CN101400789B

CN101400789B - 新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法

Info

Publication number: CN101400789B
Application number: CN2006800538817A
Authority: CN
Inventors: 塚本浩史; 峰利喜; 高仓由光; 山本岳
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2006-03-14
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2026-08-10
Also published as: US20100304460A1; EP2006378A1; EP2006378A4; CA2647221A1; NZ571868A; US7993875B2; KR20090007699A; AU2006340241A1; WO2007105305A1; US8187838B2; US20090291471A1; WO2007105321A1; CN101400789A

Abstract

本发明提供具有高生产性和/或高活性的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶以及编码该唾液酸转移酶的核酸。本发明还提供生产该唾液酸转移酶的微生物。本发明进一步提供含有编码该唾液酸转移酶的核酸的载体，以及用该载体转化的宿主细胞，并且提供制备重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法。

Description

新β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法

技术领域

本发明涉及新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、生产该酶的微生物和该酶的生产方法。

背景技术

糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等(以下称复合糖)的糖链的生物合成相关的酶。其反应生成物即复合糖的糖链在生物体内具有非常重要的功能。例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质信号传导、复合糖的靶标而发挥作用。

其应用例为血液中生产红血球的激素促红细胞生成素。天然的促红细胞生成素存在效果持续性差的缺点。因此，促红细胞生成素是一种糖蛋白，通过附加新的糖链开发了可延长生物体寿命的重组促红细胞生成素蛋白，并生产且实现了商品化。今后，此类附加或改变糖链的医药品、功能性食品等的开发也会越来越多。因此，寻求开发一种可任意合成/生产糖链的方法。其中，一种最有效的方法是糖转移酶的开发，其重要性越来越明显。

至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150种以上的糖转移酶基因。并已进一步在CHO细胞、大肠杆菌等宿主细胞中发现了该基因，且生产出具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核生物细菌中也分离出20～30种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、各种酶化学性质。

由于唾液酸多存在于糖链的非还原末端，对于糖链功能的表达，是极为重要的糖。于是，在糖转移酶中，唾液酸转移酶是最重要且高活性酶的一种。关于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因，有很多动物，特别是哺乳类动物来源的报道(Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)；Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987))。但由于这些动物来源的酶很难纯化，不能大量获得，价格很高，而且存在酶稳定性差的问题。另一方面，有唯一一篇报导称已从属于美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的微生物中获得了微生物来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因(国际公开第WO98/38315号；美国专利6255094号公报)。

但由美人鱼发光杆菌生产发光杆菌属来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性为550U/L(Yamamoto，T.，等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(2)，210-214(1998))，利用含有该基因的质粒pEBST△178通过重组大肠杆菌生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性为224.5U/L(Yamamoto，T.，等.，J.Biochem.，123，94-100(1998))，目前需要一种具有更高生产性的酶。此外，美人鱼发光杆菌来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的比活性为5.5U/mg(Yamamoto，T.等.，J.Biochem.，120，104-110(1996))，从这个角度考虑更需要寻找一种活性更高的酶。

另外，酶的种类很多，在公知的微生物来源的唾液酸转移酶中，生产性和活性较高的例子为出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)来源的α2，3-唾液酸转移酶，其生产性为6,000U/L(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.，127，17618-17619(2005))，比活性为60U/mg。

出于对唾液酸转移酶的高需求，更需要一种高生产性和/或活性高的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。

专利文献1：国际公开第WO98/38315号小册子

专利文献2：美国专利6255094号公报

非专利文献1：Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)

非专利文献2：Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987)

非专利文献3：Yamamoto，T.等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(2)，210-214(1998)

非专利文献4：Yamamoto，T.等.，J.Biochem.，123，94-100(1998)

非专利文献5：Yamamoto，T.等.，J.Biochem.，120，104-110(1996)

非专利文献6：Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.，127，17618-17619(2005)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题是提供来源于属于弧菌科发光杆菌属(ビブリオ科フォトバクテリア属)微生物的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码基因。此外，本发明的目的为，提供较微生物来源的公知唾液酸转移酶具有更高生产性和/或更高活性的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码基因。

另外，本发明的课题是提供利用编码本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的基因采用基因重组技术高效生产该酶的方法。

解决课题的方法

本发明者们分离了来自日本全国的4,000菌株以上的微生物，对其性质进行了锐意研究，结果在属于发光杆菌属(Photobacterium)的微生物菌株中发现了生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的菌株。然后，将公知基因即美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的DNA作为探针，由该菌株克隆了新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因。使该基因在大肠杆菌中表达，结果发现该基因编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，该酶产量高，为每1L培养液约10，700U。进而将该重组酶纯化，详细分析后结果发现，该重组酶将唾液酸以α2，6键高效转移至糖链中的半乳糖残基、N-乙酰半乳糖胺残基等处，其比活性高，约为110U/mg至260U/mg。由此，可知其较公知酶美人鱼发光杆菌来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶明显具有多方面优势，从而完成了本发明。本发明提供具有高生产性和/或高活性的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、编码该酶的核酸和该唾液酸转移酶的生产方法。

以下，对本发明进行详细说明。

β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶

本发明提供新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶”是指，具有使唾液酸由一磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转移至下述位置的活性的蛋白质，所述位置为：复合糖糖链或游离糖链中的半乳糖残基的6位，或者存在于乳糖或N-乙酰半乳糖胺等寡糖中的半乳糖残基的6位，或者半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖等可构成复合糖且6位的碳上有羟基的单糖的6位。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性”指β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的上述活性。此外，这里所述的唾液酸是指属于唾液酸家族的神经氨酸衍生物。具体地是指N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、5-脱氨基-5羟基神经氨酸(KDN)、ジシアル酸(二N-乙酰神经氨酸：Neu5Acα2，8(9)Neu5Ac)等。

本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶是含有SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO：4的氨基酸序列相当于是在SEQ ID NO：2的氨基酸18-514的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸的序列。SEQ ID NO：12的氨基酸序列相当于是在SEQ ID NO：2的氨基酸111-514的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸的序列。该N末端的甲硫氨酸来自蛋白质表达的起始密码子，不影响作为β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的活性。此外，蛋白质N末端的甲硫氨酸经常有通过细胞内加工而脱落的情况。因此，当为含有SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质时，不仅包括含有与SEQ ID NO：4完全一致的氨基酸序列的蛋白质的情况，也包括含有N末端甲硫氨酸缺失的氨基酸序列的蛋白质的情况。

在实施例2中，ISH224-N1C0/pTrc(SEQ ID NO：4：在SEQ ID NO：2的氨基酸18-514的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸的序列)以及ISH224-N3C0/pTrc(SEQ ID NO：12：在SEQ ID NO：2的氨基酸111-514的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸的序列)均保持了JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的活性。因此，如果存在SEQ ID NO：2中的至少氨基酸111-514，就能保持β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的活性。因此，本发明的“含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的蛋白质”包含含有SEQ IDNO：2的氨基酸1-514中氨基酸1-110全部或部分缺失的氨基酸序列组的蛋白质。

此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶是由含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11碱基序列的核酸编码的蛋白质。SEQ ID NO：3的碱基序列为相当于在SEQ ID NO：1的碱基52-1545碱基序列的5’末端添加起始密码子(ATG)的序列。SEQ ID NO：11的碱基序列为相当于在SEQID NO：1的碱基331-1545碱基序列的5’末端添加起始密码子(ATG)的序列。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：11的碱基序列分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

在本发明的含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶中，SEQ ID NO：2的氨基酸12-15的序列为Leu-Thr-Ala-Cys，这是被称为脂盒(リポボツクス)的共有序列，因此，可以认为：在细菌内，其在该共有序列的Cys的氨基末端一侧被切断(Madan Babu，M.and Sankaran，K.，Bioinformatics.，18，641-643(2002))。因此，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以是含有SEQ ID NO：2的氨基酸15-514的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶也可以是由包含SEQID NO：1的碱基43-1545的碱基序列的核酸编码的蛋白质。

本发明还包括下述变体蛋白，其为上述本发明β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的变体，且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。这样的变体蛋白也包含于本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶中。

本发明的变体蛋白可以是含有下述氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列在选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸15-514、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。

氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如公知的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。

