CN102409031A - 新β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法，具体的本发明提供新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及编码该唾液酸转移酶的核酸。本发明还在提供生产该唾液酸转移酶的微生物的同时，提供使用这样的微生物生产该唾液酸转移酶的方法。本发明进一步提供含有编码该唾液酸转移酶的核酸的载体和用该载体转化的宿主细胞，同时本发明还提供生产重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的方法。本发明进一步提供利用本发明的唾液酸转移酶生产唾液酸糖链的方法。

Description

新β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法

本申请是申请日为2006年03月31日，申请号为200680012544.3(国际申请号为PCT/JP2006/306896)，名称为“新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法”的发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、生产该酶的微生物和该酶的生产方法。 

背景技术

糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等的糖链的生物合成相关的酶。而且，其反应生成物即糖蛋白、糖脂等的糖链(以下称复合糖糖链)在生物体内具有非常重要的功能。例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质信号传导、复合糖的靶标而发挥作用。 

如上述，糖链有着非常重要的功能，与此相应的具体例子是促红细胞生成素。促红细胞生成素是一种糖蛋白，人们制备了增加糖链的数目重组促红细胞生成素，从而提高了其寿命，现在已经实现商品化。 

今后，像这样利用糖链的医药产品、功能性食品等的开发是可以预期的。因此，作为糖链的合成、生产手段，糖转移酶的重要性正在提高。 

至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150种以上的糖转移酶基因，并已进一步在以CHO细胞、大肠杆菌等为宿主细胞的生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核生物细菌中也分离出数种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、各种酶化学性质。 

在构成糖链的糖中，从糖链功能的观点来看，多存在于非还原末端的唾液酸是极其重要的糖，因而，在现在越来越重要的糖转移酶中，唾液酸转移酶是需求最高的酶之一。 

关于α2，3-唾液酸转移酶及其基因，已有许多动物特别是哺乳动物来源的产物的报道(例如参见Harduin-Lepers，A.et al.，Biochem.J.，15；352 Pt1：37-48(2000)；Young-Choon Lee et al.，J.Biol.Chem.，23；274(17)：11958-67(1999)；Lee，Y-C.et al.，J.Biochem.，216，377-385(1993)；Chang，M-L.et al.，Glycobiology，5，319-325(1995)；Gillespie，W.et al.，J.Biol.Chem.，267，21004-21010(1999))。但是，这些动物来源的酶的问题是纯化困难、无法大量获得因此价格非常高，而且作为酶、其稳定性不好。 

与此相对，有报导称已从属于奈瑟(氏)菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)和巴斯德氏菌属(Pasteurella)的微生物中获得了微生物来源的α2，3-唾液酸转移酶及其基因(例如参见WO97/047749、WO99/049051、WO01/077314、WO03/027297)。但是，尚未有从属于弧菌科的微生物获取的报导，也未有属于弧菌科的微生物中存在具有α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的报导。 

专利文献1：国际公开第WO97/047749A号小册子 

专利文献2：国际公开第WO99/049051A号小册子 

专利文献3：国际公开第WO01/077314A号小册子 

专利文献4：国际公开第WO03/027297A号小册子 

非专利文献1：Harduin-Lepers，A.et al.，Biochem.J.，15；352Pt 1：37-48(2000) 

非专利文献2：Young-Choon Lee et al.，J.Biol.Chem.，23；274(17)：11958-67(1999) 

非专利文献3：Lee，Y-C.et al.，J.Biochem.，216，377-385(1993) 

非专利文献4：Chang，M-L.et al.，Glycobiology，5，319-325(1995) 

非专利文献5：Gillespie，W.et al.，J.Biol.Chem.，267，21004-21010(1992) 

发明内容

发明要解决的课题 

本发明的课题是提供来源于弧菌科微生物的新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码基因。此外，本发明的课题是提供利用编码本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的基因采用基因重组技术高效生产该酶的方法。解决课题的方法 

本发明人等进行了深入研究，结果发现属于弧菌科(Vibrionaceae)的微生物产生一种新酶，该酶使唾液酸以α2，3键转移到糖链中的半乳糖残基、葡萄糖残基、甘露糖残基、果糖残基、N-乙酰葡萄糖胺残基或N-乙酰半乳糖胺残基上，从而完成了本发明。本发明提供新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸、以及生产该唾液酸转移酶的方法。 

以下，对本发明进行详细说明。 

β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶

本发明提供新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶”是指具有使唾液酸由一磷酸胞苷(CMP)转移至复合糖糖链或游离糖链中的半乳糖残基的3位，存在于乳糖或N-乙酰乳糖胺等寡糖中的半乳糖残基的3位，或者半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺等可构成复合糖且3位的碳上有羟基的单糖的3位的活性的蛋白质。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性”指β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的上述活性。此外，这里所述的唾液酸是指属于唾液酸家族的神经氨酸的衍生物。具体地是指N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、5-脱氨基-5羟基神经氨酸(KDN)、ジシアル酸等。 

本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶是含有序列号2、序列号29或序列号31的氨基酸序列蛋白质。本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶是由含序列号1、序列号28或序列号30的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 

在本发明的含有序列号2的氨基酸序列的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶中，序列号2的氨基酸1-21为信号序列。因此，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是包含序列号2的氨基酸22-409的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是由包含序列号1中碱基64-1230的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 

在本发明的包含序列号29的氨基酸序列的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶中，估计序列号29的氨基酸1-24为信号序列。因此，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是含有序列号29的氨基酸25-409的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是由含有序列号28中碱基73-1230的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 

在本发明的含有序列号31的氨基酸序列的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶中，估计序列号31的氨基酸1-22为信号序列。因此，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是含有序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是由包含序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 

本发明还包括上述本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的变体，其为具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的变体蛋白也包含于本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶中。 

本发明的变体蛋白可以是含有下述氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列在选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号29的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。 

氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如公知的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。 

就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有作为单链的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。 

另外，在保持其活性的同时对酶等生物活性多肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，删除、然后取代插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。 

本发明的变体蛋白可以是由下述核酸编码、且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：其中所述核酸包含在严紧条件或高度严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交的碱基序列。 

这里，严紧的杂交条件例如但不限于在0.5M磷酸钠pH7.2、1mMEDTA、7％SDS、1％BSA中55℃进行杂交，然后在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、5％SDS、0.5％BSA中55℃洗涤2次每次15分钟，在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中55℃洗涤2次每次15分钟；或者按Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版、第1卷、1.101-104页、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(通过引用将其全文引入本文)等的记载在30％去离子化甲酰胺、0.6M NaCl、40mM磷酸钠pH7.4、2.5mM EDTA、1％SDS中42℃进行杂交后，在2×SSC、0.1％SDS中室温洗涤2次每次10分钟，再于同样的缓冲液中55℃洗涤1小时。此外，在高度严紧条件下进行的杂交例如按Molecular Cloning(同上)等的记载在0.5M磷酸钠pH7.2、1mM EDTA、7％SDS、1％BSA中65℃进行杂交，然后在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、5％SDS、0.5％BSA中65℃，在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中65℃进行洗涤。 

本发明的变体蛋白还可以是含有下述氨基酸序列、且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号29的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的氨基酸同源性。 

此外，本发明的变体蛋白可以是由下述核酸编码、且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：所述核酸与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30 的碱基67-1209的碱基序列具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的同源性。 

这里，氨基酸序列或核酸碱基序列的同源性可以通过目测或数学计算确定。例如，2个氨基酸序列的同源性％可以用遗传信息处理软件GENETYXVer.7(GENETIC制作)等程序或FASTA算法、BLAST算法等，通过比较序列信息来确定。 

唾液酸转移酶活性可以采用公知方法测定，例如采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全文引入本文)中记载的方法。例如，以CMP-Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)为糖供体底物、以乳糖为糖受体底物进行酶反应，通过评价反应生成物唾液酸乳糖的量可以评价酶活性。 

作为确定转移至糖受体底物的唾液酸的结合形式的方法，可以采用任何本领域技术人员公知的方法进行，例如但不限于使用吡啶氨基化糖链的方法、采用核磁共振分光法(NMR)对反应生成物进行分析等。使用吡啶氨基化糖链的方法中包括以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。具体地，以吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio产品)为糖受体底物、以CMP-Neu5Ac为糖供体底物进行酶反应，对反应生成物进行高效液相色谱(HPLC)分析，由反应生成物的保留时间判断唾液酸转移的位置。 

在本发明的一个实施方式中，本发明的酶是源自属于弧菌科的微生物，优选源自属于弧菌属(Vibrio spp.)的微生物、或者优选源自属于发光杆菌属(Photobacterium spp.)的微生物、其中更优选源自属于明亮发光杆菌种(Photobacterium pho sphoreum)的微生物的酶。 

本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶学性质和理化性质，除以具有上述定义的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性为特征外，并非限定，其最适pH在pH5-11、pH5-10、pH5-9或pH5-7的范围，其最适温度为5-35℃、10-35℃、20-35℃或20-30℃，分子量用SDS-PAGE分析为42,000±3000Da左右。 

编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸

本发明提供编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸。 

本发明的核酸是编码含有选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号29的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402 的氨基酸序列的蛋白质的核酸。此外，本发明的核酸是含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸。 

本发明的核酸可以是上述核酸的变体，所述变体编码具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的核酸也包含于本发明的编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸之中。 

这样的核酸的变体是编码含有下述氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列是在选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号29的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。 

这样的核酸的变体还可以是含有下述碱基序列、且编码具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列在严紧条件或高度严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交。这里，严紧条件或高度严紧条件的定义同上。 

这样的核酸的变体还可以是与如下所述的碱基序列具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的同源性，且编码具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209。这里，核酸碱基序列的同源性可以用前面描述的方法确定。 

这样的核酸的变体还可以是编码含有如下所述的氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号29的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的同源性。这里，氨基酸序列的同源性可以用前面描述的方法确定。 

表达β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物

本发明人发现，属于弧菌科的微生物表达新的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶。因而，本发明提供表达β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物。本发明的微生物是属于弧菌科且具有产β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，其优选为属于弧菌属(Vibrio spp.)的微生物、或者优选为属于发光杆菌属(photobacterium spp.)的微生物、其中更优选为属于明亮发光杆菌(photobacterium phosphoreum)的微生物。具有产β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶能力的属于弧菌科的微生物例如明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏编号NITE BP-88)、发光杆菌属JT-ISH-224株(保藏编号NITE BP-87)和弧菌属JT-FAJ-16株(保藏编号NITE BP-98)。而且，上述弧菌科微生物为海洋性细菌，其是从海水中或海产鱼贝类(鱼类和贝类)分离的。例如，本发明的明亮发光杆菌JT-ISH-467株、发光杆菌属JT-ISH-224株和弧菌属JT-FAJ-16株分别是从石川县产的乌贼、石川县产的梭子鱼(カマス)和福冈县产的竹荚鱼(アジ)分离的。 

本发明的微生物例如可以采用诸如以下说明的筛选方法进行分离。以海水、海砂石、海泥或海产鱼贝类作为微生物源。将海水、海砂石或海泥直接或用灭菌海水稀释后作为接种源。对于海产鱼贝类，可以用接种环擦取其表面粘液等作为接种源，或者以在灭菌海水中磨碎其内脏而得的液体作为接种源。将这些涂布在Marine Broth Agar 2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Agar培养基(Becton·Dickinson产)等平板培养基上，获得在各种温度条件下生长的海洋微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用Marine Broth 2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Broth(Becton·Dickinson产)等液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0.2％TritonX-100(关东化学产)的20mM卡可基酸盐(カコジレ一ト)缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液，按常规方法测定唾液酸转移酶活性，可以获得具有唾液酸转移酶活性的菌株。 

