WO2006112253A1

WO2006112253A1 - 新規なβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子およびその製造方法

Info

Publication number: WO2006112253A1
Application number: PCT/JP2006/306896
Authority: WO
Inventors: Takeshi Yamamoto; Hiroshi Tsukamoto; Yoshimitsu Takakura
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2006-10-26
Also published as: EP1876234A1; EP1876234A4; CA2608410A1; AU2006238137B2; EP1876234B1; AU2006238137A1

Abstract

　本発明は、新規なβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素および当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。本発明はまた、当該シアル酸転移酵素を生産する微生物を提供すると共に、そのような微生物を用いた当該シアル酸転移酵素の製造方法を提供する。本発明はさらに、当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を含むベクター、および当該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供すると共に、組換えβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。本発明はさらに、本発明のシアル酸転移酵素を利用したシアリル糖鎖を製造する方法を提供する。

Description

明細書

新規な 0—ガラタトシドー x 2， 3_シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子およびその製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、新規な β -ガラタトシド- a 2, 3-シアル酸転移酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該酵素を生産する微生物および当該酵素の製造方法に関する。背景技術

[0002] 糖転移酵素は、生体内において糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖の生合成に関与する酵素である。そしてその反応生成物である糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖 (以下、複合糖質糖鎖）は、生体内において非常に重要な機能を有している。例えば、糖鎖は、主に哺乳類細胞において、分化や発生における細胞間および細胞細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることなどが明らかにされている。

[0003] 上記のとおり、糖鎖は非常に重要な機能を有しているが、これを応用した具体例として、エリスロポエチンが挙げられる。エリスロポエチンは本来糖タンパク質であるが、糖鎖の数を増カロさせ、その寿命を向上させた組換えエリスロポエチンタンパク質が作製され、現在市販されている。

[0004] 今後もこのように糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発が想定される。そのため、糖鎖を合成 ·生産する手段としての糖転移酵素の重要性が増大してヽる。

[0005] これまでに約 150種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラットおよび酵母等の真核生物力単離されており、さらに CHO細胞や大腸菌等を宿主細胞とする生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現されている。一方、原核生物である細菌からも、いくつかの糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる組換え生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。

[0006] 糖鎖を構成する糖の中でも、非還元末端に存在することの多!、シアル酸は、糖鎖機能という観点力も極めて重要な糖であり、従って、シアル酸転移酵素は、現在重要性が増して!/ヽる糖転移酵素の中で最も需要が高!ヽ酵素の一つである。

[0007] a 2, 3—シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関しては、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（例えば、 Harduin- Lepers, A. et al., Biochem J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000) ; Young- Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 ( 1999) ; Lee, Y— C. et al., J. Biochem., 216, 377—385 (1993) ; Chang, M— L. et al., Glyc obiology, 5, 319—325 (1995) ; Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 21004—21010 (1992)を参照)。しかし、これらの動物由来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、さらに酵素としての安定性が悪、と、う問題を有して、る。

[0008] これに対し、微生物由来の a 2, 3—シアル酸転移酵素およびその遺伝子としては、ナイセリア属、キャンピロパクター属、へモフイラス属およびパスッレラ属に属する微生物から取得されたものが報告されている（例えば、 WO97Z047749、 WO 99/0 49051、 WO01/077314, WO03/027297を参照）。し力し、ビブリ才科に属する微生物力取得されたという報告はなぐまた、ビブリオ科に属する微生物に《2, 3 -シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質が存在すると!/ヽぅ報告もな!/ヽ。

特許文献 1：国際公開第 WO97Z047749A号パンフレット

特許文献 2：国際公開第 WO99Z049051A号パンフレット

特許文献 3：国際公開第 WO01Z077314A号パンフレット

特許文献 4 :国際公開第 WO03Z027297A号パンフレット

非特許文献 1 : Harduin- Lepers, A. et al., Biochem. J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000) 非特許文献 2 : Young- Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 (1999) 非特許文献 3 : Lee, Y- C. et al" J. Biochem., 216, 377-385 (1993)

非特許文献 4 : Chang, M-し et al., Glycobiology, 5, 319-325 (1995)

非特許文献 5 : Gillespie, W. et al" J. Biol. Chem., 267, 21004-21010 (1992) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の課題は、ビブリオ科の微生物に由来する新規な β -ガラタトシド- a 2, 3- シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することである。また、本発明の課題は、本発明の j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードする遺伝子を利用して遺伝子組換え技術により本酵素を高生産する方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは鋭意研究に努めた結果、ビブリオ科 (Vibrionaceae)に属する微生物がシアル酸を糖鎖中のガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基、フコース残基、 N ァセチルダルコサミン残基もしくは N ァセチルガラタトサミン残基に (X 2, 3結合で転移させる新規な酵素を生産することを見出し、本発明を完成させた。本発明は、新規な )8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸、ならびに、当該シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。

[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0012] β ガラクトシドー 2. 3 シアル酸転移酵素

本発明は、新規な β—ガラタトシド— oc 2, 3 シアル酸転移酵素を提供する。本明細書において、「 —ガラクトシド《2, 3 シアル酸転移酵素」とは、シチジン 1リン酸 (CMP)—シアル酸力ゝらシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の 3位、ラタトースもしくは Ν ァセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの 3位、またはガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、 Ν—ァセチルダルコサミン、 Ν ァセチルガラタトサミンなどの複合糖質を構成しうる単糖であって 3位の炭素に水酸基を有する単糖の 3位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「j8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素活性」とは、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここでいぅシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノィラミン酸誘導体を示す。具体的には、 Ν ァセチルノイラミン酸 (Neu5Ac)、 Ν—グリコリルノィラミン酸（Neu5Gc)、 5 -デァミノ 5—ヒドロキシノイラミン酸 (KDN)、ジシアル酸などを示す。

[0013] 本発明の /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 2、配列番号 29または配列番号 31のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。また、本発明の β ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 1、配列番号 28または配列番号 30の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質である。 [0014] 本発明の配列番号 2のアミノ酸配列を含んでなる、 13 ガラクトシドー α 2, 3 シァル酸転移酵素において、配列番号 2のアミノ酸 1— 21はシグナル配列である。したがつて、本発明の j8—ガラタトシドー a 2, 3—シアル酸転移酵素は、配列番号 2のアミノ酸 22— 409のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明の β ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。

[0015] 本発明の配列番号 29のアミノ酸配列を含んでなる、 13 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素にぉ、て、配列番号 29のアミノ酸 1― 24はシグナル配列であると想定される。したがって、本発明の j8—ガラタトシドー a 2, 3—シアル酸転移酵素は、配列番号 29のアミノ酸 25— 409のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明の j8—ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 28 の塩基 73— 1230の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であつてもよい。

[0016] 本発明の配列番号 31のアミノ酸配列を含んでなる、 13 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素にぉ、て、配列番号 31のアミノ酸 1― 22はシグナル配列であると想定される。したがって、本発明の j8—ガラタトシドー a 2, 3—シアル酸転移酵素は、配列番号 31のアミノ酸 23— 402のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明の j8—ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 30 の塩基 67— 1209の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であつてもよい。

[0017] 本発明はまた、上記の本発明の β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素の変異体であって、ガラクトシドー _{α 2}, 3—シアル酸転移酵素活性を有する変異タンパク質をも包含する。このような変異タンパク質もまた、本発明の β—ガラタトシド - α 2, 3 シアル酸転移酵素に含まれる。

[0018] 本発明の変異体タンパク質は、配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のアミノ酸 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のァミノ酸 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列において、 1または複数のァミノ酸の欠失、置換、挿入および/または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよぐこれは、特定のアミノ酸残基を類似の物理ィ匕学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、 Ile、 Val、 Leuまたは Ala相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、 Lysおよび Arg、 Gluおよび Asp、 Ginおよび Asn相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。

[0019] アミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付カ卩による変異体は、野生型タンパク質をコードする DNAに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発 (例えば、 Nucl eic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487- 6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「1 または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および Zまたは付加できる程度のアミノ酸を意味する。

[0020] 部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージ DNAに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖 DNAで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞力もプラークを形成させる。そうすると、理論的には 50%の新コ口- 一が一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの 50%が元の配列を有する。上記所望の変異を有する DNAと完全に一致するものとはハイブリダィズする力元の鎖を有するものとはハイブリダィズしな、温度にぉ、て、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダィズさせる。次に該プローブとハイブリダィズするプラークを拾ヽ、培養して DNAを回収する。

[0021] なお、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ 1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次ヽで連結する方法もある。 [0022] 本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73— 1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む核酸によつてコードされるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよ、。

ここで、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 0. 5Μ リン酸ナトリゥム ρΗ7. 2、 ImM EDTA、 7%SDS、 1%BSA中で 55°Cでハイブリダィゼーシヨンさせた後、 40mM リン酸ナトリウムバッファー ρΗ7. 2、 ImM EDTA、 5%SD S、 0. 5%BSA中で 55。C、 15分を 2回、 40mM リン酸ナトリウムノッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 1%SDS中で 55°C、 15分を 2回、洗浄操作を行うという条件、あるいは Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2版、第 1卷、 1.101- 104頁、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (引用によりその全体を本明細書に援用する )等に記載されているように、 30% 脱イオン化ホルムアミド、 0. 6M NaCl、 40mM リン酸ナトリウム ρΗ7. 4、 2. 5mM EDTA、 1%SDS中で 42°Cで、ハイブリダィゼーシヨンさせた後、 2XSSC、 0. 1%SDS、中で室温で 10分を 2回、さらに同じバッファー中で 55°Cで 1時間洗浄操作を行うという条件が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、高度にストリンジェントな条件におけるハイブリダィゼーションとして、例えば、 Molecular Cloning (同上）等に記載されている、 0. 5M リン酸ナトリウム pH7. 2、 ImM EDTA、 7%SDS、 1%BSA中で 65°Cでハイブリダィゼーシヨンさせた後、 40mM リン酸ナトリウムバッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 5%S DS、 0. 5%BSA中で 65。C、 40mM リン酸ナトリウムノッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 1%SDS中で 65°C、洗浄操作を行うという条件が挙げられる。

[0023] 本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のアミノ酸 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31 のアミノ酸 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、好ましくは 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95% 以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シァル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよ、。

[0024] または、本発明の変異体タンパク質は、配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230 、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73— 1230、配列番号 30、および、配列番号 30 の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも 60%以上、好ましくは 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の相同性を有する核酸によってコードされるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよ、。

[0025] ここで、アミノ酸配列または核酸塩基配列の相同性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定可能である。例えば、 2つのアミノ酸配列の相同性％は、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネテイツタス製）などのプログラム、または、 FASTAアルゴリズムや BLASTアルゴリズムなどを用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。

[0026] シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、 J. Biochem., 120, 104-110 (1996 ) (引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質として CMP— NeuAc (N—ァセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラタトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシァリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。

[0027] 糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルァミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ NMR)による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルァミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルァミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルァミノ化ラタトース (Gal |8 1— 4Glc— PA、タカラバィォ製)を糖受容体基質、 CMP— NeuAcを糖供与体基質として用いて酵素反応を行ヽ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー (HPLC)分析にかけ、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。

[0028] 本発明の一態様において本発明の酵素は、ビブリオ科に属する微生物由来、好ましくはビブリオ属 (Vibrio spp.)に属する微生物由来、または、好ましくはフォトバタテリゥム属（Photobacterium spp.)に属する微生物由来、さらに好ましくは、フォトバタテリゥム ·フォスフォレゥム種（Photobacterium phosphoreum)に属する微生物由来の酵素である。

[0029] 本発明の β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素学的性質および理化学的性質は、上記に定義した |8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とするほか、限定するわけではないが、至適 ρΗが、 ρΗ5〜11、 ρ Η5〜10、 ρΗ5〜9、または ρΗ5〜7の範囲であり、至適温度が、 5〜35°C、 10〜35 。C、 20〜35。C、または 20〜30。Cであり、分子量力 DS— PAGE分析で 42, 000 ± 3, OOODa程度である。

[0030] R ガラクトシ a 2. 3 シアル酸転移酵素コードする核酸

本発明は、 |8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。

[0031] 本発明の核酸は、配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のアミノ酸 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸 23— 4 02からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 2 8、配列番号 28の塩基 73— 1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸である。

[0032] 本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、 β ガラクトシドー α 2, 3 シァル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよ、。そのような核酸もまた、本発明の β ガラクトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素をコードする核酸に含まれる。

[0033] そのような核酸の変異体は、配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のアミノ酸 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のァミノ酸 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および/または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシド— α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。

[0034] そのような核酸の変異体はまた、配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73— 1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む核酸であつて、該核酸は j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、ストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件とは、上記で定義したとおりである。

[0035] そのような核酸の変異体はまた、配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73— 1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも 60%以上、好ましくは 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の相同性を有する核酸であつて、該核酸は j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、核酸塩基配列の相同性は、上記に示した方法で決定することができる。

[0036] そのような核酸の変異体はさらに、配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のアミノ酸 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、好ましくは 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95% 以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシド α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。ここで、アミノ酸配列の相同性は、上記に示した方法で決定することができる。

[0037] β ガラクトシドー α 2. 3 シアル酸転移酵素を発現する微生物

本発明者らは、ビブリオ科に属する微生物が新規な )8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、 —ガラタトシドー (X 2, 3 シアル酸転移酵素を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、ビブリォ科に属し、 —ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素生産能を有する微生物であり、好ましくはビブリオ属 (Vibrio spp.)に属するもの、または、好ましくはフォトバタテリゥム属（Photobacterium spp.)に属するもの、さらに好ましくは、フォトバクテリウム- フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)に属するものである。 β—ガラタトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素生産能を有するビブリオ科に属する微生物の例としては、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株（寄託番号 NITE BP — 88)、フォトバタテリゥム属 11ー1311— 224株（寄託番号^0¾ BP— 87)、および、ビブリオ属 JT— FAJ— 16株（寄託番号 NITE BP— 98)が挙げられる。なお、上記のビブリオ科の微生物は海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類力分離される。たとえば、本発明のフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467 株は石川県産のイカから、フォトバタテリゥム属 JT— ISH— 224株は石川県産の力マスから、そして、ビブリオ属 JT— FAJ— 16株は福岡県産のアジから、それぞれ分離されたものである。