就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有作为单链的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。

另外，在保持其活性的同时对酶等生物活性多肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，删除、然后取代插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。

本发明的变体蛋白可以是由下述核酸编码且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质：其中所述核酸包含在选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：1的核苷酸43-1545、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的碱基序列中有一个或多个核苷酸发生缺失、取代、插入和/或添加而成的碱基序列。核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加除了定位诱变外，还可采用上述方法进行。

本发明的变体蛋白还可以是含有下述氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸15-514、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少60％，优选至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％，更优选至少99.5％的氨基酸同一性。

此外，本发明的变体蛋白还可以是由下述核酸编码且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述核酸与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：1的核苷酸43-1545、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的碱基序列具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％，更优选至少99.5％的同一性。

两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来决定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵、blosum62；(2)一个空位扣12分；(3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。

也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Centerfor Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常用默认值进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。

两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux，等.，1984，Nucl.Acids Res.，12:387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列、并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括：(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG时，如Schwartz和Dayhoff主编的”多肽序列及结构图谱(Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure)”(国立生物医学研究财团，353-358页，1979年)所记载的Gribskov及Burgess(Nucl.AcidsRes.，14:6745，1986)的加权氨基酸比对矩阵；或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/bls.html提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。关于UW-BLAST2.0标准默认参数的设定，以下网站：http://blast.wustl.edu中有记载。而且，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含括具有低组成复杂性的提问序列片断(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；参考Wootton及Federhen，1996”序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases)”Methods Enzymol.，266:544-71)，或掩蔽短周期性内部重复形成片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分(Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不能报告该匹配；优选E-得分阈值的数值为0.5，此外按照优选度增大的顺序依次为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、1e-100。

本发明的变异蛋白质也可以是由含有下述碱基序列的核酸编码的、具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述碱基序列在严格条件下，与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的核苷酸43-1545、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：11的碱基序列的互补链杂交。

此处，所说的“严格条件下”是指在中度或高度的严格条件下进行杂交。中度严格条件的具体例为根据DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易的确定。基本条件如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，第6-7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，而且关于硝基纤维素滤膜，其可使用的情况包括：5×SSC、0.5％SDS、1.0mEDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约40-50℃约50％的甲酰胺、2×SSC-6×SSC(或约42℃、约50％甲酰胺中的Stark’s溶液等其它类似的杂交液)的杂交条件，以及例如在约40℃-60℃，0.5-6×SSC，0.1％SDS的洗涤条件下使用。优选中度严格条件包括约50℃，6×SSC的杂交条件(以及洗涤条件)。关于高度严格条件，例如根据DNA长度，本领域技术人员能够容易的确定。

通常，该条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如：约65℃，6×SSC-0.2×SSC，优选6×SSC，更优选2×SSC，最优选0.2×SSC的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65℃-68℃，0.2×SSC，0.1％SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl以及15mM柠檬酸钠)使用，在杂交结束后15分钟进行洗涤。

此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以举例，使用ECL direct labeling&detection system(Amersham公司制)的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入封闭试剂5％(w/v)、NaCl0.5M，于42℃进行杂交4小时，关于洗涤，在0.4％SDS、0.5xSSC中，55℃条件下每次20分钟，洗涤两次，在2xSSC中，室温条件下，每次5分钟，洗涤一次。

唾液酸转移酶活性可以采用公知方法测定，例如采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全文引入本文)中记载的方法。例如，以CMP-Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)为糖供体底物、以乳糖为糖受体底物进行酶反应，通过评价反应生成物唾液酸乳糖的量可以评价酶活性。此外，1单位(1U)酶为每分钟转移1微摩尔唾液酸的酶量。

作为确定转移至糖受体底物的唾液酸的结合形式的方法，可以采用任何本领域技术人员公知的方法进行，例如但不限于使用吡啶氨基化糖链的方法、采用核磁共振分光法(NMR)对反应生成物进行分析等。使用吡啶氨基化糖链的方法中包括以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。具体地，以吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio产品)为糖受体底物、以CMP-Neu5Ac为糖供体底物进行酶反应，对反应生成物进行高效液相色谱(HPLC)分析，由反应生成物的保留时间判断唾液酸转移的位置。

在本发明的一类实施方式中，本发明的酶是源自属于发光杆菌属的微生物。本发明的酶只要是属于发光杆菌属的微生物即可，没有特别的限制，也可以是源自属于发光杆菌属新种微生物的酶。

本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的酶学性质和理化性质，除以具有上述定义的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性为特征外，并非限定，其最适pH在pH5-6的范围，其最适温度为25-35℃，分子量用SDS-PAGE分析为56,000±3000Da左右。

此外，在本发明的一类实施方式中，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，其具有高β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。此处所说的高β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性是指每1mg酶具有6U以上、10U以上、20U以上、40U以上、60U以上、100U以上的活性。

编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸

本发明提供编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸。

本发明的核酸是编码含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸15-514、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12的氨基酸序列的蛋白质的核酸。此外，本发明的核酸是含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的碱基43-1545、SEQID NO：3、SEQ ID NO：11的碱基序列的核酸。

本发明的核酸可以是上述核酸的变体，所述变体编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的核酸也包含于本发明的编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸之中。

这样的核酸的变体是编码含有下述氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列是在选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸15-514、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12的氨基酸中一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加而成的氨基酸序列。此外，本发明的核酸的变体是含有下述碱基序列的核酸，所述碱基序列是在选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的碱基43-1545、SEQ ID NO：3、SEQID NO：11的碱基序列中一个或多个核苷酸发生缺失、取代、插入和/或添加而成的碱基序列。氨基酸或核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加可通过上述方法导入。

此外，这样的核酸的变体还可以是编码含有下述氨基酸序列、且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2的氨基酸15-514、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的同一性。本发明的核酸的变体还可以是与如下所述的碱基序列具有优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％、更优选至少99.5％的同一性且编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：1的碱基43-1545、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11的碱基序列。这里，氨基酸序列核酸或碱基序列的同一性可以用前面描述的方法确定。

这样的核酸的变体还可以是含有下述碱基序列、且编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列在严格条件或高度严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的碱基43-1545、SEQID NO：3、SEQ ID NO：11的碱基序列的互补链杂交。这里，严格条件或高度严格条件的定义同上。

表达β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物

本发明人发现，属于弧菌科发光杆菌属的微生物表达新的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。因而，本发明提供表达β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物。本发明的微生物是属于发光杆菌属且具有产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶能力的微生物。具有产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶能力的属于发光杆菌属的微生物，可以举例，发光杆菌属(photobacterium sp.)JT-ISH-224株(保藏编号NITE BP-87)。此外，上述发光杆菌属的微生物通常为海洋性细菌，其是从海水中或海产鱼贝类分离的。例如，本发明发光杆菌属JT-ISH-224株是从石川县产的梭子鱼(カマス)分离的。

本发明的微生物例如可以采用诸如以下说明的筛选方法进行分离。以海水、海砂石、海泥或海产鱼贝类作为微生物源。将海水、海砂石或海泥直接或用灭菌海水稀释后作为接种源。对于海产鱼贝类，可以用接种环擦取其表面粘液等作为接种源，或者以在灭菌海水中磨碎其内脏而得的液体作为接种源。将这些涂布在Marine Broth Agar2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Agar培养基(Becton·Dickinson产)等平板培养基上，获得在各种温度条件下生长的海洋微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用Marine Broth2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Broth(Becton·Dickinson产)等液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0.2％TritonX-100(关东化学产)的20mM二甲胂酸盐(カコジレ—ト)缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液，按常规方法测定唾液酸转移酶活性，可以获得具有唾液酸转移酶活性的菌株。

本发明的发光杆菌属JT-ISH-224株也是使用上述的筛选方法获得的。关于所获上述菌株的细菌学性质和生理生化性质以及通过16S rRNA基因的碱基序列分析进行的菌种鉴定将在实施例1中详细描述。

根据布达佩斯条约的规定，发光杆菌属JT-ISH-224株保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD：National Instituteof Technology and Evaluation，Patent Microorganisms Depositary；日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，保藏日为2005年3月11日，保藏编号为NITEBP-87。