本发明的明亮发光杆菌JT-ISH-467株、发光杆菌属JT-ISH-224株和弧菌属JT-FAJ-16株也是使用上述的筛选方法获得的。关于所获上述菌株的细菌学性质和生理生化性质以及通过16S rRNA基因的碱基序列分析进行的菌 种鉴定将在实施例1中详细描述。 

上述菌种均保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD：National Institute of Technology and Evaluation，Patent Microorganisms Depositary；日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。其中，明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)JT-ISH-467株的保藏编号为NITE BP-88，保藏日为2005年3月14日；发光杆菌属(Photobacterium sp.)JT-ISH-224株的保藏编号为NITE BP-87，保藏日为2005年3月11日；弧菌属(Vibrio sp.)JT-FAJ-16株的保藏编号为NITE BP-98，保藏日为2005年5月23日。 

生产β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的方法

(1)通过培养表达β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物生产该酶的方法

在本发明的一个实施方式中，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶来自属于弧菌科的微生物；通过在培养基中培养具有产β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，使之产生β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶，并将其提取而获得。 

作为此处使用的微生物，只要是属于弧菌科且具有产β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，可以使用任何菌株。在弧菌科微生物中优选属于弧菌属的微生物，或者优选属于发光杆菌属的微生物、其中更优选属于明亮发光杆菌的微生物。在本发明的方法中使用的微生物例如有明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏编号NITE BP-88)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)JT-ISH-224株(保藏编号NITE BP-87)和弧菌属(Vibrio sp.)JT-FAJ-16株(保藏编号NITE BP-98)。 

作为用于培养上述微生物的培养基，使用含有这些微生物可利用的碳源、氮源、无机物等的培养基。碳源例如蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白分解物、肉浸膏、葡萄糖等，优选使用蛋白胨。作为氮源，优选使用酵母提取物。作为盐类，优选适当组合使用氯化钠、柠檬酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等。 

此外，可以使用含上述成分的Marine Broth 2216培养基(Becton ·Dickinson产)。而且，还可以使用适度含有上述盐类的人工海水、及向其中添加了蛋白胨、酵母提取物等的培养基。培养条件因培养基的组成、菌株而多少会有些差别，例如培养明亮发光杆菌JT-ISH-467株时培养温度为10-28℃、优选为20-25℃，培养时间为8-48小时、优选为16-24小时。 

由于目的酶存在于菌体内，可以采取例如超声波破碎法、弗氏细胞压碎器破碎法、玻璃珠破碎法、Dyno Mill(ダイノミル)破碎法等任何公知的菌体破碎方法，并由菌体破碎物分离纯化目的酶。在本发明的方法中优选的菌体破碎方法是超声波破碎法。例如，通过离心分离从菌体破碎物中除去固形物后，所得的菌体破碎液上清通过适当组合市售阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(ネイテイブ-PAGE)等，可以纯化至电泳单一条带。 

此外，β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以完全纯化，但部分纯化品也有充分的活性，因此本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。 

(2)生产重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的方法

本发明提供包含编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。而且，本发明还提供通过在适合重组蛋白表达的条件下培养包含该表达载体的宿主细胞并回收表达的重组蛋白来生产重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的方法。 

为了生产本发明的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白，根据使用的宿主选择表达载体，在该载体上插入编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸序列，其中所述编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸序列可操作地连接于衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因等的适当的转录或翻译调控核苷酸序列。调控序列例如有转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点以及调控转录和翻译的起始和终止的适宜序列。 

插入本发明的载体的编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸序列中可以含有也可以不含有相当于序列号1的碱基1-63、序列号28的碱基1-72或序列号30的碱基1-66的前导序列，此外上述前导序列还可以替换为其它生物来源的前导序列。通过对前导序列进行替换，可以设计表达系统使得表 达的蛋白质分泌至宿主细胞外。 

此外，本发明的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白还可以表达为融合蛋白的形式，这是通过在载体上插入下述核酸而实现的：该核酸中在编码该酶的核酸之后连接了编码His标签、FLAG^TM标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的核酸。以这样的融合蛋白的形式表达本发明的酶，可以使该酶易于纯化和检测。 

适于β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。可在细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中使用的适宜克隆和表达载体记载于例如Pouwels等、Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York，(1985)(通过引用将其全部内容并入本文)。 

原核生物中包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌或枯草杆菌。当用大肠杆菌这样的原核细胞作为宿主时，为了易于原核细胞内表达重组多肽，可以使β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白包含N末端甲硫氨酸残基。这个N末端甲硫氨酸残基可以在表达后从重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白上切除。 

在原核宿主细胞内使用的表达载体一般含有1个或2个以上可以进行表型选择的标记基因。可以进行表型选择的标记基因例如赋予抗生素抗性或独立营养缺陷型(独立栄養要求性)的基因。适于原核宿主细胞的表达载体的例子包括pBR322(ATCC37017)这样的商品化质粒或者它们的衍生物。pBR322携带氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，易于对转化细胞进行鉴定。该pBR322载体内可以插入合适的启动子和编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的核酸的DNA序列。其它的商品化载体还包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotech.，Madison，Wisconsin，America)等。 

在用于原核宿主细胞的表达载体中通常使用的启动子序列包括tac启动子、β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子(Chang等、Nature 275：615，1978；和Goeddel等、Nature 281：544，1979；通过引用，其全文引入本说明书)等。 

此外，可以在酵母宿主内表达重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白。优选使用酵母属(Saccharomyces，例如酿酒酵母(S.Cerevisiae))，也可以使 用毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)等其它酵母属。酵母载体大多含有来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列以及可选择的标记基因。使用酵母α因子前导序列可以促使重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白分泌。适于用来促进重组多肽从酵母宿主中分泌的其它前导序列也是公知的。转染酵母的方法记载于例如Hinnen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929-1933，1978(通过引用将其全部内容并入本文)。 

使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可以表达重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白。也可以使用哺乳动物起源的确立细胞系。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译调控序列可以从病毒基因组获得。常用的启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2等。可以使用由SV40病毒基因组例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点和聚腺苷酸化位点衍生的DNA序列，赋予哺乳动物宿主细胞内结构基因序列表达所需的其它基因元件。在哺乳动物宿主细胞内使用的载体可以采用例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.，3：280，1983，通过引用将其全部内容并入本文)的方法构建。 

生产本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的一种方法包括在该蛋白质得以表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，其中所述表达载体包含编码β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的核酸序列。然后，根据使用的表达系统，由培养培养基或细胞提取液回收β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白。 

纯化重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的操作根据使用的宿主的形式以及本发明的蛋白质是否分泌至培养基中等重要因素适宜地选择。例如纯化重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的操作包括阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等，或者它们的组合。此外，当与易化重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶纯化的标签等融合表达时，可以利用采用亲和层析的纯化方法。例如，当与组氨酸标签、FLAG^TM标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等融合时，可以分别使用Ni-NTA(次氨基三乙酸)柱、结合有抗FLAG抗体的柱子或结合有谷胱甘肽的柱子等、通过亲和层析进行纯化。 

重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以纯化至电泳单一条带，但由于部分纯化品也具有充分的活性，所以本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。 

抗体

本发明提供抗本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白的抗体。本发明的抗体可以针对本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白或其片段进行制备。这里，本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的片段是具有下述序列的片段：所述序列包含该酶的氨基酸序列中至少6个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸或至少30个氨基酸。 

抗体可以用本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶或其片段免疫本技术领域中用于抗体制备的动物进行制备，所述动物例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊等。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。抗体可以基于本领域技术人员公知的抗体制备方法进行制备。 

本发明的抗体可以用于亲和纯化回收本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白。本发明的抗体可以用于在Western印迹、ELISA等测定法中检测本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶蛋白。 

唾液酸糖链的生产方法

在本发明的一个实施方式中，本发明提供利用本发明的唾液酸转移酶生产唾液酸糖链的生产方法。本发明的方法是唾液酸糖链的生产方法，所述方法包括： 

(i)制备含有本发明的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液； 

(ii)在该溶液中进行唾液酸转移反应； 

(iii)从反应溶液中获取生成的唾液酸糖链。 

在本说明书中，唾液酸糖链是指具有唾液酸的糖链。在本发明的方法中，借助本发明的酶进行唾液酸转移反应，通过该反应将糖供体底物的唾液酸转移至糖受体底物，得到唾液酸糖链。 

可以在本发明的方法中使用的糖供体底物没有特别的限制，只要其是可以成为通过本发明的唾液酸转移酶进行的唾液酸转移反应的糖供体的底物。 优选的可以在发明的方法中使用的糖供体底物是CMP-唾液酸，更优选的是CMP-Neu5Ac。 

可以在本发明的方法中使用的糖受体底物没有特别的限制，可以是具有半乳糖残基、葡萄糖残基、甘露糖残基、岩藻糖残基、N-乙酰葡萄糖胺残基或N-乙酰半乳糖胺残基等的复合糖糖链或寡糖，或者是半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺等单糖。这里，“复合糖”是含糖生物分子的统称，包括糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂。在本说明书中，“复合糖糖链”可以指糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂等复合糖本身，也可以指其糖链部分。“寡糖”是指2个或2个以上的单糖通过糖苷键连接而成的糖。对于构成寡糖的单糖的数目没有特别的限制。此外，单糖或寡糖的还原末端可以用烷基、吡啶氨基、苯甲酰基、苄基、对硝基苯基、4-甲基伞形酮基(4-メチルウンベリフエリル基)等修饰。 

在本发明的方法中，含有本发明的酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液是缓冲液，例如包括但不限于醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris缓冲液、CHES缓冲液、CAPS缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、ADA缓冲液、PIPES缓冲液、ACES缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液等。本发明的方法中含有本发明的酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液的pH只要是本发明的酶具有酶活性的pH，没有特别限制，优选为pH5-11、pH5-10、pH5-9、pH5-7。 

在本发明的方法中，进行唾液酸转移反应的温度只要是本发明的酶具有酶活性的温度，没有特别限制，优选在5-35℃、10-35℃、20-35℃、20-30℃的范围内进行。 

本发明的方法中的从反应溶液中获取生成的唾液酸糖链的步骤，可以采用本领域技术人员公知的纯化复合糖糖链、寡糖的方法进行。例如，层析有反相层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、羟基磷灰石层析、亲和层析、凝集素层析、活性碳层析、硅胶层析等，其它方法有采用超滤对糖链进行分级·浓缩、糖链的结晶等，或者这些方法的组合，但不限于上述。 

如后述的实施例4、11、12和13所示，本发明的酶可以通过α2，3键使唾液酸转移到多种糖受体底物。采用本发明的唾液酸糖链的生产方法，可以容易地生产一般使用高底物特异性的公知唾液酸转移酶无法生产的糖链。特别是由于尚未发现具有高效地向α-吡喃半乳糖苷、α-吡喃葡萄糖苷、α-吡喃 甘露糖苷、α-吡喃岩藻糖苷、β-吡喃岩藻糖苷等糖转移唾液酸的活性的酶，本发明的方法提供容易地生产在这些糖上添加了唾液酸的糖链的方法。 

发明的效果 

本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸，在提供已逐渐明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成·生产手段的观点上做出了贡献。特别是唾液酸在生物体内多存在于复合糖糖链中的非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一，而本发明提供新的唾液酸转移酶正回应了这样的高需求。 

本发明还涉及如下方面： 

1.一种分离的蛋白质，其含有选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列。 

2.一种分离的蛋白质，其含有在选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列中发生1个或多于1个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性。 

3.一种分离的蛋白质，其含有如下所述的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性：该氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列具有至少60％的氨基酸同源性。 

4.一种分离的蛋白质，其由含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸编码，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性。 

5.一种分离的蛋白质，其由含有如下所述的碱基序列的核酸编码，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性：该碱基序列在严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交。 

6.项1-5任一项的分离的蛋白质，其来自弧菌科微生物。 

7.一种分离的核酸，其编码如下所述的蛋白质：该蛋白质含有选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列。 

8.一种分离的核酸，其编码如下所述的具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：该蛋白质含有在选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列中发生1个或多于1个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。 

