CN102409070A

CN102409070A - 一种稀少糖核苷酸的制备方法

Info

Publication number: CN102409070A
Application number: CN2011102737837A
Authority: CN
Inventors: 房俊强; 刘现伟; 顾国锋; 王鹏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本发明涉及一种稀少糖核苷酸的制备方法，特别涉及一种利用糖核苷酸合成酶制备稀少糖核苷酸及其衍生物的方法，属于糖核苷酸合成技术领域。本发明利用空肠弯曲菌C.je juniNCTC 11168来源的一种能够催化尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)生物合成的糖核苷酸合成酶，以酶的天然底物及其衍生物做催化反应底物，一步酶法合成系列糖核苷酸及稀少糖核苷酸。本发明采用底物识别广泛的糖核苷酸合成酶，能够催化多种糖核苷酸和稀少糖核苷酸的合成，催化反应效率较高，大大降低了糖核苷酸类产品的生产成本，能够适用于糖核苷酸和稀少糖核苷酸的大规模制备，具有潜在的应用前景。

Description

一种稀少糖核苷酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种稀少糖核苷酸的制备方法，特别涉及一种利用糖核苷酸合成酶制备稀少糖核苷酸及其衍生物的方法，属于糖核苷酸合成技术领域。

技术背景

糖核苷酸(sugar nucleotide)又称活性糖，在化学结构上是单糖的还原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基团结合形成的化合物。糖核苷酸是生物体内一类重要的化合物，参与生物体内重要物质的合成和代谢过程，尤其是作为糖基转移酶反应必需的底物，参与生物体的糖基化过程。

生物体内有九种常见糖核苷酸。糖核苷酸的制备方法有化学合成和生物酶法合成两种。化学法合成糖核苷酸，主要是采用有机合成的策略，通过多步保护/脱保护/选择性修饰等化学反应过程，制备糖核苷酸，存在步骤繁琐、产率低等问题。生物酶法合成是解决糖核苷酸供给不足的一种有效手段，目前，九种常见糖核苷酸都能够通过生物酶法催化反应制备得到，但一种生物酶只能催化合成一种特定糖核苷酸，限制了糖核苷酸的制备和应用；此外，近年来，随着糖核苷酸研究领域的深入发展，部分肿瘤细胞、病原微生物中发现有结构上区别于九种常见糖核苷酸的稀少糖核苷酸，这类稀少糖核苷酸被认为具有潜在的治疗、诊断等应用前景，但稀少糖核苷酸的制备比较困难，目前主要依赖化学合成方法制备获得。

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起肠胃疾病的主要细菌，能够导致严重的神经疾病。本世纪初，研究发现空肠弯曲菌中存在一个类似真核生物的N-糖基化途径，这也是目前细菌中发现的唯一N-糖基化途径，这个新发现的糖基化系统可以用于开发疫苗，降低空肠弯曲菌相关疾病的发病率。空肠弯曲菌糖基化系统的发现及模式菌C.jejuniNCTC11168测序工作的完成，开辟了糖核苷酸合成研究的新领域。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，以一种具有底物选择广泛性的糖核苷酸合成酶为基础，提供一种稀少糖核苷酸的制备方法。

发明概述

本发明的技术要点是利用空肠弯曲菌C.jejuniNCTC 11168来源的一种能够催化尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)生物合成的糖核苷酸合成酶，以酶的天然底物及其衍生物做催化反应底物，一步酶法合成系列糖核苷酸及稀少糖核苷酸。

术语说明：

糖核苷酸合成酶的活力单位(U)：在特定反应体系及条件下，以每分钟生成1μmol产物UDP-GlcNAc的酶量为1个糖核苷酸合成酶的活力单位(U)。

上述特定反应体系如下：取含20％甘油、pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制的糖核苷酸合成酶液10μL，加100mM N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸溶液5μL(pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制)、100mM尿苷三磷酸溶液5μL(pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制)、100mMMgCl₂溶液5μL、0.5U焦磷酸水解酶(Pyrophosphatase)，pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液补足体积至100μL。