生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法

本发明还涉及生产本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法。在优选实施方式中，利用本发明的方法高效生产本发明的酶。具体而言，本发明方法中本发明的酶的生产性为每1L培养液50U/L以上，1,000U/L以上，10,000U/L以上。

(1)通过培养表达β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物生产该酶的方法

在本发明的一个实施方式中，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶来自属于发光杆菌属的微生物；通过在培养基中培养具有产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶能力的微生物，使之产生β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，并将其提取而获得。

作为此处使用的微生物，只要是属于发光杆菌属且具有产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶能力的微生物，可以使用任何菌株。优选属于发光杆菌属的微生物。在本发明的方法中使用的微生物例如有发光杆菌属(Photobacterium sp.)JT-ISH-224株(保藏编号NITE BP-87)。

作为用于培养上述微生物的培养基，使用含有这些微生物可利用的碳源、氮源、无机物等的培养基。碳源例如蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白分解物、肉浸膏、葡萄糖等，优选使用蛋白胨。作为氮源，优选使用酵母提取物。作为盐类，优选适当组合使用氯化钠、柠檬酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等。

此外，可以使用含上述成分的Marine Broth2216培养基(Becton·Dickinson产)。而且，还可以使用适度含有上述盐类的人工海水、及向其中添加了蛋白胨、酵母提取物等的培养基。培养条件因培养基的组成、菌株而多少会有些差别，例如培养发光杆菌属JT-ISH-224株时培养温度为20-30℃、优选为25-30℃，培养时间为6-48小时、优选为15-24小时。

由于目的酶存在于菌体内，可以采取例如超声波破碎法、弗氏细胞压碎器破碎法、玻璃珠破碎法、Dyno Mill(ダイノミル)破碎法等任何公知的菌体破碎方法，并由菌体破碎物分离纯化目的酶。在本发明的方法中优选的菌体破碎方法是超声波破碎法。例如，通过离心分离从菌体破碎物中除去固形物后，可以将所得的菌体破碎液上清通过适当组合市售阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺琼脂糖柱、CMP-己醇胺琼脂糖柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(ネイティブ-PAGE)等进行纯化。

此外，β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以完全纯化，但部分纯化品也有充分的活性，因此本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。

(2)生产重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法

本发明提供包含编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。而且，本发明还提供通过在适合重组蛋白表达的条件下培养包含该表达载体的宿主细胞并回收表达的重组蛋白来生产重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的方法。

为了生产本发明的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白，根据使用的宿主选择表达载体，在该载体上插入编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列，其中所述编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列可操作地连接于衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因等的适当的转录或翻译调控核苷酸序列。调控序列例如有转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点以及调控转录和翻译的起始和终止的适宜序列。

插入本发明的载体的编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列为编码上述本发明β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的碱基序列。该序列可以含有也可以不含有前导序列。含有前导序列时，可以是相当于SEQ IDNO：1的核苷酸1-42的前导序列，此外上述前导序列还可以替换为其它生物来源的前导序列。通过对前导序列进行替换，可以设计表达系统使得表达的蛋白质分泌至宿主细胞外。

此外，本发明的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白还可以表达为融合蛋白的形式，这是通过在载体上插入下述核酸而实现的：该核酸中在编码该酶的核酸之后连接了编码His标签、FLAG^TM标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的核酸。以这样的融合蛋白的形式表达本发明的酶，可以使该酶易于纯化和检测。

适于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。可在细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中使用的适宜克隆和表达载体记载于例如Pouwels等、Cloning Vectors：ALaboratory Manual，Elsevier，New York，(1985)(通过引用将其全部内容并入本文)。

原核生物中包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌或枯草杆菌。当用大肠杆菌这样的原核细胞作为宿主时，为了易于原核细胞内表达重组多肽，可以使β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白包含N末端甲硫氨酸残基。这个N末端甲硫氨酸残基可以在表达后从重组α2，6-唾液酸转移酶蛋白上切除。

在原核宿主细胞内使用的表达载体一般含有1个或2个以上可以进行表型选择的标记基因。可以进行表型选择的标记基因例如赋予抗生素抗性或独立营养缺陷型(独立栄養要求性)的基因。适于原核宿主细胞的表达载体的例子包括pBR322(ATCC37017)这样的商品化质粒或者它们的衍生物。pBR322携带氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，易于对转化细胞进行鉴定。该pBR322载体内可以插入合适的启动子和编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的DNA序列。其它的商品化载体还包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(PromegaBiotech.，Madison，Wisconsin，America)等。

在用于原核宿主细胞的表达载体中通常使用的启动子序列包括tac启动子、β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子(Chang等、Nature275:615，1978；和Goeddel等、Nature281:544，1979；通过引用，其全文引入本说明书)等。

此外，可以在酵母宿主内表达重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。优选使用酵母属(Saccharomyces，例如酿酒酵母(S.Cerevisiae))，也可以使用毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)等其它酵母属。酵母载体大多含有来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列以及可选择的标记基因。使用酵母α因子前导序列可以促使重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白分泌。适于用来促进重组多肽从酵母宿主中分泌的其它前导序列也是公知的。转染酵母的方法记载于例如Hinnen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929-1933，1978(通过引用将其全部内容并入本文)。

使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可以表达重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。也可以使用哺乳动物起源的确立细胞系。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译调控序列可以从病毒基因组获得。常用的启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2等。可以使用由SV40病毒基因组例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点和聚腺苷酸化位点衍生的DNA序列，赋予哺乳动物宿主细胞内结构基因序列表达所需的其它基因元件。在哺乳动物宿主细胞内使用的载体可以采用例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.，3：280，1983，通过引用将其全部内容并入本文)的方法构建。

生产本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的一种方法包括在该蛋白质得以表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，其中所述表达载体包含编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的核酸序列。然后，根据使用的表达系统，由培养培养基或细胞提取液回收β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。

纯化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的操作根据使用的宿主的形式以及本发明的蛋白质是否分泌至培养基中等重要因素适宜地选择。例如纯化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的操作包括阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺琼脂糖柱、CMP-己醇胺琼脂糖柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等，或者它们的组合。此外，当与易化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶纯化的标签等融合表达时，可以利用采用亲和层析的纯化方法。例如，当与组氨酸标签、FLAG^TM标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等融合时，可以分别使用Ni-NTA(次氨基三乙酸)柱、结合有抗FLAG抗体的柱子或结合有谷胱甘肽的柱子等、通过亲和层析进行纯化。

重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以纯化至电泳单一条带，但由于部分纯化品也具有充分的活性，所以本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。

抗体

本发明提供抗本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的抗体。本发明的抗体可以针对本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白或其片段进行制备。这里，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的片段是具有下述序列的片段：所述序列包含该酶的氨基酸序列中至少6个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸或至少30个氨基酸。

抗体可以用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶或其片段免疫本技术领域中用于抗体制备的动物进行制备，所述动物例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊等。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。抗体可以基于本领域技术人员公知的抗体制备方法进行制备。

本发明的抗体可以用于亲和纯化回收本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。本发明的抗体可以用于在Western印迹、ELISA等测定法中检测本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。

发明效果

本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码核酸，在提供已逐渐明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成·生产手段的观点上做出了贡献。尤其是本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，与现有酶相比，生产效率高，比活性高，而且受体底物特异性范围广。唾液酸多存在于生物体内复合糖糖链的非还原末端，从糖链功能的角度考虑是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一，而本发明提供新的唾液酸转移酶正回应了这样的高需求。

附图说明

图1-1为显示JT-ISH-224株的粗酶液在吡啶氨基化乳糖(PA-乳糖)和CMP-唾液酸中反应后反应液的HPLC分析结果的图。保留时间为3.995分钟的峰是PA-乳糖，保留时间为4.389分钟的峰是PA-6’-唾液酰乳糖，保留时间为5.396分钟的峰是PA-3’-唾液酰乳糖。

图1-2为显示JT-ISH-224株的粗酶液在吡啶氨基化(PA)乳糖中反应后反应液的HPLC分析结果的图。与图1-1的实验相比较，图1-2为反应液中未混合唾液酸供体CMP-唾液酸的对比实验结果，保留时间为3.993分钟的峰是PA-乳糖。