9.一种分离的核酸，其编码含有如下所述的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：该氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号29的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列具有至少60％的同源性。 

10.一种分离的核酸，其含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列。 

11.一种分离的核酸，其含有如下所述的碱基序列，并且编码具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：该碱基序列在严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交。 

12.含有项7-11任一项所述核酸的重组载体。 

13.用项12所述的重组载体转化的宿主细胞。 

14.一种弧菌科的分离的微生物，其表达项1-6任一项的蛋白质。 

15.项14所述的微生物，其为明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏号NITEBP-88)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)JT-ISH-224株(保藏号NITE BP-87)或弧菌属(Vibrio sp.)JT-FAJ-16株(保藏号NITE BP-98)。 

16.一种生产具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的方法，包括以下步骤： 

1)培养产生β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物； 

2)从培养的微生物或培养上清分离β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶。 

17.一种生产具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的 方法，包括以下步骤： 

1)用含有项7-11任一项的核酸的重组载体转化宿主细胞； 

2)培养经过转化的所述宿主细胞； 

3)从培养的宿主细胞或培养上清分离具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。 

18.一种生产唾液酸糖链的方法，包括： 

(i)制备含有项1-6任一项的蛋白质、糖供体底物及糖受体底物的溶液； 

(ii)在该溶液中进行唾液酸转移反应； 

(iii)从反应溶液获得生成的唾液酸糖链。 

附图说明

(图1-1)图1-1为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性确认实验中的标准品(失活的粗酶液、吡啶氨基化乳糖和吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)的混合物)的HPLC分析结果的图。 

(图1-2)图1-2为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性确认实验的HPLC分析结果的图。 

(图1-3)图1-3为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性确认实验中的对照实验(使用不含糖供体即CMP-唾液酸的反应液进行的反应)的HPLC分析结果的图。 

(图2)图2为显示明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源、发光杆菌属JT-ISH-224株来源和弧菌属JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶(分别为序列号2、9、31)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)以及多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)的氨基酸序列间的比对的图。JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的下划线显示由纯化蛋白测定的氨基酸序列。 

(图3-1)图3-1为显示JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性中反应pH的影响的图表。图中，黑方块、黑圆圈、黑三角、黑菱形、白方块和白圆圈的图线(plot)分别表示在醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、CHES缓冲液和CAPS缓冲液中的测 定结果。 

(图3-2)图3-2为显示重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性中反应pH的影响的图表。图3-2a、图3-2b和图3-2c分别为显示针对JT-ISH-467株来源、JT-ISH-224株来源和JT-FAJ-16株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的结果的图表。图中，黑方块、黑圆圈、黑三角、黑菱形、白方块和白圆圈的图线分别表示在醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、CHES缓冲液和CAPS缓冲液中的测定结果。 

(图4-1)图4-1为显示JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性中反应温度的影响的图表。 

(图4-2)图4-2为显示重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性中反应温度的影响的图表。图4-2a、图4-2b和图4-2c分别为显示关于JT-ISH-467株来源、JT-ISH-224株来源和JT-FAJ-16株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的结果的图表。 

下面通过实施例对本发明做更具体的说明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。 

实施例

实施例1：表达β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物的筛选及菌株的鉴定

以海水、海砂、海泥或海产鱼贝类作为接种源。将该接种源涂布在由Marine Broth Agar 2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的平板培养基上，获取在15℃、25℃或30℃生长的微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用由Marine Broth 2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0.2％Triton X-100(关东化学产)的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液测定唾液酸转移酶活性，得到具有唾液酸转移酶活性的菌株JT-ISH-467株、JT-ISH-224株和JT-FAJ-16株。此外，JT-ISH-467株、JT-ISH-224株和JT-FAJ-16株分别是从乌贼的表皮、梭子鱼的内脏和竹荚鱼的内脏获得的。 

唾液酸转移酶活性采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全 部内容并入本文)中记载的方法测定。具体地说，使用反应溶液(30μl)进行酶反应，所述反应溶液中添加了糖供体底物CMP-Neu5Ac(70nmol、含25000cpm用¹⁴C标记NeuAc的CMP-NeuAc、356cpm/nmol。NeuAc表示N-乙酰神经氨酸)、糖受体底物乳糖(1.25μmol)和终浓度为0.5M的NaCl，并含有依照前文所述方法制备的酶。酶反应在25℃进行10-30分钟。反应结束后，向反应溶液中加入5mM磷酸缓冲液(pH6.8)1.97ml，所得溶液上样于Dowex1×8(PO₄ ^3-型、0.2×2cm、BIO-RAD产)柱。测定该柱的洗脱液中所含的反应生成物，即唾液酸乳糖中所含的放射活性，可以计算出酶活性。 

(i)JT-ISH-467株

获得的JT-ISH-467株的性质如下： 

(细菌学性质) 

(1)细胞形态为杆菌，大小为0.7～0.8μm×1.5～2.0μm。 

(2)运动性- 

(3)革兰氏染色性- 

(4)有无孢子- 

(生理生化性质) 

(1)生长温度4℃为+、25℃为+、30℃为- 

(2)菌落颜色不产生特征性菌落色素 

(3)O/F检验+/- 

(4)过氧化氢酶试验- 

(5)氧化酶试验+ 

(6)由葡萄糖产酸- 

(7)由葡萄糖产气- 

(8)发光性+ 

(9)硝酸盐还原+ 

(10)产吲哚+ 

(11)葡萄糖酸化- 

(12)精氨酸双水解酶+ 

(13)脲酶- 

(14)七叶苷水解- 

(15)明胶水解性- 

(16)β-半乳糖苷酶+ 

(17)葡萄糖同化性- 

(18)L-阿拉伯糖同化性- 

(19)D-甘露糖同化性- 

(20)D-甘露醇同化性- 

(21)N-乙酰-D-葡糖胺同化性- 

(22)麦芽糖同化性- 

(23)葡糖酸钾同化性- 

(24)正癸酸同化性- 

(25)己二酸同化性- 

(26)dl-苹果酸同化性- 

(27)柠檬酸钠同化性- 

(28)乙酸苯酯同化性- 

(29)细胞色素氧化酶+ 

(30)菌体内DNA的GC含量(摩尔％)39.7％ 

(通过16S rRNA基因碱基序列分析和DNA-DNA杂交进行种的鉴定)

以采用常规方法从JT-ISH-467株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。该碱基序列示于序列号3。将该碱基序列与明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)模式株ATCC11040株的16S rRNA基因的碱基序列相比较，显示同源率为100％的高同源性。该结果表明，JT-ISH-467株属于发光杆菌属。然而，16S rRNA基因仅为细菌全基因组的一部分，据称对于种水平的极近亲生物间的距离，根据16S rRNA基因的碱基序列的鉴定分析在很大的误差。因而，采用在属内菌株亲缘关系定量评定中一般采用的DNA-DNA杂交试验法进行了种的鉴定。提取JT-ISH-467株和明亮发光杆菌模式株NCIMB1282株(与ATCC11040株为同一株)的全DNA，用于试验。其结果，获得了84.7％的高同源值(DNA-DNA亲缘性)。一般地，同种间DNA-DNA同源值为60％以上，因此JT-ISH-467株被鉴定为明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)。此外，DNA-DNA杂交试验按《微生物的分类·鉴定实验方法》(铃木健一郎平石明横田明编著シユプリンガ一·フエアラ一ク东京株式会社，2001年9月；将其全部内容引入本文)采用使用微量滴定板 的光生物素标记法进行。 

(ii)JT-ISH-224株

获得的JT-ISH-224株的性质如下： 

(细菌学性质) 

(1)细胞形态为杆菌，大小为0.7-0.8μm×1.0-1.5μm。 

(2)运动性+ 

(3)革兰氏染色性- 

(4)有无孢子- 

(生理生化性质) 

(1)生长温度4℃为-、25℃为+、30℃为+、37℃为- 

(2)菌落颜色不产生特征性菌落色素 

(3)O/F检验+/- 

(4)过氧化氢酶试验+ 

(5)氧化酶试验+ 

(6)由葡萄糖产酸+ 

(7)由葡萄糖产气+ 

(8)发光性- 

(9)硝酸盐还原+ 

(10)产吲哚+ 

(11)葡萄糖酸化- 

(12)精氨酸双水解酶+ 

(13)脲酶- 

(14)七叶苷水解- 

(15)明胶水解性- 

(16)β-半乳糖苷酶+ 

(17)葡萄糖同化性- 

(18)L-阿拉伯糖同化性- 

(19)D-甘露糖同化性- 

(20)D-甘露醇同化性- 

(21)N-乙酰-D-葡糖胺同化性- 

(22)麦芽糖同化性- 

(23)葡糖酸钾同化性- 

(24)正癸酸同化性- 

(25)己二酸同化性- 

(26)dl-苹果酸同化性- 

(27)柠檬酸钠同化性- 

(28)乙酸苯酯同化性- 

(29)细胞色素氧化酶+ 

(30)O/129敏感性10μg-、15μg+

(31)菌体内DNA的GC含量(摩尔％)39.4％ 

(16S rRNA基因碱基序列分析)

以采用常规方法从JT-ISH-224株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。该碱基序列示于序列号32。 

JT-ISH-224株在Marine Agar上的生长性、杆菌、革兰氏染色性、葡萄糖发酵分解性、O/129敏感性等形态学观察和生理生化性状试验结果显示，其属于弧菌科。更进一步，明确了JT-ISH-224株的16S rRNA基因的DNA碱基序列对明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)模式株ATCC11040的16S rRNA基因序列的同源性最高，其同源率为99.2％；其次是对Photobacterium iliopiscarium模式株ATCC51760的16S rRNA基因的序列的同源性较高，其同源率为99.1％。由这些结果，可以明确JT-ISH-224株是属于发光杆菌属(Photobacterium sp.)的微生物。 

(iii)JT-FAJ-16株

获得的JT-FAJ-16株的性质如下： 

(细菌学性质) 

(1)细胞形态为杆菌，大小为0.7～0.8μm×1.2～1.5μm。 

(2)运动性- 

(3)革兰氏染色性- 

(4)有无孢子- 

(生理生化性质) 

(1)生长温度4℃为+w、25℃为+、30℃为+、37℃为+ 

(2)菌落颜色淡黄色～奶油色 

(3)O/F检验+/+ 

(4)过氧化氢酶试验+ 

(5)氧化酶试验+ 

(6)由葡萄糖产酸+ 

(7)由葡萄糖产气- 

(8)硝酸盐还原+ 

(9)产吲哚- 

(10)葡萄糖酸化+ 

(11)精氨酸双水解酶- 

(12)脲酶- 

(13)七叶苷水解+ 

(14)明胶水解性- 

(15)β-半乳糖苷酶+ 

(16)葡萄糖同化性- 

(17)L-阿拉伯糖同化性- 

(18)D-甘露糖同化性- 

(19)D-甘露醇同化性- 

(20)N-乙酰-D-葡糖胺同化性- 

(21)麦芽糖同化性- 

(22)葡糖酸钾同化性- 

(23)正癸酸同化性- 

(24)己二酸同化性- 

(25)dl-苹果酸同化性- 

(26)柠檬酸钠同化性- 

(27)乙酸苯酯同化性- 

(28)细胞色素氧化酶+ 

(29)O/129敏感性- 

(30)マンイト一ル发酵性+ 

(31)肌醇发酵性+ 

(32)阿拉伯糖发酵性+ 

(33)鼠李糖发酵性- 

(34)蔗糖发酵性- 

(35)生长性(NaCl)3％NaCl+、4％NaCl+、6％NaCl+ 

(36)淀粉水解- 

(37)Tween80分解- 

(38)产H₂S- 

(39)产3-羟基丁酮(VP检验)-

(16S rRNA基因碱基序列分析)

