KR20080013909A - 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 그것을코드하는 유전자 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 및 해당 시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한, 해당 시알산 전이효소를 생산하는 미생물을 제공하는 동시에, 그러한 미생물을 이용한 해당 시알산 전이효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 해당 시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 해당 벡터로 형질전환한 숙주세포를 제공하는 동시에, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 시알산 전이효소를 이용한 시알릴 당쇄를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 그것을 코드하는 유전자 및 그 제조방법{NOVEL β-GALACTOSIDE-α2,3-SIALYLTRANSFERASE, GENE ENCODING THE SAME, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF THE SAME}

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 해당 효소를 코드하는 유전자, 해당 효소를 생산하는 미생물 및 해당 효소의 제조방법에 관한 것이다.

당전이효소는, 생체내에 있어서 당단백질이나 당지질 등의 당쇄(糖鎖:sugar chain)의 생합성에 관여하는 효소이다. 그리고 그 반응생성물인 당단백질이나 당지질 등의 당쇄(이하, 복합 당질당쇄)는, 생체내에 있어서 대단히 중요한 기능을 갖고 있다. 예를 들면, 당쇄는, 주로 포유류세포에 있어서, 분화나 발생에 있어서의 세포간 및 세포-세포외 매트릭스간의 시그널 전달이나 복합 당질의 태그(tag)로서 기능하는 중요한 분자인 것 등이 밝혀져 있다.

상기한 바와 같이, 당쇄는 대단히 중요한 기능을 갖고 있지만, 이것을 응용한 구체예로서, 에리스로포이에틴을 들 수 있다. 에리스로포이에틴은 원래 당단백질이지만, 당쇄의 수를 증가시키고, 그 수명을 향상시킨 재조합 에리스로포이에틴 단백질이 제작되어, 현재 시판되고 있다.

금후에도 이와 같이 당쇄를 응용한 의약품, 기능성 식품 등의 개발이 예상된다. 그 때문에 당쇄를 합성·생산하는 수단으로서의 당전이효소 의 중요성이 증대하고 있다.

지금까지 약 150종류 이상의 당전이효소 유전자가 인간, 마우스, 래트(rat) 및 효모 등의 진핵생물로부터 단리 되어 있고, 또한, CHO세포나 대장균 등을 숙주세포로 하는 생산계에서 당전이효소 활성을 갖는 단백질이 발현되어져 있다. 한편, 원핵생물인 세균에서도, 몇개의 당전이효소 유전자가 단리되어 있고, 또한 대장균을 이용하는 재조합 생산계에서 당전이효소 활성을 갖는 단백질이 발현되어, 그것들의 기질특성이나 효소화학적인 여러 가지 성질이 밝혀져 있다.

당쇄를 구성하는 당 중에서도, 비환원 말단에 존재하는 것이 많은 시알산은, 당쇄기능이라고 하는 관점에서 극히 중요한 당이며, 따라서, 시알산 전이효소는, 현재 중요성이 늘고 있는 당전이효소 중에서 가장 수요가 높은 효소중 하나이다.

2, 3-시알산 전이효소 및 그 유전자에 관해서는, 동물, 특히 포유류유래의 것이 많이 보고되어 있다(예를 들면, Harduin-Lepers, A. et al., Biochem J., 15;352 Pt 1:37-48(2000);Young-Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67(1999);Lee, Y-C. et al., J. Biochem., 216, 377-385 (1993);Chang, M-L. et al., Glycobiology, 5, 319-325(1995);Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 21004-21010(1992)을 참조). 그러나, 이들 동물유래의 효소는 정제가 곤란해서 대량으로 얻을 수 없기 때문에 대단히 고가이며, 게다가 효소로서의 안정성이 나쁘다는 문제를 가지고 있다.

이것에 대하여, 미생물 유래의 α2,3-시알산 전이효소 및 그 유전자로는, 나이세리아속( Neisseria ), 캄필로박터속( Campylobacter ), 헤모필러스속( Haemophilus ) 및 파스퇴렐라속(Pasteurella)에 속하는 미생물로부터 취득된 것이 보고되어 있다(예를 들면, WO97/047749, WO99/049051, WO01/077314, WOO3/027297을 참조). 그러나, 비브리오과(Vibrionaceae)에 속하는 미생물로부터 취득된다는 보고는 없고, 또한, 비브리오과에 속하는 미생물에 α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질이 존재한다는 보고도 없다.

특허문헌1: 국제공개 제WO97/047749A호 팜플렛

특허문헌2: 국제공개 제WO99/049051A호 팜플렛

특허문헌3: 국제공개 제WO01/077314A호 팜플렛

특허문헌4: 국제공개 제WO03/027297A호 팜플렛

비특허문헌1: Harduin-Lepers, A. et al., Biochem. J., 15;352 Pt 1:37-48(2000)

비특허문헌2: Young-Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67(1999)

비특허문헌3: Lee, Y-C. et al., J. Biochem., 216, 377-385(1993)

비특허문헌4: Chang, M-L. et al., Glycobiology, 5, 319-325(1995)

비특허문헌5: Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 21004-21010(1992)

[도 1a] 도 1a은 JT-ISH-467주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성의 확인 실험에 있어서의, 표품(실활시킨 조효소액, 피리딜아미노화 락토오스 및 피리딜아미노화α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화3'-시알릴락토오스)의 혼합물)의 HPLC 분석결과를 나타내는 도이다.

[도 1b] 도 1b는 JT-ISH-467주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성의 확인 실험의 HPLC분석 결과를 나타내는 도이다.

[도 1c] 도 1c은 JT-ISH-467주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성의 확인 실험에 있어서의, 대조 실험(당공여체인 CMP-시알산을 포함하지 않는 반응액을 사용한 반응)의 HPLC분석 결과를 나타내는 도이다.

[도 2] 도 2는 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래, 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래, 및 비브리오속 JT-FAJ-16주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 (각각 서열번호2, 29, 31), 포토박테리움·담세라(Photobacterium damselae)의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898), 및 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주( Pasteurella multocida subsp . multocida strain ) Pm70의 가정상의 단백질PM0l88(AAKO2272)의 아미노산 서열간의 얼라인먼트를 나타내는 도이다. JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소에 있어서의 밑줄은 정제 단백에서 결정된 아미노산 서열을 나타낸다.

[도 3a] 도 3a은 JT-ISH-467주가 생산한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성에 있어서의 반응 pH의 영향을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의, 흑사각, 흑환, 흑삼각, 흑마름모, 흰사각 및 흰환의 플롯은 각각, 아세트산 버퍼, 카코딜산 버퍼, 인산 버퍼, TAPS 버퍼, CHES 버퍼 및 CAPS 버퍼내에서 측정한 결과를 나타낸다.

[도 3b] 도 3b는 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성에 있어서의 반응 pH의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 3ba는 JT-ISH-467주 유래, 도 3bb는 JT-ISH-224주 유래, 및 도 3bc는 JT-FAJ-16주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 관한 결과를 나타내는 그래프이다. 그래프 중의, 흑사각, 흑환, 흑삼각, 흑마름모, 흰사각, 및 흰환의 플롯은 각각, 아세트산 버퍼, 카코딜산 버퍼, 인산 버퍼, TAPS 버퍼, CHES버퍼 및 CAPS 버퍼내에서 측정한 결과를 나타낸다.

[도 4a] 도 4a은 JT-ISH-467주가 생산한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성에 있어서의 반응 온도의 영향을 나타내는 그래프이다.

[도 4b] 도 4b는 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소활성에 있어서의 반응 온도의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 4ba는 JT-ISH-467주 유래, 도 4bb는 JT-ISH-224주 유래, 그리고 도 4b는 JT-FAJ-16주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 관한 결과를 나타내는 그래프이다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 과제는, 비브리오과의 미생물에 유래되는 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 및 그것을 코드하는 유전자를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 과제는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 유전자를 이용해서 유전자 재조합 기술에 의해 본 효소를 고생산하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 예의 연구로 노력한 결과, 비브리오과(Vibrionaceae)에 속하는 미생물이 시알산을 당쇄 중의 갈락토오스 잔기, 글루코오스 잔기, 만노스 잔기, 푸코오스 잔기, N-아세틸글루코사민 잔기 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기에 α2, 3결합으로 전이시키는 신규한 효소를 생산하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다. 본 발명은 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산, 및 해당 시알산 전이효소를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 제공한다. 본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소」는, 시티딘1인산(CMP)-시알산으로부터 시알산을, 복합 당질당쇄 혹은 유리의 당쇄 중의 갈락토오스 잔기의 3위치, 락토오스 혹은 N-아세틸락토사민 등의 올리고당에 존재하는 갈락토오스의 3위치, 또는 갈락토오스, 글루코오스, 만노스, 푸코오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 등의 복합 당질을 구성할 수 있는 단당이며, 3위치의 탄소에 수산기를 갖는 단당의 3위치에 전이시키는 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 「β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성」이란, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 대하여 상술한 활성을 의미한다. 또한, 여기에서 말하는 시알산은, 시알산 패밀리에 속하는 노이라민산(neuramic acid) 유도체를 나타낸다. 구체적으로는, N-아세틸노이라민산(Neu5Ac), N-글리코릴노이라민산(Neu5Gc), 5-데아미노-5-히드록시노이라민산(KDN), 디시알산 등을 나타낸다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호2, 서열번호29 또는 서열번호31의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이다. 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호1, 서열번호28 또는 서열번호30의 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질이다.

본 발명의 서열번호2의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 있어서, 서열번호2의 아미노산1~21은 시그널 서열이다. 따라서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호2의 아미노산22~409의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호1의 염기64~1230의 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질이어도 좋다.

본 발명의 서열번호29의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 있어서, 서열번호29의 아미노산1~24는 시그널 서열이라고 상정된다. 따라서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호29의 아미노산25~409의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호28의 염기73~1230의 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질이어도 좋다.

본 발명의 서열번호31의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 있어서, 서열번호31의 아미노산1~22는 시그널 서열이라고 상정된다. 따라서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호31의 아미노산23~402의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 서열번호30의 염기67~1209의 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질이어도 좋다.

본 발명은 또한 상기의 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 변이체이며, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 변이 단백질도 포함한다. 이러한 변이 단백질도 또한 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 포함된다.

본 발명의 변이체 단백질은 서열번호2, 서열번호2의 아미노산22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산23~402로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질이어도 좋다. 치환은, 보존적 치환이어도 좋으며, 이것은, 특정의 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이다. 보존적 치환의 비한정적인 예로는, Ile, Val, Leu 또는 Ala상호의 치환과 같은 지방족기함유 아미노산 잔기 사이의 치환, Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, Gln 및 Asn 상호의 치환과 같은 극성 잔기 사이에서의 치환 등이 포함된다.

아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 변이체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 예를 들면, 주지기술인 부위특이적 변이유발(예를 들면, Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982참조, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 실시함으로써 작성할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「하나 또는 복수의 아미노산」이란, 부위특이적 변이유발법에 따라 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 아미노산을 의미한다.

부위특이적 변이유발법은, 예를 들면, 소망하는 변이인 특정한 불일치외에는 변이를 받아야 할 1본쇄 파지 DNA(Single-stranded phage DNA)에 상보적인 합성올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용해서 다음과 같이 행할 수 있다. 즉, 프라이머로서 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용해서 파지에 상보적인 쇄를 합성시키고, 얻어진 2중쇄 DNA에서 숙주세포를 형질전환한다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이팅 하고, 파지를 함유하는 단일세포로부터 플라크를 형성시킨다. 그렇다면, 이론적으로는 50%의 새로운 콜로니가 1본쇄로서 변이를 갖는 파지를 함유하고, 나머지의 50%가 원래의 서열을 갖는다. 상기 소망하는 변이를 갖는 DNA와 완전히 일치하는 것으로는 하이브리다이즈(hybridize)하거나, 원래의 쇄를 갖는 것과는 하이브리다이즈하지 않는 온도에 있어서, 얻어진 플라크를 키나제 처리에 의해 표식한 합성 프로브와 하이브리다이즈한다. 이어서 해당 프로브와 하이브리다이즈하는 플라크를 얻고, 배양해서 DNA를 회수한다.

또한, 효소 등의 생물활성 펩티드의 아미노산 서열에 그 활성을 유지하면서 하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 실시하는 방법으로서는, 상기의 부위특이적 변이유발의 이외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하고, 이어서 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환, 삽입 또는 부가하고, 이어서 연결하는 방법도 있다.

본 발명의 변이체 단백질은 또한, 서열번호1, 서열번호1의 염기64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열의 상보쇄에 스트린젠트(strigent)한 조건 또는 고도로 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되는 단백질이며, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질이어도 좋다.

여기에서, 스트린젠트한 하이브리다이제이션(hybridization)의 조건으로서는, 0.5M 인산나트륨 pH7.2, 1mM EDTA, 7% SDS, 1%BSA 중에서 55℃에서 하이브리다이제이션시킨 후, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 5% SDS, 0.5%BSA 중에서 55℃, 15분을 2회, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 1% SDS 중에서 55℃, 15분을 2회, 세정조작을 행한다는 조건, 혹은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 제1권, 1.101~1O4페이지, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다) 등에 기재되어 있는 바와 같이, 30% 탈이온화 포름아미드, 0.6M NaCl, 40mM 인산나트륨 pH7.4, 2.5mM EDTA, 1% SDS 중에서 42℃에서, 하이브리다이제이션시킨 후, 2XSSC, 0.1% SDS SDS 중에서 실온에서 10분을 2회, 동일한 버퍼내에서 55℃에서 1시간 세정조작을 더 행한다는 조건을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 고도로 스트린젠트한 조건에 있어서의 하이브리다이제이션으로서, 예를 들면, Molecular Cloning(상기와 동일) 등에 기재되어 있는 0.5M 인산나트륨 pH7.2, 1mM EDTA, 7% SDS, 1%BSA 중에서 65℃에서 하이브리다이제이션시킨 후, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 5% SDS, 0.5%BSA 중에서 65℃, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 1% SDS 중에서 65℃, 세정조작을 행한다는 조건을 들 수 있다.

본 발명의 변이체 단백질은, 또한 서열번호2, 서열번호2의 아미노산22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60%이상, 바람직하게는 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상 또는 99%이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질이어도 좋다.

또는, 본 발명의 변이체 단백질은, 서열번호1, 서열번호1의 염기64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열과, 적어도 60%이상, 바람직하게는 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상 또는 99%이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 코드되는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질이어도 좋다.

여기에서, 아미노산 서열 또는 핵산 염기서열의 상동성%는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정가능하다. 예를 들면, 2개의 아미노산 서열의 상동성%는, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7 (제네틱스 제조) 등의 프로그램, 또는 FASTA알고리즘이나 BLAST알고리즘 등을 이용하여, 서열 정보를 비교함으로써 결정할 수 있다.

시알산 전이효소활성은, 공지의 방법, 예를 들면, J. Biochem., 120, 104~110(1996)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있는 방법으로 측정해도 좋다. 예를 들면, 당공여체 기질로서 CMP-NeuAc(N-아세틸노이라민산)를 그리고 당수용체 기질로서 락토오스를 이용해서 효소반응을 행하고, 반응생성물인 시알릴락토오스의 양을 평가함으로써 효소활성을 평가할 수 있다.