图1-3为显示PA-乳糖标准品的HPLC分析结果的图。PA-乳糖体现为保留时间4.026分钟的峰。

图1-4为显示PA-3’-唾液酰乳糖标准品的HPLC分析结果的图。PA-3’-唾液酰乳糖体现为保留时间5.447分钟的峰。

图1-5为显示公知酶美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶在PA-乳糖和CMP-唾液酸中反应后的反应液(生成吡啶氨基化α2，6-唾液酰乳糖)的HPLC分析结果的图。保留时间为4.000分钟的峰为PA-乳糖，保留时间4.406分钟的峰为PA-6’-唾液酰乳糖。

图1-6为显示公知酶美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶在PA-乳糖中反应后的反应液的HPLC分析结果的图。

与图1-5的实验相比较，图1-6为反应液中未混合CMP-唾液酸的对比实验。保留时间为3.995分钟的峰是PA-乳糖。

图2-1为显示反应pH对JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性影响的图表。图中的简略符号所代表的内容如下所示：Ac：乙酸缓冲液、Cac：二甲胂酸缓冲液、Phos：磷酸缓冲液、TAPS：TAPS缓冲液。

图2-2为显示反应温度对JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性影响的图表。

图2-3为显示反应液中NaCl浓度对JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性影响的图表。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。

实施例1：生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物的筛选及菌株的鉴定

以海水、海砂、海泥或海产鱼贝类作为接种源。将该接种源涂布在由Marine Broth Agar2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的平板培养基上，获取在15℃、25℃或30℃生长的微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用由Marine Broth2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0.2％TritonX-100(关东化学产)的20mM二甲胂酸缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为粗酶溶液测定唾液酸转移酶活性，得到具有唾液酸转移酶活性的菌株JT-ISH-224株。此外，JT-ISH-224株是从梭子鱼的内脏获得的。

唾液酸转移酶活性采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全部内容并入本文)中记载的方法测定。具体地说，使用反应溶液(30μl)进行酶反应，所述反应溶液中添加了糖供体底物CMP-Neu5Ac(70nmol、含20,000cpm用¹⁴C标记NeuAc的CMP-NeuAc。NeuAc表示N-乙酰神经氨酸)、糖受体底物乳糖(1.25μmol)和终浓度为0.5M的NaCl，并含有依照前文所述方法制备的酶。酶反应在25℃进行10-180分钟。反应结束后，向反应溶液中加入5mM磷酸缓冲液(pH6.8)1.97ml，所得溶液上样于Dowex1×8(PO₄ ^3-型、0.2×2cm、BIO-RAD产)柱。测定该柱的洗脱液中所含的反应生成物，即唾液酸乳糖中所含的放射活性，可以计算出酶活性。1单位(1U)酶为每分钟转移1微摩尔唾液酸的酶量。

然后，为了了解唾液酸的连接方式，进行以PA-乳糖为底物的反应。用所得粗酶液，以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。吡啶氨基化糖链使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio制)进行分析。向5μL粗酶液中加入1.5μL5mM的CMP-Neuac以及1.5μL10pmol/μL的糖受体底物，25℃反应18小时。反应结束后，100℃处理反应溶液2分钟以使酶失活。然后用HPLC对反应生成物进行分析。HPLC系统使用Shimadzu LC10A(岛津制作所)，分析柱使用Takara PALPAK Type R(TaKaRa Bio产品)。将加有72μL洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)的反应液注入用含0.15％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺(pH5.0)平衡的柱中。吡啶氨基化糖链的洗脱使用洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)和洗脱液B(含0.5％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)，通过30～50％的洗脱液B的直线浓度梯度法(0-20分钟)和100％的洗脱液B(21～35分钟)，依次洗脱吡啶氨基化糖链。此外，分析采用以下的条件进行(流速：1ml/min、柱温：40℃、检测：荧光(Ex：320nm、Em:400nm))。结果表明：JT-ISH-224株具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性和β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶转移酶活性(图1-1～6)。

JT-ISH-224株的细菌学鉴定

所得JT-ISH-224株的性质如下所示：

(细菌学性质)

(1)细胞形态为杆菌，大小为0.7～0.8μm×1.0～1.5μm。

(2)运动性+

(3)革兰氏染色性-

(4)有无孢子-

(生理生化性质)

(1)生长温度4℃为-、25℃为+、30℃为+、37℃为-

(2)菌落颜色不产生特征性菌落色素

(3)O/F检验 +/-

(4)过氧化氢酶试验 +

(5)氧化酶试验 +

(6)由葡萄糖产酸 +

(7)由葡萄糖产气 +

(8)发光性 -

(9)硝酸盐还原 +

(10)产吲哚 +

(11)葡萄糖酸化 -

(12)精氨酸双水解酶 +

(13)脲酶 -

(14)七叶苷水解 -

(15)明胶水解性 -

(16)β-半乳糖苷酶 +

(17)葡萄糖同化性 -

(18)L-阿拉伯糖同化性 -

(19)D-甘露糖同化性 -

(20)D-甘露醇同化性 -

(21)N-乙酰-D-葡糖胺同化性 -

(22)麦芽糖同化性 -

(23)葡糖酸钾同化性 -

(24)正癸酸同化性 -

(25)己二酸同化性 -

(26)dl-苹果酸同化性 -

(27)柠檬酸钠同化性 -

(28)乙酸苯酯同化性 -

(29)细胞色素氧化酶 +

(30)O/129敏感性10μg -、15μg +

(31)菌体内DNA的GC含量(摩尔％)39.4％

16SrRNA基因的碱基序列分析

以采用常规方法从JT-ISH-224株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。该碱基序列示于SEQID NO：5。

JT-ISH-224株在Marine Agar上的生长性、杆菌、革兰氏染色性、葡萄糖发酵分解性、O/129敏感性等形态学观察和生理生化性状试验结果显示，其属于弧菌科。更进一步，明确了JT-ISH-224株的16S rRNA基因的DNA碱基序列对明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)模式株ATCC11040的16S rRNA基因序列的同一性最高，其同一率为99.2％；其次是对Photobacterium iliopiscarium模式株ATCC51760的16S rRNA基因的序列的同一性较高，其同一率为99.1％。由这些结果，可以明确JT-ISH-224株是属于弧菌科发光杆菌属(Photobacterium sp.)的微生物。

实施例2JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的克隆和碱基序列的确定，以及该基因在大肠杆菌中的表达

(1)JT-ISH-224株中存在β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的确认

为了确认已在实施例1中确认具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的JT-ISH-224株中是否存在美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的同源物，实施了基因组Southern杂交。由约0.5gJT-ISH-224株的菌体离心沉淀物(ペレツト)，用Qiagen Genomic-tip100/G(Qiagen公司制)，按照试剂盒说明书的记载，制备约100μg的基因组DNA。然后，将数μgJT-ISH-224株基因组DNA用限制性酶EcoRI或HindIII消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分级，使用0.4M NaOH进行碱印迹将凝胶转印到Hybond-N⁺尼龙滤膜(Amersham Biosciences产)上。对于该滤膜，使用美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(基因库检索号：E17028)的部分片段(从ATG至HindIII的约1.2kbEcoRI-HindIII片段)为探针(SEQ ID NO：17)，进行Southern杂交。杂交实验使用ECL directlabelling&detection system(Amersham产)。按试剂盒所附的说明书标记探针。杂交是在试剂盒的杂交缓冲液中加入终浓度为5％(w/v)的封闭试剂及终浓度为0.5M的NaCl，37℃(通常42℃)进行4小时。清洗是在0.4％SDS、0.5×SSC中50℃(通常55℃)进行2次、每次20分钟；然后在2×SSC中室温进行1次、5分钟。信号的检测按试剂盒所附的说明书进行。结果检测出EcoRI消化的约12.5kb的条带，HindIII消化的约9kb的条带。该结果说明JT-ISH-224株中存在美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的同源物。

