1H),4.02(d,J=4.1Hz,2H),3.57(d,J=6.5Hz,1H),3.51(d,J=3.1Hz,1H),3.48-3.45(m,1H),3.37-3.34(m,1H),1.02(d,J=6.5Hz,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ158.74(s),153.74(s),151.60(s),137.42(s),115.99(s),98.27(d,J=5.9Hz),86.65(s),83.62(d,J=9.2Hz),73.55(s),72.31(s),71.31(s),71.00(s),70.30(s),65.17(d,J=5.4Hz),59.17(s),15.29(s).
实施例6:鸟苷二磷酸甘露糖的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、甘露糖(0.72g)、GTP.3Na(6.80g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至8.0。继续震荡至底物全部溶解。加入NahK(4mg)、PmManC(6mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育14h,反应期间前2h每隔15min调节pH至8.0。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:2.5:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物Ⅶ(2.35g,收率97%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ8.03(s,1H),5.85(d,J=6.2Hz,1H),5.43(dd,J=7.8,1.7Hz,1H),4.68(s,1H),4.43(dd,J=5.1,3.4Hz,1H),4.27(dd,J=3.2,2.0Hz,1H),4.13(dd,J=5.4,3.6Hz,2H),3.97(dd,J=3.2,2.1Hz,1H),3.84(dd,J=9.8,3.4Hz,1H),3.78(ddd,J=9.8,6.5,2.2Hz,2H),3.67(dd,J=12.4,5.5Hz,1H),3.60(t,J=10.0Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ159.02(s),153.94(s),151.83(s),137.62(s),116.29(s),96.44(d,J=5.7Hz),86.78(s),83.79(d,J=8.9Hz),73.64(d,J=8.6Hz),70.43(s),70.25(d,J=9.0Hz),69.81(s),66.42(s),65.25(d,J=5.4Hz),60.75(s).
实施例7:胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、N-乙酰神经氨酸(1.24g)、CTP.2Na(3.17g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至9.0。继续震荡至底物全部溶解。加入NmCSS(6mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育4h,反应期间前2h每隔15min调节pH至9.0。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得乳白色化合物Ⅷ(1.87g,收率76%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.99(d,J=7.6Hz,1H),6.14(d,J=7.6Hz,1H),6.00(d,J=4.5Hz,1H),4.36(t,J=4.7Hz,1H),4.31(t,J=4.8Hz,1H),4.25(d,J=4.7Hz,3H),4.15(d,J=10.5Hz,1H),4.07(dd,J=10.7,4.7Hz,1H),3.99-3.93(m,2H),3.89(dd,J=11.8,2.2Hz,1H),3.63(dd,J=11.8,6.6Hz,1H),3.46(d,J=9.6Hz,1H),2.50(dd,J=13.2,4.7Hz,1H),2.06(s,3H),1.70-1.63(m,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ177.58(s),177.26(s),168.74(s),160.30(s),144.57(s),102.97(d,J=7.5Hz),99.45(s),91.93(s),85.82(d,J=7.9Hz),77.17(s),74.68(s),72.54(s),72.20(s),71.69(s),69.74(s),65.77(s),62.18(s),54.66(s),43.94(d,J=9.9Hz),24.97(s).
实施例8:尿苷二磷酸半乳糖的制备方法
向50mL离心管中加入六水合氯化镁(0.81g)、半乳糖(0.72g)、ATP.2Na(3.31g)、UTP.3Na(3.30g)。加入10mL水,震荡。使用5M NaOH溶液调整pH至7.5。继续震荡至底物全部溶解。加入BiGalK(4mg)、AtUSP(4mg)、PmPPA(2mg),加双蒸水至总体积20mL后,将反应液置于摇床中,37℃、220rpm孵育12h,反应期间前2h每隔15min调节pH至7.5。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=5:2:3:1)检测完成后,加入等体积的冰乙醇对蛋白变性终止反应,4℃条件下静止60min;将反应液在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液。使用移液器将1M氯化钡溶液逐次加入反应液,反应体系在4℃、12000rpm条件下离心20min,收集上清液,再次使用移液器将氯化钡溶液逐次加入反应液,重复上述步骤直至无沉淀产生,收集上清液浓缩,添加适量的强酸型阳离子交换树脂介质,4℃条件下100rpm混匀20min,处理后的溶液冻干获得白色化合物Ⅸ(1.61g,收率71%)。参数如下:1H NMR(600MHz,D2O)δ7.88(d,J=8.1Hz,1H),5.91(dd,J=12.0,6.2Hz,2H),5.56(dd,J=7.2,3.6Hz,1H),4.31-4.28(m,2H),4.23-4.20(m,1H),4.17(ddd,J=11.7,4.5,2.6Hz,1H),4.15-4.08(m,2H),3.95(d,J=3.2Hz,1H),3.84(dd,J=10.3,3.3Hz,1H),3.73(dt,J=10.3,3.2Hz,1H),3.66(qd,J=11.8,6.2Hz,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ166.32(s),151.89(s),141.60(s),102.67(s),95.82(d,J=6.6Hz),88.37(s),83.23(d,J=9.4Hz),73.77(s),71.90(s),69.64(s),69.30(s),69.10(s),68.40(d,J=8.3Hz),64.94(d,J=5.5Hz),60.99(s).
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
2.根据权利要求1所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)包括:将步骤(1)得到的含有糖核苷酸及其衍生物粗产物的混合液加入有机溶剂,蛋白变性沉淀,去除蛋白,然后加入盐溶液,离心,收集上清液,再使用离子交换树脂介质吸附去除杂质,收集上清液,得到糖核苷酸及其衍生物。
3.根据权利要求2所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述盐溶液为含有金属离子的溶液;优选地,所述金属离子的溶液为含有钡离子的溶液;更优选地,所述钡离子溶液为氯化钡溶液;所述钡离子能够与核苷三磷酸、核苷二磷酸形成络合物沉淀。
4.根据权利要求2所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中的有机溶剂选自:甲醇、乙醇、丙酮;优选地,有机溶剂为乙醇;更优选地,有机溶剂为冰乙醇;将冰乙醇加入混合液中,4℃下静止10-60min,蛋白变性沉淀,去除蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中混合液在4-10℃下离心,收集上清液。
6.根据权利要求2所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中离子交换树脂介质为强酸型阳离子交换树脂介质。
9.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)包括:将单糖或其衍生物、核苷三磷酸配制成溶液,调节pH,然后添加生物酶,反应12-24h后,终止反应,得到含有糖核苷酸及其衍生物的混合液。
10.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的生物酶为激酶、糖核苷酸合成酶、焦磷酸化酶中的一种或两种以上组成的组合物;优选地,所述的激酶选自葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)、半乳糖激酶(BiGalK)、N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)、L-岩藻糖激酶/鸟苷二磷酸-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)一种或两种以上;所述的糖核苷酸合成酶选自拟南芥UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)、多杀巴斯德氏菌N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸尿苷转移酶(PmGlmU)、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(AGX1)、鸟苷二磷酸-甘露糖焦磷酸化酶(PfManC)、L-岩藻糖激酶/鸟苷-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)、胞苷一磷酸-唾液酸合成酶(NmCSS)一种或两种以上;所述的焦磷酸酶选自无机焦磷酸酶;更优选地,所述的生物酶的浓度为0.01-2mg/mL。
11.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述的单糖及其单糖衍生物的浓度为50-500mM。
12.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述核苷三磷酸及其衍生物的浓度为100-700mM。
13.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中反应液的pH为7.0-9.0。
14.根据权利要求1、7、8任一项所述的一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中反应温度为10-50℃,反应时间为12-24h。
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