당수용체 기질에 전이한 시알산의 결합 양식의 결정 방법으로서는, 한정하는 것은 아니지만, 피리딜아미노화 당쇄를 이용하는 방법, 반응생성물의 핵자기공명 분광법(NMR)에 의한 분석 등, 당업자에 공지인 방법 중 어떤 것을 이용해서 행할 수 있다. 피리딜아미노화 당쇄를 이용하는 방법은, 피리딜아미노화 당쇄를 당수용체 기질로서 효소반응을 하는 것을 포함한다. 구체적으로는, 피리딜아미노화 락토오스(Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오 제조)를 당수용체 기질, CMP-NeuAc를 당공여체 기질로서 이용해서 효소반응을 행하고, 반응생성물을 고속 액체크로마토그래피(HPLC)분석에 걸어, 반응생성물의 유지 시간으로부터 시알산이 전이된 위치를 특정한다.

본 발명의 1태양에 있어서 본 발명의 효소는, 비브리오과에 속하는 미생물 유래, 바람직하게는 비브리오속(Vibrio spp.)에 속하는 미생물 유래, 또는 바람직하게는 포토박테리움속(Photobacterium spp.)에 속하는 미생물 유래, 더 바람직하게는, 포토박테리움·포스포레움종( Photobacterium phosphoreum )에 속하는 미생물 유래의 효소이다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 효소학적 성질 및 이화학적 성질은, 상기에 정의한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 것을 특징으로 하는 것 외, 한정하는 것은 아니지만, 최적 pH가 pH5~11, pH5~10, pH5~9, 또는 pH5~7의 범위이며, 최적온도가 5~35℃, 10~35℃, 20~35℃, 또는 20~30℃이며, 분자량이 SDS-PAGE분석으로 42,000±3,000Da정도이다.

β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산

본 발명은, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은, 서열번호2, 서열번호2의 아미노산22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는 핵산이다. 본 발명의 핵산은, 또한 서열번호1, 서열번호1의 염기64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산이다.

본 발명의 핵산은, 상기 핵산의 변이체로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 핵산이어도 좋다. 그러한 핵산도 또한, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산에 포함된다.

그와 같은 핵산의 변이체는, 서열번호2, 서열번호2의 아미노산22-409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 핵산이다.

그러한 핵산의 변이체는 또한, 서열번호1, 서열번호1의 염기64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열의 상보쇄에 스트린젠트한 조건, 또는 고도로 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 핵산은 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 상기 핵산이다. 여기에서, 스트린젠트한 조건 또는 고도로 스트린젠트한 조건은 상기에서 정의한 바와 같다.

그와 같은 핵산의 변이체는, 또한 서열번호1, 서열번호1의 염기64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열과, 적어도 60%이상, 바람직하게는 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상 또는 99%이상, 보다 바람직하게는 99.5%이상의 상동성을 갖는 핵산으로서, 해당 핵산은 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 상기 핵산이다. 여기에서, 핵산 염기서열의 상동성은 상기에 나타낸 방법으로 결정할 수 있다.

그와 같은 핵산의 변이체는 또한, 서열번호2, 서열번호2의 아미노산22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60%이상, 바람직하게는 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상 또는 99%이상, 보다 바람직하게는 99.5%이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 핵산이다. 여기에서, 아미노산 서열의 상동성은 상기에 나타낸 방법으로 결정할 수 있다.

β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 미생물

본 발명자들은, 비브리오과에 속하는 미생물이 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 미생물을 제공한다. 본 발명의 미생물은 비브리오과에 속하고, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 생산능을 갖는 미생물로서, 바람직하게는 비브리오속(Vibrio spp.)에 속하는 것, 또는 바람직하게는 포토박테리움속( Photobacterium spp.)에 속하는 것, 더 바람직하게는 포토박테리움·포스포레움( Photobacterium phosphoreum)에 속하는 것이다. β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 생산능을 갖는 비브리오과에 속하는 미생물의 예로서는, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주(기탁번호 NITE BP-88), 포토박테리움속 JT-ISH-224주(기탁번호 NITE BP-87), 및 비브리오속 JT-FAJ-16주(기탁번호 NITE BP-98)을 들 수 있다. 또한, 상기의 비브리오과의 미생물은 해양성 세균이며, 해수중 또는 바다에서 나는 어개류(魚介類)로부터 분리된다. 예를들면, 본 발명의 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주는 이시카와현산의 물오징어에서, 포토박테리움속 JT-ISH-224주는 이시카와현산의 꼬치고기로부터, 그리고, 비브리오속 JT-FAJ-16주는 후쿠오카현산의 일본산 전갱이에서 각각 분리된다.

본 발명의 미생물은, 예를 들면, 이하에 설명하는 것과 같은 스크리닝법을 이용해서 분리할 수 있다. 해수, 바다모래, 갯벌 혹은 바다산 어개류를 미생물원으로 한다. 해수, 바다모래, 갯벌은 그대로 혹은 멸균 해수로 희석하여, 접종원으로 한다. 바다산 어개류는 표면의 점액 등을 루프로 문질러 채취하여 접종원으로 하거나, 내장기를 멸균 해수 중에서 마쇄한 액을 접종원으로 한다. 이것들을 마린브로스 아가 2216배지(벡톤·디킨슨 제조)나 염화나트륨 첨가 뉴트리엔트 아가배지(벡톤·디킨슨 제조) 등의 평판배지 상에 도포하고, 여러 가지 온도조건하에서 생육하는 해양성 미생물을 취득한다. 통상적인 방법에 따라, 얻어진 미생물을 순수배양한 후, 마린브로스2216배지(벡톤·디킨슨 제조)나 염화나트륨 첨가 뉴트리엔트브로스 배지(벡톤·디킨슨 제조) 등의 액체배지를 이용하여, 각각의 미생물을 배양한다. 미생물을 충분히 생육한 후에, 배양액으로부터 균체를 원심분리에 의해 모은다. 모아진 균체에 계면활성제인 0.2% 트리톤 X-100(간토화학 제조)을 포함하는 20mM 카코디레이트 완충액(pH6.0)을 첨가하고, 균체를 현탁한다. 이 균체 현탁액을 빙냉하에서 초음파 처리하여 세포를 파쇄한다. 이 세포파쇄액을 효소용액으로 하여, 통상적인 방법에 따라 시알산 전이활성을 측정하고, 시알산 전이활성을 갖는 균주를 얻을 수 있다.

본 발명의 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주, 포토박테리움속 JT-ISH-224주, 및 비브리오속 JT-FAJ-16주도 상기의 스크리닝법을 이용함으로써 얻을 수 있었다. 얻어진 상기의 균주의 균학적 성질 및 생리학 생화학적 성질, 및 16S rRNA유전자의 염기서열 해석에 의한 종의 동정에 대해서는, 실시예 1에 상술한다.

포토박테리움·포스포레움( Photobacterium phosphoreum )JT-ISH-467주는 2005년 3월14일부로 NITE BP-88로서, 포토박테리움속( Photobacterium sp .) JT-ISH-224주는 2005년 3월11일부로 NITE BP-87로서, 그리고 비브리오속( vibrio sp .) JT-FAJ-16주는 2005년 5월23일부로 NITE BP-98로서, 모두 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터(NPMD:National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary; 일본국 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8)에 기탁되어 있다.

β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 제조하는 방법

(1) β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 미생물을 배양하는 것에 의한 해당 효소의 제조방법

본 발명의 1태양에 있어서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는 비브리오과에 속하는 미생물 유래이며, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 생산능을 갖는 미생물을 배지에 배양하고, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 생산시켜, 이것을 채취함으로써 얻을 수 있다.

여기에서, 이용하는 미생물로서는, 비브리오과에 속하고, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 생산능을 갖는 미생물이면, 어느 균주라도 이용할 수 있다. 비브리오과의 미생물 중에서도, 비브리오속에 속하는 것이 바람직하고, 또는 포토박테리움속 에 속하는 것이 바람직하고, 또한 포토박테리움·포스포레움에 속하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 방법에 있어서, 이용하는 미생물의 예로서는, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주(기탁번호 NITE BP-88), 포토박테리움속( Photobacterium sp .)JT-ISH-224주(기탁번호 NITE BP-87), 및 비브리오속( Vibrio sp.) JT-FAJ-16주(기탁번호 NITE BP-98)을 들 수 있다.

상기 미생물의 배양에 이용하는 배지로서는, 그것들의 미생물을 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기물 등을 포함하는 것을 이용한다. 탄소원으로서는, 펩톤, 트립톤, 카제인 분해물, 육류 엑기스, 포도당 등을 들 수 있고, 바람직하게는 펩톤을 이용한다. 질소원으로서는, 효모 엑기스를 이용하는 것이 바람직하다. 염류로서는, 염화나트륨, 구연산철, 염화마그네슘, 황산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 브롬칼륨, 염화스트론티움, 붕산나트륨, 규산나트륨, 불화나트륨, 질산암모늄, 인산수소이나트륨 등을 적당히 조합시켜서 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 성분을 포함한 마린브로스2216배지(벡톤·디킨슨제)를 이용해도 좋다. 또한, 상기 염류를 적당하게 포함하는 인공해수를 이용하고, 이것에 펩톤, 효모 엑기스 등을 첨가한 배지를 이용해도 좋다. 배양 조건은 배지의 조성이나 균주에 따라 다소 다르지만, 예를 들면, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주를 배양하는 경우, 배양온도는 10~28℃, 바람직하게는 20~25℃, 배양 시간은 8~48시간, 바람직하게는 16~24시간이다.

목적으로 하는 효소는 균체내에 존재하기 때문에, 공지의 균체 파쇄법, 예를 들면 초음파 파쇄법, 프렌치프레스 파쇄법, 유리 비즈 파쇄법, 다이노밀(Dynomil) 파쇄법 등의 어느 한 방법을 행하면 좋고, 그 균체 파쇄물에서 목적으로 하는 효소를 분리 정제한다. 본 발명의 방법에 있어서 바람직한 균체 파쇄법은 초음파 파쇄법이다. 예를 들면, 균체 파쇄물로부터 원심분리에 의해 고형물을 제거한 후에, 얻어지는 균체 파쇄액 상등액을 시판하는 음이온 교환 컬럼, 양이온 교환 컬럼, 겔여과 컬럼, 하이드록시아파타이트 컬럼, CDP-헥사놀아민아가로오스 컬럼, CMP-헥사놀아민아가로오스 컬럼, 소수성 컬럼 등의 컬럼 크로마토그래피 및 네이티브-PAGE 등을 적당히 조합시켜서 전기영동적으로 단일 밴드가 될 때까지 정제할 수 있다.

또한, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는 완전히 정제해도 좋지만, 부분정제품으로도 충분한 활성을 갖기 때문에, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는 정제품이어도 좋고, 또는 부분정제품이어도 좋다.

(2) 재조합 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 제조하는 방법

본 발명은, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산을 포함하는 발현벡터, 및 해당 발현벡터를 함유하는 숙주세포를 제공한다. 그리고, 본 발명은, 해당 발현벡터를 함유하는 숙주세포를 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 발현되어진 재조합 단백질을 회수하는 것에 의해 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 제조하는 방법도 제공한다.

본 발명의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 제조하기 위해서는, 사용하는 숙주에 따라 선택된 발현벡터에 포유동물, 미생물, 바이러스, 또는 곤충유전자 등으로부터 유도된 적당한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 기능할 수 있게 연결한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산서열을 삽입한다. 조절 서열의 예로서, 전사 프로모터, 오퍼레이터, 또는 인핸서, mRNA리보솜 결합 부위, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 제어하는 적절한 서열을 들 수 있다.

본 발명의 벡터에 삽입되는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산서열은, 서열번호1의 염기1~63, 서열번호28의 염기1~72, 또는 서열번호30의 염기1~66에 상당하는 리더 서열을 포함하고 있어도, 포함하지 않고 있어도 좋고, 또한, 다른 생물원 유래 리더서열로 치환하여도 좋다. 리더 서열을 치환함으로써 발현된 단백질을 숙주세포외로 분비시키도록 발현 시스템을 설계하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질은, 해당 효소를 코드하는 핵산에 계속해서, His태그, FLAG^TM태그, 글루타치온-s-트랜스퍼라제 등을 코드하는 핵산을 연결한 핵산을 벡터에 삽입하는 것에 의해, 융합 단백질로서 발현되는 것도 가능하다. 본 발명의 효소를 이러한 융합 단백질로서 발현시키는 것에 의해 해당 효소의 정제 및 검출을 용이하게 할 수 있다.

β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질의 발현에 적합한 숙주세포에는, 원핵세포, 효모 또는 고등진핵세포가 포함된다. 세균, 진균, 효모, 및 포유동물세포 숙주에서 이용하는 적합한 클로닝 및 발현벡터는, 예를 들면, Pouwels 등, Cloning Vectors: A Laboratory manual, Elsevier, NewYork, (1985)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있다.

원핵생물에는, 그람 음성 또는 그람 양성균, 예를 들면, 대장균 또는 고초균이 포함된다. 대장균과 같은 원핵세포를 숙주로서 사용할 경우, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질은, 원핵세포 내에서의 재조합 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위해서 N말단 메티오닌 잔기를 포함하도록 해도 좋다. 이 N말단 메티오닌은, 발현 후에 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질로부터 절단할 수도 있다.

원핵숙주세포 내에서 이용하는 발현벡터는, 일반적으로 1 또는 2 이상의 표현형 선택가능 마커 유전자를 포함한다. 표현형 선택가능 마커 유전자는, 예를 들면, 항생물질 내성을 부여하거나, 또는 독립영양 요구성을 부여하는 유전자이다. 원핵숙주세포에 적합한 발현벡터의 예로서는, pBR322(ATCC37017)과 같은 시판되는 플라스미드 또는 그것들로부터 유도되는 것이 포함된다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질전환 세포를 동정하는 것이 용이하다. 적절한 프로모터 및 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 핵산의 DNA서열이, 이 pBR322벡터 내에 삽입된다. 그 밖의 시판되는 벡터로는, 예를 들면, pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, 스웨덴, 웁살라) 및 pGEM1(Promega Biotech., 미국, 위스콘신주, 메디슨) 등이 포함된다.

원핵숙주세포용의 발현벡터에 있어서 통상 이용되는 프로모터 서열에는, tac프로모터, β-락타마제(페니실리나제)프로모터, 락토오스 프로모터(Chang 등, Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel 등, Nature 281:544, 1979, 인용에 따라 그 전체를 본 명세서에 원용한다. ) 등이 포함된다.

또한, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 효모숙주 내에서 발현시켜도 좋다. 바람직하게는, 사카로마이세스속( Saccharomyces , 예를 들면, S.cerevisiae)을 이용하지만, 피키아속( Pichia ) 또는 클루이베로마이세스속( Kluyveromyces )과 같은 그 밖의 효모의 속을 이용해도 좋다. 효모 벡터는 2μ효모 플라스미드로부터의 복제 기점의 서열, 자립복제서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열, 및 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 것이 많다. 효모α인자 리더 서열을 이용하여, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질의 분비를 행하게 할 수도 있다. 효모숙주로부터의 재조합 폴리펩티드의 분비를 촉진하는 데에 적합한 그 밖의 리더 서열도 알려져 있다. 효모를 형질전환하는 방법은, 예를 들면, Hinnen 등, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있다.