以采用常规方法从JT-FAJ-16株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。碱基序列示于序列号33。 

JT-FAJ-16株在Marine Agar上的生长性、杆菌、革兰氏染色性、葡萄糖发酵分解性、O/129敏感性等形态学观察和生理生化性状试验结果显示，其属于弧菌科。更进一步，明确了JT-FAJ-16株的16S rRNA基因的DNA碱基序列对Vibrio rumoiensis模式株的16S rRNA基因的序列的同源性最高，其同源率为99.5％。由这些结果，可以明确JT-FAJ-16株是属于弧菌属(Vibrio sp.)的微生物。 

实施例2：由明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)JT-ISH-467株提取和纯化β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶

由在Marine Agar 2216平板培养基上传代培养的明亮发光杆菌JT-ISH-467株的菌落用接种环采取菌体，接种在10ml Marine Broth 2216液体培养基中，25℃、180转/分振荡培养8小时。 

主培养按以下程序进行。向容积为1000ml的带挡板烧瓶(コブ付フラスコ)中注入300ml含20g/L Bacto Peptone和4g/L Bacto Yeast Extract的Marine Broth 2216培养基，用高压灭菌器灭菌(121℃、15分钟)。共准备36瓶(合计10.8L)培养基。向各烧瓶中接种10ml前培养液，25℃、180转/分振荡培养24小时。离心分离培养液，收集菌体。获得的菌体湿重约为60g。 

将该菌体悬浮于990ml的含0.2％TritonX-100和3M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)中，在冰冷却条件下进行超声波破碎。4℃、100,000×g离心分离菌体破碎液1小时，获得上清。将所得的上清装入透析袋中，在含 0.2％TritonX-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)中于4℃透析至氯化钠浓度为20mM左右。透析后，由于溶液中出现沉淀，4℃、100,000×g离心1小时，除去沉淀。 

使该粗酶液吸附于用含表面活性剂即0.2％TritonX-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)平衡的HiPrep16/10DEAE FF(Amersham Biosciences产)阴离子交换柱，从含0.2％Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度0.25M附近处洗脱的具有酶活性的级分。 

收集的级分用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)稀释，使之吸附于预先用含0.2％Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad产)，从含0.2％Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)至含0.2％TritonX-100的500mM磷酸缓冲液(pH6.0)用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集磷酸缓冲液浓度125mM左右洗脱的具有酶活性的级分。 

使该级分吸附于MonoQ 5/50GL(Amersham Biosciences产)阴离子交换柱，从含0.2％Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度300mM左右洗脱的具有酶活性的级分。 

将该级分用含0.2％Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH7.0)稀释10倍，使之吸附于Mono Q 5/50GL(Pharmacia产)阴离子交换柱。从含0.2％Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH7.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。收集氯化钠浓度300mM左右洗脱的具有酶活性的级分。 

将该级分用含0.2％Triton X-100和0.2M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液(pH7.0)稀释2倍，用HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade(Amersham Biosciences产)凝胶过滤柱进行分级。用含0.2％Triton X-100和0.2M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。 

将有活性的级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺的浓度为12.5％)，结果表明，目的酶显示单一条带，分子量约39,000。与菌体破碎时的比活性相比，该级分的比活性约提高了350倍(表1)。 

表1显示了由粗酶液纯化JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶，经过上述各纯化步骤后的样品的酶活性。酶活性采用与前述实施例1中相同的 J.Biochem.，120，104-110(1996)中记载的方法测定。此外，蛋白质的定量使用Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE产)，按其中的说明书进行蛋白质的定量。酶的1个单位(1U)设定为在1分钟内转移1微摩尔唾液酸的酶量。 

表1从粗酶液纯化JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的纯化表 

使用吡啶氨基化糖链确定唾液酸连接方式

使用实施例2获得的酶，以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。以吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio产品)作为吡啶氨基化糖链进行分析。将糖受体底物、CMP-NeuAc和酶溶于25μl的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)中，其终浓度分别为2.0μM、5.7μM和20mU/ml，25℃反应3小时。反应结束后，100℃处理反应溶液2分钟以使酶失活。然后用HPLC对反应生成物进行分析。 

HPLC系统使用Shimadzu LC10A(岛津制作所)，分析柱使用Takara PALPAK Type R(TaKaRa Bio产品)。将用洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)稀释的反应液注入用含0.15％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺(pH5.0)平衡的柱中。吡啶氨基化糖链的洗脱使用洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)和洗脱液B(含0.5％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)，通过30～100％的洗脱液B的直线浓度梯度法(0-35分钟)和100％的洗脱液B(35～50分钟)，依次洗脱吡啶氨基化糖链。此外，分析采用以下的条件进行(流速：1ml/min、柱温：40℃、检测：荧光(Ex：320nm、Em：400nm))。 

结果表明：使用该酶由吡啶胺化乳糖合成了吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)。 

实施例4：使用JT-ISH-467菌株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶进行向单糖·二糖类的唾液酸转移(含唾液酸糖链的生产)

(材料与方法)

使用离子交换层析柱、羟基磷灰石层析柱、凝胶过滤层析柱对由JT-ISH-467菌株制备的菌体破碎液进行部分纯化而得到α2，3-唾液酸转移酶。使用该酶进行以下实验，以确认向各种单糖·二糖类的唾液酸转移。 

使用各种糖受体底物进行的唾液酸转移反应

制备24μl的反应溶液，该反应溶液中含有糖供体底物CMP-¹⁴C-NeuAc(400nmol(15600cpm)、在反应液中的终浓度为16.6mM)、各种糖受体底物(10μmol、在反应液中的终浓度为200mM)、唾液酸转移酶(0.13mU)、NaCl(在反应液中的终浓度为500mM)，25℃酶反应4小时。使用6种单糖·二糖类作为糖受体底物，即：甲基-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(Gal-β-OMe)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、乳糖(Gal-β1，4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-β1，4-GlcNAc)和甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Gal-β1，3-GlcNAc-β-OMe)。 

酶反应结束后，向反应溶液中加入1.98ml的5mM磷酸缓冲液(pH6.8)以终止酶反应。然后，将用5mM磷酸缓冲液(pH6.8)稀释的酶反应溶液(2ml)上样于AG1-×2Resin(PO₄ ^3-型、0.2×2cm)柱。该柱的制作是将AG1-×2Resin(OH^-型、BIO-RAD公司产)悬浮于1M磷酸缓冲液(pH6.8)，30分钟后用蒸馏水清洗树脂，然后再将树脂悬浮在蒸馏水中。测定该柱的洗脱液(0-2ml)的放射活性。该柱的洗脱液中含有反应生成的结合有 ¹⁴C-NeuAc(N-乙酰神经氨酸)的反应生成物和未反应的糖受体底物，而未反应的CMP-¹⁴C-NeuAc保留在柱上。因而，酶反应结果生成的各种含唾液酸糖链来源的¹⁴C放射活性全部来自反应生成物，由该级分的放射活性可以计算出酶活性。 

采用上述方法测定转移至各种糖受体底物的NeuAc的放射活性，并计算出发生转移的唾液酸。 

(结果)

结果表明：对此次作为糖受体底物使用的6种单糖·二糖类均发生了唾液酸转移(参见表2)；在此次作为糖受体底物使用的糖类中，转移到N-乙酰乳糖胺的唾液酸最多。 

表2JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶向各种糖受体底物的 

唾液酸转移酶活性 

受体底物	转移的唾液酸的量
		Gal-α-OMe	60.0nmol
Gal-β-OMe	50.2nmol
		GalNAc	37.8nmol
Gal-β1，4-Glc	57.9nmol
		Gal-β1，4-GlcNAc	74.9nmol
Gal-β1，3-GlcNAc-β-OMe	71.1nmol

实施例5：编码明亮发光杆菌JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的基因的碱基序列分析和该基因的转化

(1)基因组DNA的纯化和基因组文库的制作

使用Qiagen Genomic-tip 100/G(Qiagen公司)，按试剂盒的说明书由JT-ISH-467株的菌体离心沉淀物(ペレツト)约0.5g制备约100μg的基因组DNA。对于1-2μg的DNA，使用0.1-0.2单位的识别四碱基的限制酶Sau3AI进行部分降解。使用的反应缓冲液是与酶配套的缓冲液，反应条件为37℃、30分钟。反应结束后，向反应液中加入终浓度为25mM的EDTA pH8.0，用苯酚·氯仿进行处理。乙醇沉淀回收基因组DNA，溶于400μl的TE中。使用梯度制作装置，在离心管(日立制作所生产40PA)中由40％的蔗糖(シユ一クロ一ス)缓冲液(20mM Tris pH8.0，5mM EDTA pH8.0，1M NaCl)和10％的蔗糖缓冲液制作40-10％的梯度，并在其上叠加上述部分分解的DNA溶液层。使用超离心机(日立制作所生产SCP70H，转子：SRP28SA)，26,000rpm、20℃离心15分钟。离心后，在管底用25G的针扎开小孔，从底部液体以每次1ml回收。将收集的含基因组DNA的样品的一部分使用潜水电泳槽在0.5-0.6％琼脂糖凝胶/TAE缓冲液中26V电泳20小时，收集含大小为9-16kb的DNA的级分。分子量标准使用λ/HindIII。向含大小为9-16kb的DNA片段的级分中加入2.5ml的TE降低蔗糖浓度后，进行乙醇沉淀和洗 涤，将其溶解于少量TE中。 

用于制作JT-ISH-467株的基因组文库的载体使用λDASH II(Stratagene产)。λDASH II/BamHI载体与基因组DNA片段的连接反应使用Stratagene产的连接试剂盒，12℃反应过夜。反应后，使反应液与GigaPack III Gold Packaging extract反应，使整合了基因组DNA的λ载体纳入到噬菌体颗粒中。噬菌体液在500μl SM缓冲液和20μl的氯仿中4℃保存。将大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)(Stratagene产)在LBMM(LB+0.2％麦芽糖+10mMMgSO₄)中培养至A₆₆₀＝0.5，向200μl该培养液中加入适量的噬菌体溶液，37℃培养15分钟。向其中加入48℃保温的NZY顶层琼脂糖4ml，混合，铺于NZY琼脂平板上(直径9cm的塑料平皿)。平板于37℃培养过夜，计数菌落数，计算滴度，结果算出文库的大小为约30万pfu(噬斑形成单位，plaque forming unit)。 

(2)引物设计和探针制作

使用Procise 494 cLC Protein Sequencing System(Applied Biosystems严)，测定JT-ISH-467株来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的氨基末端(N末端)氨基酸序列及内部氨基酸序列。 

N末端的氨基酸序列的测定按如下进行。将该唾液酸转移酶用5/20％的梯度凝胶(ATTO产)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后将该酶吸附于PVDF膜上，利用氨基酸序列分析装置分析氨基末端10个氨基酸的序列。其结果：该酶的N末端氨基酸序列为XNSDSKHNNS(序列号4)。 

此外，内部氨基酸序列的测定按如下进行。用5/20％的梯度凝胶(ATTO产)对该唾液酸转移酶实施SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。对凝胶进行染色后，切分出目标条带，加入含赖氨酰内肽酶的Tris缓冲液(pH8.5)，35℃处理20小时。然后，将全部溶液上样于反相HPLC(柱：Symmetry C183.5μm)，分离肽片段。利用氨基酸序列分析装置确定该酶的内部氨基酸序列包括SLDSMILTNEIK(序列号5)、FYNFTGFNPE(序列号6)和GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列号7)。 

基于如上测定的发光明亮杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的部分氨基酸序列，即N末端氨基酸序列：XNSDSKHNNS(序列号4)及三个内部氨基酸序列中的两个：FYNFTGFNPE(序列号6)和 GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列号7)，设计、合成了以下的简并引物。即由N末端的氨基酸序列：XNSDSKHNNS(序列号4)合成了下面表3所示的3条引物(I为次黄嘌呤核苷)。 