(2)JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的克隆

(i)基因组文库的构建

关于1-2μgJT-ISH-224株的基因组DNA，使用0.1-0.2单位的识别四碱基的限制酶Sau3AI进行部分降解。处理基因组DNA总量为80μg。是与酶配套的缓冲液，反应条件为37℃、30分钟。反应结束后，向反应液中加入终浓度为25mM的EDTA pH8.0，用苯酚·氯仿进行处理。乙醇沉淀回收基因组DNA，溶于400μl的TE中。使用梯度制作装置，在离心管(日立制作所生产40PA)中由40％的蔗糖(シュ一クロ一ス)缓冲液(20mM Tris pH8.0，5mM EDTA pH8.0，1M NaCl)和10％的蔗糖缓冲液制作40-10％的梯度，并在其上叠加上述部分分解的DNA溶液层。使用超离心机(日立制作所生产SCP70H，转子：SRP28SA)，26,000rpm、20℃离心15分钟。离心后，在管底用25G的针扎开小孔，从底部液体以每次1ml回收。将收集的含基因组DNA的样品的一部分使用潜水电泳槽在0.5-0.6％琼脂糖凝胶/TAE缓冲液中26V电泳20小时，收集含大小为9-16kb的DNA的级分。分子量标准使用λ/HindIII。向含大小为9-16kb的DNA片段的级分中加入2.5ml的TE降低蔗糖浓度后，进行乙醇沉淀和洗涤，将其溶解于少量TE中。

用于制作JT-ISH-224株的基因组文库的载体使用λDASH II(Stratagene产)。λDASH II/BamHI载体与基因组DNA片段的连接反应使用Stratagene产的连接试剂盒，12℃反应过夜。反应后，使反应液与GigaPack III GoldPackaging extract反应，使整合了基因组DNA的λ载体纳入到噬菌体颗粒中。噬菌体液在500μl SM缓冲液和20μl的氯仿中4℃保存。将大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)(Stratagene产)在LBMM(LB+0.2％麦芽糖+10mMMgSO₄)中培养至A₆₀₀＝0.5，向200μl该培养液中加入适量的噬菌体溶液，37℃培养15分钟。向其中加入48℃保温的NZY顶层琼脂糖4ml，混合，铺于NZY琼脂平板上(直径9cm的塑料平皿)。平板于37℃培养过夜，计数菌落数，计算滴度，结果算出文库的大小为约30万pfu(噬斑形成单位，plaqueforming unit)。

(ii)菌落杂交和含有JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因基因组片段的次级克隆

然后，以前述美人鱼发光杆菌JT0160来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的部分片段为探针，筛选JT-ISH-224株基因组文库。按λDASHII/BamHI载体试剂盒(Stratagene产)的说明书，将约数百pfu的噬菌体与宿主菌XL1-blue MRA(P2)一起铺在直径9cm的圆形平皿上。使噬菌斑与Hybond-N⁺尼龙滤膜接触(Amersham产)，按膜所附的说明书进行碱处理，使DNA变性并固定在膜上。探针的标记、杂交条件按上述(1)记载的方法进行。其结果：在兼带菌落纯化的二次筛选之前，获得了8个克隆，回收其中4个菌落，分别与大肠杆菌XL1-blue MRA(P2)一起铺在NZY平板上，使菌落量为每个平板数万pfu，然后37℃保温过夜。向一面长出菌落的6个平板各加入4ml SM缓冲液、4℃静置过夜。用巴斯德吸管回收噬菌体平板裂解物，用QIAGEN Lambda Mini Kit(QIAGEN产)提取、纯化λDNA。将这4种λDNA样品用限制性酶EcoRI和HindIII、EcoRI和BamHI、或EcoRI和XhoI消化。消化物用琼脂糖凝胶电泳分级，与上述(1)相同，转印到尼龙膜上。再次以美人鱼发光杆菌JT0160来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的部分片段为探针，用该膜进行Southern分析。结果，EcoRI-BamHI消化时，检测出10kb的条带。考虑到很难用常规方法将10kb长的基因组亚克隆化到高拷贝质粒载体上，再进行使用各种限制酶的Southern杂交。使用的酶为BglII、EcoRV、KpnI、NheI、PstI、PvuII、SacI、SalI、XbaI。结果，以EcoRV、KpnI、NheI消化时，分别检测出了6.6kb、7kb、3.5kb的条带。因此再次用NheI消化λDNA样品，在TAE缓冲液中进行使用低熔点琼脂糖(SeaPlaqueGTG)的琼脂糖凝胶电泳。每片凝胶切下3.5kb的DNA片段，加入与凝胶等量的200mM的NaCl，在65℃处理10分钟，凝胶溶解。该样品分别用苯、苯·氯仿、氯仿各萃取一次，通过乙醇沉淀回收3.5kbDNA片段。使用Ligation Kit(Takara Bio产)将该片段连接于质粒载体pBluescript SK(-)的XbaI部位(经脱磷酸处理过)。连接反应后，通过电穿孔将DNA转化为大肠杆菌TB1，铺于含有氨苄青霉素(100g/mL)的LA琼脂培养基上。将37℃过夜培养所得的菌落接种于多个LB培养基(含有氨苄青霉素)上，37℃过夜振荡培养，用常规方法(Sambrook等.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(通过引用将其全部内容并入本文)))提取质粒。

(iii)JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因全部碱基序列的确定

然后，关于上述确认插入DNA的质粒，使用M13引物(Taraka Bio产)，用ABI PRISM荧光测序仪(Model310Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司产)测定3.5kb Nhel片段两端的碱基序列。所得DNA序列用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETIC制作)翻译成氨基酸序列，通过BLAST程序对National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GeneBank数据库进行同一性检索。结果由一条DNA序列翻译而成的氨基酸序列与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的氨基酸序列显示出有意义的同一性。具有同一性区域的方向性表明3.5kb Nhel片段中含有含有全部的JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因。

随后，为了完全确定JT-ISH-224株来源该种酶基因的DNA序列，在由3.5kbNhe片段得到的DNA序列的基础上，合成下述两种引物：ISH224-26ST-C3-R(5’-TTCATCGTCATCTAATCGTGGC-3’(22mer)：SEQ IDNO：6)；ISH224-26ST-C4-R(5’-AGTTGTTGCGTACCACAAGT-3’(22mer)：SEQID NO：7)，用于决定碱基序列。

使用该引物，如上所述确定碱基序列，结果得到序列表中SEQ ID NO：1的序列。该序列为JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的开放阅读框(ORF)的全碱基序列。发光杆菌属JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的ORF由1545个碱基组成，编码514个氨基酸。该氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO：2。用GENETYX Ver.7对DNA序列以及氨基酸序列进行分析时，JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的DNA序列与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因有63％的同一性。此外，氨基酸序列与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有54.5％的同一性。

(3)JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因表达载体的构建

为了确定克隆的基因是否具有唾液酸转移酶活性，此外也为了得到大量JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，将该基因全长以及N末端信号肽部分删除型基因整合入表达载体，在大肠杆菌内生成蛋白质，测定该表达蛋白质的活性。

根据JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的氨基酸序列，用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7进行分析时，预测出N末端的17氨基酸为信号肽。于是，设计、合成了用于克隆基因全长(本实施例中记为ISH224-N0C0)的引物：

ISH224-26ST-N0BspHI

(5’-AGAATATCATGAAAAACTTTTTATTATTAAC-3’(31mer)，SEQIDNO：8)、

ISH224-26ST-C0BamHI

(5’-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3’(33mer)，SEQ IDNO：10)，以及用于克隆编码信号肽部分氨基酸删除型蛋白质的基因(本实施例中记为ISH224-N1C0)的引物

ISH224-26ST-N1PciI

(5’-CTTGTAACATGTCAGAAGAAAATACACAATC-3’(31mer)：SEQIDNO：9)、

ISH224-26ST-C0BamHI

(5’-TTTTTTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACC-3’(33mer)：SEQ IDNO：10)。