上述特定反应条件如下：

37℃反应10min，100℃沸水浴5min终止反应，13,400rpm离心15min。上清用毛细管电泳仪检测。

发明详述

一种稀少糖核苷酸的制备方法，步骤如下：

(1)将糖-1-磷酸(Sugar-1-Phosphate)溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的糖-1-磷酸溶液；

将核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate，NTP)或脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的核苷三磷酸溶液或脱氧核苷三磷酸溶液；

(2)将步骤(1)制得的糖-1-磷酸溶液与核苷三磷酸溶液或脱氧核苷三磷酸溶液分别按反应体系终浓度4～10mM的添加量加入到反应容器中，再按反应体系终浓度4～10mM的添加量添加MgCl₂、反应体系终浓度4～10IU/mL的添加量添加焦磷酸水解酶、反应体系终浓度4～10U/mL的添加量添加糖核苷酸合成酶，Tris-HCl缓冲液补足体积，得反应体系，在30～42℃的条件下，反应1～3小时，沸水浴终止反应，10,000～13,400rpm离心10～20min，取上清，过0.22～0.45μm的滤膜，得滤液；

(3)将步骤(2)制得的滤液，经色谱分离、冷冻干燥，制得稀少糖核苷酸。

所述步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液pH 7.0～10.0、浓度10～100mM；优选的，所述步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液pH 7.5，浓度10mM。

所述步骤(1)中的糖-1-磷酸为葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P)、N-乙酰氨基半乳糖-1-磷酸(GalNAc-1-P)或N-丙酰胺基葡萄糖-1-磷酸(GlcNPr-1-P)之一。

所述步骤(1)中的核苷三磷酸为尿苷三磷酸(UTP)或胞苷三磷酸(CTP)，脱氧核苷三磷酸为脱氧尿苷三磷酸(dUTP)或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。

所述步骤(2)中的糖核苷酸合成酶，通过如下步骤制备：

以来源于大肠杆菌K12的糖核苷酸合成酶GlmU(登录号：EG11198)序列为基础，利用同源序列比对，从来源于GenBank登录号为NC 002163的空肠弯曲菌C.jejuniNCTC11168基因组中筛选糖核苷酸合成酶基因序列(Nucleotides 768906-770195)，PCR获得目的糖核苷酸合成酶基因并构建到pET-15b载体中，将构建获得的重组载体转化到表达菌株Escherichia coliBL21(DE3)中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达糖核苷酸合成酶；再通过超声破碎菌体，经Ni-NTA亲和层析纯化、超滤浓缩后，获得糖核苷酸合成酶。

所述步骤(2)的反应体系中，MgCl₂与核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的终浓度比为1∶1。

所述步骤(2)中，反应温度为37℃。

所述步骤(2)中，终止反应的100℃沸水浴5min。

所述步骤(2)中，离心条件为13,400rpm离心15min。

所述步骤(3)中的色谱分离，步骤如下：

以水为流动相，利用规格10mm ID×85cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，分离流速为0.1～0.5mL/min，分离时用毛细管电泳对洗脱液进行检测，合并经检测相同的洗脱液；优选的，步骤(3)中的分离流速为0.25mL/min；

上述毛细管电泳的检测条件为：进样缓冲液为25mM、pH 9.18四硼酸钠溶液，清洗缓冲液为0.1M NaOH溶液，毛细管长度50cm，电泳工作电压25Kv，阴极进样，检测波长254～262nm；优选的，检测波长为262nm。

下式为本发明糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸的反应式，其中：1、糖-1-磷酸，2、核苷三磷酸，3、糖核苷酸合成酶，4、糖核苷酸，5、焦磷酸，6、无机磷酸根；

