CN102443597A

CN102443597A - 糖核苷酸的酶法制备

Info

Publication number: CN102443597A
Application number: CN2010105076530A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 李磊; 原静; 王凤荣
Original assignee: TIANJIN SAIKE RUIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: TIANJIN SAIKE RUIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2012-05-09

Abstract

本发明涉及糖核苷酸的酶法制备，即利用分子生物学技术构建糖核苷酸合成酶表达载体，转化入大肠杆菌进行过量表达，目的蛋白进行粗略纯化后在体外催化糖核苷酸的合成。本发明涉及三类四种糖核苷酸的酶法合成：GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc。使用本发明描述的方法能够大量制备糖核苷酸，并大大简化制备步骤和降低制备成本。

Description

糖核苷酸的酶法制备

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体地说，涉及包括GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc在内的糖核苷酸的酶法制备方法。

背景技术

糖类是生物体内最基本的组成部分之一，糖结构的表达异常是肿瘤表型的标志之一。结构均一性糖链的获得是破解它们生物功能谜题的先决条件。人们开发了多种合成复杂糖结构的方法和工艺。这个前沿领域的发展

为糖链功能的测定，糖链结构-功能关系的解析，生物合成途

的阐明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生产奠定基础。体外糖合成有两种常用策略：化学合成和酶法(包括化学-酶法)合成。复杂糖链目前依然是有机化学合成中具有挑战性的化合物。

实践检验，酶法合成被证明是化学合成的有效替代途

。与化学方法相此，酶法合成在更为有效进行高度空间和立体化学特异性的糖基化反应方面具有明显的优势。用于糖合成的酶主要是糖基转移酶。而糖基转移酶催化的反应需要糖核苷酸作为糖基供体。如下图所示，其中R代表不同的核苷。

糖核苷酸价格昂贵，如GDP-Fuc的价格为5mg/$594(Sigma)，CMP-Sia的价格为5mg/$189，UDP-GalNAc的价格为5mg/$159。这是由于糖核苷酸极难化学合成，而如GDP-Fuc等在内的糖核苷酸在生物体内纯在较少，生物提取

接提高了其成本。之前的酶法合成则需要多酶反应，也比较复杂，难以大量合成。如以前GDP-Fuc的酶法合成使用De novo路线，如下图，其需要本身就昂贵的GDP-Man作为底物，分两步反应得到GDP-Fuc，而GDP-Man、GDP-Fuc以及其生成的中间产物结构极为相似，造成纯化生的困难。其他几种糖核苷酸如CMP-Sia、UDP-GalNAc的合成也是如此。

发明内容

本发明的目的在于提供酶法大量制备包括GDP-Fuc在内的昂贵糖核苷酸的方法，该方法所使用的是糖核苷酸的Salvage Pathway路线，如上图中GDP-Fuc 的Salvage路线。使用本发明的方法，能够一价格低廉的单糖作为合成底物，经过两步简单的生物反应，大量制备糖核苷酸。

本发明所涉及的糖核苷酸的酶法制备，由下述步骤组成：

(1).克隆表达载体的构建：

克隆出FKP使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-FKP；克隆出NahK使用酶切位点NdeI和XhoI构建入载体pET22b，命名为v-NahK；克隆GlmU使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-GlmU、克隆NmCSS使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-NmCSS；

(2).酶的过量表达与纯化：

上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。

阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为25℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白；

其中LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L氯化钠；

其中亲和层析使用镍离子亲和树脂；纯化使用平衡缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，5mM4咪唑；清洗缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，25mM咪唑；洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，250mM咪唑；

(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制备与纯化

以等物质的量的L-岩藻糖、ATP、GTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，

反应液与活性炭混合，使用10体积的水和20体积的10％的乙醇洗涤，然后使用含有5％氨水的35％乙醇洗脱；洗脱液经浓缩并真空抽去氨水和乙醇后进行离子交换纯化，最后使用氯化钠溶液洗脱；得到的溶液使用活性炭除盐。

(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制备与纯化

以等物质的量的唾液酸、CTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁，反应在CMP-Sia合成酶NmCSS的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，使用与步骤(3)中相似的方法纯化；

(5).糖核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc的酶法制备与纯化

以等物质的量的氮乙酰葡萄糖胺/氮乙酰半乳糖胺、ATP、UTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在NahK和GlmU的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，

反应液与活性炭混合，使用与步骤(3)中相似的方法纯化；

优选的，步骤(3)中所述的反应pH值是8；

优选的，步骤(3)中所述的反应温度是30℃；

优选的，步骤(3)中所述的反应时间是是10-15小时；

优选的，步骤(4)中所述的反应pH值是9；

优选的，步骤(4)中所述的反应温度是37℃；

优选的，步骤(4)中所述的反应时间是是4小时；

优选的，步骤(5)中所述的反应pH值是8；

优选的，步骤(5)中所述的反应温度是30℃；

优选的，步骤(5)中所述的反应时间是是20-25小时；

本发明所涉及的糖核苷酸的酶法制备，充分糖核苷酸Salvage Pathway的酶能够利用单糖的性质，以及这些酶的高效催化特性，大量制备糖核苷酸，并利用离子交换的方法纯化，大大降低了糖核苷酸的生产成本，并能够扩大生产。