表3 

名称	序列5’-3’	混合度	长度
				467N-RV	AAY WSI GAY WSI AAR CAY AAY AA(序列号8)	256	23mer
467N-RV2	GAY WSI AAR CAY AAY AAY WS(序列号9)	512	20mer
				467N-RV3	AAY WSN GAY WSI AAR CAY AAY AA(序列号10)	1024	23mer

表中：Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；W表示胸腺嘧啶或腺嘌呤；S表示胞嘧啶或鸟嘌呤；R表示腺嘌呤或鸟嘌呤；N表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；I表示次黄嘌呤。 

此外，由内部氨基酸序列：GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列号7)合成了下面表4所示的4条引物。 

表4 

名称	序列5’-3’	混合度	长度
				467in1RV	ATH ATH GAY GCN CAY AAY ATG(序列号11)	288	21mer
467in1FW	CAT RTT RTG NGC RTC DAT DAT(序列号12)	288	21mer
				467in1RV2	TAY AAY CAR CAR ATH ATH GAY GC(序列号13)	288	23mer
467in1FW2	GCR TCD ATD ATY TGY TGR TTR TA(序列号14)	288	23mer

表中：H表示胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤；Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；R表示腺嘌呤或鸟嘌呤；D表示腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶；N表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。 

此外，由内部氨基酸序列：FYNFTGFNPE(序列号6)合成了下面表5所示的2条引物。 

表5 

名称	序列5’-3’	mix度	长度
				467in2RV	TAY AAY TTY ACN GGN TTY AAY CC(序列号15)	512	23mer
467in2FW	GGR TTR AAN CCN GTR AAR TTR TA(序列号16)	512	23mer

表中：Y表示胸腺嘧啶或胞嘧啶；R表示腺嘌呤或鸟嘌呤；N表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。 

使用这些引物，以上述(1)中提取·纯化的JT-ISH-467株的基因组DNA为模板进行PCR，扩增出JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分DNA作为用于筛选文库的探针。引物组合共有13组，即：来自N末端 序列的3条引物分别与467in1FW(序列号12)、467in1FW2(序列号14)或467in2FW(序列号16)形成的9个组合，467in1RV(序列号11)或467in1RV2(序列号13)与467in2FW(序列号16)形成的2个组合，以及467in2RV(序列号15)与467in1FW(序列号12)或467in1FW2(序列号14)形成的2个组合。PCR反应按如下进行：50μl的反应液中含有基因组DNA 250ng、10×Ex taq缓冲液5μl、2.5mM的每种dNTPs 4μl、每种序列的引物5pmole、Ex taq(Takara Bio产)0.5μl。使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；40个循环的96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟；1个循环的72℃6分钟。结果是使用9个引物组合(除467N-RV(序列号8)和467in1FW(序列号12)、467N-RV(序列号8)和467in2FW(序列号16)、467in1RV(序列号11)和467in2FW(序列号16)、467in2RV(序列号15)和467in1FW(序列号12)的组合以外的9个组合)扩增得到了PCR产物。在所有PCR产物中，将来自获得特异性且高效率扩增的组合(467N-RV3(序列号10)与467in1FW(序列号12))的PCR产物克隆至pCR2.1TOPO载体(Invitrogen产)。连接反应按载体试剂盒所附说明进行。采用电穿孔法将DNA导入大肠杆菌TB 1，按常规方法(Sambrook et al.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(通过引用将其全部内容并入本文))提取质粒DNA。对于该克隆，使用M13引物(Takara Bio产)用ABI PRISM荧光测序仪(Model310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer产)从PCR产物的两端开始测定其序列。 

对于测定的DNA碱基序列(929bp：序列号17)，通过BLAST程序对National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GeneBank数据库进行同源性检索。结果未检索出显示显著同源性的DNA序列。这意味着本发明揭示的发光明亮杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的DNA碱基序列是新序列。接下来，将该碱基序列翻译成氨基酸，再次进行BLAST检索，检索出其与美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有30％的同源性，与多杀巴斯德氏菌多杀亚种(Pasteurella multocida subsp.multocida)Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)具有26％的同源性，与杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)35000HP株的假设蛋白HD0053(AAP95068)具有21％的同源性。而且，翻译的氨基酸序列包含从上述纯化的酶直接测定的内部氨基酸序列 FYNFTGFNPE(序列号6)和SLDSMILTNEIK(序列号5)的全部、以及N末端氨基酸序列XNSDSKHNNS(序列号4)和内部氨基酸序列GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(序列号7)的一部分。由以上结果可知，所克隆的DNA是来源于发光明亮杆菌JT-ISH-467株的α2，3-唾液酸转移酶基因的一部分，而且本发明的发光明亮杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列是与已报导的序列仅有30％左右同源性的新氨基酸序列。 

(3)筛选和基因克隆

用限制性酶EcoRI从pCR2.1TOPO载体上切出由(2)中克隆的发光明亮杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的一部分构成的DNA片段，以这些DNA片段为探针，对上述(1)制作的发光明亮杆菌JT-ISH-467株来源的基因组DNA文库进行筛选。按λDASH II/BamHI载体试剂盒(Stratagene产)的说明书，将约300-500pfu的噬菌体与宿主菌XL1-blueMRA(P2)一起铺在直径9cm的圆形平皿上。使噬菌斑与Hybond-N⁺尼龙滤膜接触(Amersham产)，按膜所附的说明书进行碱处理，使DNA变性并固定在膜上。使用rediprime II^TM DNA labeling system(Amersham公司产)对探针进行³²P标记。杂交是在0.5M磷酸钠缓冲液pH7.2、7％SDS、1mM EDTA中65℃过夜；洗涤条件为40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、5％SDS中65℃洗涤2次、每次15分钟，在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1％SDS、1mM EDTA中65℃洗涤2次、每次15分钟。第一轮筛选从约5000pfu的噬菌体中获得了24个阳性克隆。对其中的18个克隆进行第二轮筛选同时纯化噬菌斑。结果可以获得6种经选择·纯化的噬菌斑。 

回收这些噬菌斑，将它们分别与大肠杆菌XL1-blue MRA(P2)一起铺在NZY平板上，使噬菌体量为每个平板数万pfu，然后37℃保温过夜。向一面长出噬菌斑的6个平板各加入4ml SM缓冲液、4℃静置过夜。用巴斯德吸管回收噬菌体平板裂解物，用QIAGEN Lambda Mini Kit(QIAGEN产)提取、纯化λDNA。将这6种λDNA和(1)中纯化的JT-ISH-467株的全基因组DNA用限制性酶EcoRI、HindIII消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分级，使用0.4M NaOH进行碱印迹将凝胶转印到Hybond-N⁺尼龙滤膜(Amersham Biosciences产)上。对于该滤膜，使用上述的929bp的探针(序列号17)， 如上进行Southern杂交。其结果：用EcoRI消化时，检测出了9kb或9kb以上的条带。另一方面，用HindIII消化时，与全长λDNA、基因组DNA一起检测出4.6kb的条带。因而，将λDNA再次用HindIII消化，进行琼脂糖凝胶电泳，回收4.6kb的HindIII片段，采用常规方法将其克隆至质粒载体pBluescript SK(-)的HindIII位点。 

接下来，为测定明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的全碱基序列，基于该基因的部分DNA序列(上述929bp：序列号17)合成了以下表6所示的引物。 

表6 

名称	序列5’-3’	长度
			467-23STinRV1	TGTTGATAGAGCAACATTACC(序列号18)	21mer
467-23STinRV2	TGGTAATACCTTATGGGCAG(序列号19)	20mer
			467-23STinRV3	GAACAGCAACGGCAGAGC(序列号20)	18mer
467-23STinRV4	CTAATTCAATTCAAGGATTGG(序列号21)	21mer
			467-23STinFW1	TGGTAATGTTGCTCTATCAAC(序列号22)	21mer
467-23STinFW2	ACTGCCCATAAGGTATTACC(序列号23)	20mer
			467-23STinFW3	GCTCTGCCGTTGCTGTTC(序列号24)	18mer

使用这些引物，用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer产)分析4.6kb HindIII片段的内部碱基序列，对明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的内部及其近邻的碱基序列进行了解析。其结果，获得了序列表中的序列号1的序列。该序列是明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的开放阅读框(ORF)的全碱基序列。在第一个ATG的上游的同一阅读框内出现了翻译终止密码子，因而认为这个ATG是该基因的翻译起始密码子。

明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的ORF由1230个碱基组成，编码409个氨基酸。该氨基酸序列示于序列表的序列号2。该氨基酸序列中包含从纯化酶测得的全部4个位置的所有氨基酸序列。N末端氨基酸序列的第一个氨基酸未能测出，而由基因推导而来的该位置的氨基酸是Cys(半胱氨酸)。而且，因为成熟蛋白的N末端是序列表序列号2的序列中第22位的Cys，可以认为前面的21个氨基酸的序列经过在明亮发光 杆菌中的加工而被去除了。使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制作)分析本发明的明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶全长蛋白及其全长基因与它们的同源物的相应全长序列的同源性时发现：在氨基酸序列方面，其与美人鱼发光杆菌的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有32％的同源性，与多杀巴斯德氏菌多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)具有28％的同源性；在基因DNA序列方面，其与上述两者分别具有53％和51％的同源性。 

(4)表达载体的构建

为考察克隆的基因是否具有唾液酸转移酶活性，将该基因的全长和N末端信号肽部分删除型的基因整合入载体，在大肠杆菌中表达蛋白质，测定了该表达蛋白的活性。 

对于明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列，使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7进行分析时，预测N末端的24个氨基酸为信号肽。因此，设计并合成了两组引物(表7)，即：467-23ST-N0-Pci(序列号27)和467-23ST-C0-Bm(序列号26)，其用于克隆全长基因(在本实施例中表示为467-N0C0)；以及467-23ST-N2-Nco(序列号25)和467-23ST-C0-Bm(序列号26)，其用于克隆编码信号肽部分的氨基酸删除型蛋白的基因(在本实施例中表示为467-N2C0)。 

表7 

下划线所示为预先引入引物的克隆用限制酶Pci I(467-23ST-N0-Pci)、Nco I(467-23ST-N2-Nco)和BamH I(467-23ST-C0-Bm)的位点用。翻译起始密码子ATG和与翻译终止密码子相应的互补序列TAA加有方框。而且，在引物序列中，限制酶位点3’侧的与模板DNA退火部分的序列用粗体字示出。 PCR的模板使用整合了包含全长明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的上述4.6kb的HindIII片段的质粒。PCR的反应条件设定如下。50μl的反应液中含有模板DNA 100ng、10×Ex taq缓冲液5μl、2.5mM的每种dNTPs 4μl、引物50pmole、Ex taq(Takara Bio产)0.5μl。使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；15个循环的96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟；1个循环72℃6分钟。其结果：467-N0C0扩增出约1.2kb的PCR产物，而467-N2C0扩增出约1.1kb的PCR产物。在这些PCR产物中，467-N0C0用限制酶Pci I(New England Biolab产)和BamH I(Takara Bio产)双重消化，467-N2C0用限制酶Nco I(Takara Bio产)和BamH I双重消化，然后进行凝胶纯化。大肠杆菌表达载体使用pTrc99A(Pharmacia LKB产)。用相同的限制酶即PciI和BamH I或者Nco I和BamH I双重消化该载体并进行凝胶纯化，然后用Takara Ligation Kit(Takara Bio产)将其与经限制酶处理的PCR产物进行连接，再转染大肠杆菌TB1。按常规方法提取质粒DNA，进行限制酶分析，确认发生了插入序列的整合。为考察PCR反应所致的碱基变化，测定了467-N0C0的2个克隆和467-N2C0的3个克隆的全碱基序列。其结果：在467-N0C0的1个克隆(ISH467-N0C0第1克隆)中序列号1的碱基序列第569位的腺苷酸(A)变为鸟苷酸(G)，因此密码子由AAC变为AGC，序列号2的氨基酸序列第190位的天冬酰胺(Asn)变为丝氨酸(Ser)。Asn和Ser均为极性氨基酸。另一方面，在另一个克隆(ISH467-N0C0第2克隆)中无碱基的变化，确认其为序列号1的碱基序列。接着，测定3个467-N2C0克隆的全碱基序列。其结果，在第1和第2两个克隆中发现了伴有氨基酸替换的碱基突变。即，在ISH467-N2C0第1克隆中，序列号1的碱基序列的第476位的胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)，因此密码子由TTT变为TCT，第159位的苯丙氨酸(Phe)替换为丝氨酸(Ser)。在ISH467-N2C0第2克隆中，序列号1的碱基序列的第78位的胸腺嘧啶(T)缺失，因此引起移框，未能翻译为正确的蛋白质。另一方面，在ISH467-N2C0第3克隆中未检出突变，其含有序列号1的第73位碱基至第1230位碱基的序列。 