本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離することができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を接種源とする。これらをマリンブロスァガー 2216培地（ベタトン'ディッキンソン製）や塩ィ匕ナトリウム添加-ユートリエントァガー培地 (ベタトン'ディッキンソン製)などの平板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッキンソン製)や塩ィ匕ナトリウム添加-ユートリエントブロス培地（ベタトン'ディッキンソン製)などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液力も菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である 0. 2%トリトン X— 100 (関東化学製）を含む 20mMカコジレート緩衝液 (pH6. 0)を添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。 [0039] 本発明のフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株、フォトバクテリウム属 JT—ISH— 224株、および、ビブリオ属 JT—FAJ—16株も上記のスクリー- ング法を用いることで得られた。得られた上記の菌株の菌学的性質および生理学生化学的性質、ならびに 16S rRNA遺伝子の塩基配列解析による種の同定については、実施例 1に詳述する。

[0040] フォトバタテリゥムフォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)JT— ISH— 467 株は 2005年 3月 14日付で NITE BP— 88として、フォトバタテリゥム属（Photobacter ium sp.)JT— ISH— 224株は 2005年 3月 11日付で NITE BP— 87として、そして、ビブリオ属（Vibrio sp.)JT— FAJ— 16株は 2005年 5月 23日付で NITE BP— 98として、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター (N PMD： National Institute of Tecnnology and Evaluation, Patent Microorganisms Dep ositary ;日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8)に寄託されている。

[0041] β ガラクトシドー 2. 3—シアル酴転移酵素 ¾告する方法

( D f! ガラクトシ 2. 3—シアル酸転移酵素発現する微牛物谘着するこ Wこよる P まの ¾告

本発明の一態様において、本発明の j8—ガラクトシドーひ 2, 3 シアル酸転移酵素はビブリオ科に属する微生物由来であり、 j8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、 |8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素を生産させ、これを採取することによって得られる。

[0042] ここで用いる微生物としては、ビブリオ科に属し、 β—ガラタトシド一 a 2, 3 シアル酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれの菌株でも用いることができる。ビブリオ科の微生物の中でも、ビブリオ属に属するものが好ましぐまたは、フォトバクテリウム属に属するものが好ましぐそしてフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥムに属するものがさらに好ましい。本発明の方法において用いる微生物の例としては、フォトバタテリゥム.フォスフォレゥム JT—ISH— 467株（寄託番号 NITE BP— 88)、フォトバタテリゥム属（Photobacterium sp.)JT—ISH— 224株（寄託番号 NITE BP— 87) 、および、ビブリオ属（Vibrio sp.)JT— FAJ— 16株（寄託番号 NITE BP— 98)が挙げられる。 [0043] 上記微生物の培養に用いる培地としては、それらの微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリプトン、カゼィン分解物、肉エキス、ブドウ糖等が挙げられ、好ましくはペプトンを用いる。窒素源としては、酵母エキスを用いるのが好ましい。塩類としては、塩ィ匕ナトリウム、クェン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩ィ匕カルシウム、塩ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほう酸ナトリウム、ケィ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモ-ゥム、リン酸水素ニナトリウム等を適宜組み合わせて用いるのが好ましい。

[0044] また、上記成分を含んだマリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッキンソン製)を用いてもよい。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母エキス等を添加した培地を用いてもょヽ。培養条件は培地の組成ゃ菌株によって多少異なるが、例えば、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株を培養する場合、培養温度は 10〜28°C、好ましくは 20〜25°C、培養時間は 8〜48時間、好ましくは 16〜24時間である。

[0045] 目的とする酵素は菌体内に存在するため、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などのいずれかの方法を行えばよぐその菌体破砕物から目的とする酵素を分離精製する。本発明の方法における好ましい菌体破砕法は超音波破砕法である。例えば、菌体破砕物から遠心分離により固形物を除去した後に、得られた菌体破砕液上清を市販の陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、 CD P へキサノールアミンァガロースカラム、 CMP へキサノールアミンァガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ一 PAGE等を適宜組み合わせて電気泳動的に単一バンドになるまで精製することができる。

[0046] なお、 /3—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は完全に精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明の β—ガラタトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素は精製品であってもよぐまたは部分精製品であってもよい。

[0047] (2)組椽ぇ β ガラクトシドー a 2. 3 シアル酸転移酵素を製诰する方法

本発明は、 j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換え |8— ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。

[0048] 本発明の組換え β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子等力誘導された適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結した j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレータ一、またはェンノヽンサ一、 mRNAリボソーム結合部位、ならびに、転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。

[0049] 本発明のベクターに挿入される β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素をコードする核酸配列は、配列番号 1の塩基 1 63、配列番号 28の塩基 1 72、または配列番号 30の塩基 1 66に相当するリーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよぐまた、他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。

[0050] また、本発明の組換え /3—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質は、当該酵素をコードする核酸に続いて、 Hisタグ、 FLAG™タグ、ダルタチオン— S— トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすることができる。

[0051] β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローユングおよび発現ベクターは、例えば、 Pou weisら、 Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985) (引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。 [0052] 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、 β ガラクトシドー《2 , 3—シアル酸転移酵素タンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするために Ν末端メチォニン残基を含むようにしてもよ、。この Ν末端メチォ二ンは、発現後に組換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質から切り離すことちでさる。

[0053] 原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に 1または 2以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、 pBR322 (ATCC37017)のような巿販のプラスミドまたはそれらカゝら誘導されるものが含まれる。 pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびに j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素をコードする核酸の DNA配列力この pBR322ベクター内に挿入される。他の巿販のベクターには、例えば、 ρΚΚ223 - 3 (Pharmacia Fine Chemicals,スウェーデン、ゥプサラ）および pGEMl (Promega Biotech.、米国、ウィスコンシン州、マディソン）などが含まれる。

[0054] 原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、 t a_cプロモーター、 βーラクタマーゼ（ベ-シリナーゼ）プロモーター、ラタトースプロモ一ター（Changら、 Nature 275:615, 1978;および Goeddelら、 Nature 281 :544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。

[0055] また、組換え /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、 S.cere visiae )を用いるが、ピキア属（Pichia)またはクルイべ口ミセス属（Kluyveromyces)のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、 2 酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列 (ARS)、プロモーター領域、ポリアデ-ルイ匕のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母因子リーダー配列を用いて、組換え β ガラクトシドー 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主力もの組換えポリべプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られて!/、る。酵母を形質転換する方法は、例えば、 Hinnenら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978 ( 引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。

[0056] 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換え β ガラクトシドー α 2, 3— シアル酸転移酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウィルスゲノム力も得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およびェンハンサー配列は、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス 2など力も誘導される。 S V40ウィルスゲノム、例えば、 SV40起点、初期および後期プロモーター、ェンハンサ一、スプライス部位、およびポリアデニルイ匕部位力誘導される DNA配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、 Okayamaおよび Berg (Mol. Cell. Biol, 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する）の方法で構築することができる。

[0057] 本発明の /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を産生する 1つの方法は、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じて )8—ガラクトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。

[0058] 組換え β ガラクトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかとヽつた要因に従って適宜選択される。例えば、糸且換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 シァル酸転移酵素タンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換力ラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、 CDP へキサノールアミンァガロースカラム、 CMP へキサノールアミンァガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ PAGE等、またはそれらの組み合わせが含まれる。また、組換え j8—ガラクトシド—ひ 2, 3 シアル酸転移酵素に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、ァフィユティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、 FLAG™タグ、またはダルタチォン— S トランスフェラーゼ (GST)などを融合させた場合には、それぞれ、 Ni-NT A (二トリ口トリ酢酸)カラム、抗 FLAG抗体を連結したカラム、またはダルタチオンを連結したカラム、などを用いてァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる。

[0059] 組換え /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明の β ガラクトシドー 2, 3 シアル酸転移酵素は精製品であってもよぐまたは部分精製品であってもよい。

[0060]

本発明は、本発明の β—ガラタトシド— (X 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明の β ガラクトシドー (X 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明の j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素のミノ酸酉己歹 IJ中、少なくとち 6 ミノ酸、少なくとち 10 ミノ酸、少なくとち 20 ミノ酸、または少なくとも 30アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。

[0061] 抗体は、本発明の j8—ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ャギなどに免疫して作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。

[0062] 本発明の抗体は、本発明の β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質をァフィユティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本発明の j8—ガラタトシド— a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を、ウェスタンブロッティングや ELISAなどのアツセィにおいて検出するのに用いることもできる。

[0063] シァリル糖鎖の製造方法

一態様において、本発明は本発明のシアル酸転移酵素を利用したシァリル糖鎖の製造方法を提供する。本発明の方法は、シァリル糖鎖の製造方法であって、

(i)本発明の β ガラクトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液を調製し；

(ii)当該溶液にぉ、てシアル酸転移反応を行ヽ；そして

(iii)反応溶液から生成したシァリル糖鎖を得る；

ことを含んでなる、前記方法である。

[0064] 本明細書にぉ、てシァリル糖鎖とは、シアル酸を有する糖鎖を、う。本発明の方法においては、本発明の酵素によるシアル酸転移反応より、糖供与体基質のシアル酸が糖受容体基質に転移し、シァリル糖鎖が得られる。

[0065] 本発明の方法に使用可能な糖供与体基質は、本発明のシアル酸転移酵素によるシアル酸転移反応にお!、て糖供与体となりうる基質であれば特に限定されな、。好ましい本発明の方法に使用可能な糖供与体基質は CMP シアル酸であり、より好ましくは CMP— NeuAcである。

[0066] 本発明の方法に使用可能な糖受容体基質は、特に限定されないが、ガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基、フコース残基、 N ァセチルダルコサミン残基、もしくは N ァセチルガラタトサミン残基などを有する複合糖質糖鎖もしくはオリゴ糖、または、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、 N ァセチルダルコサミンもしくは N ァセチルガラタトサミンなどの単糖である。ここで、複合糖質とは、糖質を含む生体分子の総称で、糖タンパク質、プロテオダリカン、糖脂質が含まれる。本明細書において複合糖質糖鎖とは、糖タンパク質、プロテオダリカン、糖脂質などの複合糖質そのものを意味することもあるし、また、その糖鎖部分を意味することもある。また、オリゴ糖とは、 2以上の単糖がグリコシド結合で連結された糖を意味する。オリゴ糖を構成する単糖の数には特に制限はない。また、単糖またはオリゴ糖の還元末端は、アルキル基、ピリジルァミノ基、ベンゾィル基、ベンジル基、パラ-トロフエ-ル基、 4ーメチルゥンベリフェリル基などで修飾されて、てもよ、。

[0067] 本発明の方法において、本発明の酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液は緩衝液であり、例えば、非限定的に、酢酸バッファー、力コジル酸バッファー、リン酸バッファー、 TAPSバッファー、 Bis— Trisバッファー、 Trisバッファー、 C HESバッファー、 CAPSバッファー、 MOPSバッファー、 MESバッファー、 ADAノッファー、 PIPESバッファー、 ACESバッファー、 MOPSOバッファー、 HEPESバッファー、などが含まれる。本発明の方法における、本発明の酵素、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液の pHは、本発明の酵素が酵素活性を有する pHであれば特に限定されないが、好ましくは pH5〜l l、 pH5〜10、 pH5〜9、 pH5〜7である

[0068] 本発明の方法において、シアル酸転移反応を行う温度は、本発明の酵素が酵素活性を有する温度であれば特に限定されないが、好ましくは、 5〜35°C、 10〜35°C、 2 0〜35°C、 20〜30°Cの範囲で行うことができる。

[0069] 本発明の方法における、反応溶液から生成したシァリル糖鎖を得る工程は、当業者に公知の複合糖質糖鎖、オリゴ糖を精製する手法を用いて行うことができる。例えば、クロマトグラムとしては、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ィォン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィーなど、またその他の手法としては、限外ろ過による糖鎖の分画'濃縮、糖鎖の結晶化など、もしくはそれらの組み合わせ、などが挙げられるがこれらに限定されない。

[0070] 本発明の酵素は、後述の実施例 4、 1 1、 12および 13に示すように、多くの種類の糖受容体基質にシアル酸を α 2, 3結合で転移することが可能である。本発明のシァリル糖鎖の製造方法により、一般的には基質特異性が高い公知のシアル酸転移酵素では製造できな力つた糖鎖を容易に製造することが可能になる。特に α -ガラクトビラノシド、 α—グノレコピラノシド、 α—マンノビラノシド、 α—フコシノビラノシド、 β -フコシノピラノシドなどといった糖に効率よくシアル酸を転移する活性を有する酵素は知られていないので、本発明の方法は、これらの糖にシアル酸が付加されたシァリル糖鎖の容易な製造方法を提供する。

発明の効果

[0071] 本発明は、新規な β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきて!/ヽる糖鎖の合成 ·生産手段を提供するとヽぅ観点におヽて貢献する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。

図面の簡単な説明

[図 1- 1]図 1— 1は、 JT— ISH— 467株由来の組換え j8 ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験における、標品（失活させた粗酵素液、ピリジルァミノ化ラタトースおよびピリジルアミノィ匕 a 2, 3 シァリルラタトース（ピリジルアミノ化 3 '—シァリルラタトース）の混合物）の HPLC分析結果を示す図である。

[図 1- 2]図 1— 2は、 JT— ISH— 467株由来の組換え j8 ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験の HPLC分析結果を示す図である。

[図 1- 3]図 1— 3は、 JT— ISH— 467株由来の組換え j8 ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性の確認実験における、対照実験 (糖供与体である CMP ーシアル酸を含まなヽ反応液を使用した反応）の HPLC分析結果を示す図である。

[図 2]図 2は、フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来、フォトバタテリゥム属 JT—ISH— 224株由来、およびビブリオ属 71—？ー16株由来の0；2

, 3 シアル酸転移酵素（それぞれ配列番号 2、 29、 31)、フォトバタテリゥム 'ダムセラの α 2, 6 シアル酸転移酵素 (JC5898)、ならびにパスッレラ 'ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)のアミノ酸配列間のアラインメントを示す図である。 JT— ISH— 467株由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素についての下線は精製タンパク力決定されたアミノ酸配列を示す。

[図 3- 1]図 3—1は、 JT—ISH—467株が生産した j8 ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性における反応 pHの影響を示すグラフである。グラフ中の、黒四角、黒丸、黒三角、黒ひし形、白抜き四角、および白抜き丸のプロットはそれぞれ、酢酸バッファー、力コジル酸バッファー、リン酸バッファー、 TAPSバッファー、 CHES バッファーおよび CAPSバッファ一中で測定した結果を示す。