포유동물 또는 곤충 숙주세포 배양계를 이용하여, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 발현할 수도 있다. 포유동물 기원의 주화(株化) 세포계도 이용할 수 있다. 포유동물 숙주세포 발현벡터를 위한 전사 및 번역 제어 서열은, 바이러스 게놈으로부터 얻을 수 있다. 통상 이용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스2 등으로부터 유도된다. SV40 바이러스 게놈, 예를 들면, SV40기점, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 부위, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA서열을 이용하여, 포유동물 숙주세포 내에서의 구조 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전자요소를 부여하여도 좋다. 포유동물 숙주세포 내에서 이용하기 위한 벡터는, 예를 들면, Okayama 및 Berg(Mol. Cell. Biol., 3:280, 1983, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)의 방법으로 구축할 수 있다.

본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 생산하는 하나의 방법은, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 코드하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주세포를, 해당 단백질이 발현하는 조건하에서 배양하는 것을 포함한다. 이어서, 이용한 발현계에 따라 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 배양 배지 또는 세포추출액으로부터 회수한다.

재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 정제하는 조작은, 이용한 숙주의 유형 및 본 발명의 단백질을 배양배지 중에 분비시키도록 할 것인지 말 것인지의 요인에 따라서 적당히 선택된다. 예를 들면, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 정제하는 조작에는, 음이온 교환 컬럼, 양이온 교환 컬럼, 겔여과 컬럼, 하이드록시아파타이트 컬럼, CDP-헥사놀아민아가로오스 컬럼, CMP-헥사놀아민아가로오스 컬럼, 소수성 컬럼 등의 컬럼 크로마토그래피 및 네이티브-PAGE 등, 또는 그들의 조합이 포함된다. 또한, 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에 정제를 용이하게 하는 태그 등을 융합시켜서 발현시킨 경우에는, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제 방법을 이용해도 좋다. 예를 들면, 히스티딘 태그, FLAG^TM태그, 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 등을 융합시켰을 경우에는, 각각, Ni-NTA(니트릴로트리초산)컬럼, 항FLAG항체를 연결한 컬럼, 또는 글루타치온을 연결한 컬럼 등을 이용해서 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는 전기영동적으로 단일 밴드가 될 때까지 정제해도 좋지만, 부분정제품에서도 충분한 활성을 갖기 때문에 본 발명의 β-갈락토시드2, 3-시알산 전이효소는 정제품이어도 좋고, 또는 부분정제품이어도 좋다.

항체

본 발명은, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질, 또는 그 프래그먼트에 대하여 제작해도 좋다. 여기에서, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 프래그먼트는, 해당 효소의 아미노산 서열 중, 적어도 6아미노산, 적어도 10아미노산, 적어도 20아미노산, 또는 적어도 30아미노산을 포함하는 서열을 갖는 프래그먼트이다.

항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 또는 그 프래그먼트를 해당 기술분야에 있어서 항체제작을 위하여 이용되는 동물, 예를 들면, 한정되는 것은 아니지만, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트, 염소 등에 면역시켜 제작해도 좋다. 항체는 폴리크로날 항체이어도, 또는 모노크로날 항체이어도 좋다. 항체는, 당업자에게 주지된 항체제작 방법에 근거해서 제작할 수 있다.

본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 어피니티 정제에 의해 회수하는데에 이용할 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 단백질을 웨스턴 블럿팅(Western blotting)이나 ELISA 등의 시험(assay)에서 검출하는데도 이용할 수도 있다.

시알릴 당쇄의 제작방법

1태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 시알산 전이효소를 이용한 시알릴 당쇄의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 시알릴 당쇄의 제조방법으로서,

(i) 본 발명의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 당공여체 기질, 및 당수용체 기질을 포함하는 용액을 조제하고;

(ii) 해당용액에 있어서 시알산 전이반응을 행하고; 그리고

(iii) 반응용액으로부터 생성한 시알릴 당쇄를 얻는;

것을 포함하여 이루어지는 상기 방법이다.

본 명세서에 있어서, 시알릴 당쇄는, 시알산을 갖는 당쇄를 말한다. 본 발명의 방법에 있어서는, 본 발명의 효소에 의한 시알산 전이반응에 의해, 당공여체 기질의 시알산이 당수용체 기질에 전이하여, 시알릴 당쇄가 얻어진다.

본 발명의 방법에 사용가능한 당공여체 기질은, 본 발명의 시알산 전이효소에 의한 시알산 전이반응에 있어서 당공여체가 될 수 있는 기질이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 본 발명의 방법에 사용가능한 당공여체 기질은 CMP-시알산이며, 보다 바람직하게는 CMP-NeuAc이다.

본 발명의 방법에 사용가능한 당수용체 기질은, 특별히 한정되지 않지만, 갈락토오스 잔기, 글루코오스 잔기, 만노스 잔기, 푸코오스 잔기, N-아세틸글루코사민 잔기, 혹은 N-아세틸갈락토사민 잔기 등을 갖는 복합 당질당쇄 혹은 올리고당, 또는 갈락토오스, 글루코오스, 만노스, 푸코오스, N-아세틸글루코사민 혹은 N-아세틸갈락토사민 등의 단당이다. 여기에서, 복합 당질은, 당질을 포함하는 생체분자의 총칭으로, 당단백질, 프로테오글리칸, 당지질이 포함된다. 본 명세서에 있어서, 복합 당질당쇄란, 당단백질, 프로테오글리칸, 당지질 등의 복합 당질 그 자체를 의미하는 것도 있고, 또한 그 당쇄부분을 의미하는 것도 있다. 또한, 올리고당이란 2이상의 단당이 글리코시드 결합으로 연결된 당을 의미한다. 올리고당을 구성하는 단당의 수에는 특별히 제한은 없다. 또한, 단당 또는 올리고당의 환원 말단은, 알킬기, 피리딜아미노기, 벤조일기, 벤질기, 파라니트로페닐기, 4-메틸움벨리페릴기 등으로 수식되어 있어도 좋다.

본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 효소, 당공여체 기질, 및 당수용체 기질을 포함하는 용액은 완충액이며, 예를 들면, 비한정적으로, 아세트산 버퍼, 카코딜산 버퍼, 인산 버퍼, TAPS 버퍼, Bis-Tris버퍼, Tris버퍼, CHES 버퍼, CAPS 버퍼, MOPS버퍼, MES버퍼, ADA버퍼, PIPES버퍼, ACES버퍼, MOPSO버퍼, HEPES버퍼 등이 포함된다. 본 발명의 방법에 있어서의, 본 발명의 효소, 당공여체 기질, 및 당수용체 기질을 포함하는 용액의 pH는, 본 발명의 효소가 효소활성을 갖는 pH이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 pH5~11, pH5~10, pH5~9, pH5~7이다.

본 발명의 방법에 있어서, 시알산 전이반응을 하는 온도는, 본 발명의 효소가 효소활성을 갖는 온도이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 5~35℃, 10~35℃, 20~35℃, 20~30℃의 범위에서 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서의, 반응용액으로부터 생성한 시알릴 당쇄를 얻는 공정은, 당업자에게 공지된 복합 당질당쇄, 올리고당을 정제하는 방법을 이용해서 할 수 있다. 예를 들면, 크로마토그람으로서는, 역상 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 어피니티크로마토그래피, 렉틴크로마토그래피, 활성탄 크로마토그래피, 실리카겔크로마토그래피 등, 또한 그 밖의 방법으로서는, 한외 여과에 의한 당쇄의 분획·농축, 당쇄의 결정화 등, 또는 그것들의 조합 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다.

본 발명의 효소는, 후술의 실시예4, 11, 12 및 13에 나타낸 바와 같이, 많은 종류의 당수용체 기질에 시알산을 α2, 3결합으로 전이하는 것이 가능하다. 본 발명의 시알릴 당쇄의 제조방법에 의해, 일반적으로는 기질특이성이 높은 공지의 시알산 전이효소에서는 제조할 수 없었던 당쇄를 용이하게 제조할 수 있게 된다. 특히 α-갈락토피라노시드, α-글루코피라노시드, α-만노피라노시드, α-푸코시노피라노시드, β-푸코시노피라노시드 등의 당에 효율적으로 시알산을 전이하는 활성을 갖는 효소는 알려져 있지 않으므로, 본 발명의 방법은 이들 당에 시알산이 부가된 시알릴 당쇄의 용이한 제조방법을 제공한다.

발명의 효과

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산을 제공하는 것에 의해, 생체내에 있어서 중요한 기능을 갖는 것이 밝혀져 있는 당쇄의 합성·생산 수단을 제공하는 관점에 있어서 공헌한다. 특히, 시알산은, 생체내의 복합 당질당쇄에 있어서 비환원 말단에 존재하는 일이 많고, 당쇄기능이라고 하는 관점에서 극히 중요한 당이기 때문에, 시알산 전이효소는 당전이효소중에서도 가장 수요가 높은 효소의 하나이며, 본 발명의 신규한 시알산 전이효소의 제공은, 그러한 높은 수요에 응하는 것이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이것들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 발현하는 미생물의 스크리닝과 균체의 동정

해수, 바다모래, 갯벌 혹은 바다산 어개류를 접종원으로 했다. 이 접종원을 마린브로스 아가2216배지(벡톤·디킨슨제)로 이루어지는 평판배지 상에 도포하고, 15℃, 25℃ 혹은 30℃에서 생육하는 미생물을 취득했다. 통상적인 방법에 따라, 얻어진 미생물을 순수배양한 후, 마린브로스2216배지(벡톤·디킨슨제)로 이루어지는 액체배지를 이용해서 각각의 미생물을 배양했다. 미생물이 충분히 성육(成育)한 후에, 배양액으로부터 균체를 원심분리에 의해 모았다. 모아진 균체에, 0.2% 트리톤 X-100(간토화학 제조)을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0)을 첨가하고, 균체를 현탁했다. 이 균체 현탁액을 빙냉하, 초음파처리하여 세포를 파쇄했다. 이 세포 파쇄액을 효소용액으로 하여 시알산 전이활성을 측정하고, 시알산 전이활성을 갖는 균주 JT-ISH-467주, JT-ISH-224주, 및 JT-FAJ-16주를 얻었다. 또한, JT-ISH-467주는, 오징어의 표피로부터, JT-ISH-224주는 꼬치고기의 내장으로부터, 그리고 JT-FAJ-16주는 전갱이의 내장으로부터 각각 얻을 수 있었다.

시알산 전이활성은, J. Biochem., 120, 104-110(1996)(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)에 기재되어 있는 방법으로 측정했다. 구체적으로는, 당공여체 기질 CMP-NeuAc(70nmol, ¹⁴C로 NeuAc를 라벨한 CMP-NeuAc 25000cpm을 포함하는, 356cpm/nmol. NeuAc는 N-아세틸노이라민산을 나타낸다), 당수용체 기질로서 락토오스(1.25μmol), NaCl을 0.5M농도가 되도록 첨가하고, 그리고 상기에 기재한 방법으로 조제한 효소를 포함하는 반응용액(30㎕)을 사용해서 효소반응을 행하였다. 효소반응은 25℃에서 10분간에서 30분간 행하였다. 반응 종료 후, 반응용액에 1.97㎖의 5mM 인산 완충액(pH6.8)을 가하고, 이 용액을 Dowex1×8(PO₄ ^{3 -} 폼, 0.2×2cm, BIO-RAD 제조)컬럼에 넣었다. 이 컬럼의 용출액(0~2㎖)에 포함되는 반응생성물, 즉 시알릴락토오스에 포함되는 방사 활성을 측정함으로써 효소활성을 산출했다.

(i) JT - ISH -467주

얻어진 JT-ISH-467주의 성질은 이하와 같다:

(균학적 성질)

(1) 세포의 형태는 간균(桿菌)으로, 크기는 0.7~0.8μm×1.5~2.0μm.

(2) 운동성 -

(3) 그람 염색성 -

(4) 포자의 유무 -

(생리학 생화학적 성질)

(1) 생육 온도 4℃에서는 +, 25℃에서는 +, 30℃에서는 -

(2) 집락의 색조 특징적 집락색소를 생산하지 않음

(3) 0/F테스트 +/-

(4) 카탈라아제 테스트 -

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산 생산 -

(7) 글루코오스로부터의 가스 생산 -

(8) 발광성 +

(9) 질산염 환원 +

(10) 인돌 생산 +

(11) 포도당 산성화 -

(12) 아르기닌디하이드롤라제 +

(13) 우레아제 -

(14) 에스쿨린 가수분해 -

(15) 젤라틴 가수분해성 -

(16) β-갈락토시다아제 +

(17) 포도당 자화성 -

(18) L-아라비노오스 자화성 -

(19) D-만노스 자화성 -

(20) D-만니톨 자화성 -

(21) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(22) 말토오스 자화성 -

(23) 글루콘산 칼륨 자화성 -

(24) n-카프린산 자화성 -

(25) 아디핀산 자화성 -

(26) dl-말산 자화성 -

(27) 구연산나트륨 자화성 -

(28) 아세트산페닐 자화성 -

(29) 시토크롬 옥시다아제 +

(30) 균체내 DNA의 GC함량(몰%）39.7%

(16S rRNA 유전자의 염기서열 해석 및 DNA - DNA하이브리다이제이션에 따른 종의 동정)

JT-ISH-467주로부터, 통상적인 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호3에 나타냈다. 이 염기서열은 포토박테리움·포스포레움( Photobacterium phosphoreum ) 기준주인 ATCC11040주의 16S rRNA유전자의 염기서열에 대하여, 상동율100%의 높은 상동성을 나타냈다. 이 결과로부터, JT-ISH-467주는 포토박테리움속에 속하는 것이 명확하게 되었다. 그렇지만, 16S rRNA유전자는 세균의 전체 게놈의 일부에 불과하므로, 16S rRNA유전자의 염기서열에 의한 동정해석은 종 레벨의 극히 근연한 생물간의 거리에 대해서는 오차가 대단히 크다고 되어 있다. 그래서, 속(屬)내에 있어서의 균주의 유연관계의 정량적인 평가에 일반적으로 이용되고 있는 DNA-DNA하이브리다이제이션 시험법을 이용하여 종의 결정을 행하였다. JT-ISH-467주 및 포토박테리움·포스포레움기준주인 NCIMB1282주(ATCC11040주와 동일주)의 전DNA를 추출하고, 공시(供試)하였다. 그 결과, 84.7%의 높은 상동값(DNA-DNA relatedness)이 얻어졌다. 일반적으로, 동일 종간의 DNA-DNA상동값은 60% 이상을 나타내는 것이므로, JT-ISH-467주는 포토박테리움·포스포레움( Photobacterium Phosphoreum )으로 동정되었다. 또한, DNA-DNA하이브리다이제이션 시험은 「미생물의 분류·동정 실험법」 (스즈키 켄이치로·히라이시 아키라·요코타 아키라 편, 슈프링거·페어라크 동경주식회사, 2001년 9월, 참조에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 따라, 마이크로 플레이트를 이용한 포토 바이오틴 표식법에 의해 행하였다.