以含有35kbNheI片段的质粒为模板，使用这些引物进行PCR，扩增用于整合入表达载体的JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因。PCR的反应条件按如下进行设定。50μL的反应液中含有模板DNA500ng、10×Ex taq缓冲液5μl、2.5mM的每种dNTP4μl、引物50pmole、Ex taq(Takara Bio产)0.5μl，使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；5个循环的96℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟；1个循环的72℃6分钟。结果是ISH224-N0C0扩增了约1.55kbPCR产物，ISH224-N1C0扩增了约1.5kbPCR产物。将这些PCR产物克隆于pCR4TOPO(Invitrogen产)上。连接反应按载体试剂盒所附说明进行。采用电穿孔法将DNA导入大肠杆菌TB1，按常规方法(Sambrook等.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版提取质粒DNA。对于确认插入的克隆，使用M13引物(Takara Bio产)用ABIPRISM荧光测序仪(Model310Genetic Analyzer，Perkin Elmer产)从PCR产物的两端开始测定其序列。结果ISH224-N0C0的序列表中SEQ ID NO：1的第718位被胞嘧啶(C)碱基取代。通过该突变，密码子由TTA变为CTA，由于这些密码子同时还编码亮氨酸(Leu)，不产生氨基酸突变。一方面，ISH224-N1C0中碱基序列不变。ISH224-N1C0的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

对于确认了碱基序列的ISH224-N0C0以及ISH224-N1C0的各一个代表克隆，经限制酶BspHI和BamHI(对于ISH224-N0C0)、或限制酶PciI和BamHI(对于ISH224-N1C0)双重消化后，与上述(2)的(ii)同样进行凝胶纯化。大肠杆菌表达用载体使用pTrc99A(Pharmacia LKB产)。使用限制酶处理过的ISH224-N0C0以及ISH224-N1C0的PCR产物、Takara Ligation Kit(Takara Bio产)将用限制酶NcoI和BamHI对该载体进行双重消化、纯化后的产物进行连接，转化大肠杆菌TB1。用常规方法提取质粒DNA，进行限制酶分析，确认了插入物的整合，制作了ISH224-N0C0/pTrc以及ISH224-N1C0/pTrc。

而且，为了制备JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的各种截短蛋白质，设计以下引物。

引物名、序列(SEQ ID NO：)、长度

224-26N2Bsp AAACTTTCATGACGCAACAACTATTAACAGAA(SEQ IDNO：15)、32mer

224-26N3Bsp AAGTAATCATGAACGTAGTGGCTCCATCTTTA(SEQ IDNO：16)、32mer

224-26N3.1Bsp CACGTGTCATGACTCTTCAGCAGCTAATGGAT(SEQ IDNO：17)、32mer

使用224-26N2Bsp，则N末端62个氨基酸缺失，而且在N末端导入甲硫氨酸。使用224-26N3Bsp，则N末端110个氨基酸缺失，而且在N末端导入甲硫氨酸。使用224-26N3.1Bsp，则N末端127个氨基酸缺失，而且在N末端导入甲硫氨酸。用这些引物和上述引物ISH224-26ST-C0BamHI的组合，以ISH224-N1C0为模板，与上述同样进行PCR反应。将所得PCR产物克隆于载体pCR4TOPO(Invitrogen产)上，确认碱基序列后，对于所有组合克隆，其碱基序列均显示出与模板ISH224-N1C0的碱基序列有100％的同一性。分别将224-26-N2Bsp和ISH224-26ST-C0BamHI组合所得的克隆、224-26-N3Bsp和ISH224-26ST-C0BamHI组合所得的克隆、224-26-N3.1Bsp和ISH224-26ST-C0BamHI组合所得的克隆命名为N2C0、N3C0和N3.1C0。对于这些克隆，用限制酶BspHI和BamHI双重消化后，如上述克隆至大肠杆菌表达用载体pTrc99A上，制作了ISH224-N2C0/pTrc、ISH224-N3C0/pTrc以及ISH224-N3.1C0/pTrc。

(4)诱导表达和活性测定

对于上述(3)所得的5种克隆(ISH224-N0C0/pTrc、ISH224-N1C0/pTrc、ISH224-N2C0/pTrc、ISH224-N3C0/pTrc以及ISH224-N3.1C0/pTrc)进行蛋白质表达诱导试验。将携带整合了各克隆的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的单菌落接种于含抗生素氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB培养基(6ml)中，30℃进行前培养至A₆₀₀＝0.5左右，然后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷，和光纯药工业产)，30℃进一步振荡培养4小时。通过离心分离收集4ml培养液中的菌体。将这些菌体悬浮于200μl含0.336％TritonX-100和0.5M氯化钠的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在冰冷却下进行超声波破碎。所得的破碎液作为粗酶液，将其用含有0.336％TritonX-100的20mM二甲胂酸缓冲液(pH5.0)稀释200倍，用于活性测定。反应重复进行2次。反应条件如表1-1及表1-2脚注所示。其结果如下述表1-1及表1-2所示，在除了ISH224-N3.1C0/pTrc外的克隆的粗酶液中，存在使糖供体CMP-NeuAc中的¹⁴C标记的NeuAc转移至糖受体底物乳糖的因子，即表明存在唾液酸转移酶活性。以上结果显示，在导入ISH224-N0C0/pTrc、ISH224-N1C0/pTrc、ISH224-N2C0/pTrc以及ISH224-N3C0/pTrc的大肠杆菌中唾液酸转移酶表达。

因此，ISH224-N3C0为保持JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的最小克隆。于是发现只要SEQ ID NO：2中至少存在氨基酸111-514，即可保持β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。

[表1-1]

表1-1：重组了JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的大肠杆菌的破碎液中的唾液酸转移酶活性

反应条件

反应组成

3M NaCl 5μL

45mg/mL乳糖(20mM二甲胂酸缓冲液(pH5)中) 10μL

稀释200倍的粗酶液 5μL

4.55mM CMP-唾液酸(20mM二甲肿酸缓冲液(pH5)中)+¹⁴C-CMP-唾液酸 5μL

反应时间：2分钟

反应温度：30℃

[表1-2]

表1-2：重组了JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的大肠杆菌的破碎液中的唾液酸转移酶活性

粗酶液	放射活性
		ISH224-N0C0克隆	+
ISH224-N1C0克隆	+
		ISH224-N2C0克隆	+
ISH224-N3C0克隆	+
		ISH224-N3.1C0克隆	-
不含粗酶液	-

反应条件

反应组成

3M NaCl 5μL

45mg/mL乳糖(20mM二甲肿酸缓冲液(pH5)中) 10μL

稀释200倍的粗酶液 5μL

4.55mM CMP-唾液酸(20mM二甲胂酸缓冲液(pH5)中)+¹⁴C-CMP-唾液酸 5μL

反应时间：2分钟

反应温度：30℃

(5)β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的确认

使用上述(4)的ISH224-N1C0克隆以及ISH224-N0C0克隆所得的粗酶液，考察导入ISH224-N0C0/pTrc以及ISH224-N1C0/pTrc的大肠杆菌所表达的唾液酸转移酶是否具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。与实施例1相同，使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-SugarChain026)进行酶反应。与实施例1相同，检测出PA-6’-唾液酰乳糖(Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc-PA)。即表明两个克隆株来源的唾液酸转移酶均具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移活性。由这些结果可以证明发光杆菌属JT-ISH-224株的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因被克隆，且在大肠杆菌内表达。

实施例3：JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性

ISH224-N0C0克隆与ISH224-N1C0克隆的比较

对实施例2所得的ISH224-N0C0克隆与ISH224-N1C0克隆，进行历时蛋白质表达诱导试验。将携带整合了各克隆的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的单菌落接种于含抗生素氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB培养基(6ml)中，30℃培养约8小时。将该前培养液接种于含抗生素氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB培养基(300ml)中，30℃振荡培养。OD600＝0.5左右时，添加IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷，和光纯药工业产)至终浓度1mM，30℃进一步振荡培养。培养4、6、22、28小时后，经离心分离收集培养液中的菌体。将这些菌体悬浮于含0.336％TritonX-100的20mMBis-Tris缓冲液(pH6.0)中，在冰冷却下进行超声波破碎。所得的破碎液作为粗酶液，将其用含有0.336％TritonX-100的20mM二甲胂酸缓冲液(pH5.0)稀释200倍，用于活性测定。反应重复进行2次。反应条件如表表2脚注所示。其结果如下述表2所示，在ISH224-N0C0克隆中，添加IPTG4小时后，β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移活性为最大，其产量为5501U/L·培养基。一方面，在ISH224-N1C0克隆方面，添加IPTG22小时后，β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移活性变最大，其产量为10776U/L·培养基。

[表2]