(5)诱导表达与活性测定

对于上述(4)获得的467-N0C0的2个克隆和467-N2C0的3个克隆， 进行蛋白质诱导表达实验。将携带整合了各克隆的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的单菌落接种于含抗生素氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB培养基(5ml)中，30℃进行前培养至A₆₀₀＝0.5左右，然后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷，和光纯药工业产)，30℃进一步振荡培养4小时。通过离心分离收集2ml培养液中的菌体，将这些菌体悬浮于200μl含0.336％TritonX-100和0.5M氯化钠的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在冰冷却下进行超声波破碎。所得的破碎液作为粗酶液用于酶活性测定。反应重复进行2次，反应组成与实施例1相同，只是反应时间为15小时。结果如下述表8所示，其表明：在ISH467-N0C0第1克隆的粗酶液和ISH467-N0C0第2克隆的粗酶液中，存在将糖供体CMP-NeuAc中被 ¹⁴C标记的NeuAc转移至糖受体底物即乳糖的因素，即唾液酸转移酶活性。此外，还表明在ISH467-N2C0第1克隆和ISH467-N2C0第3克隆的粗酶液中也存在唾液酸转移酶活性。另一方面，在ISH467-N2C0第2克隆的粗酶液中和不含粗酶液的反应液中不含有唾液酸转移酶活性。以上结果表明，在导入了ISH467-N0C0第1克隆或第2克隆、或者ISH467-N2C0第1克隆或第3克隆的大肠杆菌中有唾液酸转移酶的表达。 

表8：重组了JT-ISH-467株来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶基因的大肠杆菌的裂解液中的唾液酸转移酶活性 

(6)α2，3-唾液酸转移活性的确认

使用上述(5)的粗酶液，考察导入ISH467-N2C0第1克隆的大肠杆菌所表达的唾液酸转移酶是否具有α2，3-唾液酸转移酶活性。与实施例3相同，使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-Sugar Chain026)进行酶反应。反应结束后，95℃热处理反应溶液5分钟以使酶失活，用HPLC进行分析。酶反应是将终浓度为2.0μM的吡啶氨基化乳糖和终浓度为5.7μM的CMP-唾液酸溶于25μl的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)中，25℃进行6小时(反应1)。另一方面，使用不含CMP-唾液酸的反应液进行对照实验(反应2)。此外，为了确定标准品的保留时间，进行下述测试：该测试加入了经热处理(95℃、5分钟)而失活的粗酶液，并添加了吡啶氨基化乳糖和吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-Sugar Chain 029)。 

标准品的分析结果(图1-1)显示，吡啶氨基化乳糖的保留时间为4.1分钟，吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)的保留时间为5.4分钟。由此可知：在反应2(图1-3)中未检出的保留时间为5.3分钟的峰(图1-2)是吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)。即，证明了导入ISH467-N2C0第1克隆的大肠杆菌所表达的唾液酸转移酶具有α2，3-唾液酸转移活性。 

此外，同样对于ISH467-N0C0第1克隆和第2克隆以及ISH467-N2C0第3克隆考察了导入该克隆的大肠杆菌表达的唾液酸转移酶是否具有α2，3-唾液酸转移活性。其结果，在由大肠杆菌表达的唾液酸转移酶催化的反应中，任何一个克隆均检测出了作为反应生成物的吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)的峰。因此，表明这些酶均具有α2，3-唾液酸转移活性。 

实施例6：发光杆菌属细菌JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆、碱基序列分析及该基因在大肠杆菌中的表达

(1)JT-ISH-224株β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性和该酶的基因的存在的确认

为了确认已在实施例1中确认具有唾液酸转移酶活性的发光杆菌属JT-ISH-224株中是否存在明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转 移酶基因的同源物，实施了基因组Southern杂交。采用实施例5(1)中的方法，由JT-ISH-224株的菌体离心沉淀制备基因组DNA。然后采用实施例5(3)中的方法，用限制性酶EcoRI或HindIII消化JT-ISH-224株的基因组DNA，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分级，然后采用使用0.4M NaOH的碱印迹法将凝胶转印到Hybond-N⁺尼龙滤膜(Amersham Biosciences产)上。对于该滤膜，使用上述的JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分片段(929bp；序列号17)作为探针，采用实施例5(3)中的方法进行southern杂交，但杂交温度和清洗温度为55℃。其结果：用EcoRI消化时，检测出16kb的条带。另一方面，用HindIII消化时，检测出5kb和2.7kb的条带。该结果表明：JT-ISH-224株中存在JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的同源物。 

(2)JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆

接下来，进行JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆。采用实施例5(1)中的方法，由JT-ISH-224株的基因组DNA使用λDASH II(Stratagene产)构建基因组文库。以JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分片段(929bp；序列号17)为探针，对JT-ISH-224株的基因组文库进行筛选，但与实施例6(1)相同，杂交和清洗温度为55℃。 

其结果：在兼带噬菌斑纯化的二次筛选之前，获得了12个克隆，对于其中的6种λDNA，如实施例5(3)那样使用QIAGEN Lambda Mini Kit(QIAGEN产)进行纯化。进一步，将其中的3个克隆的λDNA样品和JT-ISH-224株的全基因组DNA用限制酶EcoRI或HindIII消化。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分级后，如上述那样转印至尼龙滤膜上。使用该滤膜，以JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分片段(929bp；序列号17)为探针，进行Southern分析，杂交和清洗温度为55℃。其结果：用EcoRI消化时，检测出12kb或12kb以上的条带。与此相对，用HindIII消化时，全部3个λDNA样品和JT-ISH-224株的全基因组DNA均检测出5kb和2.7kb的两个条带。因而，将λDNA样品再次用HindIII消化，凝胶纯化5kb和2.7kb的两个DNA片段，采用常规方法将其克隆至质粒载体pBluescript SK(-)的HindIII位点。 

然后，对于这些克隆，使用M13引物(Taraka Bio产)，用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司产)测定5kb HindIII片段和2.7kb HindIII片段两端的碱基序列。其结果，由5kb片段的一侧的DNA序列和2.7kb片段的一侧的DNA序列推测的氨基酸序列，与数据库检索结果一道，均显示了与唾液酸转移酶的同源性。为了测定JT-ISH-224株的该酶基因的全长DNA，基于由HindIII 2.7kb片段获得的DNA序列，设计、合成了下面表9的引物，用于碱基序列测定。 

表9 

名称	序列5’-3’	长度
			224-23ST-inRV 1	CAGGAACTGCAACAGCAGAG  (序列号34)	20mer

其结果，获得了序列表中的序列号28的序列。该序列是JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的开放阅读框(ORF)的全碱基序列。在第一个ATG的上游，在同一个阅读框内出现了翻译终止密码子，因而认为这个ATG是该基因的翻译起始密码子。发光杆菌属JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的ORF与明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的ORF一样，包含1230个碱基，编码409个氨基酸。该氨基酸序列示于序列表的序列号29。基因内部有HindIII位点。使用GENETYX Ver.7(GENETIC制作)进行核酸和氨基酸序列分析发现，JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因与JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因具有92％的同源性。此外，在氨基酸序列也与JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶具有92％的同源性。进一步，JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列显示其与美人鱼发光杆菌的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有33％的同源性，与多杀巴斯德氏菌多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)具有29％的同源性；在基因DNA序列方面，其与上述两者的同源性分别为54％和50％。 

(3)表达载体的构建

为考察克隆的基因是否具有唾液酸转移酶活性，将该基因的全长和N末端信号肽部分删除型基因整合入载体，在大肠杆菌中表达蛋白质，测定了该表达蛋白的活性。 

对于JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7进行分析，预测N末端的24个氨基酸为信号肽。因此，设计并合成了引物224-23ST-N0-Pci(序列号35)和 224-23ST-C0new-Bm(序列号37)，用于克隆全长基因(在本实施例中表示为224-N0C0)；以及224-23ST-N1-Nco(序列号36)和224-23ST-C0new-Bm(序列号37)，用于克隆编码信号肽部分氨基酸删除型蛋白的基因(在本实施例中表示为224-N1C0)(表10)。 

表10 

用下划线所示是预先整合入引物供克隆用的限制酶PciI(224-23ST-N0-Pci)、NcoI(224-23ST-N1-Nco)和BamHI(224-23ST-C0new-Bm)的位点。翻译起始密码子ATG和与翻译终止密码子相应的互补序列TAA加方框表示。而且，在引物序列中，与模板DNA退火部分的序列用粗体字示出。在引物224-23ST-N0-Pci中导入了用于后续克隆的PciI位点，翻译起始密码子ATG之后的胞嘧啶(C)被替换为胸腺嘧啶(T)。因此，紧随翻译起始的甲硫氨酸之后的氨基酸序列由亮氨酸(Leu)被替换为苯丙氨酸(Phe)。Leu与Phe均为疏水性氨基酸且该部分为信号肽区域，因此可以断定该突变引起酶活性发生大的变化的可能性低。 

接着，进行PCR，扩增用于整合入载体的JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因。PCR的模板使用包含JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的上述λDNA。PCR的反应条件设定如下。50μl的反应液中含有模板DNA 100ng、10×Ex taq缓冲液5μl、2.5mM的每种dNTPs 4μl、引物50pmole、Ex taq(Takara Bio产)0.5μl。使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；15个循环的96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟；1个循环的72℃6分钟。其结果：224-N0C0扩增出约1.2kb的PCR产物，224-N1C0扩增出约1.1kb的PCR产物。在这些PCR产物中，224-N0C0用限制酶PciI(New England Biolab产)和BamHI(Takara Bio产)双重消化，224-N1C0用限制酶NcoI(Takara Bio产)和 BamHI双重消化，然后进行凝胶纯化。大肠杆菌表达载体使用pTrc99A(Phatmacia LKB产)。用相同的限制酶即PciI和BamHI(导入224-N0C0时)或者NcoI和BamHI(导入224-N1C0时)双重消化该载体，并进行凝胶纯化，然后用Takara Ligation Kit(Takara Bio产)将其与经限制酶处理的PCR产物进行连接，转染大肠杆菌TB1。按常规方法提取质粒DNA，进行限制酶分析，确认插入序列的整合，然后测定了224-N0C0(ISH224-N0C0第1克隆)和224-N1C0(ISH224-N1C0第1克隆)的全部碱基序列。其结果：在ISH224-N0C0第1克隆中确认了上述的由Leu至Phe的取代，除此之外没有碱基序列的突变。同样，对于ISH224-N1C0第1克隆，没有碱基序列的突变，其含有期望的碱基序列即序列号1的第73位碱基至第1230位碱基。 

(4)诱导表达与活性测定

像实施例5(5)那样，对于ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆这两个克隆进行蛋白质诱导表达实验，测定酶活性。其结果，如下面表11所示，表明在ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆的粗酶液中存在唾液酸转移酶活性。 