本发明有益效果

1、本发明利用来源于空肠弯曲菌C.jejuniNCTC11168的糖核苷酸合成酶合成稀少糖核苷酸，糖核苷酸合成酶具有较好的底物识别能力和催化反应效率，并且容易制备，从而避免了传统化学合成方法中基团保护和脱保护的步骤。

2、本发明所述制备方法，反应条件温和，工艺简单，易于操作；与已有糖核苷酸酶合成稀少糖核苷酸方法相比，本发明采用底物识别广泛的糖核苷酸合成酶，能够催化多种糖核苷酸和稀少糖核苷酸的合成，催化反应效率较高，大大降低了糖核苷酸类产品的生产成本，能够适用于糖核苷酸和稀少糖核苷酸的大规模制备，具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为利用本发明制备的CDP-GlcNAc高分辨质谱图；

图2为利用本发明制备的CDP-GlcNAc¹H NMR图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的各种糖-1-磷酸、核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸水解酶均购自sigma公司，其他常规试剂购自国药集团化学试剂公司。

实施例1

一种稀少糖核苷酸胞苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖CDP-GlcNAc的制备方法，步骤如下：

1.糖核苷酸合成酶的获得

以来源于大肠杆菌K12的糖核苷酸合成酶GlmU(登录号：EG11198)序列为基础，利用同源序列比对，从来源于GenBank登录号为NC 002163的空肠弯曲菌C.jejuni NCTC11168基因组中筛选能够催化UDP-GlcNAc合成的糖核苷酸合成酶基因序列(Nucleotides768906-770195)，合成PCR引物序列如下：

forward primer：5’GTACCATATGAAAACTTCTATTTTGATTTTAGCGGCAGGATTAGGCACTAG 3’

reverse primer：5’GTACGGATCCTCATTTTTGAAATTTCTTATAATAATAATCTTTTATCATTTTATGCCC 3’

C.jejuniNCTC11168基因组购买自美国ATCC，其他分子生物学试剂购自MBI公司，目的基因PCR体系组成：

将PCR小管用手指轻弹混匀，用离心机轻甩。然后每管加入50μL矿物油，封住液面，防止PCR过程中高温导致水分蒸发。

PCR反应过程步骤如下：

PCR获得目的糖核苷酸合成酶基因并构建到pET-15b载体中，将构建获得的重组载体转化到表达菌株Escherichiacoli BL21(DE3)中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达糖核苷酸合成酶；再通过超声破碎菌体，经Ni-NTA亲和层析纯化、超滤浓缩后，获得糖核苷酸合成酶。上述操作步骤均为分子生物学研究领域的惯用技术，可参照《精编分子生物学操作实验指南》(科学出版社，2005.1，ISBN：9787030147257)中的相关描述进行操作。

2.糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸胞苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(CDP-GlcNAc)

将CTP和GlcNAc-1-P分别溶于pH 7.5、10mM Tris-HCl缓冲液中，制得浓度为100mM的CTP溶液和GlcNAc-1-P溶液；

将GlcNAc-1-P溶液和CTP溶液按反应体系终浓度5mM加入到反应容器中，再按反应体系终浓度5mM的添加量添加MgCl₂、添加50IU的焦磷酸水解酶、添加50U的糖核苷酸合成酶，用pH 7.5、10mM Tris-HCl缓冲液补足体积至10mL，得10mL的反应体系，在37℃的条件下反应，毛细管电泳仪检测反应底物消耗和产物生成情况，当底物消耗量和产物生成量不再变化即反应达到平衡的情况下，100℃沸水浴5min终止反应，13,400rpm离心15min，取上清，过0.22μm的滤膜，得滤液。毛细管电泳检测，糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸胞苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖CDP-GlcNAc的催化转化率为85％，利用酶法合成CDP-GlcNAc尚未见相关报道。