(ii) JT - ISH -224주

얻어진 JT-ISH-224주의 성질은 이하와 같다;

( 균학적 성질 )

(1) 세포의 형태는 간균으로, 크기는 0.7~0.8μm×1.0~1.5μm.

(2) 운동성 +

(3) 그람 염색성 -

(4) 포자의 유무 -

( 생리적생화학적 성질 )

(1) 생육 온도 4℃에서는 -, 25℃에서는 +, 30℃에서는 +, 37℃에서는 -

(2) 집락의 색조 특징적 집락색소를 생산하지 않음

(3) O/F테스트 +/-

(4) 카탈라아제 테스트 +

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산 생산 +

(7) 글루코오스로부터 가스 생산 +

(8) 발광성 -

(9) 질산염 환원 +

(10) 인돌 생산 +

(11) 포도당 산성화 -

(12) 아르기닌디하이드롤라제 +

(13) 우레아제 -

(14) 에스쿨린 가수분해 -

(15) 젤라틴 가수분해성 -

(16) β-갈락토시다아제 +

(17) 포도당 자화성 -

(18) L-아라비노오스 자화성 -

(19) D-만노스 자화성 -

(20) D-만니톨 자화성 -

(21) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(22) 말토오스 자화성 -

(23) 글루콘산 칼륨 자화성 -

(24) n-카프린산 자화성 -

(25) 아디핀산 자화성 -

(26) dl-말산 자화성 -

(27) 구연산나트륨 자화성 -

(28) 아세트산페닐 자화성 -

(29) 시토크롬 옥시다아제 +

(30) O/129 감수성, 10μg -, 15μg +

(31) 균체내 DNA의 GC함량(몰%）39.4%

( 16S rRNA 유전자의 염기서열 해석 )

JT-ISH-224주로부터 통상적인 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호32에 나타냈다.

JT-ISH-224주는 마린 아가 상에서의 생육성, 간균, 그람 염색성, 글루코오스 발효적 분해성, O/129감수성 등의 형태관찰 및 생리·생화학적 성상시험 결과로부터 비브리오과에 속하는 것이 나타났다. 또한, JT-ISH-224주의 16S rRNA유전자의 DNA염기서열은 포토박테리움·포스포레움( Photobacterium phosphoreum )기준주 ATCC11040의 16S rRNA유전자의 서열에 가장 상동성이 높고, 그 상동율은 99 .2%인 것, 다음에 포토박테리움·이리오피스카리움( Photobacterium iliopiscarium ) 기준주ATCC51760의 16S rRNA유전자의 서열로 상동성이 높고, 그 상동율은 99.1%인 것이 명확하게 되었다. 이들 결과로부터, JT-ISH-224주는 포토박테리움속( Photobacterium sp .)에 속하는 미생물인 것이 명확해졌다.

(iii) JT - FAJ -16주

얻어진 JT-FAJ-16주의 성질은 이하와 같다:

( 균학적 성질 )

(1) 세포의 형태는 간균으로, 크기는 0.7~0.8μm×1.2~1.5μm.

(2) 운동성 -

(3) 그람 염색성 -

(4) 포자의 유무 -

( 생리학 생화학적 성질 )

(1) 생육 온도 4℃에서는 +w, 25℃에서는 +, 30℃에서는 +, 37℃에서는 +

(2) 집락의 색조 담황색~크림색

(3) 0/F테스트 +/+

(4) 카탈라아제 테스트 +

(5) 옥시다아제 테스트 +

(6) 글루코오스로부터의 산 생산 +

(7) 글루코오스로부터의 가스 생산 -

(8) 질산염 환원 +

(9) 인돌 생산 -

(10) 포도당 산성화 +

(11) 아르기닌디하이드롤라제 -

(12) 우레아제 -

(13) 에스쿨린 가수분해 +

(14) 젤라틴 가수분해성 -

(15) β-갈락토시다아제 +

(16) 포도당 자화성 -

(17) L-아라비노오스 자화성 -

(18) D-만노스 자화성 -

(19) D-만니톨 자화성 -

(20) N-아세틸-D-글루코사민 자화성 -

(21) 말토오스 자화성 -

(22) 글루콘산 칼륨 자화성 -

(23) n-카프린산 자화성 -

(24) 아디핀산 자화성 -

(25) dl-말산 자화성 -

(26) 구연산나트륨 자화성 -

(27) 아세트산페닐 자화성 -

(28) 시토크롬 옥시다아제 +

(29) O/129감수성, -

(30) 만니톨 발효성 +

(31) 이노시톨 발효성 +

(32) 아라비노오스 발효성 +

(33) 람노스 발효성 -

(34) 사카로오스 발효성 -

(35) 생육성(NaCl), 3%NaCl+, 4%NaCl+, 6%NaCl+,

(36) 전분 가수분해 -

(37) Tween80분해 -

(38) H₂S생산 -

(39) 아세토인 산생 (VP테스트) -

(16S rRNA 유전자의 염기서열 해석)

JT-FAJ-16주로부터, 통상적인 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 16S rRNA유전자의 전염기서열을 증폭하고, 염기서열을 결정했다. 염기서열을 서열번호33에 나타냈다.

JT-FAJ-16주는 마린 아가상에서의 생육성, 간균, 그람 염색성, 글루코오스 발효적 분해성, O/129감수성 등의 형태관찰 및 생리·생화학적 성상시험의 결과에서 비브리오과에 속하는 것으로 나타났다. 또한, JT-FAJ-16주의 16S rRNA유전자의 DNA염기서열은 비브리오·루모이엔시스(Vibrio rumoiensis)기준주의 16S rRNA유전자의 서열과 가장 상동성이 높고, 그 상동율은 99.5%인 것이 명확하게 되었다. 이들 결과로부터, JT-FAJ-16주는 비브리오속(Vibrio sp.)에 속하는 미생물인 것이 명확하게 되었다.

실시예 2: 포토박테리움 포스포레움 ( Photobacterium phoshoreum ) JT - ISH -467로부터의 β- 갈락토시드 α2,3-시알산 전이효소의 추출 및 정제

마린 아가2216 평판배지상에서 연속 배양한 포토박테리움 포스포레움 JT-ISH-467주의 콜로니로부터 균체를 루프로 채취하고, 마린브로스2216 액체배지 10㎖에 접종하고, 25℃, 매분 180회전으로 8시간 진탕배양했다.

본배양은, 이하의 순서로 실시했다. 20g/L의 Bacto Peptone 및 4g/L의 Bacto Yeast Extract를 가한 마린브로스2216 배지를 1000㎖용의 배플 플라스크(Baffle flask)에 300㎖를 채우고, 오토클레이브(121℃, 15분간)로 멸균했다. 이것을 36개(합계 10.8L) 준비했다. 각각의 플라스크에 전(前) 배양액 10㎖를 접종하고, 25℃, 매분 180회전으로 24시간 진탕배양했다. 배양액을 원심분리하고, 균체를 회수했다. 습중량으로 약 60g을 얻었다.

이 균체를, 990㎖의 0.2% 트리톤 X-100 및 3M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0)으로 현탁하고, 빙냉하에서 초음파 파쇄했다. 균체 파쇄액을 4℃, 100,000×g으로 1시간, 원심분리를 하고, 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을, 투석막 튜브에 넣고, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0) 내에서 4℃, 염화나트륨이 20mM정도가 될 때까지 투석했다. 투석 후, 용액중에 침전(沈澱)이 생겼기 때문에, 4℃에서, 100,000×g으로 1시간 원심분리를 하고, 침전을 제거했다

이 조효소액(粗酵素液)을, 0.2% 트리톤 X-100이 되는 계면활성제를 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0)으로 평형화한 HiPrep 16/10 DEAE FF(아마샴바이오사이언스 제조)라는 음이온 교환 컬럼에 흡착시키고, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 같은 완충액에 직선농도 구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화나트륨 농도가 0.25M 부근에서 용출된 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

회수한 분획을 20mM 인산 완충액(pH6.0)으로 희석하고, 미리 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 인산 완충액(pH6.0)으로 평형화한 하이드록시아파타이트(Bio-Rad 제조)에 흡착시키고, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 인산 완충액(pH6.0)으로부터 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 500mM 인산 완충액(pH6.0)에 직선농도 구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 인산 완충액 농도가 125mM 부근에서 용출된 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을 MonoQ 5/50 GL(아마샴바이오사이언스 제조) 음이온 교환 컬럼에 흡착시키고, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 같은 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 그 결과, 염화나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을, 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH7.0)으로 10배 희석하고, MonoQ 5/50 GL(파마시아 제조)음이온 교환 컬럼에 흡착시켰다. 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH7.0)으로부터 1M 염화나트륨을 포함하는 같은 완충액에 직선농도구배법으로 용출시켰다. 염화나트륨 농도가 300mM 부근에서 용출되는 효소활성을 갖는 분획을 회수했다.

이 분획을 0.2% 트리톤 X-100 및 0.2M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH7.0)으로 2배 희석하고, HiLoad 16/60 Superdex 200 prepgrade(아마샴바이오사이언스 제조) 겔여과 컬럼으로 분획했다. 0.2% 트리톤 X-100 및 0.2M 염화나트륨을 포함하는 20mM 카코딜레이트 완충액(pH7.0)으로 용출시켰다.

활성이 있는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(아크릴아미드겔의 농도는 12.5%)한 결과, 목적효소는 단일 밴드를 나타내고, 약 39,000의 분자량을 나타냈다. 이 분획의 비활성은, 균체 파쇄시의 비활성과 비교하여 약 350배로 상승했다(표 1).

조효소액으로부터의 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소의 정제에 있어서, 상술한 각각의 정제 공정을 거친 시료의 효소활성을 표 1에 나타낸다. 효소활성은, 실시예 1에 기재한 바와 같이 J. Biochem. 120, 104-110(1996)에 기재되어 있는 방법으로 측정했다. 또한, 단백질의 정량은 Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE 제조)를 이용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라서 단백질의 정량을 행하였다. 효소1단위(1U)는, 1분간에 1마이크로몰의 시알산을 전이하는 효소량으로 했다.

표 1 . 조효소액으로부터의 JT - ISH -467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소의 정제법

실시예 3: 피리딜아미노화 당쇄를 이용한 시알산 결합양식의 결정

실시예 2에서 얻어진 효소를 이용하고, 피리딜아미노화 당쇄를 당수용체 기질로 하여 효소반응을 행하였다. 피리딜아미노화 당쇄로서는, 피리딜아미노화 락토오스(Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오 제조)를 이용하여 분석했다. 당수용체 기질이 2.0μM, CMP-NeuAc가 5.7μM 및 효소가 20mU/㎖가 되도록, 각각을 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0) 25㎕ 중에 용해하고, 25℃하에서 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 100℃에서 2분간 반응용액을 처리함으로써 효소를 실활시켰다. 그 후, HPLC로 반응생성물의 분석을 행하였다.

HPLC시스템으로서 Shimadzu LC10A(시마즈제작소 제조)를 이용하고, 분석 컬럼으로는 Takara PALPAK Type R(다카라바이오 제조)을 이용했다. 0.15% N-부탄올을 포함하는 100mM 아세트산-트리에틸아민(pH5.0)으로 평형화한 컬럼에 용출액A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH5.0)로 희석한 반응액을 주입했다. 피리딜아미노화 당쇄의 용출에는 용출액A(100mM 아세트산-트리에틸아민, pH5.0) 및 용출액B(0.5%, n-부탄올을 포함하는 100mM 아세트산-트리에틸아민, pH5.0)을 이용하고, 30~100% 용출액B의 직선농도구배법(0~35분) 및 100% 용출액B(35~50분)에 의해, 순차적으로 피리딜아미노화 당쇄를 용출했다. 또한, 분석은 이하의 조건에서 행하였다(유속:1㎖/min, 컬럼 온도:40℃, 검출:형광(Ex:320nm, Em:400nm)).

그 결과, 본효소를 이용함으로써, 피리딜아미노화 락토오스로부터 피리딜아미노화α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화3'-시알릴락토오스)가 합성되는 것이 명확하게 되었다.

실시예 4: JT - ISH - 467균체가 생산하는 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소를 이용한 단당류·이당류에서의 시알산의 전이(시알산함유 당쇄의 제조)

( 재료 및 방법 )

JT-ISH-467균주로부터 조정한 균체 파쇄액을, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피를 이용해서 부분정제한 α2,3-시알산 전이효소를 이용하여, 각종의 단당류·이당류에서의 시알산의 전이를 확인하기 위해서 이하의 실험을 행하였다.

각종의 당수용체 기질을 이용한 시알산 전이반응

반응용액 24㎕ 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc(400nmol(15600cpm), 반응용액 중에서의 최종농도: 16.6mM), 각종 당수용체 기질(10μmol, 반응용액 중에서의 최종농도: 200mM), 시알산 전이효소(0.13mU), NaCl(반응용액 중에서의 최종농도: 500mM)로 이루어지는 반응용액을 조제하고, 25℃에서 4시간, 효소반응을 행하였다. 또한, 당수용체 기질로서 이용한 단당류·이당류는, 메틸-α-D-갈락토피라노시드(Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노시드(Gal-β-OMe), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 락토오스(Gal-β1,4-Glc), N-아세틸락토사민(Gal-β1,4-GlcNAc), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-N-아세틸글루코사미니드(Gal-β1,3-GlcNAc-β-OMe)의 6종류를 이용했다.

효소반응 종료 후, 반응용액에 1.98㎖의 5mM 인산 버퍼(pH6.8)를 첨가해서 효소반응을 정지했다. 그 후, 5mM 인산 버퍼(pH6.8)로 희석한 효소반응용액(2㎖)을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}폼, 0.2×2cm)컬럼에 적용했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-form, BlO-RAD사 제조)을 1M 인산 버퍼(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수로 현탁해서 제조했다. 이 컬럼의 용출액(0~2㎖)의 방사 활성을 측정했다. 이 컬럼의 용출액에는, 반응에서 생긴 ¹⁴C-NeuAc(N-아세틸노이라민산)가 결합한 반응생성물 및 미반응의 당수용체 기질이 포함되지만, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc는 컬럼에 유지된 채였다. 따라서, 효소반응의 결과로부터 생긴 각종 시알산함유 당쇄유래의 ¹⁴C의 방사 활성은 모두 반응생성물 유래이며, 이 분획의 방사 활성으로부터 효소활성을 산출할 수 있다.

상기의 방법을 이용하고, 각각의 당수용체 기질에 전이된 NeuAc의 방사 활성을 측정해서 전이된 시알산을 산출했다.

(결과)

이번 당수용체 기질로서 이용한 6종류의 단당류, 이당류 어느 것에서도 시알산이 전이하고 있다는 것이 명확하게 되었다(표 2 참조). 이번에 당수용체 기질로서 이용한 당류 중에서는, N-아세틸락토사민에 가장 많은 시알산이 전이하고 있다는 것이 명확하게 되었다.