[図 3-2]図 3— 2は、組換え |8—ガラクトシドーひ 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性における反応 pHの影響を示すグラフである。図 3— 2aiお T— ISH— 467株由来、図 3— 2biお T— ISH— 224株由来、および図 3— 2dお T—FAJ— 16株由来の組換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素についての結果を示すグラフである。グラフ中の、黒四角、黒丸、黒三角、黒ひし形、白抜き四角、および白抜き丸のプロットはそれぞれ、酢酸バッファー、力コジル酸バッファー、リン酸バッファー、 TAPSノッファー、 CHESバッファーおよび CAPSバッファ一中で測定した結果を示す。

[図 4- 1]図 4— 1は、 JT— ISH— 467株が生産した j8—ガラタトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。

[図 4-2]図 4— 2は、組換え |8 ガラクトシドーひ 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。図 4— 2ai T— ISH— 467株由来、図 4— 2biお T— ISH— 224株由来、そして図 4— 2dお T—FAJ— 16株由来の組換え j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素についての結果を示すグラフである。

[0073] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例

[0074] 実施例 1： β -ガラクトシド α 2. 3 シアル酸転移酵素を発現する微生物のスクリーユングと菌株の同定

海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスァガー 2216培地（ベタトン'ディッキンソン製)からなる平板培地上に塗布し、 15°C、 25 °Cもしくは 30°Cで生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッキンソン製)からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、 0. 2%トリトン X— 100 (関東ィ匕学製)を含む 20mMカコジレート緩衝液 (pH6. 0)を添カ卩し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を酵素溶液としてシァル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌¾[丁— ISH— 467株、 JT-I SH— 224株、および JT— FAJ— 16株を得た。なお、 JT— ISH— 467株は、スルメイ力の表皮から、 JT—ISH— 224株は力マスの内臓から、および JT— FAJ— 16株はァジの内臓から、それぞれ得られた。

[0075] シアル酸転移活性は、 J. Biochem., 120, 104-110 (1996) (引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質 CMP— NeuAc (70nmol、 ¹⁴Cで NeuAcをラベルした CMP— NeuAc 25000cpm を含む、 356cpmZnmol。 NeuAcは N ァセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクト一ス（1. 25 mol)、 NaClを 0. 5M濃度になるように添カ卩し、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液 (30 IX 1)を用いて酵素反応を行つた。酵素反応は 25°Cで 10分間から 30分間行った。反応終了後、反応溶液に 1. 9 7mlの 5mMリン酸緩衝液（pH6. 8)を加え、この溶液を Dowexl X 8 (PO ³-フォー

4 ム、 0. 2 X 2cm、 BIO— RAD製）カラムに供した。このカラムの溶出液（0〜2ml)に含まれる反応生成物、すなわち、シァリルラタトースに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。

(i) TT ISH— 467株

得られ^ JT ISH— 467株の性質は以下の通りであった：

睡

(1)細胞の形態は桿菌で、大きさは 0. 7〜0. 8 /z m X l. 5〜2. 0 m。

[0076] (2)運動性

(3)グラム染色性

(4)胞子の有無

(生理学生化学的性質）

(1)生育温度 4°Cでは +、 25°Cでは +、 30°Cでは

(2)集落の色調特徴的集落色素を産生せず

(3) OZFテスト +Z—

(4)カタラーゼテスト

(5)ォキシダーゼテスト +

(6)グルコースからの酸産生

(7)グノレコースからのガス産生 (8)発光性 +

(9)硝酸塩還元 +

(10)インドール産生 +

(11)ブドウ糖酸性ィ匕

( 12)アルギニンジヒドロラーゼ +

(13)ゥレアーゼ

(14)エスクリン加水分解

(15)ゼラチン加水分解性

(16) β -ガラタトシダーゼ +

(17)ブドウ糖資化性

( 18) L ァラビノース資化性

(19) D マンノース資化性

(20) D マンニトール資化性

(21) Ν ァセチルー D—ダルコサミン資化性

(22)マルトース資化性

(23)ダルコン酸カリウム資化性

(24) η—力プリン酸資化性

(25)アジピン酸資化性

(26) dl リンゴ酸資化性

(27)クェン酸ナトリウム資化性 ―

(28)酢酸フエ二ル資化性

(29)チトクロームォキシダーゼ +

(30)菌体内 DNA の GC含量（モル％) 39. 7%

(16S rRNA遣伝子の塩某配列解析および DNA— DNAノ、イブリダィゼーシヨンによる種の同定）

JT— ISH— 467株から、常法により抽出したゲノム DNAを铸型として、 PCRにより 1 6S rRNA遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号 3に示した。この塩基配列はフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)基準株である ATCC11040株の 16S rRNA遺伝子の塩基配列に対し、相同率 100%の高い相同性を示した。この結果から、 JT—ISH— 467株はフォトバクテリゥム属に属することが明ら力となった。しかしながら、 16S rRNA遺伝子は細菌の全ゲノムの一部でしかないので、 16S rRNA遺伝子の塩基配列による同定解析は種レベルの極めて近縁な生物間の距離に対しては誤差が非常に大きいとされている。そこで、属内における菌株の類縁関係の定量的な評価に一般的に用いられて、る DNA— DNAノヽイブリダィゼーシヨン試験法を用い、種の決定を行った。 JT

— ISH— 467株およびフォトバクテリウム'フォスフォレゥム基準株である NCIMB128

2株 (ATCC11040株と同一株）の全 DNAを抽出し、供試した。その結果、 84. 7% の高い相同値（DNA- DNA relatedness)が得られた。一般に、同一種間の DNA—D

NA相同値は 60%以上を示すことから、 JT—ISH—467株はフォトバタテリゥム ·フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)と同定された。なお、 DNA— DNAハイブリダィゼーシヨン試験は「微生物の分類.同定実験法」（鈴木健一郎'平石明.横田明編、シュプリンガー'フエアラーク東京株式会社、 2001年 9月、参照によりその全体を本明細書に援用する）に従い、マイクロプレートを用いたフォトピオチン標識法によって行った。

(ii) TT ISH— 224株

得られ^ JT ISH— 224株の性質は以下の通りであった：

睡

(1)細胞の形態は桿菌で、大きさは 0. 7〜0. 8 /z m X l. 0〜1. 5 m。

(2)運動性 +

(3)グラム染色性

(4)胞子の有無

(生理学生化学的性質）

(1)生育温度 4°Cでは一、 25°Cでは +、 30°Cでは +、 37°Cでは

(2)集落の色調特徴的集落色素を産生せず

(3) OZFテスト +Z—

(4)カタラーゼテスト + (5)ォキシダーゼテスト +

(6)グルコースからの酸産生 +

(7)グノレコースからのガス産生 +

(8)発光性

(9)硝酸塩還元 +

(10)インドール産生 +

(11)ブドウ糖酸性ィ匕

( 12)アルギニンジヒドロラーゼ +

(13)ゥレアーゼ

(14)エスクリン加水分解

(15)ゼラチン加水分解性

(16) β -ガラタトシダーゼ +

(17)ブドウ糖資化性

( 18) L ァラビノース資化性

(19) D マンノース資化性

(20) D マンニトール資化性

(21) Ν ァセチルー D—ダルコサミン資化性

(22)マルトース資化性

(23)ダルコン酸カリウム資化性

(24) η—力プリン酸資化性

(25)アジピン酸資化性

(26) dl リンゴ酸資化性

(27)クェン酸ナトリウム資化性

(28)酢酸フエ二ル資化性

(29)チトクロームォキシダーゼ +

(30) 0/129感受' 14、 10 g 一 +

(31)菌体内 DNA の GC含量（モル％) 39. 4% (16S rRNA遣伝子の塩某配列解析） JT— ISH— 224株から、常法により抽出したゲノム DNAを铸型として、 PCRにより 1 6S rRNA遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号 32に示した。

[0078] JT—ISH— 224株はマリンァガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、 OZ129感受性などの形態観察および生理'生化学的性状試験の結果力もビブリオ科に属することが示された。さらに、 JT— ISH— 224株の 16S rR NA遺伝子の DNA塩基配列はフォトバタテリゥム ·フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)基準株 ATCC11040の 16S rRNA遺伝子の配列に最も相同性が高ぐその相同率は 99. 2%であること、次にフォトバタテリゥム 'イリオピスカリウム（Ph otobacterium iliopiscarium)基準株 ATCC51760の 16S rRNA遺伝子の配列に相同性が高ぐその相同率は 99. 1%であることが明ら力となった。これらの結果から、 J T— ISH— 224株はフォトバタテリゥム属（Photobacterium sp.)に属する微生物であることが明ら力となった。

(iii) TT_FAT_ 16株

得られ^ JT—FAJ— 16株の性質は以下の通りであった：

睡

(1)細胞の形態は桿菌で、大きさは 0. 7〜0. 8 /z m X l. 2〜1. 5 m。

[0079] (2)運動性

(3)グラム染色性

(4)胞子の有無

(生理学生化学的性質）

(1)生育温度 4°Cでは +w、 25°Cでは +、 30°Cでは +、 37°Cでは +

(2)集落の色調淡黄色〜クリーム色

(3) OZFテスト +Z +

(4)カタラーゼテスト +

(5)ォキシダーゼテスト +

(6)グルコースからの酸産生 +

(7)グノレコースからのガス産生 (8)硝酸塩還元 +

(9)インドール産生

(10)ブドウ糖酸性ィ匕 +

(11)アルギニンジヒドロラーゼ

(12)ゥレアーゼ

(13)エスクリン加水分解 +

(14)ゼラチン加水分解性

(15) β -ガラタトシダーゼ +

(16)ブドウ糖資化性

( 17) L ァラビノース資化性

(18) D マンノース資化性

(19) D マンニトール資化性

(20) Ν ァセチルー D ダルコサミン資化性

(21)マルトース資化性

(22)ダルコン酸カリウム資化性

(23) η—力プリン酸資化性

(24)アジピン酸資化性

(25) dl リンゴ酸資化性

(26)クェン酸ナトリウム資化性

(27)酢酸フエ二ル資化性

(28)チトクロームォキシダーゼ +

(29) OZl29感受性、

(30)マンィトール発酵性、 +

(31)イノシトール発酵性、 +

(32)ァラビノース発酵性、 +

(33)ラムノース発酵性、

(34)サッカロース発酵性、

(35)生育性（NaCl)、 3%NaCl+、 4%NaCl +、 6%NaCl +、 (36)デンプン加水分解、

(37) Tween80分解、 -

(38) H S産生、

2

(39)ァセトイン産生 (VPテスト）、

( 16S rRNA遣伝子の塩某配列解析）

JT— FAJ— 16株から、常法により抽出したゲノム DNAを铸型として、 PCRにより 16 S rRNA遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号 33に示した。

[0080] JT—FAJ— 16株はマリンァガー上での生育性、桿菌、グラム染色性、グルコース発酵的分解性、 OZ129感受性などの形態観察および生理'生化学的性状試験の結果カもビブリオ科に属することが示された。さらに、 JT— FAJ— 16株の 16S rRNA 遺伝子の DNA塩基配列はビブリオ ·ルモイエンシス (Vibrio rumoiensis)基準株の 16 S rRNA遺伝子の配列に最も相同性が高ぐその相同率は 99. 5%であることが明らカとなった。これらの結果から、 JT—FAJ— 16株はビブリオ属（Vibrio sp.)に属する微生物であることが明らかとなつた。

実施例 2：フォトパクテリゥムフォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum) TT— TSH— 467からの β ガラクトシド、 2. 3 シアル酸転移酵素の抽出および精製マリンァガー 2216平板培地上で継代培養したフォトバクテリゥムフォスフォレゥム J T—ISH— 467株のコロニーから菌体をループで採取し、マリンブロス 2216液体培地 10mlに接種し、 25°C、毎分 180回転で 8時間振とう培養した。

[0081] 本培養は、以下の手順で実施した。 20gZLの Bacto Peptoneおよび 4 gZLの Bacto Yeast Extractをカ卩えたマリンブロス 2216培地を 1000ml容のコブ付フラスコに 300ml張り込み、オートクレーブ（121°C、 15分間）で滅菌した。これを 36本（合計 10. 8L)用意した。各々のフラスコに前培養液 10mlを接種し、 25°C、毎分 180 回転で 24時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約 6 0gを得た。

[0082] この菌体を、 990mlの 0. 2%トリトン X— 100および 3M塩化ナトリウムを含む 20m Mカコジレート緩衝液 (pH6. 0)に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を 4°C、 100, 000 ₈で1時間、遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を、透析膜チューブに入れ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMカコジレート緩衝液（pH6. 0)中で 4°C、塩ィ匕ナトリウムが 20mM程度になるまで透析した。透析後、溶液中に沈澱が生じたため、 4°Cで、 100, 000 X gで 1時間遠心分離を行い、沈殿を取り除いた

[0083] この粗酵素液を、 0. 2%トリトン X— 100なる界面活性剤を含む 20mMカコジレート緩衝液（ρΗ6. 0)で平衡化した HiPrep 16/10 DEAE FF (アマシャムバイオサィエンス製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20m Mカコジレート緩衝液 (pH6. 0)から 1M塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 25M付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。

[0084] 回収した画分を 20mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)で希釈し、予め 0. 2%トリトン X— 1 00を含む 20mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)で平衡化したハイドロキシアパタイト（Bio— Rad製）に吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMリン酸緩衝液（pH6. 0)から 0. 2%トリトン X— 100を含む 500mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が 125mM付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。

[0085] この画分を MonoQ 5/50 GL (アマシャムバイオサイエンス製）陰イオン交換力ラムに吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mM カコジレート緩衝液（pH6. 0 )から 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩ィ匕ナトリウム濃度が 300mM付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。

[0086] この画分を、 0. 2%トリトン X—100を含む 20mM カコジレート緩衝液（pH7. 0)で 10倍希釈し、 MonoQ 5/50 GL (フアルマシア製）陰イオン交換カラムに吸着させた。 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMカコジレート緩衝液（pH7. 0)から 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ、直線濃度勾配法で溶出させた。塩ィ匕ナトリウム濃度が 300mM付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。