附图说明

图1是GDP-Fuc、CMP-Sia和UDP-GalNAc的酶法制备路线

图2是GDP-Fuc的1H NMR图谱

图3是UDP-GalNAc的1H NMR图谱

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。

实施例1：GDP-Fuc的制备

L-岩藻糖(164mg，1mmole)，ATP(507mg，1mmole)，GTP(522mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl，pH 8缓冲液100mL，加入终浓度为20mM氯化镁，最后加入50单位的FKP和10单位的焦磷酸水解酶，30℃反应10小时后过离子交换纯化(0.2mM氯化钠洗脱)，最后使用活性炭纯化(5％氨水、35％乙醇洗脱)，的白色固体543mg，收率：92％

制备得到GDP-Fuc的数据：

分子式：C₁₆H₂₅N₅O₁₅P₂

分子量：589

形状：白色粉末

图谱数据：见附图2

实施例2：UDP-GlcNAc的制备

氮乙酰半乳糖胺(221mg，1mmole)，ATP(509mg，l mmole)，UTP(483mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl，pH 8缓冲液100mL，加入终浓度为20mM氯化镁，最后加入50单位的NahK、50单位的GlmU和10单位的焦磷酸水解酶，30℃反应20小时后过离子交换纯化(0.2mM氯化钠洗脱)，最后使用活性炭纯化(5％氨水、35％乙醇洗脱)，的白色固体550mg，收率：90％

制备得到UDP-GalNAc的数据：

分子式：C₁₇H₂₇N₃O₁₇P₂

分子量：607

形状：白色粉末

图谱数据：见附图3

实施例3：CMP-Sia的制备

唾液酸(309mg，1mmole)，UDP-Glc 499mg，l mmole)加入到250mL三角瓶中，加入100mM Tris-HC，pH 9缓冲液100mL，加入终浓度为20mM氯化镁，最后加入50单位的NmCSS，37℃反应4小时后过离子交换纯化(0.1mM氯化钠洗脱)，最后使用活性炭纯化(5％氨水、35％乙醇洗脱)，的白色固体565mg，收率：88％

制备得到CMP-Sia的数据：

分子式：C₂₀H₃₁N₄O₁₆P

分子量：614

形状：白色粉末

图谱数据：¹H NMR(400MHz，D2O)：d 7.87(d，1H，J＝7.6Hz，H-6ofcytidine)，6.25(d，1H，J＝7.6Hz，H-5 of cytidine)，5.91(d，1H，J＝4.4Hz，H-1 of ribose)，4.26-4.20(m，2H，H-2 of ribose，H-3 of ribose)，4.17-4.10(m，3H，H-5a，H-5b，H-4 of ribose)，4.09-3.98(m，2H)，3.90-3.80(m，3H)，3.59-3.40(m，2H)，2.42(dd，1H，J＝4.8，13.2Hz)，1.98(s，3H)，1.60(dt，1H，J＝5.6，12.6Hz)；13C(100MHz)：d 174.9，174.6，166.3，157.9，141.7，100.2，96.8，89.3，83.0，74.4，71.9，69.7，69.2，68.9，67.0，65.1，63.1，51.9，41.3，22.3.。

Claims

1.糖核苷酸的酶法制备，包括三类糖核苷酸，分别是GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc，由下述步骤组成：

(1).酶表达载体的构建：

克隆出GDP-Fuc合成酶(FKP)、氮乙酰六糖胺激酶(NahK)、GlcNAc-1-Puridyltransferase(GlmU)、CMP-Sia合成酶(NmCSS)，经酶切后插入大肠杆菌载体，分别命名为v-FKP、v-NahK、v-GlmU、v-NmCSS；

(2).酶的过量表达与纯化：

上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为16℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白；

(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制备与纯化

(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制备与纯化

(5).糖核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc的酶法制备与纯化

反应液与活性炭混合，使用与步骤(3)中相似的方法纯化。

2.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的GDP-Fuc合成酶是来源于人体共生微生物Bacteroides fragilis的FKP。

3.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的GlcNAc-1-P uridyltransferase是来源于大肠杆菌K12的GlmU。

4.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的氮乙酰六糖胺激酶是来Bifidobacterium longum的NahK。

5.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的CMP-Sia合成酶是来源于Neisseria meningitidis的NmCSS。

6.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的载体为pET15b、pET22b等大肠杆菌表达载体及在此基础上改造的载体。

7.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(2)中所述的大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)或其他含有DE3特性的大肠杆菌菌株。

8.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(2)中所述的IPTG浓度为0.2-0.4mM。

9.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(3)、(5)中所述的反应pH值均为8，使用氢氧化钠溶液调节pH。

10.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(4)中所述的反应pH值均为9，使用氢氧化钠溶液调节pH，并使用100mM Tris-HCl作为缓冲体系。