표 2 : JT - ISH -467주 유래 α2,3-시알산 전이효소에 의한 각종의 당수용체 기질에의 시알산 전이효소 활성

실시예 5: 포토박테리움 ·포스포레움 JT-ISH-467주가 생산하는 β- 갈락토시 드-α2,3-시알산 전이효소를 코드하는 유전자의 염기서열 해석 및 해당 유전자의 형질변환

(1) 게놈 DNA 의 정제와 게놈 라이브러리의 작성

JT-ISH-467주의 균체 펠렛 약 0.5g으로부터, Qiagen Genomic-tip 100/G(Qiagen사 제조)를 이용하여, 키트 첨부의 설명서에 따라, 약 100μg의 게놈 DNA를 조제했다. 1~2μg의 DNA에 대하여, 0.1~0.2유닛의 4염기 인식의 제한효소 Sau3AI를 반응시켜 부분분해를 행하였다. 반응 버퍼는 효소에 첨부된 것을 이용하고, 반응 조건은 37℃, 30분으로 했다. 반응 종료 후, 반응액에 최종농도 25mM의 EDTA pH8.0을 가하고, 페놀·클로로포름 처리를 행하였다. 게놈 DNA를 에탄올 침전으로 회수하고, TE 400㎕에 용해했다. 원심 튜브(히다치제작소 제조 40PA)에 그라디엔트 작제장치를 이용하여, 40% 슈크로오스 버퍼(20mM Tris pH8.0, 5mM EDTA pH8.0, 1M NaCl)와 10%슈크로오스 버퍼로부터, 40~10%의 그라디엔트를 작제하고, 거기에 상기의 부분분해 DNA용액을 중층했다. 초원심기(히다치제작소 제조 SCP70H, 로터: SRP28SA)를 이용하여, 26,000rpm, 20℃, 15시간 원심하였다. 원심 후 튜브의 저부에 25G의 침으로 구멍을 뚫고, 저부의 액으로부터 1㎖씩 회수했다. 회수한 게놈 DNA를 포함하는 샘플의 일부를 서브머린 전기영동조를 이용하여, 0.5~0.6% 아가로오스겔/TAE버퍼 내에서, 26V, 20시간 전기영동을 하고, 9~16kb의 사이즈의 DNA를 포함하는 분획을 파악했다. 마커로서 λ/HindIII를 이용했다. 9~16kb의 사이즈의 DNA단편을 포함하는 분획에 TE를 2.5㎖가해 슈크로오스 농도를 낮춘 후, 에탄올 침전, 린스를 하고, 소량의 TE에 용해했다.

JT-ISH-467주의 게놈 라이브러리 작성을 위한 벡터로서, λDASH II(Stratagene 제조)를 이용했다. λDASH II/BamHI 벡터와 게놈 DNA단편의 라이게이션 반응은 Stratagene 제조의 라이게이션 키트를 이용하여, 12℃에서 하룻밤 행하였다. 반응 후, 반응액을 GigaPack III Gold Packaging extract와 반응시키고, 게놈 DNA가 도입된 λ벡터를 파지 입자로 받아들이게 했다. 파지액은 500㎕의 SM버퍼와 20㎕의 클로로포름내에 4℃로 보관했다. 대장균XLl-Blue MRA(P2)(Stratagene 제조)를 LBMM(LB+0.2%말토오스+10mM MgSO₄)내에서 A₆₀₀=0.5가 될 때까지 배양하고, 이 배양액 200㎕에, 적량의 파지 용액을 가하고, 37℃에서 15분간 배양했다. 여기에, 48℃에서 보온한 NZY 상부 아가로오스를 4㎖ 가하고, 혼합하여, NZY아가플레이트(지름 9cm의 플라스틱 샬레)에 플래이팅 했다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양하고, 플라크 수를 세고, titer를 계산한 결과, 라이브러리 사이즈는 약 30만pfu(plaque forming unit)으로 산출되었다.

(2) 프라이머 설계와 프로브 작성

Procise 494 cLC protein Sequencing System(Applied Biosystems 제조)을 이용하고, JT-ISH-467주 유래의 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 아미노 말단(N말단)아미노산 서열, 및 내부 아미노산 서열을 결정했다.

N말단 아미노산 서열의 결정은, 다음과 같이 행하였다. 해당 시알산 전이효소를 5/20% 그라디엔트 겔(ATTO 제조)로 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 행하였다. 영동 후, 해당 효소를 PVDF막에 흡착시키고, 아미노산 서열 분석장치에 의해, 아미노 말단측 10개의 아미노산의 서열을 결정했다. 그 결과, 해당 효소의 N말단 아미노산 서열은 XNSDSKHNNS(서열번호4)였다.

또한, 내부 아미노산 서열의 결정은, 다음과 같이 행하였다. 해당 시알산 전이효소를 5/20% 그라디엔트 겔(ATTO 제조)로 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 행하였다. 겔을 염색한 후, 목적하는 밴드를 절단하고, 리실엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase)를 포함하는 트리스 버퍼(pH8.5)를 가하고, 35℃, 20시간의 처리를 행하였다. 그 후, 용액의 전량을 역상HPLC(컬럼:Symmetry C18 3.5μm)에 적용하여, 단편 펩티드를 분리했다. 아미노산 서열 분석장치에 의해, 해당 효소의 내부 아미노산 서열은, SLDSMILTNEIK(서열번호5), FYNFTGFNPE(서열번호6) 및 GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)를 갖는 것이 명확하게 되었다.

상기한 바와 같이, 결정된 포토박테리움·포스포레움JT-ISH-467 유래 α2,3-시알산 전이효소의 부분 아미노산 서열, 즉 N말단 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)와, 3개소의 내부 아미노산 서열 중, 2개소의 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6) 및 GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)를 기초로 이하의 데제너레이트(degenerate) 프라이머를 설계, 합성했다. 즉, N말단의 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)로부터, 하기의 표3에 나타내는 3개의 프라이머(I는 이노신)을 합성했다.

표 3

표 중, Y는 티민 또는 사이토신; W는 티민 또는 아데닌; S는 사이토신 또는 구아닌; R은 아데닌 또는 구아닌; N은 아데닌, 구아닌, 사이토신 또는 티민; I는 이노신;을 각각 나타낸다.

또한, 내부 아미노산 서열:GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)로부터 하기의 표 4에 나타내는 4개의 프라이머를 합성했다.

표 4

표 중, H는 티민, 사이토신 또는 아데닌; T는 티민 또는 사이토신;

R은 아데닌 또는 구아닌; D는 아데닌, 구아닌 또는 티민; N은 아데닌, 구아닌, 사이토신 또는 티민;을 각각 나타낸다.

또한, 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6)로부터 하기의 표5에 나타내는 2개의 프라이머를 합성했다.

표 5

표 중, Y는 티민 또는 사이토신; R은 아데닌 또는 구아닌;

N은 아데닌, 구아닌, 사이토신 또는 티민;을 각각 나타낸다.

이들의 프라이머를 이용하여, 상기 (1)에서 추출·정제한 JT-ISH-467주의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 행하고, 라이브러리를 스크리닝하기 위해서 프로브가 되는 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분 장DNA를 증폭했다. 프라이머 조합은, N말단 서열 유래의 3개의 프라이머의 각각과 467in1FW(서열번호12), 467in1FW2(서열번호14) 혹은 467in2FW(서열번호16)의 9개의 조합, 467in1RV(서열번호11) 혹은 467in1RV2(서열번호13)와 467in2FW(서열번호16)의 2개의 조합, 또한 467in2RV(서열번호15)와 467in1FW(서열번호12) 혹은 467in1FW2(서열번호14)의 2개의 조합의, 총계13조합이다. PCR 반응은 이하와 같이 행하였다. 50㎕의 반응액 중에, 게놈 DNA 250ng, 10(Ex taq버퍼 5㎕, 2.5mM 각 dNTPs 4㎕, 프라이머를 각각의 서열에 대하여, 5pmole, Ex taq(다카라바이오 제조) 0.5㎕를 각각 함유시키고, 프로그램 템프 콘트롤 시스템 PC-700(ASTEK사)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 40회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, 9개의 프라이머 조합(467N-RV(서열번호8)와 467in1FW(서열번호12), 467N-RV(서열번호8)와 467in2FW(서열번호16), 467in1RV(서열번호11)와 467in2FW(서열번호16), 467in2RV(서열번호15)와 467in1FW(서열번호12)의 조합 이외의 9개)에 있어서, PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물 중, 특이적이고도 높은 증폭 효율이 얻어진 조합(467N-RV3(서열번호10)과 467in1FW(서열번호12)) 유래의 PCR산물을 벡터 pCR2. 1TOPO(Invitrogen 제조)로 클로닝 했다. 라이게이션 반응은 벡터 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 대장균 TB1에 일렉트로포레이션법(electroporation)을 이용해서 DNA를 도입하고, 통상적인 방법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition(인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다))에 따라 플라스미드DNA를 추출했다. 이 클론에 관해서, M13프라이머(다카라바이오 제조)를 이용하여, ABI PRISM형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer 제조)로, PCR산물의 염기서열을 그 양단으로부터 결정했다.

결정된 DNA염기서열(929bp: 서열번호17)에 관해서, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GeneBank 데이타베이스에 대하여, BLAST프로그램에 의한 상동성 검색을 행하였다. 그 결과, 유의한 상동성을 나타내는 DNA서열은 검출되지 않았다. 이것은 본 발명에 의해 밝혀진 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 DNA염기서열이 신규한 서열인 것을 의미한다. 이어서, 이 염기서열을 아미노산으로 번역하고, 재차 BLAST서치 한 결과, 포토박테리움·담세라(Photobacterium damselae)의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 30%의 상동성, 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주( Pasteurella multocida subsp . multocida )Pm70의 가정상의 단백질 PM0l88(AAKO2272)과 26%의 상동성, 헤모필루스·듀크레이(Haemophilus ducreyi)35000HP주의 가정상의 단백질HDOO53(AAP95068)과 21%의 상동성이 검출되었다. 또한, 번역된 아미노산 서열은, 상기의 정제 효소로부터 직접 결정된 내부 아미노산 서열:FYNFTGFNPE(서열번호6)와 SLDSMILTNAIK(서열번호5)의 전체를 포함하고, N말단 아미노산 서열:XNSDSKHNNS(서열번호4)와, 내부 아미노산 서열:GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY(서열번호7)의 일부를 포함하고 있다. 이상의 결과로부터, 클로닝된 DNA는 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 일부이며, 또한 본 발명의 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은 이미 알려진 서열과 30% 정도밖에 상동성을 나타내지 않는 신규한 아미노산 서열인 것이 명확하게 되었다.

(3) 스크리닝과 유전자 클로닝

상기(2)에서 클론화된 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 일부로 이루어지는 DNA단편을, pCR2.1 TOPO벡터로부터 제한효소 EcoRI로 절단하고, 이것을 프로브로 하여, 상기 (1) 제작한 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 게놈 DNA라이브러리를 스크리닝했다. 지름 9cm의 원형 샬레에 λDASH II/BamHI 벡터 키트(Stratagene 제조)의 설명서에 따라, 약 300~500pfu의 파지를 숙주균 XL1-blue MRA(P2)와 함께 플레이팅 했다. 플라크를 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(Amersham 제조)에 접촉시키고, 멤브레인 첨부의 설명서에 따라 알칼리 처리를 행하여 DNA를 변성시키고, 멤브레인 상에 고정시켰다. 프로브는 rediprime II^TM DNA labelling system(아마샴바이오사이언스 제조)을 이용해서 ³²P라벨 했다. 하이브리다이제이션은 0.5M 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 7% SDS, lmM EDTA 중에서 65℃에서 하룻밤, 세정 조건은 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1mM EDTA, 5% SDS 중에서 65℃, 15분을 2회, 40mM 인산나트륨 버퍼 pH7.2, 1% SDS, 1mM EDTA 중에서 65℃, 15분을 2회 행하였다. 1차 스크리닝에서 약 5,000pfu의 파지로부터 24개의 포지티브 클론이 얻어졌다. 내부 18개의 클론에 대해서, 플라크의 정제를 겸한 2차 스크리닝을 행하였다. 그 결과, 6종류의 선발·정제 플라크를 얻을 수 있었다.

이들의 플라크를 회수하고, 각각 대장균 XL1-blue MRA(P2)와 함께, 1장에 수만pfu가 되도록 NZY플레이트에 플레이팅 하고, 하룻밤 동안 37℃에서 보온했다. 플라크가 한면에 나와 있는 6장의 플레이트에 SM버퍼를 4㎖씩 붓고, 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 파스퇴르 피펫으로, 파지 플레이트 라이세이트(lysate)를 회수하고, QIAGEN Lambda Mini Kit(키아겐 제조)로, λDNA를 추출, 정제했다. 이들 6종류의 λDNA, 및 (1)에서 정제한 JT-ISH-467주의 전체 게놈 DNA를 제한효소 EcoRI, HindIII로 소화하고, 0.7% 아가로오스겔 전기영동으로 분획한 후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블럿팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스 제조)에 전사했다. 이 필터에 관해서, 상기의 929bp의 프로브(서열번호17)를 이용하여, 상술한 바와 같이 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridaization)을 행하였다. 그 결과, EcoRI소화로는, 9kb 또는 그 이상의 밴드가 검출되었다. 한편, HindIII소화의 경우, 모든 λDNA, 게놈 DNA와 함께 4.6kb의 밴드가 검출되었다. 여기서, λDNA를 재차 HindIII로 소화하고, 아가로오스겔 전기영동을 행하고, 4.6kb HindIII 단편을 회수하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 HindIII부위로, 통상적인 방법에 따라 클로닝 했다.

이어서, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 전체 염기서열을 결정하기 위해서, 동유전자의 부분DNA서열(상술, 929bp: 서열번호17)을 근거로 이하의 표6에 나타내는 프라이머를 합성했다.

표 6

이들 프라이머를 이용하고, ABI PRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer 제조)로, 4.6kb HindIII 단편의 내부염기서열을 해석하고, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 내부, 및 그 근방의 염기서열을 해석했다. 그 결과, 서열표의 서열번호1의 서열을 얻었다. 이 서열은, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 같은 리딩 프레임으로, 번역 종지코돈이 나타나므로 이것이 본 유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다.

포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 1230염기로 이루어지고, 409개 아미노산을 코드하고 있다. 이 아미노산 서열을 서열표의 서열번호2로 나타낸다. 이 아미노산 서열은 정제 효소로부터 결정된 4개소의 아미노산 서열 모두를 완전히 포함한다. N말단의 아미노산 서열의 한글자가 해독되지 않고 있었지만, 유전자로부터 연역되는 이 부분의 아미노산은 Cys(시스테인)이었다. 또한 성숙 단백의 N말단은, 서열표의 서열번호2의 서열 중의 제22번째인 Cys인 것이므로, 처음의 21아미노산으로 이루어지는 서열은, 포토박테리움·포스포레움에 있어서는 프로세싱을 받고, 제거되었다고 생각되었다. 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스 제조)을 이용하고, 본 발명의 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 단백질 전체길이, 및 그 유전자 전체길이와, 그것들의 호모로그의 전체길이간의 상동성을 해석한 바, 아미노산 서열에서는, 포토박테리움·담세라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 32%의 상동성, 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주 Pm70의 가정상의 단백질PM0188(AAKO2272)과 28%의 상동성을 갖고, 또한, 유전자DNA서열에서는 각각 53%, 51%의 상동성을 갖고 있었다.