[0087] この画分を 0. 2%トリトン X— 100および 0. 2M塩化ナトリウムを含む 20mMカコジレー卜緩衝液（ρΗ7. 0)で 2倍希釈し、 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (アマシャムバイオサイエンス製）ゲルろ過カラムで分画した。 0. 2%トリトン X— 100および 0. 2M塩化ナトリウムを含む 20mM カコジレート緩衝液（pH7. 0)で溶出させた。

[0088] 活性のあった画分を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は 12. 5%)した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約 39, 000の分子量を示した。この画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて約 350倍に上昇した（表 1)。

[0089] 粗酵素液力ゝらの JT— ISH— 467株由来の《2, 3—シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表 1に示す。酵素活性は、実施例 1に記載したのと同様に J. Biochem. 120, 104-110(1996)に記載されている方法で測定した。また、タンパク質の定量は Coomassie Protein Assay Reagent (PIE RCE製)を用いて、添付されたマ-ユアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素 1単位（1U)は、 1分間に 1マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。

[0090] [表 1]

表 i . 粗酵素液からの JT SH-467株由来の α 2,3—シアル酸転移酵素の精製表

[0091] 実施例 3 : ピリジルァミノ化糖鎖を用いたシアル酸結合様式の決定実施例 2で得られた酵素を用い、ピリジルァミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルァミノ化糖鎖としては、ピリジルァミノ化ラタトース (Gal |8 1—4 Glc— PA、タカラバィォ製)を用い分析した。糖受容体基質が 2. 0 /z M、 CMP-Ne uAcが 5. および酵素が 20mUZmlとなるように、それぞれを 20mM カコジレート緩衝液 (PH6. 0) 25 冲に溶解し、 25°C下で 3時間反応させた。反応終了後、 100°Cで 2分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、 HPLC で反応生成物の分析を行った。

[0092] HPLCシステムとして Shimadzu LCI OA (島津製作所製）を用い、分析カラムには Takara PALPAK Type R (タカラバイオ製）を用いた。 0. 15% N ブタノールを含む lOOmM 酢酸—トリェチルァミン (pH5. 0)で平衡化したカラムに溶出液 A (lOOmM 酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0)で希釈した反応液を注入した。ピリジルァミノ化糖鎖の溶出には溶出液 A (lOOmM 酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0)および溶出液 B (0. 5%、 n—ブタノールを含む lOOmM 酢酸—トリェチルァミン、 pH 5. 0)を用い、 30〜100%溶出液 Bの直線濃度勾配法 (0〜35分）および 100%溶出液 B (35〜50分）により、順次ピリジルァミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速： lmlZmin、カラム温度： 40°C、検出：蛍光（Ex: 320nm、 E m:400nm) )。

[0093] その結果、本酵素を用いることにより、ピリジルァミノ化ラタトースカもピリジルァミノィ匕 (X 2, 3 シァリルラタトース（ピリジルァミノ化 3，一シァリルラタトース）が合成されることが明ら力となった。

実施例 4 : TT—ISH—467菌株が生産する β ガラクトシドー α 2. 3 シアル酸転移酵素を用いた単糖'二糖街へのシアル酸の転移 (シアル酸含有糖鎖の製诰）

JT— ISH— 467菌株カも調整した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて部分精製した α 2, 3 シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖 '二糖類へのシアル酸の転移を確認するために、以下の実験を行った。 [0094] 各糠の糖容体某皙を用いたシアル酸転移反

反応溶液 24 1中に、糖供与体基質 CMP— "C NeuAc (400nmol ( 15600cp m)、反応溶液中での最終濃度：16. 6mM)、各種糖受容体基質（10 ;ζ ΐη_Ο1、反応溶液中での最終濃度： 200mM)、シアル酸転移酵素（0. 13mU)、 NaCl (反応溶液中での最終濃度： 500mM)からなる反応溶液を調製して、 25°Cで 4時間、酵素反応を行った。なお、糖受容体基質として用いた単糖'二糖類は、メチル— oc— D—ガラタトビラノシド（Gal— a— OMe)、メチル一 j8—D ガラクトピラノシド（Gal— β— OMe ；)、 N—ァセチルガラタトサミン（GalNAc)、ラタトース（Gal— β 1 ,4— Glc)、 Ν ァセチルラクトサミン（Gal— β 1 ,4— GlcNAc)、メチル一 13—D—ガラタトピラノシル一 β 1 , 3 —Ν ァセチルダルコサミニド（Gal— β 1 ,3 - GlcNAc- β—OMe)の 6種類を用いた

[0095] 酵素反応終了後、反応溶液に 1. 98mlの 5mMリン酸バッファー（pH6. 8)を添カロして酵素反応を停止した。その後、 5mMリン酸バッファー (pH6. 8)で希釈した酵素反応溶液（2ml)を、 AGl - X 2Resin (PO ³-フォーム、 0. 2 X 2cm)カラムに供した

4

。このカラムは、 AG1— X 2Resin (OH- form、 BIO- RAD社製）を 1Mリン酸バッファ一 (pH6. 8)に懸濁し、 30分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液 (0〜2ml)の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた¹⁴ C— NeuAc (N ァセチルノイラミン酸）が結合した反応生成物および未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応の CMP— ¹⁴ C NeuAcはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖由来の¹⁴ Cの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性カも酵素活性を算出することができる。

[0096] 上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移された NeuAcの放射活性を測定して転移されたシアル酸を算出した。

(腿）

今回糖受容体基質として用いた 6種類の単糖、ニ糖、ずれにもシアル酸が転移して!、ることが明らかとなつた (表 2参照)。今回糖受容体基質として用いた糖類の中では、 N ァセチルラクトサミンに最も多くのシアル酸が転移していることが明ら力となつた。

[0097] [表 2] 表 2 ： 1815-467株由来 α2,3-シァル酸転移酵素による

種々の糖受容体基質へのシァル酸転移酵素 ¾1生

[0098] 実施例 5 : フォトバクテリウム'フォスフォレゥム TT— ISH— 467株が生産する — ガラクトシ — _{α 2}. 3—シアル酸転移酵素をコードする遺伝子の塩某西 R列解析および当該遺伝子の形皙転椽

( 1)ゲノム DNAの精製とゲノムライブラリーの作成

JT— ISH— 467株の菌体ペレット約 0. 5g力ら、 Qiagen Genomic- tip 100/G (Qiage n社製)を用いて、キット添付の説明書きに従って、約 100 gのゲノム DNAを調製した。 1 2 gの DNAに対して、 0. 1〜0. 2ユニットの四塩基認識の制限酵素 Sau3 AIを反応させ、部分分解を行った。反応バッファ一は酵素に添付のものを用い、反応条件は 37°C、 30分とした。反応終了後、反応液に最終濃度 25mMの EDTA p H8. 0を加え、フエノール'クロ口ホルム処理を行った。ゲノム DNAをエタノール沈殿で回収し、 TE 400 μ 1に溶解した。遠心チューブ（日立製作所製 40ΡΑ)に、グラジェント作製装置を用いて、 40%シユークロースバッファー（20mM Tris pH8. 0, 5 mM EDTA pH8. 0, 1M NaCl)と 10%シユークロースバッファーから、 40— 10 %のグラジェントを作製し、そこへ上記の部分分解 DNA溶液を重層した。超遠心機 (日立製作所製 SCP70H、ローター： SRP28SA)を用いて、 26, 000rpm、 20。C、 15時間遠心した。遠心後チューブの底部に 25Gの針で穴を空け、底部の液から lm 1ずつ回収した。回収したゲノム DNAを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳動糟を用い、 0. 5 - 0. 6%ァガロースゲル ZTAEバッファ一中で、 26V、 20時間電気泳動を行い、 9— 16kbのサイズの DNAを含む画分を把握した。マーカーとして λ Ζ Hindlllを用いた。 9— 16kbのサイズの DNA断片を含む画分に TEを 2. 5ml加えシユークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量の TEに溶解した

[0099] JT—ISH— 467株のゲノムライブラリー作成のためのベクターとして、 DASH II

(Stratagene製）を用いた。 λ DASH IlZBamHIベクターとゲノム DNA断片のライゲーシヨン反応は Stratagene製のライゲーシヨンキットを用いて、 12°Cでー晚行った。反応後、反応液を GigaPack III Gold Packaging extractと反応させ、ゲノム DNAが組み込まれた λベクターをファージ粒子に取り込ませた。ファージ液は 500 μ 1の SMバッファーと 20 ΐのクロ口ホルム中で 4°C保管した。大腸菌 XLl— Blue MRA (P2) ( Stratagene製）を LBMM (LB + 0. 2%マルトース + 10mM MgSO )中で A = 0.

4 600

5になるまで培養し、この培養液 200 1〖こ、適量のファージ溶液をカ卩え、 37°Cで 15 分間培養した。ここへ 48°Cで保温した NZYトップァガロースを 4mlカ卩え、混合し、 NZ Yァガープレート（直径 9cmのプラスチックシャーレ）にプレーティングした。プレートを 37°Cで一晩培養し、プラーク数を数え、 titerを計算したところ、ライブラリーサイズは約 30万 pfu (plaque forming unit)と算出された。

(2)プライマー設 t ^プローブ作成

Precise 494 cLし Protein sequencing System (Applied Biosystems製)を用ヽ飞、 JT — ISH— 467株由来の |8—ガラクトシド一《 2, 3—シアル酸転移酵素のァミノ末端（ Ν末端)アミノ酸配列、および内部アミノ酸配列を決定した。

[0100] Ν末端アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を 5Ζ

20%グラジェントゲル（ΑΤΤΟ製）にて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つた。泳動後、当該酵素を PVDF膜に吸着させ、アミノ酸配列分析装置により、アミノ末端側 10個のアミノ酸の配列を決定した。その結果、当該酵素の Ν末端アミノ酸配列は XNSDSKHNNS (配列番号 4)であった。

[0101] また、内部アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を 5Ζ20%グラジェントゲル (ΑΤΤΟ製）にて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルを染色した後、目的のバンドを切り出し、リジルエンドべプチダーゼを含むトリスバッファー（pH8. 5)を加え、 35°C、 20時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相 HPLC (カラム： Symmetry C18 3. 5 m)に供して、断片ペプチドを分離した。アミノ酸配列分析装置により、当該酵素の内部アミノ酸配列は、 SLDSMI LTNEIK (配列番号 5)、 FYNFTGFNPE (配列番号 6)および GHPSATYNQQII DAHNMIEIY (配列番号 7)を有することが明らかとなつた。

[0102] 上記のように決定されたフォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT—ISH— 467由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素の部分アミノ酸配列、即ち Ν末アミノ酸配列： XNSDSKH NNS (配列番号 4)と、三箇所の内部アミノ酸配列のうち、二箇所の内部アミノ酸配列： FYNFTGFNPE (配列番号 6)および GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番号 7)を基に以下の degenerateプライマーを設計、合成した。即ち、 N末端のァミノ酸配列： XNSDSKHNNS (配列番号 4)から、下記の表 3に示す 3本のプライマー（I はイノシン)を合成した。

[0103] [表 3] 表 3

名称配列 5' -3' mi x度長さ

467N-RV AAY WS I GAY WS I AAR CAY AAY AA (配列番号 8 ) 256 Z3mer

4B7N-RV2 GAY WS I AAR CAY AAY AAY WS (配列番号 9 ) 512 20mer

467N - RV3 AAY WSN GAY WS I AAR CAY AAY AA (配列番号 1 0 ) 1024 23mer 表中、 Yはチミンまたはシトシン； wはチミンまたはアデニン； Sはシトシンまたはグァニン； Rはアデニンまたはグァニン； Nはアデニン、グァニン、シトシンまたはチミン；

Iはイノシン；をそれぞ；表す。

[0104] また、内部アミノ酸配列： GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番号 7)力下記の表 4に示す 4本のプライマーを合成した。

[0105] [表 4] 表 4

名称配列 5' 3 mi) (度長 5

467inlRV ATH ATH GAY GCN CAY AAY ATG (配列番号 1 1 ) 288 21mer 467in1FW CAT TT RTG NGC RTC DAT DAT (配列番号 1 2) 2 B 21ner

467in1RV2 TAY AAY CAR CAR ATH ATH GAY GC (配列番号 1 3) 288 23mer

467in1F 2 _GCR TCD ATD ATY TGY TGR TTR TA—(配列番号 1 4) 288 23mer 表中、 Hはチミン、シトシンまたはアデニン； Yはチミンまたはシトシン；

Rはアデニンまたはグァニン； Dはアデニン、グァニンまたはチミン； Νはアデニン，グァニン、シトシンまたはチミン；をそれぞれ表す。

[0106] さらに、内部アミノ酸配列： FYNFTGFNPE (配列番号 6)力下記の表 5に示す 2本のプライマーを合成した。

[0107] [表 5] 表 5

名称配列 5' -3' mix度長さ

467in2RV TAY AAY TTY ACN GGN TTY AAY CC (S己列番号 1 5) 512 23mer

467in2FW GGR TTR AAN CCN GTR MR TTR TA (配列番号 1 6) 512 23mer 表中、 Yはチミンまたはシトシン； Rはアデニンまたはグァニン；

Nはアデニン、グァニン、シトシンまたはチミン；をそれぞれ表す。

[0108] これらのプライマーを用いて、上記（1)で抽出'精製し^ JT—ISH—467株のゲノム DNAを铸型に PCRを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなる J T ISH— 467株由来 a 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子の部分長 DNAを増幅した。プライマー組み合わせは、 N末端配列由来の 3本のプライマーのそれぞれと、 46 7inlFW (配列番号 12)、 467inlFW2(配列番号 14)もしくは 467in2FW (配列番号 16)の 9つの組み合わせ、 467inlRV (配列番号 11)もしくは 467inlRV2(配列番号 13)と 467in2FW (配列番号 16)の 2つの組み合わせ、さらに 467in2RV (配列番号 15)と 467inlFW (配列番号 12)もしくは 467inlFW2 (配列番号 14)の 2つの組み合わせの、総計 13組み合わせである。 PCR反応は以下のように行った。 50 /xl の反応液中に、ゲノム DNA 250ng、 10( Ex taqバッファー 5 1、2.5mM 各 dNTPs 4 1,プライマーをそれぞれの配列について 5pmole, Ex taq (タカラバイォ製） 0. 5 /z l、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700 (A STEK社）を用いて、 96。C 3分を 1回、 96。C 1分、 50。C 1分、 72。C 2分を 40回、 72°C 6分を 1回行った。その結果、 9つのプライマー組み合わせ（467N—RV (配列番号 8)と 467inlFW (配列番号 12)、 467N— RV (配列番号 8)と 467in2FW (配列番号 16)、 467inlRV (配列番号 11)と 467in2FW (配列番号 16)、 467in2RV ( 配列番号 15)と 467inlFW (配列番号 12)の組み合わせ以外の 9つ）において、 PC R産物が増幅された。これらの PCR産物のうち、特異的かつ高い増幅効率の得られた組み合わせ（467N— RV3 (配列番号 10)と 467inlFW (配列番号 12) )由来の P CR産物をベクター pCR2. 1TOPO (Invitrogen製）にクローユングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌 TBIにエレクト口ポレーション法を用いて DN Aを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A labo ratory manual, 2^nd edition (引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミド DNAを抽出した。このクローンに関して、 Ml 3プライマー（タカラバイオ製)を用いて、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elme r製)で、 PCR産物の塩基配列をその両端力も決定した。