表2：重组了JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的大肠杆菌的破碎液中的唾液酸转移酶活性

反应条件

反应组成

3MNaCl 5μL

45mg/mL乳糖(20mM二甲胂酸缓冲液(pH5)中) 10μL

稀释200倍的粗酶液 5μL

反应时间：1分钟

反应温度：30℃

以上结果表明，与ISH224-N0C0克隆相比，ISH224-N1C0克隆的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性更高。

本申请之前已经证明：美人鱼发光杆菌来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性，即用质粒pEBST△178转化大肠杆菌生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性为224.5U/L(Yamamoto，T.等，J.Biochem.，120，104-110(1996))。与该酶相比，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性高达约48倍。此外，虽然酶的种类不同，但作为微生物来源的唾液酸转移酶中生产性高的出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)来源的α2，3-唾液酸转移酶的生产性为6,000U/L(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.，127，17618-17619(2005))。即便是与该酶相比较，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性也高达约1.8倍。

实施例4-1：从ISH224-N1C0中提取、纯化β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶以及纯化蛋白质氨基末端氨基酸序列的确定

(1)提取及纯化

由在LBAmp平板培养基上传代培养ISH224-N1C0的菌落用接种环采取菌体，接种在10mL下述液体培养基中，30℃、180转/分钟振荡培养8小时，所述液体培养基是向6mL LB液体培养基中添加30μL×200氨苄青霉素(400mg/20mL)而制成的。

主培养按以下程序进行。向容积为1000ml的带挡板烧瓶(コブ付フラスコ)中注入300ml下述LB培养基，共准备9瓶(合计2.7L)该样品，所述LB培养基为向300mL LB培养基中加入1.5mL×200氨苄青霉素(400mg/20mL)和300μL1M的IPTG而制成的。向各烧瓶中接种12ml前培养液，30℃、180转/分钟振荡培养24小时。离心分离培养液，收集菌体。获得的菌体湿重约为15g。

将该菌体悬浮于990ml含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)中，使其浓度为1.6g/26mL，在冰冷却条件下进行超声波破碎。4℃、100,000×g离心分离菌体破碎液1小时，获得上清。

使该粗酶液吸附于用含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)平衡的Hiload26/10Q Sepharose HP(Amersham产)阴离子交换柱，从含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度0.25M附近处洗脱的具有酶活性的级分。

收集的级分用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)稀释，使之吸附于预先用含0.336％TritonX-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad产)，从含0.336％Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)至含0.336％Triton X-100的500mM磷酸缓冲液(pH6.0)用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集磷酸缓冲液浓度125mM左右洗脱的具有酶活性的级分。

使该级分吸附于MonoQ5/50GL(Amersham产)阴离子交换柱，从含0.336％Triton X-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度300mM左右洗脱的具有酶活性的级分。

将有活性的级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺凝胶的浓度为12.5％)，结果表明，目的酶显示单一条带，分子量约56,000。与菌体破碎时的比活性相比，纯化后级分的比活性约提高了9.4倍(表3-1)。通过以上操作，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的比活性为113U/mg，相比之下美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的比活性为5.5U/mg(J.Biochem.，120，104-110，1996，T.Yamamoto等.)，前者是后者的约21倍。此外，虽然酶的种类不同，但出血败血性巴(氏)杆菌(Pasteurella multocida)来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的比活性为60U/mg(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.，127，17618-17619，2005)。即使是与该酶相比，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的比活性也高达约1.9倍。

关于由粗酶液纯化ISH224-N1C0克隆的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，经过上述各纯化工序的样品的酶活性如表3-1所示。与实施例1记载的方法相同，同样以J.Biochem.120，104-110(1996)记载的方法为基准，如表3-1脚注所示的反应条件测定酶活性。此外，蛋白质的定量使用CoomassieProtein Assay Reagent(PIERCE产)，按其中的说明书进行蛋白质的定量。酶的1个单位(1U)设定为在1分钟内转移1微摩尔唾液酸的酶量。

[表3-1]

表3-1从粗酶液纯化ISH224-N1C0株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的纯化表

纯化步骤	体积(ml)	总蛋白(mg)	总活性(U)	比活性(U/mg)	收率(％)	纯化度(倍)
							粗酶液	237.5	1,100	13167	12.0	100	1.0
Q sepharose	64.0	371	11794	31.8	90	2.7
							羟基磷灰石	180.0	138	9448	68.3	72	5.7
Mono Q	4.5	24.1	2720	113	21	9.4

反应条件

反应组成

3MNaCl 5μL

360mM乳糖 10μL

1M Bis-Tris缓冲液(pH6) 3μL

水 2μL

14mM CMP-唾液酸(20mM Bis-Tris缓冲液(pH6)中)+¹⁴C-CMP-唾液酸 5μL

反应时间：5分钟

反应温度：25℃

(2)氨基酸末端氨基酸序列的确定

将上述(1)纯化至单一条带的酶溶液进行SDS-聚丙烯酰胺电泳(丙烯酰胺凝胶浓度为12.5％)。电泳后将蛋白质转印至PVDF膜上，用CBB染色后，切下目标条带部分，用Procise494HT Protein Sequencing System(Applied Biosystems)测定氨基酸序列。其结果确定了从丝氨酸起到第15个残基的氨基酸末端序列(Ser Glu Glu Asn Thr Gln SerIle Ile Lys Asn Asp IleAsn Lys)。由该结果可以认为ISH224-N1C0克隆的转化大肠杆菌产生的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白质中，氨基末端的甲硫氨酸被在大肠杆菌菌体内进行了加工。

实施例4-2：从ISH224-N3C0中提取、纯化β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶

(1)提取及纯化

由在LBAmp平板培养基上传代培养ISH224-N3C0的菌落用接种环采取菌体，接种在10mL下述液体培养基中，30℃、180转/分钟振荡培养8小时，所述液体培养基是向6mL LB液体培养基中添加30μL×200氨苄青霉素(400mg/20mL)而制成的。

主培养按以下程序进行。向容积为1000ml的带挡板烧瓶(コブ付フラスコ)中注入300ml下述LB培养基，共准备18瓶(合计5.4L)该样品，所述LB培养基为向300mLLB培养基中加入1.5mL×200氨苄青霉素(400mg/20mL)和300μL1M的IPTG(1.192个/5mL)而制成的。向各烧瓶中接种12ml前培养液，30℃、180转/分钟振荡培养24小时。离心分离培养液，收集菌体。获得的菌体湿重约为33.1g。

将该菌体悬浮于538.5ml含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)中，使其浓度为1.6g/26mL，在冰冷却条件下进行超声波破碎。4℃、100,000×g离心分离菌体破碎液1小时，获得上清。

收集的级分用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)稀释，使之吸附于预先用含0.336％TritonX-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad产)，从含0.336％Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)至含0.336％Triton X-100的500mM磷酸缓冲液(pH6.0)用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集磷酸缓冲液浓度125mM左右洗脱的具有酶活性的级分。使该级分吸附于MonoQ5/50GL(Amersham公司产)阴离子交换柱上，从含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH6.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度300mM附近处洗脱的具有酶活性的级分。

将有活性的级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺凝胶的浓度为12.5％)，结果表明，目的酶显示单一条带，分子量约40,000。与菌体破碎时的比活性相比，纯化后级分的比活性约提高了131.5倍(表3-2)。通过以上操作，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N3C0的比活性为264U/mg，相比之下美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的比活性为5.5U/mg(J.Biochem.，120，104-110，1996，T.Yamamoto等.)，前者是后者的约48倍。此外，虽然酶的种类不同，但出血败血性巴(氏)杆菌(Pasteurella multocida)来源的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的比活性为60U/mg(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.，127，17618-17619，2005)。即使与该酶相比，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N3C0的比活性也高达约4.4倍。

关于由粗酶液纯化ISH224-N3C0克隆的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，经过上述各种纯化工序的试料的酶活性如表3-2所示。与实施例1记载的方法相同，同样以J.Biochem.120，104-110(1996)记载的方法为基准，如表3-2脚注所示的反应条件测定酶活性。此外，蛋白质的定量使用CoomassieProtein Assay Reagent(PIERCE产)，按其中的说明书进行蛋白质的定量。酶的1个单位(1U)设定为在1分钟内转移1微摩尔唾液酸的酶量。