(4) 발현 벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이활성을 갖는지의 여부를 조사하기 위해서, 동유전자의 전체길이, 및 N말단 측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현벡터에 도입하고, 대장균내에서 단백질을 생산시키고, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 있어서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7로 해석을 행한 결과, N말단의 24아미노산이 시그널 펩티드인 것으로 예측되었다. 여기서, 유전자 전체길이(본 실시예에 있어서, 467-N0C0로 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머467-23ST-N0-Pci(서열번호27) 및 467-23ST-C0-Bm(서열번호26), 또한 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제외된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 실시예에 있어서 467-N2C0로 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머467-23ST-N2-Nco(서열번호25) 및 467-23ST-C0-Bm(서열번호26)을 설계, 합성했다(표 7).

표 7

클로닝용으로 프라이머에 미리 도입한 제한효소 PciI(467-23ST-N0-Pci), NcoI(467-23ST-N2-Nco), BamHI(467-23ST-C0-Bm) 부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 번역 종지코돈에 대응하는 상보 서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 또한, 프라이머 서열 중, 제한효소부위에서 3'측으로, 주형 DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. PCR 시의 주형 DNA는 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래(α2,3-시알산 전이효소 유전자 전체길이를 포함하는 상기 HindIII 4.6kb단편이 도입된 플라스미드를 이용했다. PCR의 반응 조건은 이하와 같이 설정했다. 50㎕의 반응액 중에, 주형 DNA 100ng, 10×Ex taq buffer 5㎕, 2.5mM 각 dNTP 4㎕, 프라이머 50pmole, Ex taq(다카라바이오 제조) 0.5㎕를 각각 포함하고, 프로그램 템프 콘트롤 시스템PC-700(ASTEK 제조)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 15회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, 467-N0C0에서 약 1.2kb, 467-N2C0에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물 중, 467-N0C0를 제한효소 PciI(New England Biolab 제조)와 BamHI(다카라바이오 제조)로 2중 소화하고, 그리고, 467-N2C0를 제한효소 NcoI(다카라바이오 제조)와 BamHI로 2중 소화한 후, 겔 정제했다. 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A(Pharmacia LKB 제조)를 이용했다. 이 벡터를 같은 제한효소 PciI와 BamHI, 또는 제한효소 NcoI와 BamHI로 2중 소화하여 겔 정제한 것을, 제한효소처리를 행한 PCR산물과 Takara Ligation Kit(다카라바이오 제조)를 이용해서 라이게이션하고, 대장균 TB1에 트랜스펙트했다. 통상적인 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소분석하고, 삽입의 도입을 확인했다. PCR 반응에 따른 염기의 변화를 조사하기 위해서, 467-N0C0로는 두개의 클론을, 467-N2C0로는 3개의 클론의 전체 염기서열을 결정했다. 그 결과, 467-N0C0에 있어서는 하나의 클론(ISH467-N0C0 제1 클론)에서 서열번호1의 염기서열 중, 제569번째의 아데닌(A)이 구아닌(G)로 변화되고, 이것에 의해 코돈이 AAC에서 AGC로 변화하고, 서열번호2의 아미노산 서열 중 제190번째의 아스파라긴(Asn)이 세린(Ser)으로 변화하고 있다. Asn과 Ser은 동일한 극성 아미노산이다. 한편, 또 하나의 클론(ISH467-N0C0 제2 클론)에서는 염기의 변화는 하나도 없고, 서열번호1의 염기서열이 확인되었다. 이어서 3개의 467-N2C0클론의 전체 염기서열을 결정했다. 그 결과, 제1 및 제2 클론 2개에 아미노산 치환을 따르는 염기의 변이가 발견되었다. 즉, ISH467-N2C0 제1 클론에서는, 서열번호1의 염기서열의 476번째의 티민(T)이 사이토신(C)으로 변이하고 있어, 이것에 의해 코돈이 TTT에서 TCT로 변하고, 159번째의 페닐알라닌(Phe)이 세린(Ser)으로 치환되어 있다. ISH467-N2C0 제2 클론에서는, 서열번호1의 염기서열의 78번째의 티민(T)이 결실되고, 이에 따라, 프레임 시프트가 일어나서, 올바른 단백질이 번역되지 않았다. 한편, ISH467-N2C0 제3 클론에서는, 변이는 검출되지 않고, 서열번호1 중 제73번째의 염기로부터 제1230번째의 염기까지의 서열 그 자체를 포함하고 있었다.

(5) 발현유도와 활성측정

상기(4)에서 얻어진 467-N0C0의 2클론, 467-N2C0의 3클론에 대해서, 단백질발현유도 실험을 행하였다. 각 클론이 도입된 발현벡터 pTrc99A를 가지는 대장균 TB1의 단일 콜로니를 항생물질 암피실린(최종농도 100(g/㎖))를 포함하는 LB배지(5㎖)에 접종하고, A₆₀₀=0.5 정도가 될 때까지 30℃에서 균을 전배양(前培養)하고, 그 후 IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드, 와코쥰야쿠공업 제조)를 최종농도로 1mM이 되도록 가하고, 30℃에서 4시간 더 진탕배양했다. 배양액 2㎖ 중의 균체를 원심분리에 의해 모았다. 이 균체를, 200㎕의 0.336% 트리톤 X-100 및 0.5M 염화나트륨을 포함하는 20mM 비스트리스 완충액(pH7.0)으로 현탁하고, 빙냉하에서 초음파 파쇄했다. 얻어진 파쇄액을 조효소액으로 하고 활성측정에 사용하였다. 반응은 2반복으로 하고, 반응 조성은 실시예 1과 동일하게 행하였다. 다만, 반응 시간은 15시간으로 했다. 그 결과, 하기의 표8에 나타낸 바와 같이, ISH467-N0C0 제1 클론의 조효소액중 및 ISH467-N0C0 제2 클론의 조효소액 중에는, 당공여체인 CMP-NeuAc 중의 ¹⁴C로 라벨된 NeuAc을 당수용체 기질인 락토오스로 전이하는 인자, 즉 시알산 전이효소활성이 존재하는 것으로 나타났다. 또한, ISH467-N2C0 제1 클론 및 ISH467-N2C0 제3 클론의 조효소액중에도 시알산 전이효소활성이 존재하는 것으로 나타났다. 한편, ISH467-N2C0 제2 클론의 조효소액 중 및 조효소액이 없는 반응액 중에는 시알산 전이효소활성이 포함되어 있지 않았다. 이상의 결과로부터, ISH467-N0C0 제1 클론 또는 제2 클론, 또는 ISH467-N2C0 제1 클론 또는 제3 클론을 도입한 대장균에서는 시알산 전이효소가 발현되어져 있는 것이 명확하게 되었다.

표 8: JP-ISH-467주 유래 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자를 도입한 대장균 파쇄액 중의 시알산 전이효소활성

(6) α-2, 3시알산 전이활성의 확인

상기(5)의 조효소액을 이용하여, ISH467-N2C0 제1 클론을 도입한 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는지의 여부를 조사했다. 실시예 3과 같이, 당수용체로서 피리딜아미노화 락토오스(Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오 제조 PA-Sugar Chain O26)를 이용하여, 효소반응을 행하였다. 반응 종료 후, 95℃에서 5분간, 반응용액을 열처리함으로써 효소를 실활시키고, HPLC로 분석했다. 또한, 효소반응은, 피리딜아미노화 락토오스가 2.0μM, CMP-시알산이 5.7μM가 되도록, 각각을 20mM 카코딜레이트 완충액(pH6.0) 25㎕ 중에 용해하고, 25℃하에서 6시간 행하였다(반응 1). 한편, CMP-시알산을 포함하지 않는 반응액을 사용한 대조 실험(반응2)을 행하였다. 또한, 표품의 유지 시간을 명확하게 하기 위해서, 열처리(95℃, 5분간)에 의해 실활시킨 조효소액을 가하고, 피리딜아미노화 락토오스 및 피리딜아미노화 α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화 3'-시알릴락토오스) (Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오 제조 PA-Sugar Chain O29)를 첨가한 시험을 행하였다.

표품의 분석 결과(도 1a)로부터, 피리딜아미노화 락토오스의 유지 시간은 4.1분, 피리딜아미노화 α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화 3'-시알릴락토오스)의 유지 시간은 5.4분인 것으로 나타내졌다. 이것에 의해 반응2(도 1c)에서는 검출되지 않는 유지 시간 5.3분의 피크(도 1b)가 피리딜아미노화α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화3'-시알릴락토오스)인 것이 명확하게 되었다. 즉, ISH467-N2C0 제1 클론을 도입한 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는 것이 증명되었다.

또한, 동일하게 ISH467-N0C0 제1 클론 및 제2 클론, 및 ISH467-N2C0 제3 클론에 있어서도, 해당 클론을 도입한 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는지의 여부를 조사했다. 그 결과, 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소에 의한 반응에 있어서, 어느쪽의 클론에 있어서도, 반응생성물로서 피리딜아미노화α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화 3'-시알릴락토오스)의 피크가 검출되었다. 따라서, 이들의 효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는 것이 명확하게 되었다.

실시예 6: 포토박테리움속 세균 JT - ISH -224주 유래 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝과 염기서열 해석 및 해당 유전자의 대장균의 발현

(1) T- ISH -224주의 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소 활성과 동효소 유전자의 존재의 확인

실시예 1에서 시알산 전이효소활성을 갖는 것이 분명하게 된 포토박테리움속 JT-ISH-224주에 있어서, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재하는지의 여부를 명확하게 하기 위해서, 제노믹 서던 하이브리다이제이션을 실시했다. 실시예 5의 (1)에 기재한 방법으로, JT-ISH-224주의 균체 펠렛으로부터 게놈 DNA를 조제했다. 이어서 실시예 5의 (3)에 기재한 방법에 따라, JT-ISH-224주의 게놈 DNA를 제한효소 EcoRI 또는 HindIH로 소화하고, 0.7%아가로오스겔 전기영동으로 분획한 후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블럿팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스 제조)에 전사했다. 이 필터에 있어서, 상기의 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로서 이용하고, 실시예 5의 (3)에 기재한 방법으로 서던 하이브리다이제이션을 행하였다. 다만, 하이브리다이제이션 온도, 및 세정 처리의 온도는 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI소화로는, 16kb의 밴드가 검출되었다. 한편, Hindm소화의 경우, 5kb와 2.7kb의 밴드가 검출되었다. 이 결과로, JT-ISH-224주에는 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재하는 것이 명확하게 되었다.

(2) JT - ISH -224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝

이어서, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝을 행하였다. 실시예 5의 (1)에 기재한 방법에 따라, JT-ISH-224주의 게놈 DNA로부터, λDASH II(Stratagene 제조)를 이용하고, 게놈 라이브러리를 구축했다. JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bP; 서열번호17)을 프로브로 이용하고, JT-ISH-224주의 게놈 라이브러리를 스크리닝했다. 다만, 실시예 6의 (1)과 같이 하이브리다이제이션, 및 세정의 온도는 55℃로 했다. 그 결과, 플라크 정제를 겸한 2차 선발까지, 12클론을 얻고, 내부 6개의 DNA를, 실시예 5의 (3)과 같이 QIAGEN Lambda Mini Kit(키아겐 제조)를 이용해서 정제했다. 또한, 이 중 3클론의 λDNA샘플, 및 JT-ISH-224주의 전체 게놈 DNA에 대해서, 제한효소 EcoRI 또는 HindIII로 소화했다. 소화물을 아가로오스겔 전기영동으로 분획하고, 상술한 바대로 나일론 멤브레인 필터에 전사했다. 이 필터를 이용하여, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로 이용하여, 서던 분석을 행하였다. 하이브리다이제이션, 세정의 온도는 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI소화의 경우, 12kb 또는 그 이상의 밴드가 검출된 것에 대하여, HindIII 소화의 경우는, 3개 모두 λDNA샘플과 JT-ISH-224주의 전체 게놈 DNA에 관해서, 5kb와 2.7kb의 두개의 밴드가 검출되었다. 거기에서, λDNA샘플을 재차 HindIII로 소화하고, 이들 5kb와 2.7kb의 두개의 DNA단편을 겔 정제하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 HindIII부위에 통상적인 방법에 따라 클로닝했다.

이어서, 이들의 클론에 관해서, M13프라이머(다카라바이오 제조)를 이용하고, ABIPRISM형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사 제조)로, 5kb HindIII단편과 2.7kb HindIII단편의 양단의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 5kb단편의 한쪽의 DNA서열, 및 2.7kb의 한쪽의 DNA서열로부터 추정되는 아미노산 서열이, 데이타베이스 검색의 결과와 같이, 시알산 전이효소와 상동성을 나타냈다. JT-ISH-224주의 동효소의 유전자의 DNA를 완전히 결정하기 위해서, HindIII 2.7kb단편으로부터 얻어진 DNA서열을 기초로, 하기의 표 9의 프라이머를 합성하고, 염기서열 결정에 이용했다.

표 9

그 결과, 서열표의 서열번호28의 서열을 얻었다. 이 서열은, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 같은 리딩 프레임에서 번역 종지코돈이 나타나므로, 이것이 본 유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다. 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 그것과 같이, 1230염기로 이루어지고, 409개의 아미노산을 코드 하고 있다. 이 아미노산 서열을 서열표의 서열번호29에 나타낸다. 유전자 내부에는 HindIII부위를 갖고 있다. GENE TYX Ver. 7을 이용해서 핵산, 및 아미노산 서열의 해석을 행한 바, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자는, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자와 92%의 상동성을 갖고 있었다. 또한, 아미노산 서열에서도, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소와 92%의 상동성을 나타냈다. 또한 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은, 포토박테리움·담세라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)과 33%의 상동성, 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주 Pm70의 가정상의 단백질PM0188(AAKO2272)과 29%의 상동성을 나타내고, 유전자DNA서열로는 각각 54%, 50%의 상동성이었다.

(3) 발현벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이효소활성을 갖는지의 여부를 조사하기 위해서, 동유전자의 전체길이, 및 N말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현벡터에 도입하고, 대장균내에서 단백질을 생산시키고, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 있어서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7로 해석을 행한 바, N말단의 24아미노산이, 시그널 펩티드인 것으로 예측되었다. 거기에서, 유전자 전체길이(본 실시예에 있어서 224-N0C0라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 224-23ST-N0-Pci(서열번호35), 224-23ST-COnew-Bm(서열번호37), 또한 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제외된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 실시예에 있어서 224-N1C0라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 224-23ST-N1-Nco(서열번호36), 224-23ST-C0new-Bm(서열번호37)을 설계, 합성했다 (표 10).

표 10

클로닝용에 프라이머로 미리 도입한 제한효소 PciI(224-23ST-N0-Pci), NcoI(224-23ST-N1-Nco), BamHI(224-23ST-COnew-Bm)부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 및 번역 종지코돈에 대응하는 상보 서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 또한, 프라이머 서열 중, 주형 DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. 프라이머 224-23ST-N0-Pci의 경우, 뒤의 클로닝용으로 PciI부위를 도입함으로써 번역 개시코돈 ATG직후의 사이토신(C)이 티민(T)으로 치환된다. 이 때문에, 번역 개시 메티오닌의 직후의 아미노산 서열이 류신(Leu)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된다. Leu과 Phe는 같은 소수성의 아미노산인 점, 이 부분은 시그널 펩티드 영역인 점으로부터 이 변이에 의해 효소활성에 큰 변화를 가져오는 가능성은 낮다고 판단했다.