決定された DNA塩基配列（929bp：配列番号 17)に関して、 National Center for B iotechnology Information (NCBI)の GeneBankデータベースに対して、 BLASTプログラムによる相同性検索を行った。その結果、有意な相同性を示す DNA配列は検出されなかった。これは本発明によって明らかにされた、フォトバタテリゥム'フォスフォレゥム JT—ISH—467株由来 a 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の DNA塩基配列が新規な配列であることを意味する。次に、この塩基配列をアミノ酸に翻訳して、再度 BLASTサーチをかけたところ、フォトバクテリウム'ダムセラ（Photobacterium damsela e)の α 2, 6—シアル酸転移酵素 (JC5898)と 30%の相同性、ノスッレラ 'ムルトシダ亜種ムルトシダ株 (Pasteurella multocida subsp. multocida) Pm70の仮定上のタンノク質 PM0188 (AAK02272)と 26%の相同性、へモフィルス 'デュクレイ（Haemoph ilus ducreyi) 35000HP株の仮定上のタンパク質 HD0053 (AAP95068)と 21% の相同性が検出された。さらに、翻訳されたアミノ酸配列は、上記の精製酵素から直接決定された内部アミノ酸配列： FYNFTGFNPE (配列番号 6)と SLDSMILTNAI K (配列番号 5)の全体を含み、 Ν末アミノ酸配列： XNSDSKHNNS (配列番号 4)と、内部アミノ酸配列： GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番号 7)の一部を含んでいた。以上の結果から、クローユングされた DNAは、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH—467株由来《2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の一部であり、かつ本発明のフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2, 3—シァル酸転移酵素のアミノ酸配列は、既報配列と 30%程度し力 4目同性を示さない新規なアミノ酸配列であることが明ら力となった。

(3)スクリーニングと遣伝子クローニング

上記（2)でクローン化されたフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の一部力もなる DNA断片を、 pCR2. 1 T OPOベクター力制限酵素 EcoRIで切り出し、これをプローブとして、上記（1)作製したフォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来ゲノム DNAライブラリ一をスクリーニングした。直径 9cmの丸形シャーレに λ DASH Il/BamHI ベクタ一キット（Stratagene製）の説明書きに従って、約 300— 500pfuのファージを宿主菌 XL 1 -blue MRA(P2)とともにプレーティングした。プラークを Hybond—N +ナイロンメンブレンフィルター（Amersham製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行い DNAを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブは rediprime II™ DNA labelling system (アマシャムバイオサイエンス製）を用いて³² Pラベルした。ハイブリダィゼーシヨンは 0. 5M リン酸ナトリウムバッファー pH7. 2、 7% SDS、 ImM EDTA中で 65(Cでー晚、洗浄の条件は 40mM リン酸ナトリウムバッファー pH7. 2、 ImM EDTA, 5%SDS中で 65。C、 15分を 2回、 40mM リン酸ナトリウムバッファー pH 7. 2、 1% SDS、 ImM EDTA中で 65(C、 15分を 2回行った。 1次スクリーニングで約 5, OOOpfuのファージから 24個のポジティブクローンが得られた。うち 18個のクローンに関して、プラークの精製を兼ねた 2次スクリーニングを行った。その結果、 6種類の選抜'精製プラークを得ることが出来た。

これらのプラークを回収し、それぞれ大腸菌 XL 1— blue MRA(P2)とともに、一枚数万 pfuとなるように NZYプレートにプレーティングし、ー晚 37°Cで保温した。プラークがー面に出ている 6枚のプレートに SMバッファーを 4mlづっ注ぎ、 4°Cでー晚静置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、 QIAGEN Lambd a Mini Kit (キアゲン製）で、 λ DNAを抽出、精製した。これら 6種類の λ DNA、および（1)で精製し^ JT— ISH— 467株の全ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI、 Hindlllで消化し、 0. 7%ァガロースゲル電気泳動で分画後、 0. 4M NaOHを用いたアル力リブロッテイングにより、ゲルを Hybond— N +ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の 929bpのプロ一ブ（配列番号 17)を用いて、上述のようにサザンノヽイブリダィゼーシヨンを行った。その結果、 EcoRI消化では、 9kbまたはそれ以上のバンドが検出された。一方、 Hindll I消化の場合、全ての DNA、ゲノム DNAともに 4. 6kbのバンドが検出された。そこで、 λ DNAを再度 Hindlllで消化し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 4. 6kb Hi ndlll断片を回収し、プラスミドベクター pBluescript SK (—）の Hindlll部位に、常法に従、クローニングした。

[0111] 次に、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を決定するため、同遺伝子の部分 DNA配列（上述、 929bp :配列番号 17)を基に以下の表 6に示すプライマーを合成した。

[0112] [表 6] 表 6

名称配列 5' -3' 長さ

467-23ST i nRVl TGTTGATAGAGCAACATTACC (配列番号 1 8) 21mer

467-23ST i n V2 TGGTAATACCTTATGGGCAG (配列番号 1 9 ) 20mer

467-23ST i nRV3 GAACAGCAACGGCAGAGC (配列番号 2 0) 18mer

467-Z3ST i nRV4 CTAATTCAATTCAAGGATTGG (配列番号 2 1 ) 21mer

467-23ST i nFW1 TGGTAATGTTGCTCTATCAAC (配列番号 2 2 ) 21tner

467-23ST i nFW2 ACTGCCCATAAGGTATTACC (配列番号 2 3 ) 20mer

467-23STi nFW3 GCTCTGCCGTTGCTGTTC (配列番号 2 4 ) 18mer これらのプライマーを用いて、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genet ic Analyzer, Perkin Elmer製）で、 4. 6kb Hindlll断片の内部塩基配列を解析し、フオトバタテリゥム'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 ex 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の内部、およびその近傍の塩基配列を解析した。その結果、配列表の配列番号 1の配列を得た。この配列は、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467 株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF) の全塩基配列である。最初の ATGの上流には同じ読み枠で、翻訳終止コドンが現れるのでこれ力本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。

[0114] フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の ORFは、 1230塩基力らなり、 409個アミノ酸をコードしていた。このァミノ酸配列を配列表の配列番号 2に示す。このアミノ酸配列は、精製酵素から決定された 4箇所のアミノ酸配列全てを完全に含む。 Ν末のアミノ酸配列の一文字目が解読されて、な力つた力遺伝子から演繹されるこの部分のアミノ酸は Cys (システィン)であった。また成熟タンパクの N末端は、配列表の配列番号 2の配列のうちの第 22番目の Cysであることから、初めの 21アミノ酸力もなる配列は、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥムにおいてはプロセッシングを受け、除去されると考えられた。遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネテイツタス製）を用いて、本発明のフォトバクテリウム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素タンパク質全長、およびその遺伝子全長と、それらのホモローグの全長同士の相同性を解析したところ、アミノ酸配列では、フォトバクテリウム'ダムセラの α 2, 6—シアル酸転移酵素 (JC5898)と 32%の相同性、パスッレラ.ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)と 28%の相同性を有し、そして、遺伝子 DNA配列ではそれぞれと、 53%、 51%の相同性を有していた。

(4)発現ベクターの構築

クローン化した遺伝子が、シアル酸転移活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、および N末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。

[0115] フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7で解析を行ったところ、 N末端の 24アミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長 (本実施例において 467— NOCOと表記する）をクローン化するためのプライマー 467— 23ST— NO— Pci (酉己列番号 27)および 467— 23ST— CO Bm (配列番号 26)、さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子 (本実施例において 467— N2C0と表記する）をクローン化するためのプライマー 467— 23ST— N2— Nco (配列番号 25)および 467— 2 3ST— CO— Bm (配列番号 26)を設計、合成した (表 7)。

[表 7]

名称配列 5' -3' 長さ

467-23ST-N2-NCO GGGCTGTACdAT§GACTCTAAGCACAATAACTCAG (配列番号 2 5 )

467-23ST-C0-Bm CTTAGAATGGATCgFTACTGCAAATCACTTATCAAC (配列番号 2 6 ) 36mer 467-23ST-N0- Pc i AAGGGAATACRfaTTCGTTTTTTGTAAAAAAATA (配列番号 2 7 ) 34mer

クローユング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素 Pcil (467— 23ST— NO - Pci)、 Ncol (467- 23ST-N2- Nco)、 BamHI (467— 23ST— CO— Bm)部位を下線で示した。翻訳開始コドン ATG、翻訳終止コドンに対応する相補配列 TAA を四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、制限酵素部位より 3'側で、铸型 DN Aとアニーリングする部分の配列を太字で示した。 PCR時の铸型 DNAは、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来ひ 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子全長を含む上記 Hindm 4. 6kb断片が組み込まれたプラスミドを用いた。 PCRの反応条件は以下のように設定した。 50 _iu lの反応液中に、铸型DNA 100ng、 10 X

Ex taq buffer 5 1、 2. 5mM 各 dNTP 4 1、プライマー 50pmole、 Ex t aq (タカラバイオ製） 0. 5 1をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700 (ASTEK製）を用いて、 96。C 3分を 1回、 96。C 1分、 50。C 1分、 72。C

2分を 15回、 72°C 6分を 1回行った。その結果、 467— N0C0でおよそ 1. 2kb、 4 67— N2C0でおよそ 1. lkbの PCR産物が増幅された。これらの PCR産物のうち、 4 67— N0C0を制限酵素 PciI (New England Biolab製）と BamHI (タカラバイオ製）で二重消化し、そして、 467— N2C0を制限酵素 Ncol (タカラバイオ製）と BamHIで二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターは pTrc99A (Pharmacia LKB 製)を用いた。このベクターを同じ制限酵素 Pcilと BamHI、または制限酵素 Ncolと B amHIで二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行った PCR産物と Takara Ligation Kit (タカラノィォ製)を用いてライゲーシヨンし、大腸菌 TBIにトランスフエクトした。常法に従いプラスミド DNAを抽出、制限酵素分析し、インサートの組み込みを確認した。 PCR反応による塩基の変化を調べるため、 467—N0C0では二つのクローンを、 467— N2C0では 3つのクローンの全塩基配列を決定した。その結果、 46 7—N0C0においては一つのクローン（ISH467—N0C0第一クローン）で配列番号 1の塩基配列のうち、第 569番目のアデニン (A)がグァニン (G)に変化し、これによりコドンが AACから AGCに変化し、配列番号 2のアミノ酸配列のうち第 190番目のァスパラギン酸 (Asn)がセリン（Ser)に変化していた。 Asnと Serは同じ極性アミノ酸である。一方、もう一つのクローン（ISH467—N0C0第二クローン）では塩基の変化は一つも無ぐ配列番号 1の塩基配列が確認された。次に 3つの 467— N2C0クローンの全塩基配列を決定した。その結果、第一および第二クローンの 2つにアミノ酸置換を伴う塩基の変異が見つ力つた。即ち、 ISH467—N2C0第一クローンでは、配列番号 1の塩基配列の 476番目のチミン (T)がシトシン (C)に変異しており、これによりコドンが TTTから TCTに変わり、 159番目のフエ-ルァラニン（Phe)がセリン（Ser)に置換されていた。 ISH467— N2C0第二クローンでは、配列番号 1の塩基配列の 78 番目のチミン (T)が欠失し、これにより、フレームシフトが起き、正しいタンパク質が翻訳されない。一方、 ISH467—N2C0第三クローンでは、変異は検出されず、配列番号 1のうち第 73番目の塩基力も第 1230番目の塩基までの配列そのものを含んでいた。

)発頊, 活件沏 I

上記（4)で得られた 467— N0C0の 2クローン、 467— N2C0の 3クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクター _PTrc9 9Aをもつ大腸菌 TBIの単一コロニーを、抗生物質アンピシリン (最終濃度 100(gZ mL)を含む LB培地（5ml)に接種し、 A =0. 5程度になるまで 30°Cで菌を前培養

600

し、その後 IPTG (イソプロピル一 β— D (―)—チォガラタトピラノシド、和光純薬工業製)を最終濃度で ImMとなるように加え、 30°Cでさらに 4時間振とう培養した。培養液 2ml中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、 200 1の0. 336%トリトン X— 100および 0. 5M塩化ナトリウムを含む 20mM ビストリス緩衝液（pH7. 0)に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。反応は 2反復で行い、反応組成は実施例 1と同様に行った。但し、反応時間は 15時間とした。その結果、下記の表 8に示すように、 ISH467— N0C0第一クローンの粗酵素液中および ISH467— N0C0第二クローンの粗酵素液中には、糖供与体である CMP— NeuAc中の¹⁴ Cでラベルされた NeuAcを糖受容体基質であるラタトースに転移する因子、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。また、 IS H467—N2C0第一クローンおよび ISH467—N2C0第三クローンの粗酵素液中にもシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。一方、 ISH467— N2C0第二クローンの粗酵素液中および粗酵素液なしの反応液中にはシアル酸転移酵素活性が含まれていなかった。以上の結果から、 ISH467— N0C0第一クローンもしくは第二クローン、または、 ISH467— N2C0第一クローンもしくは第三クローンを導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されていることが明らかとなった。

[表 8]