3.稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc的纯化

将滤液在30℃条件下真空旋转浓缩至3mL，然后用规格10mm ID×85cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，流速为0.25mL/min，利用部分收集器收集洗脱液，使用毛细管电泳进行检测，合并经检测相同的洗脱液，然后经过冷冻干燥，得到白色粉末，即为稀少糖核苷酸胞苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖CDP-GlcNAc。

4.稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc的结构鉴定

取1mg制得的稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc，用水稀释成质量体积百分比为1％的溶液，使用毛细管电泳进行检测，毛细管电泳检测显示6～8min处只有一个产物峰，与常见糖核苷酸的出峰时间相一致，表明经过纯化，稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc纯度较高。

取上述1％的溶液进行质谱分析，目标产物的分子离子峰(m/z)[M-H]^-为605.0711(如图1所示)，CDP-GlcNAc理论分子量为606.10，二者相符。

取1mg稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc，用氘代水D₂00.5mL溶解后，进行¹H NMR分析，谱图解析结果如下：¹H NMR(400MHz，D₂O)：7.90(d，1H，J 7.6Hz)，6.05(d，1H，J 7.6Hz)，5.90(d，1H，J4.2Hz)，5.43(dd，1H，J2.8，6.8Hz)，4.10-4.23(m，5H)，3.70-3.91(m，5H)，3.46(t，1H，J 9.6Hz)，1.98(s，3H)，稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc¹H NMR数据与理论值相符，本发明中的糖核苷酸合成酶能够催化稀少糖核苷酸胞苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的酶法合成。结果如图2所示。

上述毛细管电泳仪为P/ACE^TM MDQ，Beckman Coulter(美国)；质谱分析所用仪器为LCMS-IT-TOF，Shimadzu(日本)；核磁共振NMR所用仪器为AVANCE 400M核磁共振波谱仪，Bruker(瑞士)。

实施例2

一种稀少糖核苷酸尿苷二磷酸-N-丙酰氨基葡萄糖UDP-GlcNPr的制备方法，步骤如下：

如实例1所述稀少糖核苷酸CDP-GlcNAc的制备方法，不同之处在于：

糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸UDP-GlcNPr

将GlcNPr-1-P溶液和UTP溶液按反应体系终浓度5mM加入到反应容器中，再按反应体系终浓度5mM的添加量添加MgCl₂、添加10IU的焦磷酸水解酶、添加10U的糖核苷酸合成酶，用pH 7.5、10mM Tris-HCl缓冲液补足体积至2mL，得2mL的反应体系，在37℃的条件下反应，毛细管电泳仪检测反应底物消耗和产物生成情况，当底物消耗量和产物生成量不再变化即反应达到平衡的情况下，100℃沸水浴5min终止反应，13,400rpm离心15min，取上清，过0.22μm的滤膜，得滤液。毛细管电泳检测，糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸尿苷二磷酸-N-丙酰氨基葡萄糖UDP-GlcNPr的催化转化率为96％。

稀少糖核苷酸UDP-GlcNPr的结构鉴定：¹H NMR(400MHz，D₂O)：7.77(d，1H，J8.4Hz)，5.80(d，1H，J5.4Hz)，5.77(d，1H，J8.4Hz)，5.34(dd，1H，J3.0，7.2Hz)，4.15-4.20(m，2H)，4.10(m，1H)，4.05(m，1H)，4.00(m，1H)，3.87(dt，1H，J3.0，10.2Hz)，3.75(m，1H)，3.68(dd，1H，J2.4，12.6Hz)，3.64(t，1H，J10.2Hz)，3.62(dd，1H，J4.2，12.6Hz)，3.37(t，1H，J10.2Hz)，2.29(q，2H，J7.6Hz)，1.08(t，3H，J7.6Hz)；¹³C NMR(100MHz，D₂O)：170.6，166.4，151.6，141.4，102.3，94.1，88.5，83.1，73.5，72.8，70.6，69.4，69.3，64.8，60.1，53.4，29.9，10.2.ESIMS(negative ion)：Calcd for C₁₈H₂₉N₃O₁₇P₂：621.1[M]；Found：620.1[M-H]^-。UDP-GlcNPr的结构鉴定数据与理论计算值相符，本发明中的糖核苷酸合成酶能够催化稀少糖核苷酸尿苷二磷酸-N-丙酰氨基葡萄糖的酶法合成。