계속해서 PCR을 행하고, 발현벡터에 도입하기 위한 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 증폭했다. 주형 DNA는, JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 포함하는 상기 λDNA를 이용했다. PCR의 반응 조건은 아래와같이 설정했다. 50㎕의 반응액 중에, 주형 DNA 100ng, 10×Ex taq buffer 5㎕, 2.5mM 각 dNTP 4㎕, 프라이머 50pmole, Ex taq(다카라바이오 제조) 0.5㎕을 각각 함유하고, 프로그램 템프 콘트롤 시스템 PC-700(ASTEK 제조)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 15회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, 224-N0C0에서 약 1.2kb, 그리고 224-N1C0에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물을 제한효소 PciI(New England Biolab 제조)와 BamHI(224-N0C0의 경우), 또는 제한효소NcoI과 BamHI(224-N1C0의 경우)로 2중 소화한 후, 겔 정제했다. 대장균발현용 벡터는 pTrc99A를 이용했다. 이 벡터를 같은 제한효소 PciI와 BamHI(224-N0C0를 도입할 경우), 또는 제한효소 NcoI와 BamHI(224-N1C0를 도입할 경우)로 2중 소화하여 겔 정제한 것을, 제한효소처리를 행한 PCR산물과 Takara Ligation Kit(다카라바이오 제조)를 이용해서 라이게이션하고, 대장균 TB1에 트랜스펙트했다. 통상적인 방법에 따라 플라스미드DNA를 추출, 제한효소분석하고, 삽입의 도입을 확인하고, 그리고 224-N0C0(ISH224-N0C0 제1 클론), 및 224-N1C0(ISH224-N1C0 제1 클론)의 전체 염기서열을 확인했다. 그 결과, ISH224-N0C0 제1 클론에 있어서는, 상술한 Leu에서 Phe로의 치환이 확인되었지만, 그 이외는 염기서열의 변이는 없었다. 마찬가지로 ISH224-N1C0 제1 클론의 경우는, 염기서열의 변이는 없고, 원하는 염기서열, 즉 서열표의 서열번호28 중, 제73번째의 염기에서 제1230번째의 염기까지를 포함하고 있었다.

(4) 발현유도와 활성측정

실시예 5(5) 와 동일하게, ISH224-N0C0 제1 클론 및 ISH224-N1C0 제1 클론의 2클론에 관해서, 단백질발현 유도실험을 행하고, 효소활성을 측정했다. 그 결과, 하기의 표 11에 나타낸 바와 같이, ISH224-N0C0 제1 클론 및 ISH224-N1C0 제1 클론의 조효소액중에 시알산 전이효소활성이 존재하는 것으로 나타났다.

표 11 : JT-ISH-224주 유래 JT-ISH-467 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자 호모로그를 제조합한 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

(5) α-2, 3시알산 전이효소활성의 확인

실시예 5(6)와 동일하게, ISH224-N0C0 제1 클론 및 ISH224-N1C0 제1 클론을 각각 대장균에 도입해서 효소를 발현시키고, 피리딜아미노화 락토오스를 당수용체로서 이용하는 반응에 의해, α-2,3시알산 전이효소활성을 조사했다. 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소에 의한 반응생성물을 HPLC에 의해 평가한 결과, 어느 쪽의 클론을 이용한 반응에 있어서도 피리딜아미노화α2,3-시알릴락토오스(피리딜아미노화3'-시알릴락토오스)의 피크가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-ISH-224주 유래의 시알산 전이효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는 것이 명확하게 되었다.

실시예 7: 비브리오속세포 JT - FAJ -16주 유래 β- 갈락토시드 -α2,3- 시알산전 이효소 유전자의 클로닝과 염기서열 해석, 및 해당 유전자의 대장균 발현

(1) JT - FAJ -16주 유래 β- 갈락토시드 α2,3-시알산 전이효소활성과 동효소 유전자의 존재의 확인

실시예 1에서 시알산 전이효소활성을 갖는 것이 분명해진 비브리오속 JT-FAJ-16주에 있어서, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재하는지의 여부를 명확하게 하기 위해서, 게노믹 서던 하이브리다이제이션을 실시했다. 실시예 5의 (1)에 기재한 방법으로, JT-FAJ-16주의 균체 펠렛으로부터 게놈 DNA를 조제했다. 다음에 실시예 5의 (3)에 기재한 대로, 제한효소 EcoRI, HindIII로 소화하고, 0.7% 아가로오스겔 전기영동으로 분획한 후, 0.4M NaOH를 이용한 알칼리 블럿팅에 의해, 겔을 Hybond-N+나일론 멤브레인 필터(아마샴바이오사이언스 제조)에 전사했다. 이 필터에 대하여, 상기의 929bp의 프로브(서열번호17)를 이용하고, 실시예 5의 (3)에 기재한 방법으로 서던 하이브리다이제이션을 행하였다. 다만, 하이브리다이제이션 온도, 및 세정 처리의 온도는, 55℃로 했다. 그 결과, EcoRI소화로, 3.6kb의 밴드가, HindIII소화로, 7kb의 밴드가 검출되었다. 즉, JT-FAJ-16주에는 JT-ISH-467주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 호모로그가 존재하는 것이 명확하게 되었다.

(2) JT - FAJ -16주 유래의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝

이어서, JT-FAJ-16주의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 클로닝을 행하였다. 실시예 5의 (1)에 기재한 방법으로, JT-FAJ-16주의 게놈 DNA로부터, λDASH II(Stratagene 제조)를 이용하여, 게놈 라이브러리를 구축했다. JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로 이용하여, JT-FAJ-16주의 게놈 라이브러리를 스크리닝했다. 다만, 하이브리다이제이션 실험은 ECL direct labelling & detection system(아마샴바이오사이언스 제조)을 사용했다. 키트 첨부의 설명서에 따라 프로브를 작성했다. 하이브리다이제이션은, 키트 중의 하이브리다이제이션 버퍼로 블록킹 시약을 5%(w/v), NaCl을 0.5M이 되도록 가하고, 37℃에서 4시간 행하였다. 세정은, 0.4% SDS, 0.5X SSC 중에서, 50℃에서 20분을 2회, 2X SSC 중에서 실온, 5분을 1회 행하였다. 시그널의 검출은, 키트 첨부의 설명서에 따랐다.

그 결과, 플라크 정제를 겸한 일차선발에서, 12클론을 얻었고, 그 중 6개의 λDNA를, 실시예 5의 (3)과 같이 QIAGEN Lambda Mini Kit(키아겐 제조)를 이용해서 정제했다. 또한, 이들의 λDNA샘플, 및 JT-FAJ-16주의 전체 게놈 DNA에 있어서, 제한효소 EcoRI로 소화했다. 소화물을 아가로오스겔 전기영동으로 분획하고, 상술한 바와 같이, 나일론 멤브레인 필터에 전사했다. 이 필터를 이용하여, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 부분단편(929bp;서열번호17)을 프로브로 이용하여, ECL 시스템을 이용하여, 상술과 같은 조건으로 서던 분석을 행하였다. 그 결과, 6개 모두의 λDNA샘플과 JT-FAJ-16주의 전체 게놈 DNA에 있어서, 3.6kb의 밴드가 검출되었다. 거기에서 λDNA샘플을 재차 EcoRI로 소화하고, 이 3.6kb의 DNA단편을 겔 정제하고, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-)의 EcoRI부위로 통상적인 방법에 따라 클로닝 했다.

다음에, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 포함하는 것으로 생각되는 EcoRI 3.6kb단편에 관해서, M13프라이머(다카라바이오 제조)를 이용하여, ABIPRISM형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer 제조)로, 양단의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 한쪽 단의 DNA서열로부터 추정되는 아미노산 서열이, 데이타베이스 검색에서 포토박테리움·담세라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 27%의 상동성을 나타냈다. JT-FAJ-16 주의 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 전체 염기서열을 완전히 결정하기 위해서, EcoRI 3.6kb단편으로부터 얻어진 DNA서열을 기초로, 하기의 표 12에 기재된 프라이머 1을 합성하고, 염기서열 결정에 이용했다.

표 12

얻어진 염기서열 데이타로부터, 이하의 표13에 기재된 프라이머를 더 설계, 합성하고, 전체 염기서열의 결정을 하였다.

표 13

그 결과, 서열표의 서열번호30의 서열을 얻었다, 2개의 서열은, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 염기서열이다. 최초의 ATG의 상류에는 같은 리딩 프레임에서 번역 종지코돈이 나타나므로, 이것이 본유전자의 번역 개시코돈이라고 생각된다. JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자의 ORF는, 1209염기로 이루어지고, 402개 아미노산을 코드했다. 이 아미노산 서열을 서열표의 서열번호31에 나타낸다. GENETYX Ver. 7을 이용해서 핵산, 및 아미노산 서열의 해석을 행한 바, JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자는, JT-ISH-467주 및 JT-ISH-224주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자와, 각각 69.7% 및 68%의 상동성을 갖고 있었다. 또한, 아미노산 서열에서도, 각각 64.7% 및 64.8%의 상동성을 나타냈다. 또한 JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열은, 포토박테리움·담세라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898)와 30.5%의 상동성, 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주 Pm70의 가정상의 단백질PM0188(AAKO2272)과 27.3%의 상동성을 나타내고, 유전자 DNA서열로는 각각 51.2%, 48.3%의 상동성이었다.

(3) 발현벡터의 구축

클론화한 유전자가, 시알산 전이효소활성을 갖는지의 여부를 조사하기 위해서, 동유전자의 전체길이, 및 N말단측의 시그널 펩티드 부분을 제거한 타입의 유전자를 발현벡터에 도입하고, 대장균내에서 단백질을 생산시키고, 이 발현 단백질의 활성을 측정했다.

JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소의 아미노산 서열에 있어서, 유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7로 해석을 행한 바, N말단의 22아미노산이 시그널 펩티드라고 예측되었다. 거기에서, 유전자 전체길이(본 실시예에 있어서, FAJ-N0C0라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 FAJ23STN0-BspHI(서열번호43), FAJ23STC0-BamHI(서열번호45), 또한 시그널 펩티드 부분의 아미노산이 제외된 타입의 단백질을 코드하는 유전자(본 실시예에 있어서, FAJ-N1C0라 표기한다)를 클론화하기 위한 프라이머 FAJ23STN1-BspHI(서열번호44), FAJ23STC0-BamHI(서열번호45)를 설계, 합성했다(표 14).

표 14

클로닝용에 프라이머로 미리 도입한 제한효소 BspHI(FAJ23STNO-BspHI, FAJ23STN1-BspHI), BamHI(FAJ23STCO-BamHI)부위를 밑줄로 나타냈다. 번역 개시코돈 ATG, 번역 종지코돈에 대응하는 상보 서열 TAA를 사각으로 둘러쌌다. 또한, 프라이머 서열 중, 주형 DNA와 어닐링하는 부분의 서열을 굵은 글씨로 나타냈다. 이들의 프라이머를 이용해서 PCR을 행하고, 발현벡터에 도입하기 위한 JT-FAJ-16주 유래 α2,3-시알산 전이효소 유전자를 증폭했다. 주형 DNA는 동유전자를 포함하는 상기 3.6kb의 DNA단편을 이용했다. PCR의 반응 조건은 하기와 같이 설정했다. 50㎕의 반응액 중에 주형 DNA 300ng, 10×Ex taq buffer 5㎕, 2.5mM 각 dNTP 4㎕, 프라이머50pmole, Ex taq(다카라바이오 제조) 0.5㎕를 각각 함유하고, 프로그램 템프 콘트롤 시스템PC-700(ASTEK 제조)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분을 10회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, FAJ-N0C0에서 약 1.2kb, FAJ-N1C0에서 약 1.1kb의 PCR산물이 증폭되었다. 이들의 PCR산물을, TA클로닝용 벡터pCR2.1TOPO(Invitrogen 제조)로, TA클로닝 키트(Invitrogen 제조)에 첨부된 설명서에 따라, 클로닝 했다. 대장균은 TB1을 사용했다. 얻어진 콜로니로부터 통상적인 방법으로 플라스미드를 정제하고, 제한효소 EcoRI로 PCR산물의 벡터로의 도입을 확인했다. 도입이 확인된 플라스미드 샘플을 제한효소 BspHI와 BamHI로 2중 소화한 후, 1.2kb(FAJ-N0C0) 또는 1.1kb(FAJ-N1C0)단편을 겔 정제했다. 이들의 DNA샘플을 미리 제한효소 NcoI와 BamHI로 2중 소화한 대장균 발현용 벡터 pTrc99A에, Takara Ligation Kit(다카라바이오 제조)를 이용해서 라이게이션하고, 대장균 TB1에 도입하였다. 통상적인 방법에 따라, 플라스미드 DNA를 추출, 제한효소 분석을 행하여 삽입의 도입을 확인하고, FAJ-N0C0의 대표 클론 1개(FAJ-N0C0 제1 클론) 및 FAJ-N1C0의 1N1C0의 대표 클론 2개(FAJ-N1C0 제1 클론 및 FAJ-N1C0 제2 클론)의 전체 염기서열을 확인했다. 그 결과, FAJ-N0C0 제1 클론의 경우, 염기서열의 변이는 없고, 소망하는 염기서열, 즉, 서열표의 서열번호30 중, 제1번째의 염기로부터 제1209번째의 염기까지를 포함하고 있었다. 한편, FAJ-N1C0의 경우, 그 제1 클론에는 염기서열의 변이는 없고, 소망하는 염기서열, 즉, 서열표의 서열번호30 중, 제67번째의 염기로부터 제1209번째의 염기까지를 포함하고 있었다. 제2 클론에서는, 서열번호30의 염기 중, 제631번째의 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 변화되어 있었다. 이것에 의해 코돈이 ACA에서 GCA로 변화되고, 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 알라닌(Ala)으로 변화되어 있었다. 이외에는 염기치환은 존재하지 않았다.

(4) 발현유도와 활성측정

실시예 5(5)와 동일하게, FAJ-N0C0 제1 클로닝, FAJ-N1C0 제1 클론 및 제2 클론의 3클론에 관해서, 단백질 발현 유도 실험을 행하고, 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 하기의 표 15에 나타낸 바와 같이, FAJ-N0C0 제1 클론 및 FAJ-N1C0 제1 클론 및 제2 클론의 조효소액 중에 시알산 전이효소활성이 존재하는 것으로 나타났다.

표 15 : JT-FAJ-16주 유래 JT-ISH-467 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 유전자 호모로그를 재조합하는 대장균의 파쇄액 중의 시알산 전이효소 활성

(5) α-2,3-시알산 전이효소의 확인

실시예 5(6)와 동일하게, FAJ-N0C0 제1 클론, 및 FAJ-N1C0 제1 클론 및 제2 클론의 3클론을 각각 대장균에 도입해서 효소를 발현시키고, 피리딜아미노화 갈락토오스를 당수용체로서 이용하는 반응에 의해, α-2,3시알산 전이효소활성을 조사했다. 대장균에서 발현되어진 시알산 전이효소에 의한 반응생성물을 HPLC에 의해 분석한 결과, 어느 쪽의 클론을 이용한 반응에 있어서도 피리딜아미노화α2,3-시알락토오스(피리딜아미노화3'-시알릴락토오스)의 피크가 검출되었다. 이 결과로부터, JT-FAJ-16주 유래의 시알산 전이효소가 α-2,3시알산 전이활성을 갖는 것이 명확하게 되었다.