表 8 : ^1811-467株由来）3—ガラクトシド一な 2,3—シアル酸転移酵素遺伝子を組み換えた大腸 ®¾fe 液中のシアル酸転移酵素活性

(6) a - 2. 3シアル酸転移活件の確認

上記（5)の粗酵素液を用いて、 ISH467— N2C0第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がひ一 2, 3シアル酸転移活性を有するかどうか調ベた。実施例 3と同様に、糖受容体としてピリジルァミノ化ラタトース (Gal 3 l—4Glc 一 PA、タカラバイオ社製 PA— Sugar Chain 026)を用い、酵素反応を行った。反応終了後、 95°Cで 5分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、 HPLC で分析した。なお、酵素反応は、ピリジルァミノ化ラタトースが 2. 0 M、 CMP—シァル酸が 5. 7 Mとなるように、それぞれを 20mM カコジレート緩衝液 (pH6. 0) 25 1中に溶解し、 25°C下で 6時間行った (反応 1)。一方、 CMP—シアル酸を含まない反応液を供試した対照実験 (反応 2)を行った。また、標品の保持時間を明らかにするため、熱処理（95°C、 5分間）によって失活させた粗酵素液をカ卩え、ピリジルァミノ化ラタトースおよびピリジルアミノィ匕 oc 2, 3 シァリルラタトース（ピリジルアミノィ匕 3，一シァリルラタトース）（Neu5Ac a 2— 3Gal j8 1— 4Glc— PA、タカラバイオ製 PA— Sug ar Chain 029)を添カ卩した試験を行った。

[0120] 標品の分析結果 (図 1— 1)から、ピリジルァミノ化ラ外ースの保持時間は 4. 1分、ピリジルアミノィ匕 α 2, 3 シァリルラタトース（ピリジルァミノ化 3， -シァリルラタトース）の保持時間は 5. 4分であることが示された。これにより反応 2 (図 1 3)では検出されない保持時間 5. 3分のピーク（図 1— 2)がピリジルアミノィ匕《2, 3 シァリルラタトース (ピリジルァミノ化 3，一シァリルラタトース）であることが明ら力となった。すなわち、 I SH467—N2C0第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素が α - 2, 3シアル酸転移活性を有することが証明された。

[0121] また、同様に ISH467— NOCO第一クローンおよび第二クローン、ならびに ISH46 7—N2C0第三クローンについても、当該クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素が α—2, 3シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。その結果、大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応において、いずれのクローンについても反応生成物としてピリジルァミノ化 a 2, 3 シァリルラタトース (ピリジルァミノ化 3，一シァリルラタトース）のピークが検出された。よって、これらの酵素が (X - 2, 3シアル酸転移活性を有することが明らかとなった。

¾施例 6 : フォトパクテリゥム通細菌 TT TSH— 224株由 —ガラクトシド、 2 . 3—シアル酸転移酵素遣伝早のクローニング、西 R列解析および該遣伝早の大腸菌での発現，

(1) TT— ISH— 224株の β—ガラクトシド一 α 2. 3 シアル酸転移酵素活性と同酵素遺伝子の存在の確認

実施例 1でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったフォトパクテリゥム JgJT— ISH— 224株において、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467 株由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在するか否かを明らかにするため、ゲノミツクサザンノヽイブリダィゼーシヨンを実施した。実施例 5の（1)に記載した方法で、 JT— ISH— 224株の菌体ペレットからゲノム DNAを調製した。次に実施例 5の（3)に記載した方法により、 JT—ISH— 224株のゲノム DNAを制限酵素 EcoRIまたは Hindmで消化し、 0. 7%ァガロースゲル電気泳動で分画後、 0. 4M NaOHを用いたアルカリブロッテイングにより、ゲルを Hybond—N +ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の JT— ISH— 467株由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（929 bp ;配列番号 17)をプローブとして用いて、実施例 5の（3)に記載した方法でサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。ただしハイブリダィゼーシヨン温度、および洗浄処理の温度は、 55°Cとした。その結果、 EcoRI消化では、 16kbのバンドが検出された。一方、 Hindm消化の場合、 5kbと 2. 7kbのバンドが検出された。この結果から、 JT — ISH— 224株に ίお T— ISH— 467株由来の α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明ら力となった。

(2) TT— ISH— 224株由 « 2. 3—シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング次に、 JT— ISH— 224株のひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子のクローユングを行つた。実施例 5の（1)に記載した方法により、 JT— ISH— 224株のゲノム DNAから、 1 DASH II (Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。 JT—ISH— 4 67株由来《2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（929bp ;配列番号 17)をプローブに用い、 JT—ISH— 224株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、実施例 6の（1)と同様にハイブリダィゼーシヨン、および洗浄の温度は 55°Cとした。その結果、プラーク精製を兼ねた二次選抜までに、 12クローンを得、うち 6つのえ D NAを、実施例 5の（3)のよう〖こ QIAGEN Lambda Mini Kit (キアゲン製）を用いて精製した。さらにこのうち 3クローンの DNAサンプル、および JT— ISH— 224株の全ゲノム DNAについて、制限酵素 EcoRIまたは Hindlllで消化した。消化物をァガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、 JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（929bp ;配列番号 17)をプローブに用い、サザン分析を行った。ハイプリダイゼーシヨン、洗浄の温度は 55°Cとした。その結果、 EcoRI消化の場合、 12kbまたはそれ以上のバンドが検出されたのに対し、 Hindlll消化の場合は、 3つ全ての λ DNAサンプル ^JT— ISH— 224株の全ゲノム DNAに関して、 5kbと 2. 7kbの二本のバンドが検出された。そこでえ DNAサンプルを再度 Hindlllで消化し、これら 5kb と 2. 7kbの二本の DNA断片をゲル精製し、プラスミドベクター pBluescript SK (— )の Hindlll部位に常法に従、クローユングした。

[0122] 次に、これらのクローンに関して、 Ml 3プライマー（タカラバイオ製）を用いて、 ABI

PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、 5kb Hindlll断片と 2. 7kb Hindlll断片の両端の塩基配列を決定した。その結果、 5kb断片の片側の DNA配列、および 2. 7kbの片側の DNA配列力も推定されるァミノ酸配列が、データベース検索の結果ともに、シアル酸転移酵素と相同性を示した。 JT ISH— 224株の同酵素の 1遺伝子の DNAを完全に決定するため、 Hindlll 2 . 7kb断片カゝら得られた DNA配列を基に、下記の表 9のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。

[0123] [表 9]

表 9

名称長さ

224-23ST- i nRV1 CAGGAACTGCAACAGCAGAG (配列番号 3 4 ) 20mer

[0124] その結果、配列表の配列番号 28の配列を得た。この配列は、 JT ISH— 224株由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF)の全塩基配列である。最初の ATGの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。フォトパクテリゥム属 JT— 1311— 224株由来0；2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子の ORFは、フォトバクテリウム' フォスフォレゥム JT—ISH—467株由来 ex 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のそれと同様に、 1230塩基からなり、 409個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号 29に示す。遺伝子内部には Hindlll部位を有していた。 GENE TYX Ver. 7を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、 JT— ISH— 224株由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子は、 JT ISH— 467株由来 α 2, 3— シアル酸転移酵素遺伝子と 92%の相同性を有してヽた。またアミノ酸配列でも、 JT — ISH— 467株由来《2, 3 シアル酸転移酵素と 92%の相同性を示した。さらに、 JT— ISH— 224株由来《2, 3 シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フォトバタテリゥム.ダムセラの a 2， 6 シアル酸転移酵素 (JC5898)と 33%の相同性、パスッレラ •ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272) と 29%の相同性を示し、遺伝子 DNA配列ではそれぞれと、 54%、 50%という相同性であった。

[0125] (3)発現ベクターの構築

クローンィ匕した遺伝子力、シアル酸転移酵素活性を有する力否かを調べるため、同遺伝子の全長、および N末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。

[0126] 11 1311— 224株由来0；2, 3 シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7で解析を行ったところ、 N末端の 24ァミノ酸力シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長 (本実施例において 224— NOCOと表記する）をクローン化するためのプライマー 224— 23ST— NO— Pci (配列番号 35)、 224— 23ST— COnew— Bm (配列番号 37)、さらにシグナルぺプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子 (本実施例において 224— N1COと表記する）をクローン化するためのプライマー 224— 23ST N1— Nco (配列番号 36)、 224— 23ST— COnew— Bm (配列番号 37)を設計、合成した (表 10)。

[0127] [表 10] 名称配列 5' -3' 長さ

224-Z3ST-NQ-Pc i AAGGGAATAOAJGlTTCGTTTTTTGTAAAAAAATG (配列番号 3 5 ) 34mer

224-23ST-N1-Nco GGGATGTAC^TQGACTCTAATCACAATAACTCAG (配列番号 3 6 ) 35mer

224-23ST-C0new-Bm ATTAAAATGGATCqTTACTGCAAATCACTTATCAAC (配列番号 3 7 ) 36mer

[0128] クローユング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素 Pcil (224— 23ST— NO

- Pci)、 Ncol (224- 23ST-N1 - Nco)、 BamHI (224— 23 ST- COnew- Bm )部位を下線で示した。翻訳開始コドン ATG、および翻訳終止コドンに対応する相補配列 TAAを四角で囲んだ。さらに、プライマー配列のうち、铸型 DNAとアニーリングする部分の配列を太字で示した。プライマー 224— 23ST— NO— Pciの場合、後のクロー-ング用に Pcil部位を導入したことで、翻訳開始コドン ATG直後のシトシン (C )がチミン (T)に置換される。このため、翻訳開始メチォニンの直後のアミノ酸配列がロイシン（Leu)力らフヱ-ルァラニン（Phe)に置換される。 Leuと Pheは同じ疎水性のアミノ酸であること、この部分はシグナルペプチド領域であることから、この変異によつて酵素活性に大きな変化をもたらす可能性は低いと判断した。

続いて PCRを行い、発現ベクターに組み込むための JT—ISH— 224株由来 α 2,

3—シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。铸型 DNAは、 JT— ISH— 224株由来 oc 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子を含む上記え DNAを用いた。 PCRの反応条件は以下のように設定した。 50 1の反応液中に、铸型 DNA 100ng、 10 X Ex taq buffer 5 1、2. 5mM 各 dNTP 4 ΐ、プライマー 50pmole、 Ex taq (タカラバィォ製） 0. 5 1をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700(A STEK製）を用いて、 96。C 3分を 1回、 96。C 1分、 50。C 1分、 72。C 2分を 15回、 72°C 6分を 1回行った。その結果、 224— NOCOでおよそ 1. 2kb、そして 224— N1 COでおよそ 1. lkbの PCR産物が増幅された。これらの PCR産物を、制限酵素 Pcil ( New England Biolab社製）と BamHI (224— NOCOの場合）、または制限酵素 Ncolと BamHI (224— N1C0の場合)で二重消化した後、ゲル精製した。大腸菌発現用べクタ一は pTrc99Aを用いた。このベクターを同じ制限酵素 Pcilと BamHI (224— NO COを導入する場合）、または制限酵素 Ncolと BamHI (224— N1C0を導入する場合)で二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行った PCR産物と Takara Li gation Kit (タカラバイオ製)を用いてライゲーシヨンし、大腸菌 TBIにトランスフエタトした。常法に従いプラスミド DNAを抽出、制限酵素分析して、インサートの組み込みを確認し、そして 224— NOCO (ISH224— NOCO第一クローン）、ならびに 224— N 1C0 (ISH224— N1C0第一クローン）の全塩基配列を確認した。その結果、 ISH22

4— N0C0第一クローンにおいては、上述の Leuから Pheへの置換が確認されたが、それ以外は塩基配列の変異はな力つた。同様に ISH224— N1C0第一クローンの場合は、塩基配列の変異はなぐ所望の塩基配列、即ち配列表の配列番号 28のうち、第 73番目の塩基力も第 1230番目の塩基までを含んでいた。実施例 5 (5)と同様に、 ISH224—N0C0第一クローンおよび ISH224— N1CO第一クローンの 2クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表 11に示すように、 ISH224—N0C0第一クローンおよび IS H224—N1C0第一クローンの粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。

[0130] [表 11] 表 1 1 ： JTISH-224株由来 JTHSH-467 J9—ガラクトシド α 2,3—シアル酸転移酵素遺伝子ホモ口一グを組み換えた菌の破液中のシァル酸転移酵素活性

[0131] (5) - 2. 3シアル酸転移酵素活件の確認

実施例 5 (6)と同様に、 ISH224—N0C0第一クローンおよび ISH224— N1C0第一クローンをそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルァミノ化ラタトースを糖受容体として用いる反応により、 α - 2, 3シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物を HPLCにより評価した結果、いずれのクローンを用いた反応についてもピリジルアミノィ匕 α 2, 3 シァリルラクトース (ピリジルァミノ化 3，—シァリルラタトース）のピークが検出された。この結果から、 JT— ISH— 224株由来のシアル酸転移酵素が α— 2, 3シアル酸転移活性を有することが明ら力となった。

実施例 7 : ビブ' Jォ属細菌 ΤΤ FAT— 16株由 β ガラクトシド'一《 2. 3 シァル酸転移酵素遺伝子のクローユング塩某 §R列解析、および当該遺伝子の大腸菌での発現

( 1) TT FAT— 16株の β ガラクトシド ' α 2. 3 シアル酸転移酵素活件同酵素遺伝子の存在の確認

実施例 1でシアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったビブリオ属 JT— F AJ— 16株において、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α

2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在する力否かを明らかにするため、ゲノミツクサザンノ、イブリダィゼーシヨンを実施した。実施例 5の（1)に記載した方法で、 JT— FAJ— 16株の菌体ペレットからゲノム DNAを調製した。次に実施例 5の（3) に記載した通り、制限酵素 EcoRI、 Hindlllで消化し、 0. 7%ァガロースゲル電気泳動で分画後、 0. 4M NaOHを用いたアルカリブロッテイングにより、ゲルを Hybond —N +ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。このフィルターに関して、上記の 929bpのプローブ（配列番号 17)を用いて、実施例 5 の（3)に記載した方法でサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。ただしハイブリダィゼーシヨン温度、および洗浄処理の温度は、 55°Cとした。その結果、 EcoRI消化で、

3. 6kbのバンド力 Hindlll消化で、 7kbのバンドが検出された。即ち JT— FAJ— 16 株に ίお T— ISH— 467株由来のひ 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のホモローグが存在することが明らかとなった。