表11：重组了JT-ISH-224株来源的JT-ISH-467β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶基因同源物的大肠杆菌的破碎液中的唾液酸转移酶活性 

(5)α2，3-唾液酸转移酶活性的确认

如实施例5(6)那样，将ISH224-N0C0第1克隆和ISH224-N1C0第1克隆分别导入大肠杆菌，使之表达酶，通过以吡啶氨基化乳糖为糖受体的反应，考察α2，3-唾液酸转移酶活性。通过HPLC对由大肠杆菌表达的唾液酸转移酶催化的反应生成物进行分析，其结果，使用任一克隆的反应均检测出了吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)的峰。该结果表明，JT-ISH-224株来源的唾液酸转移酶具有α2，3-唾液酸转移活性。 

实施例7：弧菌属细菌JT-FAJ-16株来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆、碱基序列分析及该基因在大肠杆菌中的表达

(1)JT-FAJ-16株存在β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性和该酶的基因的存在的确定

为了确定已在实施例1中认定具有唾液酸转移酶活性的弧菌属JT-FAJ-16株中是否存在明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的同源物，实施了基因组Southern杂交。采用实施例5(1)中的方法，由JT-FAJ-16株的菌体离心沉淀制备基因组DNA。然后采用实施例5(3)中的方法，用限制性酶EcoRI和HindIII进行消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分级，然后采用使用0.4M NaOH的碱印迹法将凝胶转印到Hybond-N⁺尼龙滤膜(Amersham Biosciences产)上。对于该滤膜，使用上述的929bp的探针(序列号17)，采用实施例5(3)中的方法进行Southern杂交，但杂交温度和清洗温度为55℃。其结果：用EcoRI消化时，检测出3.6kb的条带；用HindIII消化时，检测出7kb的条带。这表明：JT-FAJ-16株中存在JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的同源物。 

(2)JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆

接下来，进行JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的克隆。采用实施例5(1)中的方法，由JT-FAJ-16株的基因组DNA使用λDASH II(Stratagene产)构建基因组文库。以JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分片段(929bp；序列号17)为探针，对JT-FAJ-16株的基因组文库进行筛选。但杂交实验使用ECL direct labelling&detection system(Amersham Biosciences产)。按试剂盒所附的说明书制备探针。杂交是在试剂盒的杂交缓冲液中加入终浓度为5％(w/v)的封闭试剂及终浓度为0.5M的NaCl，37℃进行4小时。清洗是在0.4％SDS、0.5×SSC中50℃进行2次、每次20分钟；然后在2×SSC中室温进行1次、5分钟。信号的检测按试剂盒所附的说明书进行。 

其结果：在兼带噬菌斑纯化的一次筛选中，获得了12个克隆，对于其中的6种λDNA，如实施例5(3)那样使用QIAGEN Lambda Mini Kit(QIAGEN产)进行纯化。进一步，对这些λDNA样品和JT-FAJ-16株的全基因组DNA 用限制酶EcoRI进行消化。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分级后，如上述那样转印至尼龙滤膜上。使用该滤膜，以JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的部分片段(929bp；序列号17)为探针，使用ECL系统，在与上述相同的条件下进行Southern分析。其结果：全部6个λDNA样品和JT-FAJ-16株的全基因组DNA均检测出3.6kb的条带。因而，将λDNA样品再次用EcoRI消化，凝胶纯化3.6kb的DNA片段，采用常规方法将其克隆至质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点。 

然后，对于认为包含JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的EcoRI 3.6kb片段，使用M13引物(Taraka Bio产)，用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司产)测定两端的碱基序列。其结果，从一侧的末端DNA序列推测的氨基酸序列在数据库检索中显示与美人鱼发光杆菌的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有27％的同源性。为了完全测定JT-FAJ-16株的α2，3-唾液酸转移酶基因的全碱基序列，基于由EcoRI 3.6kb片段获得的DNA序列合成了下面表12的引物用于碱基序列测定。 

表12 

名称	序列5’-3’	长度
			FAJEc3.6RV1	TTC AAA ACT GCC TGA GTC AG(序列号38)	20mer
FAJEc3.6RV2	ATT TCA TGG TCT AGA TAC CC(序列号39)	20mer

由获得的碱基序列数据进一步设计、合成以下表13记载的引物，进行全碱基序列测定。 

表13 

名称	序列5’-3’	长度
			FAJ23ST inFW3	CTG ACT CAG GCA GTT TTG AA(序列号40)	20mer
FAJ23ST inFW4	GAA AGC AAC TCT CTC AAT GGG(序列号41)	21mer
			FAJ23ST inRV3	ATA AAC CCA TTG AGA GAG TTG(序列号42)	21mer

其结果，获得了序列表中的序列号30的序列。该序列是JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因的开放阅读框(ORF)的全碱基序列。在第一个ATG的上游，在同一个阅读框内出现了翻译终止密码子，因而认为这个ATG是该基因的翻译起始密码子。JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移 酶基因的ORF包含1209个碱基，编码402个氨基酸。该氨基酸序列示于序列表的序列号31。使用GENETYX Ver.7(GENETIC制作)进行核酸和氨基酸序列分析发现，JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因与JT-ISH-467株和JT-ISH-224株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因分别具有69.7％和68％的同源性。此外，氨基酸序列也分别显示64.7％和64.8％的同源性。进一步，JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列显示与美人鱼发光杆菌的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有30.5％的同源性、与多杀巴斯德氏菌多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)具有27.3％的同源性；在基因DNA序列方面，其与上述两者分别具有51.2％和48.3％的同源性。 

(3)表达载体的构建

为考察克隆化基因是否具有唾液酸转移酶活性，将该基因的全长和N末端信号肽部分删除型基因组合入载体，在大肠杆菌中表达蛋白质，测定了该表达蛋白的活性。 

对于JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶的氨基酸序列使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7进行分析，预测N末端的22个氨基酸为信号肽。因此，设计并合成了引物FAJ23STN0-BspHI(序列号43)和FAJ23STC0-BamHI(序列号45)，用于克隆全长基因(在本实施例中表示为FAJ-N0C0)；以及引物FAJ23STN1-BspHI(序列号44)和FAJ23STC0-BamHI(序列号45)，用于克隆编码信号肽部分氨基酸删除型蛋白的基因(在本实施例中表示为FAJ-N1C0)(表14)。 

表14 

下划线示出的是预先整合入引物用于克隆的限制酶BspHI (FAJ23STN0-BspHI、FAJ23STN1-BspHI)、BamHI(FAJ23STC0-BamHI)的位点。翻译起始密码子ATG和与翻译终止密码子相应的互补序列TAA加方框表示。而且，在引物序列中，与模板DNA退火部分的序列用粗体字示出。使用这些引物进行PCR，扩增用于整合入载体的JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶基因。PCR的模板使用包含该基因的上述3.6kb DNA片段。PCR的反应条件设定如下。50μl的反应液中含有模板DNA 300ng、10×Ex taq缓冲液5μl、2.5mM的每种dNTPs 4μl、引物50pmole、Ex taq(Takara Bio产)0.5μl。使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；10个循环的96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟；1个循环的72℃6分钟。其结果：FAJ-N0C0扩增出约1.2kb的PCR产物，而FAJ-N1C0扩增出约1.1kb的PCR产物。将这些PCR产物按照TA克隆试剂盒(Invitrogen产)的说明书克隆在TA克隆用载体pCR2.1TOPO(Invitrogen产)上。大肠杆菌使用TB1。按常规方法从获得的菌落纯化质粒，用限制酶EcoRI确定PCR产物已经导入载体。确认已发生导入的质粒样品用限制性酶BspHI和BamHI双重消化后，凝胶纯化1.2kb(FAJ-N0C0)或1.1kb(FAJ-N1C0)的片段。然后将这些DNA样品用Takara Ligation Kit(Takara Bio产)与预先经限制酶NcoI和BamHI双重消化的大肠杆菌表达载体pTrc99A进行连接，导入大肠杆菌TB1。按常规方法提取质粒DNA，进行限制酶分析，确认插入序列的整合，测定了1个FAJ-N0C0代表克隆(FAJ-N0C0第1克隆)和2个FAJ-N1C0代表克隆(FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆)的全碱基序列。其结果：FAJ-N0C0第1克隆没有碱基序列的变异，其含有期望的碱基序列即序列表中序列号30的第1位碱基至第1209位碱基。另一方面，对于FAJ-N1C0，其第1克隆没有碱基序列的变异，其含有期望的碱基序列即序列表中序列号30的第67位碱基至第1209位碱基；而在其第2克隆中，序列号30中第631位碱基的腺嘌呤(A)变为了鸟嘌呤(G)。因此，密码子由ACA变为GCA，氨基酸由苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala)。除此之外不存在碱基取代。 

(4)诱导表达与活性测定

像实施例5(5)那样，对于FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆这三个克隆进行蛋白质诱导表达实验，测定酶活性。其结果，如 下面表15所示，表明在FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆的粗酶液中存在唾液酸转移酶活性。 

表11：重组了JT-FAJ-16株来源的JT-ISH-467β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶基因同源物的大肠杆菌的破碎液中的唾液酸转移酶活性 

(5)α2，3-唾液酸转移活性的确认

如实施例5(6)那样，将FAJ-N0C0第1克隆、FAJ-N1C0第1克隆和第2克隆这三个克隆分别导入大肠杆菌使之表达酶，通过以吡啶氨基化乳糖为糖受体的反应考察α2，3-唾液酸转移酶活性。通过HPLC对由大肠杆菌表达的唾液酸转移酶催化的反应生成物进行分析，结果，使用任一克隆的反应均检测出了吡啶氨基化α2，3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’-唾液酸乳糖)的峰。该结果表明，JT-FAJ-16株来源的唾液酸转移酶具有α2，3-唾液酸转移酶活性。 

实施例8：各种唾液酸转移酶蛋白的氨基酸序列的多重比对分析

使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制作)进行多重比对分析。其结果，明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源、发光杆菌JT-ISH-224株来源、以及弧菌属JT-FAJ-16株来源的α2，3-唾液酸转移酶(分别为序列号2、29、31)，美人鱼发光杆菌的α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)以及多杀巴斯德氏菌多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188(AKK02272)显示如图2的比对。此外，JT-ISH-467株来源的α2，3-唾液酸转移酶的下划线表示从纯化蛋白测定的氨基酸序列。 

实施例9：β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性的最适pH和最适温度

使用制备的纯化酶，考察了JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液 酸转移酶，ISH467-N2C0第3克隆、ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆产生的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的最适pH和最适温度。 

(1)酶活性的最适pH

配制醋酸缓冲液(pH4.0、pH4.5和pH5.0)、卡可基酸缓冲液(pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5和pH7.0)、磷酸缓冲液(pH7.0、pH7.5和pH8.0)、TAPS缓冲液(pH8.0、pH8.5、pH9.0)、CHES缓冲液(pH9.0、pH9.5和pH10.0)和CAPS缓冲液(pH10.0、pH10.5和pH11.0)，使用这些缓冲液在25℃测定各pH条件下的酶活性。 

结果如图3-1和图3-2所示，JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶在pH5.0、ISH467-N2C0第3克隆在pH5.5、ISH224-N1C0第1克隆在pH5.0、FAJ-N1C0第1克隆在pH5.5时，酶活性最大。而且，所有酶均在pH5.0至pH7.0或乃至pH9.0具有高活性。此外，各pH条件下的酶活性是以显示最大活性的pH条件下的酶活性为100而得到的相对活性。 

(2)酶活性的最适温度

对于各种酶在从5℃到45℃，依次相隔5℃的各反应温度下测定酶活性，其中对于JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶在pH5.0、对于ISH467-N2C0第3克隆使用卡可基酸缓冲液(pH5.5)、对于ISH224-N1C0第1克隆使用卡可基酸缓冲液(pH5.0)、对于FAJ-N1C0第1克隆使用卡可基酸缓冲液(pH5.5)进行测定。 