[表3-2]

表3-2从粗酶液纯化ISH224-N3C0株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的纯化表

纯化步骤	体积(ml)	总蛋白(mg)	总活性(U)	比活性(U/mg)	收率(％)	纯化度(倍)
							粗酶液	505.0	2445	4911	2.0	100	1.0
Q sepharose	39.0	136	3614	26.5	74	13.2
							羟基磷灰石	6.0	6.6	997	151	20	75.4
Mono Q	1.5	3.1	808	264	16	131.5

反应条件

反应组成

3M NaCl 5μL

360mM乳糖 10μL

1M二甲胂酸缓冲液(pH5) 3μL

水 2μL

酶液 5μL

14mM CMP-唾液酸(20mM二甲胂酸缓冲液(pH5)中)+¹⁴C-CMP-唾液酸 5μL

反应时间：5分钟

反应温度：30℃

实施例5：JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0 酶活性的最适pH、最适温度以及最适盐浓度

使用实施例4-1制备的纯化酶，考察β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的最适pH、最适温度以及最适盐浓度。

(1)JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0酶活性的最适DH

制备醋酸缓冲液(pH4.0、pH4.5以及pH5.0)、二甲胂酸缓冲液(pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5以及pH7.0)、磷酸缓冲液(pH7.0、pH7.5以及pH8.0)、TAPS缓冲液(pH8.0、pH8.5以及pH9.0)，用这些缓冲液在25℃测定各pH下酶的活性。

结果如图2-1所示，pH5.0时酶活性最强。而且，各pH的酶活性表示为以pH5.0时的酶活性为100的相对活性。

(2)JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0酶活性的最适温度

使用二甲胂酸缓冲液(pH5.0)，测定10℃-50℃每间隔5℃反应温度下的酶活性。

其结果如图2-2所示，在30℃时酶活性最强。而且，各温度时的酶活性表示为以30℃时的酶活性为100的相对活性。

(3)JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0酶活性的最适盐浓度

使用二甲胂酸缓冲液(pH5.0)，在30℃，测定反应液中氯化钠浓度调整为0M、0.1M、0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.5M、2.0M时的酶活性。

其结果如图2-3所示，0.5M至0.75M酶活性最大。此外，0M至1.0M酶活性基本维持在同一水平。而且，各氯化钠浓度下的酶活性表示为以氯化钠浓度0M时的酶活性为100的相对酶活性。

实施例6：JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶以及 JT0160菌株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(公知酶)的受体底物特异性(单糖·二糖类·三糖类)的比较

(材料以及方法)

使用阴离子交换色谱、羟基磷灰石色谱将由JT-ISH-224来源N1C0重组大肠杆菌以及美人鱼发光杆菌JT0160菌株制备的菌体破碎液纯化至电泳只产生单一条带，使用这样纯化的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，进行以下实验，考察其是否具有向各种单糖、二糖类、三糖类的唾液酸转移活性。

使用各种糖受体底物的唾液酸转移反应

制备由含有糖供体底物CMP-¹⁴C-NeuAc的CMP-NeuAc(10.9nmol(8485cmp)，反应溶液中的最终浓度：0.455mM)、用20mM二甲胂酸缓冲液(pH5.0)溶解的各种糖受体底物(1μmol，反应溶液中的最终浓度：42mM)、唾液酸转移酶(JT-ISH-224来源的N1C03.0mU、JT0160来源的4.3mU)、NaCl(反应溶液中的最终浓度：500mM)组成的反应溶液，在24μL该反应液中，于30℃进行酶反应2分钟或60分钟。而且，作为糖受体底物使用8种单糖，即：甲基-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(Gal-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(Man-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃甘露糖苷(Man-β-OMe)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)；使用5种二糖类，即：乳糖(Gal-β1，4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-β1，4-GlcNAc)、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Gal-β1，3-GlcNAc-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃半乳糖基-α1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-α1，3-Gal-α-OMe)和甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-β1，3-Gal-β-OMe)；使用1种三糖类，即：2’-岩藻糖基乳糖(Fuc-α1，2-Galβ1，4-Glc)。表4-2所示的糖链、甲基-α-D-吡喃半乳糖基-α1，3-吡喃半乳糖苷(Gal-α1，3-Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-氨基半乳糖苷(Gal-β1，3-Gal-β-OMe)和2’-岩藻糖基乳糖(Fuc-α1，2-Galβ1，4-Glc)以8.4mM的终浓度反应。

酶反应结束后，向反应溶液中加入1.98ml的5mM磷酸缓冲液(pH6.8)以终止酶反应。然后，将用5mM磷酸缓冲液(pH6.8)稀释的酶反应溶液(2ml)上样于AG1-×2Resin(PO₄ ^3-型、0.2×2cm)柱。该柱是将AG1-×2Resin(OH-型、BIO-RAD公司产)悬浮于1M磷酸缓冲液(pH6.8)，30分钟后用蒸馏水清洗树脂，然后再将树脂悬浮在蒸馏水中而制备的。测定该柱的洗脱液(0-2ml)的放射活性。该柱的洗脱液中含有反应生成的结合有¹⁴C-NeuAc(N-乙酰神经氨酸)的反应生成物和未反应的糖受体底物，而未反应的CMP-¹⁴C-NeuAc保留在柱上。因而，酶反应最终生成的各种含唾液酸糖链来源的¹⁴C放射活性，全部来自反应生成物，由该级分的放射活性可以计算出酶活性。

采用上述方法测定转移至各种糖受体底物的NeuAc的放射活性，并计算出发生转移的唾液酸。

(结果)

表明唾液酸可以转移至此次作为糖受体底物使用的14种单糖、二糖、三糖中的任何一种(表4-1和表4-2)。与公知的JT0160菌株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶相比，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶对广范围受体底物显示出高糖转移活性。更具体说，对于甲基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰乳糖胺、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-N-乙酰基氨基葡萄糖苷、甲基-β-D-吡喃半乳糖基-β1，3-吡喃半乳糖苷、2’-岩藻糖基乳糖6种糖受体，与公知的JT0160菌株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶相比，JT-ISH-224来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0显示出更高活性，表明具有广范围的受体底物特异性。此外，对各受体底物的相对活性表示的是以相对于乳糖的唾液酸转移活性为100时的情况。

[表4-1]

表4-1：ISH224-N1C0株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的受体底物特异性(1)

[表4-2]

表4-2：ISH224-N1C0株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的

受体底物特异性(2)

实施例7：对JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶以及 JT0160菌株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(公知酶)的糖蛋白质受体底物特异性的比较

糖受体底物使用脱唾液酸胎球蛋白溶液。将2mg脱唾液酸胎球蛋白溶液溶解于1mL20mM的Bis-Tris缓冲液(pH6.0)中，作为糖受体底物。糖供体使用CMP-NeuAc。将糖受体底物溶液40μL、糖供体底物5μL、酶溶液5μL(均为10mU)混合，于25℃保温2小时进行唾液酸转移反应。反应结束后，将反应溶液上样于用0.1M氯化钠平衡的Sephadex G-50superfine(0.8×18.0cm)，进行凝胶过滤。收集含糖蛋白的凝胶过滤洗脱液级分(2-4ml的级分)，用液体闪烁计数器测定该级分的放射活性，对转移至糖受体底物的唾液酸进行定量。

其结果表明每种酶都向脱唾液酸胎球蛋白溶液中转移了唾液酸。此外，JT-ISH-224来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(N1C0)与美人鱼发光杆菌JT0160菌株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶相比，唾液酸转移效率更高。

[表5]

表5：ISH224-NlC0株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的受体底物特异性(3)

酶液	放射活性(cpm)
		JT-ISH-224-N1C0	3051
JT0160	2150
		不含酶	9

反应条件

反应组成：

脱唾液酸胎球蛋白溶液 10μl

酶液 5μl

5mM CMP-唾液酸(20mM二甲胂酸缓冲液(pH5)中)+¹⁴C-CMP-唾液酸 5μl

工业实用性

本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸，从而提供已明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成·生产手段。特别是唾液酸在生物体内的复合糖链中多存在于非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一。本发明的新唾液酸转移酶可以用于开发利用糖链的医药产品、功能性食品等。