[0132] (2) TT—FAT—16¾ fe a 2. 3 シアル酸転移酵素遺伝子のクローニング

次に、 JT FAJ— 16株の ex 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングを行つた。実施例 5の（1)に記載した方法で、 JT— FAJ— 16株のゲノム DNAから、 λ DAS H II (Stratagene製）を用いて、ゲノムライブラリーを構築した。 JT—ISH— 467株由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片（929bp ;配列番号 17)をプローブに用い、 JT—FAJ— 16株のゲノムライブラリーをスクリーニングした。ただし、ハイプリダイゼーシヨン実験は ECL direct labelling & detection system (アマシャムバイオサイエンス製)を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブを作成した。ハイプリダイゼーシヨンは、キット中のハイブリダィゼーシヨンバッファーにブロッキング試薬を 5 % (wZv)、 NaClを 0. 5Mになるように加え、 37°Cで 4時間行った。洗浄は、 0. 4% SDS、 0. 5X SSC中で、 50。Cで 20分を 2回、 2X SSC中で室温、 5分を 1回行つた。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。

[0133] その結果、プラーク精製を兼ねた一次選抜で、 12クローンを得、うち 6つの λ DNA を、実施例 5の（3)のように QIAGEN Lambda Mini Kit (キアゲン製）を用いて精製した。さらにこれらの DNAサンプル、および JT— FAJ— 16株の全ゲノム DNAに関して、制限酵素 EcoRIで消化した。消化物をァガロースゲル電気泳動で分画し、上述の様にナイロンメンブレンフィルターに転写した。このフィルターを用いて、 JT— ISH— 467株由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の部分断片 (929bp ;配列番号 17) をプローブに用い、 ECLシステムを用いて、上述と同じ条件でサザン分析を行った。その結果、 6つ全ての λ DNAサンプル ^JT— FAJ— 16株の全ゲノム DNAについて、 3. 6kbのバンドが検出された。そこでえ DNAサンプルを再度 EcoRIで消化し、この 3. 6kbの DNA断片をゲル精製し、プラスミドベクター pBluescript SK (—）の Ec oRI部位に常法に従、クローユングした。

[0134] 次に、 JT— FAJ— 16株由来《2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子を含むと考えられた EcoRI 3. 6kb断片に関して、 Ml 3プライマー（タカラバイオ製）を用いて、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製）で、両端の塩基配列を決定した。その結果、片側の端の DNA配列から推定されるアミノ酸配列が、データベース検索でフォトバタテリゥム 'ダムセラの α 2, 6—シアル酸転移酵素 (JC5898)と 27%の相同性を示した。 JT— FAJ— 16株の α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を完全に決定するため、 EcoRI 3. 6kb断片力得られた DNA配列を基に、下記の表 12に記載のプライマーを合成し、塩基配列決定に用いた。

[0135] [表 12] 表 1 2

名称配列 5' - 3' 長さ

FAJEC3.6RV1 TTC AAA ACT GCC TGA GTC AG (配列番号 3 8 ) 20 mer

FAJEc3. 6RV2 ATT TCA TGG TCT AGA TAC CC (配列番号 3 9 ) 20 mer

[0136] 得られた塩基配列データ力さらに以下の表 13に記載のプライマーを設計、合成し

、全塩基配列の決定を行った。

[0137] [表 13] 表 1 3

名称配列 5' 3' 長さ

FAJ23ST i nFW3 CTG ACT CAG GCA GTT TTG AA (配列番号 4 0 ) 20me r

FAJ23STi nFI*l4 GAA AGC AAC TCT CTC AAT GGG (配列番号 4 1 ) 21mer

FAJ23STi nRV3 ATA AAC CCA TTG AGA GAG TTG (配列番号 4 2 ) 21mer

[0138] その結果、配列表の配列番号 30の配列を得た。この配列は、 JT一 FAJ— 16株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF)の全塩基配列である。最初の ATGの上流には同じ読み枠で翻訳終止コドンが現れるので、これが本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。 JT一 FAJ— 16株由来 _α 2 , 3—シアル酸転移酵素遺伝子の ORFは、 1209塩基力もなり、 402個アミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号 31に示す。 GENETYX Ver. 7を用いて核酸、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、 JT一 FAJ— 16株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子は、 JT— ISH— 467株および JT— ISH— 224株由来《2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子と、それぞれ 69. 7%および 68%の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、それぞれ、 64. 7%および 64. 8%の相同性を示した。さらに、 JT—FAJ—16株由来 _α 2, 3—シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、フオトバタテリゥム 'ダムセラの α 2, 6—シァノレ酸転移酵素 (JC5898)と 30. 5%の相同性、パスッレラ 'ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)と 27. 3%の相同性を示し、遺伝子 DNA配列ではそれぞれと、 51. 2%, 48. 3%という相同性であった。

[0139] (3)発現ベクターの構築

クローンィ匕した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するか否かを調べるため、同遺伝子の全長、および N末端側のシグナルペプチド部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。

[0140] JT一 FAJ— 16株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7で解析を行ったところ、 N末端の 22ァミノ酸が、シグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長 (本実施例において FAJ— NOCOと表記する）をクローン化するためのプライマー FAJ23STNO— Bsp HI (配列番号 43)、 FAJ23STCO— BamHI (配列番号 45)、さらにシグナルぺプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子 (本実施例において FAJ— N1COと表記する）をクローン化するためのプライマー FAJ23STN1— Bs pHI (配列番号 44)、 FAJ23STCO— BamHI (配列番号 45)を設計、合成した（表 1 4)。

[表 14] 表 1 4

名称配列 5' -3' 長さ

FAJ23STN0-BspHI TGGATAACTC ιΑΑΑ ACATTATAACAAAAAGAATG (配列番号 4 3 ) 37mer FAJ23ST 1- BspHI TATTATCGTC ACA ATGATAACAGCACTACC (配列番号 4 4 ) 3½er FAJ23STC0-BamHl TCTTTTTAGG ATCC ^ATGTCGCTGATTAGHTTAT (配列番号 4 5 ) 38mer クロー-ング用にプライマーに予め組み込んだ制限酵素 BspHI (FAJ23STNO- BspHI、 FAJ23STN1— BspHI)、 BamHI (FAJ23STCO— BamHI)部位を下線で示した。翻訳開始コドン ATG、翻訳終止コドンに対応する相補配列 TAAを四角で囲んだ。さら〖こ、プライマー配列のうち、铸型 DNAとアニーリングする部分の配列を太字で示した。これらのプライマーを用いて PCRを行い、発現ベクターに組み込むための JT— FAJ— 16株由来《2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子を増幅した。铸型 DN Aは、同遺伝子を含む上記 3. 6kbの DNA断片を用いた。 PCRの反応条件は以下のよう【こ設定した。 50 1の反応液中【こ、録型 DNA 300ng、 10 X Ex taq buff er 5 1、2. 5mM 各 dNTP 4 ΐ、プライマー 50pmole、 Ex taq (タカラバイオ製） 0. 5 1をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700 (AS TEK製;)を用いて、 96。C 3分を 1回、 96。C 1分、 50。C 1分、 72。C 2分を 10回、 72°C 6分を 1回行った。その結果、 FAJ— NOCOでおよそ 1. 2kb、 FAJ— N1C0でおよそ 1. lkbの PCR産物が増幅された。これらの PCR産物を、 TAクロー-ング用ベクター pCR2. 1TOPO (Invitrogen製）に、 TAクロー-ングキット（Invitrogen製）に添付された説明書に従って、クローユングした。大腸菌は TBIを使用した。得られたコロニーから常法でプラスミドを精製し、制限酵素 EcoRIで PCR産物のベクターへの導入を確認した。導入の確認されたプラスミドサンプルを、制限酵素 BspHIと BamHI で二重消化した後、 1. 2kb (FAJ— NOCO)または 1. lkb (FAJ— N1CO)断片をゲル精製した。これらの DNAサンプルを、予め制限酵素 Ncolと BamHIで二重消化した大腸菌発現用ベクター pTrc99Aに、 Takara Ligation Kit (タカラバイオ製）を用いてライゲーシヨンし、大腸菌 TBIに組み込んだ。常法に従いプラスミド DNAを抽出、制限酵素分析を行いインサートの組み込みを確認し、 FAJ— N0C0の代表クローン 1 つ（FAJ— N0C0第一クローン）ならびに FAJ— N1C0の代表クローン 2つ（FAJ—N 1C0第一クローンおよび FAJ— N1C0第二クローン)の全塩基配列を確認した。その結果、 FAJ— N0C0第一クローンの場合、塩基配列の変異はなぐ所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号 30のうち、第 1番目の塩基力も第 1209番目の塩基までを含んでいた。一方、 FAJ— N1C0の場合、その第一クローンには塩基配列の変異はなぐ所望の塩基配列、即ち、配列表の配列番号 30うち、第 67番目の塩基力も第 12 09番目の塩基までを含んでいた。第二クローンでは、配列番号 30の塩基のうち、第 631番目のアデニン (A)がグァニン（G)に変化していた。これによりコドンが ACAから GCAに変化し、アミノ酸がスレオニン (Thr)からァラニン (Ala)に変化していた。これ以外には塩基置換は存在しな力つた。

[0143] (4) mmm ^wm\^

実施例 5 (5)と同様に、 FAJ—N0C0第一クローン、 FAJ— N1C0第一クローンおよび第二クローンの 3クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行い、酵素活性を測定した。その結果、下記の表 15に示すように、 FAJ—N0C0第一クローンならびに FAJ— N1C0第一クローンおよび第二クローンの粗酵素液中にシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。

[0144] [表 15] 表 1 5 : JT- FAJ - 16株由来 JT-ISH - 467 j3—ガラクトシド一 α 2， 3—シァル離≤^¾¾1伝子ホモローグを組えた;^菌の破赚中のシァル職云移酵^ ·;&!生

(5) α - 2. 3シアル酸転移活性の確認

実施例 5 (6)と同様に、 FAJ—N0C0第一クローン、ならびに、 FAJ— N1C0第一クローンおよび第二クローンの 3クローンをそれぞれ大腸菌に導入して酵素を発現させ、ピリジルァミノ化ラタトースを糖受容体として用いる反応により、 α - 2, 3シアル酸転移酵素活性を調べた。大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素による反応生成物を HPLCにより分析した結果、、ずれのクローンを用いた反応にぉヽてもピリジルァミノィ匕《2, 3—シァリルラタトース（ピリジルァミノ化 3，一シァリルラタトース）のピークが検出された。この結果から、 JT—FAJ— 16株由来のシアル酸転移酵素が α—2, 3シァル酸転移活性を有することが明らかとなった。

¾施例 8：各糠シアル酸転移酵素タンパク皙のアミノ酸西 R列のマルチアライメント分近

遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネテイツタス社製）を用いて、マルチアライメント分析を行った。その結果、フォトバタテリゥム'フォスフォレゥム JT— IS H— 467株由来、フォトバタテリゥム属 JT—ISH— 224株由来、およびビブリオ属 J T— FAJ— 16株由来の a 2, 3—シアル酸転移酵素（それぞれ配列番号 2、 29、 31) 、フォトバタテリゥム 'ダムセラの a 2, 6—シアル酸転移酵素 (JC5898)、ならびに、パスッレラ 'ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PMO 188 ( AAK 02272)は図 2のようなアラインメントを示した。なぉ、11ー1311—467株由来0；2, 3 —シアル酸転移酵素についての下線は精製タンパク質力も決定されたアミノ酸配列を示す。

実施例 9 : β ガラクトシドー α 2. 3 シアル酸転移酵素の酵素活性の至谪 ΌΗおよび至谪温度

調製した精製酵素を用い、 JT—ISH— 467株が生産する |8—ガラクトシド— ひ 2, 3 —シアル酸転移酵素、 ISH467—N2C0第三クローン、 ISH224— N1CO第一クローン、および FAJ— N1C0第一クローンが生産する糸且換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 ーシアル酸転移酵素の至適 pHおよび至適温度を調べた。

(1)酵素活件の至谪 ΌΗ

酢酸バッファー（ρΗ4. 0、 ρΗ4. 5、および ρΗ5. 0)、力コジル酸バッファー（ρΗ5. 0、 ρΗ5. 5、 ρΗ6. 0、 ρΗ6. 5、および pH7. 0)、ジン酸ノッファー（pH7. 0、 pH7. 5、および pH8. 0)、 TAPSノッファー（pH8. 0、 pH8. 5、および pH9. 0)、 CHES ノッファー（pH9. 0、 pH9. 5、および pH10. 0)、 GAPSノッファー（pH10. 0、 pH 10. 5、および pHl l . 0)を調製し、これを用いて 25°Cで各 pHにおける酵素活性を測定した。

[0146] その結果、図 3—1および図 3— 2に示すように、 JT—ISH—467株が生産する |8 —ガラタトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素では ρΗ5. 0において、 ISH467— Ν2 CO第三クローンでは ρΗ5. 5において、 ISH224— N1C0第一クローンでは ρΗ5. 0 において、 FAJ— N1C0第一クローンでは ρΗ5. 5において、酵素活性が最大であつた。そして、いずれの酵素でも ρΗ5. 0〜ρΗ7. 0あるいは ρΗ9. 0まで高い活性であつた。なお、各 pHにおける酵素活性は最大活性を示した pHにおける酵素活性を 10 0とする相対活性で示した。

(2)酵素活件の至;商温度

11 1311—467株が生産する|8—ガラクトシドー0；2, 3 シアル酸転移酵素では ρΗ5. 0において、 ISH467— N2C0第三クローンでは力コジル酸バッファー（ρΗ5. 5)を用いて、 ISH224— N1C0第一クローンでは力コジル酸バッファー（ρΗ5. 0)を用いて、 FAJ— N1C0第一クローンでは力コジル酸バッファー（ρΗ5. 5)を用いて、 5 °Cから 45°Cまでの 5°C毎の反応温度にお!、て、酵素活性を測定した。

[0147] その結果、図 4—1および図 4— 2に示すように、 JT—ISH— 467株が生産する |8 ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素では 25°Cにおいて、 ISH467— N2C0 第三クローンでは 25°Cにおいて、 ISH224— N1 CO第一クローンでは 30°Cにおいて、 FAJ— N 1C0第一クローンでは 20°Cにおいて、酵素活性が最大であった。そして、、ずれの酵素でも 15°Cあるいは 20°C〜30°Cあるいは 35°Cまで高、活性であつた。なお、温度における酵素活性は最大活性を示した温度における酵素活性を 100 とする相対活性で示した。