结果如图4-1和图4-2所示，JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶在25℃、ISH467-N2C0第3克隆在25℃、ISH224-N1C0第1克隆在30℃、FAJ-N1C0第1克隆在20℃时，酶活性最大。而且，所有酶均在15℃或20℃-30℃或乃至35℃具有高活性。此外，各温度下的酶活性是以显示最大活性的温度条件下的酶活性为100而得到的相对活性。 

实施例10：β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的质谱分析 

通过激光离子化飞行时间型质谱分析装置(株式会社岛津制作所MALDI-TOFMS AXIMA-CFR)对JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶以及ISH467-N0C0第2克隆、ISH467-N2C0第3克隆、 ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆所产生的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的纯化酶进行质谱分析，其结果，它们的分子量分别为45,026Da、45,023Da、44,075Da、43,996Da和43,921Da。 

对于SH467-N2C0第3克隆、ISH224-N1C0第1克隆和FAJ-N1C0第1克隆，质谱分析结果与从氨基酸序列推测的分子量一致。然而，对于明亮发光杆菌JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶以及ISH467-N0C0第2克隆，质谱分析结果与从氨基酸序列推测的分子量不一致。可以认为其原因是这两个酶的氨基酸序列中包含称为脂盒(リポボツクス)的共有序列(Leu-Gly-Gly-Cys：序列号2的氨基酸残基19-22)，在细菌内，其在该共有序列的Cys的氨基末端一侧被切断，而在脂盒中的Cys上附加脂质(Madan Babu，M.and Sankaran，K.，Bioinformatics.，18，641-643(2002))。 

实施例11：重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的受体底物特异性(单糖·二糖类·三糖类)的比较

(材料与方法)

使用离子交换层析和羟基磷灰石层析，将从ISH467-N2C0第3克隆重组大肠杆菌、ISH224-N1C0第1克隆重组大肠杆菌和FAJ-N1C0第1克隆重组大肠杆菌制备的菌体破碎液纯化至电泳单一条带，使用这样纯化的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶进行以下实验，以考察其是否具有向各种单糖、二糖类和三糖类转移唾液酸活性。 

使用各种糖受体底物的唾液酸转移反应

制备反应溶液，其中24μl该反应溶液中包含：糖供体底物即含CMP-¹⁴C-NeuAc的CMP-NeuAc(21.9nmol、在反应溶液中的终浓度为0.874mM)、用20mM卡可基酸缓冲液(pH5.0)溶解的各种糖受体底物(1μmol、在反应液中的终浓度为42mM)、唾液酸转移酶(酶量如表脚注所示)、NaCl(在反应溶液中的终浓度为500mM)，按表脚注的条件进行反应。而且，作为糖受体底物使用10种单糖，即：甲基-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(Gal-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(Man-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃甘露糖苷(Man-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃岩藻糖苷(Fuc-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃岩藻糖苷(Fuc-β-OMe)、N- 乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)；使用5种二糖类，即：乳糖(Gal-β1，4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-β1，4-GlcNAc)、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Gal-β1，3-GlcNAc-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃半乳糖基-α1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-α1，3-Gal-α-OMe)和甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-β1，3-Gal-β-OMe)；使用1种三糖类，即：2’-岩藻糖基乳糖(Fuc-α1，2-Galβ1，4-Glc)。表18所示的糖链、甲基-α-D-吡喃半乳糖基-α1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-α1，3-Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-β1，3-Gal-β-OMe)和2’-岩藻糖基乳糖(Fuc-α1，2-Galβ1，4-Glc)以8.4mM的终浓度反应。 

酶反应结束后，向反应溶液中加入1.98ml的5mM磷酸缓冲液(pH6.8)以终止酶反应。然后，将用5mM磷酸缓冲液(pH6.8)稀释的酶反应溶液(2ml)上样于AG1-×2Resin(PO₄ ^3-型、0.2×2cm)柱。该柱是将AG1-×2Resin(OH^-型、BIO-RAD公司产)悬浮于1M磷酸缓冲液(pH6.8)，30分钟后用蒸馏水清洗树脂，然后再将树脂悬浮在蒸馏水中而制备的。测定该柱的洗脱液(0-2ml)的放射活性。该柱的洗脱液中含有反应生成的结合有¹⁴C-NeuAc(N-乙酰神经氨酸)的反应生成物和未反应的糖受体底物，而未反应的CMP-¹⁴C-NeuAc保留在柱上。因而，酶反应最终生成的各种含唾液酸糖链来源的¹⁴C放射活性，全部来自反应生成物，由该级分的放射活性可以计算出酶活性。 

采用上述方法测定转移至各种糖受体底物的NeuAc的放射活性，并计算出发生转移的唾液酸。 

(结果)

表明唾液酸可以高效地转移至此次作为糖受体底物使用的16种单糖、二糖、三糖中的任何一种(表16、表17和表18)。此外，对于各种受体底物的相对活性是以对乳糖的唾液酸转移酶活性为100而得到的值。 

表16：受体底物特异性(1) 

反应条件：

反应组成： 

反应温度：20℃ 

反应时间：14小时 

表17：受体底物特异性(2) 

反应条件：

反应组成： 

反应温度：30℃ 

反应时间：0.5分钟或2分钟 

酶量：对于ISH467-N2C0，每个反应为2.3mU；对于ISH224-N1C0，每个反应为1.0mU。 

表18：受体底物特异性(3) 

反应条件：

反应组成： 

反应温度：30℃ 

反应时间：2分钟 

酶量：对于ISH467-N2C0，每个反应为2.3mU；对于ISH224-N1C0，每个反应为1.0mU。 

实施例12：重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶对糖蛋白的受体底物特异性

使用离子交换层析和羟基磷灰石层析，将从ISH467-N2C0第3克隆重组的大肠杆菌、ISH224-N1C0第1克隆重组的大肠杆菌和FAJ-N1C0第1克隆重组的大肠杆菌制备的菌体破碎液纯化至电泳单一条带，使用这样纯化的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶进行以下实验，以考察其是否具有向糖蛋白转移唾液酸的活性。 

糖受体底物使用脱唾液酸胎球蛋白。将2mg的脱唾液酸胎球蛋白溶于1ml的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)，作为糖受体底物溶液。糖供体底物使用含CMP-¹⁴C-NeuAc的CMP-NeuAc。混合糖受体底物溶液40μl、糖供体底物5μl(22.8hmol(约19,000cpm))和酶溶液5μl(各10mU)，25℃保温2小时，进行唾液酸转移反应。反应结束后，将反应溶液上样于用0.1M氯化钠平衡的Sephadex G-50 super fine(0.8×18.0cm)，进行凝胶过滤。收集含 糖蛋白的凝胶过滤洗脱液级分(2-4ml的级分)，用液体闪烁计数器测定该级分的放射活性，对转移至糖受体底物的唾液酸进行定量。 

结果如表19所示，表明任何一种酶均向脱唾液酸胎球蛋白转移唾液酸。 

表19：受体底物特异性(4) 

酶液	放射活性(cpm)
		ISH467-N2C0	1729
ISH224-N1C0	3301
		FAJ-N1C0	2865
不含酶	9

反应条件：

反应组成： 

无唾液酸胎球蛋白溶液                                            10μl 

酶液                                                            5μl 

5mM CMP-唾液酸(20mM卡可基酸缓冲液(pH5)中)+CMP-¹⁴C-唾液酸        5μl 

实施例13：重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶对PA糖链的受体底物特异性

使用离子交换层析和羟基磷灰石层析，将从ISH467-N2C0第3克隆重组的大肠杆菌、ISH224-N1C0第1克隆重组的大肠杆菌和FAJ-N1C0第1克隆重组的大肠杆菌制备的菌体破碎液纯化至电泳单一条带，使用这样纯化的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶进行以下实验，以考察其是否具有向PA糖链转移唾液酸的活性。 

与实施例3相同，使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-Sugar Chain 026)、吡啶氨基化GM1-戊多糖(Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-Sugar Chain 032)和吡啶氨基化GD1b-己多糖(Galβ1-3GalNAc β1-4(Neu5Ac α2-8Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-Sugar Chain 034)按表脚注的条件进行酶反应。反应结束后，95℃热处理反应溶液5分钟以使酶失活，用HPLC进行分析。 

其结果，以PA-Sugar Chain 026为受体底物时，任何一种酶均检测出与PA-Sugar Chain 029标准品具有相同洗脱时间的峰。同样地，以PA-Sugar Chain 032为受体底物时，可以检测出与PA-Sugar Chain 033标准品具有相同洗脱时间的峰；而以PA-Sugar Chain 034为受体底物时，可以检测出与PA-Sugar Chain 036标准品具有相同洗脱时间的峰。因此，这表明JT-ISH-467株、JT-ISH-224株和JT-FAJ-16株来源的重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶具有以α2，3键连接方式向位于受试PA糖链非还原末端的半乳糖转移唾液酸的活性。 

表20：受体底物特异性(5) 

反应条件：

反应组成： 

反应温度：20℃ 

反应时间：ISH467-N2C0为3小时；ISH224-N1C0为16小时；FAJ-N1C0为24小时。 

工业实用性 

本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸，从而提供已明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成·生产手段。特别是唾液酸在生物体内的复合糖链中多存在于非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一。本发明的新唾液酸转移酶可以用于开发利用糖链的医药产品、功能性食品等。 

Claims (20)

1.一种分离的蛋白质，其包含选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列。

2.一种分离的蛋白质，其由选自序列号2及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列组成。

3.一种具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其包含如下所述的氨基酸序列：该氨基酸序列与选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列具有至少99％的氨基酸同源性。

4.一种具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其由包含选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的核酸编码。

5.一种具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其由下述核酸编码：所述核酸由选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列组成。

6.一种具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性分离的蛋白质，其由包含如下所述的碱基序列的核酸编码：该碱基序列在0.5M磷酸钠pH7.2、1mMEDTA、7％SDS、1％BSA中65℃的杂交条件，以及40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中65℃的洗涤条件下可与选自序列号1及序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的互补链杂交。

7.权利要求1-6任一项的分离的蛋白质，其来自弧菌科微生物。

8.一种分离的核酸，其编码如下所述的蛋白质：该蛋白质包含选自序列号2以及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列。

9.一种分离的核酸，其编码由选自序列号2以及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质。

10.一种分离的核酸，其编码包含如下所述的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质：该氨基酸序列与选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列具有至少99％的同源性。

11.一种分离的核酸，其包含选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列。

12.一种分离的核酸，由选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列组成。

13.一种分离的核酸，其编码具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质，该核酸包含如下所述的碱基序列：该碱基序列在0.5M磷酸钠pH7.2、1mM EDTA、7％SDS、1％BSA中65℃的杂交条件，以及40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中65℃的洗涤条件下可与选自序列号1及序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的互补链杂交。

14.包含权利要求8-13任一项所述核酸的重组载体。

15.用权利要求14所述的重组载体转化的宿主细胞。

16.一种弧菌科的分离的微生物，其表达权利要求1-7任一项所述的蛋白质。

17.权利要求16所述的微生物，其为明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏号NITE BP-88)。

18.一种生产具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的方法，包括以下步骤：

1)培养产生β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的微生物，所述β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶是权利要求1-7中任一项所述的分离的蛋白质；和

2)从培养的微生物或培养上清分离β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶。

19.一种生产具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的方法，包括以下步骤：

1)用包含权利要求8-13任一项所述的核酸的重组载体转化宿主细胞；

2)培养经过转化的所述宿主细胞；和

3)从培养的宿主细胞或培养上清分离具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。

20.一种生产唾液酸糖链的方法，包括：

(i)制备包含权利要求1-7任一项所述的蛋白质、糖供体底物及糖受体底物的溶液；

(ii)在该溶液中进行唾液酸转移反应；和

(iii)从反应溶液获得生成的唾液酸糖链。

Images