实施例3

一种稀少糖核苷酸脱氧尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖dTDP-GlcNAc的制备方法，步骤如下：

如实例1所述稀少糖核苷酸dTDP-GlcNAc的制备方法，不同之处在于：

糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸dTDP-GlcNAc

将GlcNAc-1-P溶液和dTTP溶液按反应体系终浓度5mM加入到反应容器中，再按反应体系终浓度5mM的添加量添加MgCl₂、添加10IU的焦磷酸水解酶、添加10U的糖核苷酸合成酶，用pH 7.5、10mM Tris-HCl缓冲液补足体积至2mL，得2mL的反应体系，在37℃的条件下反应，毛细管电泳仪检测反应底物消耗和产物生成情况，当底物消耗量和产物生成量不再变化即反应达到平衡的情况下，100℃沸水浴5min终止反应，13,400rpm离心15min，取上清，过0.22μm的滤膜，得滤液。毛细管电泳检测，糖核苷酸合成酶催化合成稀少糖核苷酸脱氧尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖dTDP-GlcNAc的催化转化率为94％，远高于本课题组报道的Escherichia coli K12来源GlmU催化合成dTDP-GlcNAc的66％的转化率。

稀少糖核苷酸dTDP-GlcNAc的结构鉴定：¹H NMR(400MHz，D₂O)：7.79(d，1H，J 7.8Hz)，6.16(t，1H，J6.6Hz)，5.34(dd，1H，J3.6，7.2Hz)，4.44(m，1H)，3.98-4.06(m，3H)，3.83(dt，1H，J3.6，10.2Hz)，3.76(m，1H)，3.71(dd，1H，J2.4，12.6Hz)，3.65(t，1H，J10.2Hz)，3.64(dd，1H，J4.2，12.6Hz)，3.39(t，1H，J10.2Hz)，2.45(s，3H)，2.20-2.25(m，2H)，1.96(s，3H)；¹³C NMR(100MHz，D₂O)：174.2，165.8，151.1，141.4，110.5，94.2，85.2，85.0，72.6，70.5，70.4，69.0，64.9，59.8，53.2，38.4，21.6，11.8.ESIMS(negative ion)：Calcd for C₁₈H₂₉N₃O₁₆P₂：605.1[M]；Found：604.4[M-H]^-。dTDP-GlcNAc的结构鉴定数据与理论计算值相符，本发明中的糖核苷酸合成酶能够催化稀少糖核苷酸脱氧尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的酶法合成。

Claims

1.一种稀少糖核苷酸的制备方法，步骤如下：

(1)将糖-1-磷酸溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的糖-1-磷酸溶液；

将核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的核苷三磷酸溶液或脱氧核苷三磷酸溶液；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液pH 7.0～10.0、浓度10～100mM；优选的，所述步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液pH 7.5，浓度10mM。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的糖-1-磷酸为葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰氨基半乳糖-1-磷酸或N-丙酰胺基葡萄糖-1-磷酸之一。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的核苷三磷酸为尿苷三磷酸或胞苷三磷酸，脱氧核苷三磷酸为脱氧尿苷三磷酸或脱氧胸苷三磷酸。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的反应体系中，MgCl2与核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的终浓度比为1∶1。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应温度为37℃。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，终止反应为100℃沸水浴5min。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，离心条件为13,400rpm离心15min。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的色谱分离，步骤如下：

以水为流动相，利用规格10mm ID×85cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，分离流速为0.1～0.5mL/min，分离时用毛细管电泳对洗脱液进行检测，合并经检测相同的洗脱液；

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的分离流速为0.25mL/min。