実施例 10 : β ガラクトシドー α 2. 3 シアル酸転移酵素の皙量分析

フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株が生産する 13—ガラタトシド - « 2, 3 シアル酸転移酵素、ならびに、 ISH467— N0C0第二クローン、 ISH46 7— N2C0第三クローン、 ISH224— N 1C0第一クローン、および FAJ— N1 C0第一クローンが生産する組換えガラクトシドー _α 2, 3 シアル酸転移酵素の精製酵素を、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置 (株式会社島津製作所 MALDI-T OFMS AXIMA-CFR)によって質量分析した結果、分子量はそれぞれ 45, 026Da、 45 , 023Da、 44, 075Da、 43, 996Da、および 43, 921Daであった。

ISH467— N2C0第三クローン、 ISH224— N1C0第一クローン、および FAJ— N 1C0第一クローンについては、質量分析の結果とアミノ酸配列から推定された分子量は一致した。しかしながら、フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株が生産する j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素、および ISH467— N0C 0第二クローンにつ、ては、質量分析の結果とアミノ酸配列力推定された分子量は一致しなかった。これは、これらの二つの酵素のアミノ酸配列にリポボックスと呼ばれる共通配列（Leu— Gly— Gly— Cys :配列番号 2のアミノ酸残基 19〜22)が含まれるため、細菌内で、この共通配列の Cysのァミノ末端側で切断され、リポボックス中の Cysに脂質が付カ卩されたためとと考えられる（Madan Babu, M. and Sankaran, K. , Bioi nformatics. , 18, 641-643 (2002)) ₀

実窗列 1 1：組椽ぇ β ガラクトシド' a 2. 3 シアル酸転移酵素の容体皙特 ¾件 (単糖'二糖街'三糖街)の比較

(材料および方法）

ISH467— N2C0第三クローン組換え大腸菌、 ISH224— N 1C0第一クローン組換え大腸菌、および FAJ—N1CO第一クローン組換え大腸菌カゝら調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製した j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖、二糖類および三糖類へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。

各糠の糖容体某皙を用いたシアル酸転移反

反応溶液 24 μ 1中に、糖供与体基質 CMP— ¹⁴ C— NeuAcを含む CMP— NeuAc (21. 9nmol、反応溶液中での最終濃度： 0. 874mM)、 20mM力コジル酸緩衝液（ pH5. 0)で溶解した各種糖受容体基質（1 μ mol、反応溶液中での最終濃度: 42m M)、シアル酸転移酵素（酵素量は表脚注に示した）、 NaCl (反応溶液中での最終濃度： 500mM)からなる反応溶液を調製し、表脚注の条件で反応した。なお、糖受容体基質として用いた単糖は、メチルー a—D ガラクトピラノシド (Gal— a— OMe) 、メチル一 13—D ガラクトピラノシド（Gal— β—OMe)、メチル一 a—D—ダルコビラノシド（Glc— a - OMe)、メチル一 j8— D—ダルコビラノシド（Glc— β - OMe)、メチノレ一 a—D マンノピラノシド（Man— a—OMe)、メチノレ一 β—D マンノピラノシド (Man- β - OMe)、メチルー α— D フコシノピラノシド（Fuc— a - OMe)、メチルー β—D フコシノピラノシド（Fuc— β— OMe)、 Ν ァセチルガラタトサミン（GalNAc) 、 N ァセチルダルコサミン (GalNAc)の 10種類を用いた。二糖類として、ラタト一ス（ Gal- β 1 ,4— Glc)、 Ν—ァセチルラクトサミン（Gal— β 1 ,4— GlcNAc)、メチルー j8 - D ガラタトピラノシル一 β 1 , 3— Ν ァセチルダルコサミニド（Gal— β 1 ,3— GlcNAc - β—OMe)、メチル一 oi—D ガラタトピラノシル一 a 1 , 3 ガラクトピラノシド（Gal a 1 ,3— Gal— a—OMe)、メチルー β D ガラクトビラノシルー β 1 , 3 ガラタトビラノシド（Gal— j8 1 ,3— Gal— j8— OMe)の 5種類を用いた。三糖類として、 2'—フコシルラタトース（Fuc- α 1 ,2- Gal j8 1 ,4- Glc )の 1種類を用いた。但し、表 18に示す糖鎖、メチル一 (X—D ガラタトピラノシル一 a 1 , 3 ガラクトピラノシド（Gal— « 1 ,3— Gal- a—OMe)、メチル一 β—D—ガラタトピラノシル一 j8 1 , 3—ガラクトピラノシド（ Gal- β 1 ,3— Gal— β—OMe)および 2'—フコシルラクトース（Fuc— α 1 ,2— Ga jS 1 ,4— Glc)については最終濃度 8. 4mMで反応させた。 [0150] 酵素反応終了後、反応溶液に 1. 98mlの 5mMリン酸バッファー（pH6. 8)を添カロして酵素反応を停止した。その後、 5mMリン酸バッファー (pH6. 8)で希釈した酵素反応溶液（2ml)を、 AGl - X 2Resin(PO ³-フォーム、 0. 2 X 2cm)カラムに供した

4

。このカラムは、 AG1— X 2Resin(OH- form、 BIO- RAD社製）を 1Mリン酸バッファ一 (pH6. 8)に懸濁し、 30分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して作成した。このカラムの溶出液 (0〜2ml)の放射活性を測定した。このカラムの溶出液には、反応で生じた¹⁴ C— NeuAc (N ァセチルノイラミン酸）が結合した反応生成物および未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応の CMP— ¹⁴ C NeuAcはカラムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖由来の¹⁴ Cの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性カも酵素活性を算出することができる。

[0151] 上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移された NeuAcの放射活性を測定して転移されたシアル酸を算出した。

(腿

今回糖受容体基質として用いた 16種類の単糖、二糖、三糖のいずれにも高効率でシアル酸が転移していることが明ら力となった (表 16、表 17および表 18)。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラタトースに対するシアル酸転移活性を 100とした値である。

[0152] [表 16]

表 16：受容体基質特異性（その 1 )

反応条件

as*威:

1 iimo 1受容体基質 (20mM力コジル ¾ 'ッファー、 Η5.0) 11.8 μΐ

CMP」⁴C-NeuAcを含む CMP- NeuAc(21 i )l (約 HWOOcpm) ) 4.S μΐ 酵素液 5 _μι i.

5 H NaCl 2.4 μΐ 反応纖： 2 O :

反応時間： 14時間

表 17 _:受容体基質特異性（その 2)

反応条件

反賊:

I NITIO 1受^:基質 (20mM力コジレ酸ハ 'ッファー、 pH5.0) CMP—^l4C-NeuAc "giiCMP- iAc(21.9rai)l (¾J18500cpm) ) 酵纖

5 M NaCl

m &： 3 o

反応時間： 0. 5分間または 2分間

酵素量：反応当り ISH4fi7- N2C0では 2 , 3mU、 ISH224-NIC0では 1.

表 1 8：受容体基質特異性（その 3 )

反応条件

誠:

0. 2 πι ο 1 §¾C体基質 (20ΕΜ力コジル酸バッファ一、 pEB. O)

CMP-^I4C-NeuAcを含む CMP- NeuAc (21.9mol (約 18500cpra) )

酵素液

5 NaCl

反応謎： 3 0 "€

反応時間： 2分間

酵素量：反応当り ISH467- N2C0では 2 . 3mU、 ISH224-N1C0では 1 .

[0155] ¾施例 1 2 ¾ fi —ガラクトシド、— " 2. 3—シアル酸転移酵素の糖タンパク皙にする

ISH467— N2C0第三クローン組換え大腸菌、 ISH224— N1CO第一クローン組換え大腸菌および FAJ—N1CO第一クローン組換え大腸菌力調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製した j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素を用いて、糖タンパク質へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。

[0156] 糖受容体基質として、ァシァ口フェツインを用いた。 2mgのァシァ口フェツインを lml の 20mM Bis-tris緩衝液 (pH6. 0)に溶解させて、糖受容体基質溶液とした。糖供与体基質として CMP— ¹⁴C NeuAcを含む CMP— NeuAcを用、た。糖受容体基質溶液 40 1、糖供与体基質 5 1 (22. 8nmol (約 19, OOOcpm) )、酵素溶液 5 1 ( いずれも 10mU)を混合して、 25°C、 2時間インキュベートしてシアル酸転移反応を行った。反応終了後、反応溶液を 0. 1M塩ィ匕ナトリウムで平衡ィ匕したセフアデックス G —50スーパーファイン（0. 8x18. Ocm)に供して、ゲルろ過を行った。糖タンパク質が含まれるゲルろ過の溶出液画分（2〜4mlの画分)を集め、この画分の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターを用いて測定することで、糖受容体基質に転移したシアル酸の定量を行つた。

[0157] その結果、表 19に示すように、いずれの酵素もァシァ口フェツインにシアル酸を転移することが明らかとなった。

[0158] [表 19] 表 1 9 _:受容体基質特異性（その 4)

反応条件

腿城：

ァシァ口フェツイン^ ¾ 10 μΐ 酵素液 5 μΐ

5mM CMP-シァ (20ι 力コシっ t¾iiffi¾(pH5)中） +¹⁴C- CMP-シ L 5 ul

[0159] ¾施例 fi —ガラクトシド、— " 2. 3—シアル酸転移酵素の P A糖鎖に針する '

ISH467— N2C0第三クローン組換え大腸菌、 ISH224— N1CO第一クローン組換え大腸菌および FAJ—N1C0第一クローン組換え大腸菌力調製した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドまで精製した j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素を用いて、 ΡΑ糖鎖へのシアル酸の転移活性の有無を調べるために、以下の実験を行った。

[0160] 実施例 3と同様に、糖受容体としてピリジルァミノ化ラタトース（Gal |8 1— 4Glc— ΡΑ 、タカラバイオ社製 PA— Sugar Chain 026)、ピリジルァミノ化 GM1- pentasacchari de (Gal β 1- 3GalNAc β 1- 4(Neu5Ac a 2- 3)Gal β 1- 4Glc- PA、タカラバィォ社製 PA— Sugar Chain 032)およびピリジルァミノ化 GDlb- hexasaccharide (Gal j8 l-3GalNA c β l-4(Neu5Ac a 2- 8Neu5Ac a 2- 3)Gal β 1- 4Glc- PA、タカラバィォ社製 PA— Suga r Chain 034)を用い、表脚注の条件で、酵素反応を行った。反応終了後、 95°C で 5分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、 HPLCで分析した。

[0161] その結果、 PA— Sugar Chain 026を受容体基質にした場合、いずれの酵素においても、 PA— Sugar Chain 029標品と同一溶出時間のピークが検出された。同様にして、 PA— Sugar Chain 032を受容体基質にした場合には PA— Sugar Chain 033標品と同一溶出時間のピーク力 PA— Sugar Chain 034を受容体基質にした場合、 PA— Sugar Chain 036標品と同一溶出時間のピークが、それぞれ検出された。従って、 JT— ISH— 467株由来、 JT— ISH— 224株由来および JT — FAJ— 16株由来の組換え |8—ガラクトシド《2, 3 シアル酸転移酵素は、供試した PA糖鎖の非還元末端にあるガラクトースに、シアル酸を《2, 3結合で転移する活性を有することが明らかとなった。

[0162] [表 20]

TO滅：

ΡΑ» (10 pmol/μΐ) 2. 5 μΐ

5mM CMP—シア ^ (2GinMカコジ JL ^¾fg(pH5)中） 5 μΐ

3 NaCl 2. 5 _μ1

酵素液 5 μΐ (0. lmU) 反応髓： 2 0

¾δ時間： ISH467- N2C0では 3時間、 ISH224- N1C0では 1 6時間、 FAJ-N1C0では 2 4時間産業上の利用可能性

[0163] 本発明は、新規な β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされてきている糖鎖の合成 ·生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多ぐ糖鎖機能という観点力ゝら極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高ヽ酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発に利用することが可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。

[2] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列において、 1またはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付加を含むアミノ酸配列を含んでなり、そして、 β—ガラクトシド— ひ 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。

[3] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、そして、 j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。

[4] 配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73

1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸によってコードされ、そして、 j8—ガラクトシドー α 2 , 3—シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。

[5] 配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73

1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む核酸によってコードされ、そして、 j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。

[6] ビブリオ科微生物由来である、請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の単離されたタンパク質。

[7] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、単離された核酸。

[8] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列において、 1またはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であつて、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸。

[9] 配列番号 2、配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409、配列番号 29、配列番号 29のァミノ酸残基 25— 409、配列番号 31、および、配列番号 31のアミノ酸残基 23— 402からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも 60%の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸。

[10] 配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73

1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列を含んでなる単離された核酸。

[11] 配列番号 1、配列番号 1の塩基 64— 1230、配列番号 28、配列番号 28の塩基 73

1230、配列番号 30、および、配列番号 30の塩基 67— 1209からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む単離された核酸であって、該核酸は j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記単離された核酸。

[12] 請求項 7な、し 11の、ずれか 1項に記載の核酸を含んでなる組換えベクター。

[13] 請求項 12に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。

[14] 請求項 1な!、し 6の、ずれか 1項に記載のタンパク質を発現するビブリオ科の単離された微生物。

[15] フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株（寄託番号 NITE BP— 88 )、フォトバタテリゥム属（Photobacterium sp.) JT— ISH— 224株（寄託番号 NITE BP— 87)、または、ビブリオ属（Vibrio sp.) JT— FAJ— 16株（寄託番号 NITE BP 98)である、請求項 14に記載の微生物。 [16] β ガラクトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下の工程：

1) β ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素を生産する微生物を培養し；

2)培養した微生物または培養上清から、 —ガラクトシド《2, 3 シアル酸転移酵素を単離する；

ことを含んでなる、前記製造方法。

[17] β—ガラタトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：

1)請求項 7な、し 11の、ずれか 1項に記載の核酸を含んでなる組換えベクターで宿主細胞を形質転換し；

2)形質転換した当該宿主細胞を培養し；そして、

3)培養した宿主細胞または培養上清から、 |8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；

ことを含んでなる、前記製造方法。

[18] シァリル糖鎖の製造方法であって、

(i)請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載のタンパク質、糖供与体基質、および糖受容体基質を含む溶液を調製し；

(ii)当該溶液にぉ、てシアル酸転移反応を行ヽ；そして

(iii)反応溶液から生成したシァリル糖鎖を得る；

ことを含んでなる、前記方法。