실시예 8: 각종 시알산 전이효소 단백질의 아미노산 서열의 멀티 얼라인먼트 분석

유전 정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스사 제조)을 이용하여, 멀티 얼라인먼트 분석을 행하였다. 그 결과, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주 유래, 포토박테리움속 JT-ISH-224주 유래, 및 비브리오속 JT-FAJ-16주 유래의 α2,3-시알산 전이효소(각각 서열번호2, 29, 31), 포토박테리움·담세라의 α2,6-시알산 전이효소(JC5898), 및 파스퇴렐라·멀토시다아종 멀토시다주 Pm70의 가정상의 단백질PM0l88(AAKO2272)은 도 2와 같은 얼라인먼트를 나타냈다. 또한, JT-ISH-467주 유래 α2,3-시알산 전이효소에 있어서의 밑줄은 정제 단백질로부터 결정된 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예9 : β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소의 효소활성의 최적 pH 및 최적온도

조제한 정제 효소를 이용하여, JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, ISH467-N2C0 제3 클론, ISH224-N1C0 제1 클론, 및 FAJ-N1C0 제1 클론이 생산하는 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 최적 pH 및 최적온도를 조사했다.

(1) 효소활성의 최적 pH

아세트산 버퍼(pH4.0, pH4.5, 및 pH5.0), 카코딜산 버퍼(pH5.0, pH5.5, pH6.0, pH6.5, 및 pH7.0), 인산 버퍼(pH7.0, pH7.5, 및 pH8.0 ), TAPS 버퍼(pH8.0, pH8.5, 및 pH9.0), CHES 버퍼(pH9.0, pH9.5, 및 pHlO.0), CAPS 버퍼(pH10.0, pH10.5, 및 pH11.O)을 조제하고, 이것을 이용하여 25℃에서 각 pH에서의 효소활성을 측정했다.

그 결과, 도 3-1 및 도 3-2에 나타낸 바와 같이, JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에서는 pH5.0에서, ISH467-N2C0 제3 클론에서는 pH5.5에서, ISH224-N1C0 제1 클론에서는 pH5.0에서, FAJ-N1C0 제1 클론에서는 pH5.5에서, 효소활성이 최대였다. 그리고, 어느 효소에서도 pH5.0~pH7.0 혹은 pH9.0까지 높은 활성이었다. 또한, 각 pH에 있어서의 효소활성은 최대활성을 나타낸 pH에 있어서의 효소활성을 100으로 하는 상대 활성으로 나타냈다.

(2) 효소활성의 최적온도

JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에서는 pH5. 0에서, ISH467-N2C0 제3 클론에서는 카코딜산 버퍼(pH5.5)를 이용하여, ISH224-N1C0 제1 클론에서는 카코딜산 버퍼(pH5.0)를 이용하여, FAJ-N1C0 제1 클론에서는 카코딜산 버퍼(pH5.5)를 이용하여, 5℃에서 45℃까지의 5℃마다의 반응 온도에 있어서, 효소활성을 측정했다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소에서는 25℃에서, ISH467-N2C0 제3 클론에서는 25℃에서, ISH224-N1C0 제1 클론에서는 30℃에서, FAJ-N1C0 제1 클론에서는 20℃에서, 효소활성이 최대였다. 그리고, 어느 효소에서도 15℃ 혹은 20℃~30℃ 혹은 35℃까지 높은 활성이었다. 또한, 온도에 있어서의 효소활성은 최대활성을 나타낸 온도에 있어서의 효소활성을 100으로 하는 상대 활성으로 나타냈다.

실시예 10: β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소의 질량분석

포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 및 ISH467-N0C0 제2 클론, 1SH467-N2C0 제3 클론, ISH224-N1C0 제1 클론, 및 FAJ-N1C0 제1 클론이 생산하는 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소의 정제 효소를, 레이저 이온화 비행시간형 질량분석장치(주식회사 시마즈제작소MALDI-TOFMS AXIMA-CFR)에 의해 질량분석한 결과, 분자량은 각각 45,026Da, 45,023Da, 44,075Da, 43,996Da, 및 43,921Da이었다.

ISH467-N2C0 제3 클론, ISH224-N1C0 제1 클론, 및 FAJ-N1C0 제1 클론에 있어서는, 질량분석의 결과와 아미노산 서열로부터 추정된 분자량은 일치했다. 그렇지만, 포토박테리움·포스포레움 JT-ISH-467주가 생산하는 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소, 및 ISH467-N0C0 제2 클론에 대해서는, 질량분석의 결과와 아미노산 서열로부터 추정된 분자량은 일치하지 않았다. 이것은, 이들의 두개의 효소의 아미노산 서열에 리포복스(lipobox)라 칭하는 공통서열(Leu-Gly-Gly-Cys:서열번호2의 아미노산 잔기19~22)이 포함되기 때문에, 세균내에서, 이 공통서열의 Cys의 아미노 말단측에서 절단되어, 리포복스중의 Cys에 지방질이 부가되었기 때문인 것으로 생각된다(Madan Babu, M. and Sankaran, K., Bioinformatics., 18, 641-643(2002)).

실시예 11: 재조합 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소의 수용체 기질특이성(단당·이당류· 삼당류 )의 비교

(재료 및 방법)

ISH467-N2C0 제3 클론 재조합 대장균, ISH224-N1C0 제1 클론 재조합 대장균, 및 FAJ-N1C0 제1 클론 재조합 대장균으로부터 조제한 균체 파쇄액을, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용해서 전기영동적으로 단일 밴드까지 정제한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 이용하여, 각종의 단당류, 이당류 및 3당류에의 시알산의 전이 활성의 유무를 조사하기 위해서, 이하의 실험을 행하였다.

각종의 당수용체 기질을 이용하는 시알산 전이반응

반응용액 24㎕ 중에, 당공여체 기질 CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함하는 CMP-NeuAc(21.9nmol, 반응용액 중에서의 최종농도:0.874mM), 20mM 카코딜산 완충액(pH5.0)으로 용해한 각종 당수용체 기질(1μmol, 반응용액 중에서의 최종농도:42mM), 시알산 전이효소(효소량은 표각주에 나타냈다), NaCl(반응용액 중에서의 최종농도:500mM)로 이루어지는 반응용액을 조제하고, 표각주의 조건에서 반응했다. 또한, 당수용체 기질로서 이용한 단당은, 메틸-α-D-갈락토피라노시드(Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노시드(Gal-β-OMe), 메틸-α-D-글루코피라노시드(Glc-α-OMe), 메틸-β-D-글루코피라노시드(Glc-β-OMe), 메틸-α-D-만노피라노시드(Man-α-OMe), 메틸-β-D-만노피라노시드(Man-β-OMe), 메틸-α-D-푸코시노피라노시드(Fuc-α-OMe), 메틸-β-D-푸코시노피라노시드(Fuc-β-OMe), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GalNAc)의 10종류를 이용했다. 이당류로서, 락토오스(Gal-β1,4-Glc), N-아세틸락토사민(Gal-β1,4-GlcNAc), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-N-아세틸글루코사미니드(Gal-β1,3-GlcNAc-β-OMe), 메틸-α-D-갈락토피라노실α1,3-갈락토피라노시드(Gal-α1,3-Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노실-β1,3-갈락토피라노시드(Gal-β1,3-Gal-β-OMe)의 5종류를 이용했다. 3당류로서, 2'-푸코실락토오스(Fuc-α1,2-Galβ1,4-Glc)의 1종류를 이용했다. 다만, 표 18에 나타내는 당쇄, 메틸-α-D-갈락토피라노실-α1,3-갈락토피라노시드(Gal-α1,3-Gal-α-OMe), 메틸-β-D-갈락토피라노실β1,3-갈락토피라노시드(Gal-β1,3-Gal-β-OMe) 및 2'-푸코실락토오스(Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc)에 관해서는 최종농도8.4mM로 반응시켰다.

효소반응 종료 후, 반응용액에 1.98㎖의 5mM 인산 버퍼(pH6.8)를 첨가해서 효소반응을 정지했다. 그 후, 5mM 인산 버퍼(pH6.8)로 희석한 효소반응용액(2㎖)을 AG1-×2Resin(PO₄ ^{3 -}폼, 0.2×2cm)컬럼에 적용했다. 이 컬럼은, AG1-×2Resin(OH^-form, BIO-RAD사 제조)을 1M 인산 버퍼(pH6.8)에 현탁하고, 30분 후, 레진을 증류수로 세정한 후, 증류수에 현탁해서 작성했다. 이 컬럼의 용출액(0~2㎖)의 방사 활성을 측정했다. 이 컬럼의 용출액에는, 반응에서 생긴 ¹⁴C-NeuAc(N-아세틸노이라민산)이 결합한 반응생성물 및 미반응의 당수용체 기질이 포함되지만, 미반응의 CMP-¹⁴C-NeuAc은 컬럼에 유지된 채이다. 따라서, 효소반응의 결과 생긴 각종 시알산 함유 당쇄유래의 ¹⁴C의 방사 활성은, 모두 반응생성물 유래이며, 이 분획의 방사 활성으로부터 효소활성을 산출할 수 있다.

상기의 방법을 이용하고, 각각의 당수용체 기질에 전이된 NeuAc의 방사 활성을 측정해서 전이된 시알산을 산출했다.

( 결과 )

이번 당수용체 기질로서 이용한 16종류의 단당, 2당, 3당의 어느 것에도 고효율로 시알산이 전이하고 있는 것이 명확하게 되었다(표16, 표17 및 표18). 또한, 각 수용체 기질에 대한 상대활성은 락토오스에 대한 시알산 전이활성을 100으로 한 값이다.

표 16 : 수용체기질 특이성(1)

반응조건

반응조성:

1μmol 수용체 기질(20mM 카코딜산 버퍼, pH5.0) 11.8㎕

CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함하는 CMP-NeuAc(21.9nmol (약 20000cpm) 4.8㎕

효소액 5㎕(약 2.5mU)

5M NaCl 2.4㎕

반응온도: 2.0℃

반응시간: 14시간

표 17 : 수용체기질 특이성(2)

반응조건

반응조성:

1μmol 수용체 기질(20mM 카코딜산 버퍼, pH5.0) 11.8㎕

CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함하는 CMP-NeuAc(21.9nmol (약 18500cpm) 4.8㎕

효소액 5㎕

5M NaCl 2.4㎕

반응온도: 30℃

반응시간: 0.5분간 또는 2분간

효소량: 반응 당 ISH467-N2C0에서는 2.3mU, ISH224-N1C0에서는 1.0mU

표 18 : 수용체기질 특이성(3)

반응조건

반응조성:

0.2μmol 수용체 기질(20mM 카코딜산 버퍼, pH5.0) 11.8㎕

CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함하는 CMP-NeuAc(21.9nmol (약 18500cpm) 4.8㎕

효소액 5㎕

5M NaCl 2.4㎕

반응온도: 30℃

반응시간: 2분간

효소량: 반응 당 ISH467-N2C0에서는 2.3mU, ISH224-N1C0에서는 1.0mU

실시예 12: 재조합 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소의 당단백질에 대한 당수용체 기질 특이성

ISH467-N2C0 제3 클론 재조합 대장균, ISH224-N1C0 제1 클론 재조합 대장균 및 FAJ-N1C0 제1 클론 재조합 대장균으로부터 조제한 균체 파쇄액을, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용해서 전기영동적으로 단일 밴드까지 정제한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 이용하여, 당단백질 에서의 시알산의 전이 활성의 유무를 조사하기 위해서, 이하의 실험을 행하였다.

당수용체 기질로서, 아시알로페투인(Asialofetuin)을 이용했다. 2mg의 아시알로페투인을 1㎖의 20mM Bis-tris 완충액(pH6.0)에 용해시켜서, 당수용체 기질용액으로 했다. 당공여체 기질로서 CMP-¹⁴C-NeuAc를 포함하는 CMP-NeuAc를 이용했다. 당수용체 기질용액 40㎕, 당공여체 기질 5㎕(22.8nmol(약 19,000cpm)), 효소용액 5㎕(모두 10mU)을 혼합하고, 25℃, 2시간 인큐베이트하여 시알산 전이반응을 행하였다. 반응 종료 후, 반응용액을 0.1M 염화나트륨으로 평형화한 세파덱스 G-50슈퍼파인(0.8×18.Ocm)에 채워, 겔여과를 행하였다. 당단백질이 포함되는 겔여과의 용출액 분획(2~4㎖의 분획)을 모으고, 이 분획의 방사 활성을 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 이용해서 측정함으로써 당수용체 기질에 전이한 시알산의 정량을 행하였다.

그 결과, 표 19에 나타낸 바와 같이, 어느 효소도 아시알로페투인에 시알산을 전이시키는 것이 명확하게 되었다.

표 19 : 수용체기질 특이성(4)

반응조건

반응조성:

아시알로페투인 용액 10㎕

효소액 5㎕

5mM CMP-시알산(20mM 카코딜산 완충액(pH 5)중)+¹⁴C-CMP-시알산 5㎕

실시예13 : 재조합 β- 갈락토시드 -α2,3-시알산 전이효소의 PA당쇄에 대한 수용체 기질 특이성

ISH467-N2C0 제3 클론 재조합 대장균, ISH224-N1C0 제1 클론 재조합 대장균 및 FAJ-N1C0 제1 클론 재조합 대장균으로부터 조제한 균체 파쇄액을, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용하고 전기영동적으로 단일 밴드까지 정제한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 이용하여, PA당쇄에서의 시알산 전이활성의 유무를 조사하기 위해서, 이하의 실험을 행하였다.

실시예 3과 동일하게, 당수용체로서 피리딜아미노화 락토오스(Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오사 제조 PA-Sugar Chain O26), 피리딜아미노화 GM1-pentasaccharide(Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오사 제조 PA-Sugar Chain 032) 및 피리딜아미노화 GD1b-hexasaccharide(Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-8Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-PA, 다카라바이오사 제조 PA-Sugar Chain 034)를 이용하고, 표 각주의 조건에서, 효소반응을 행하였다. 반응 종료 후, 95℃에서 5분간, 반응용액을 열처리함으로써 효소를 실활시키고, HPLC로 분석했다.

그 결과, PA-Sugar Chain 026을 수용체 기질로 했을 경우, 어느 효소에 있어서도, PA-Sugar Chain 029표품과 동일용출 시간의 피크가 검출되었다. 마찬가지로, PA-Sugar Chain 032를 수용체 기질로 했을 경우에는 PA-Sugar Chain 033표품과 동일용출 시간의 피크가, PA-Sugar Chain 034를 수용체 기질로 했을 경우, PA-Sugar Chain 036표품과 동일용출 시간의 피크가, 각각 검출되었다. 따라서, JT-ISH-467주 유래, JT-ISH-224주 유래 및 JT-FAJ-16주 유래의 재조합 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소는, 사용한 PA당쇄의 비환원 말단에 있는 갈락토오스에, 시알산을 α2, 3결합으로 전이하는 활성을 갖는 것이 명확하게 되었다.

표 20 : 수용체기질 특이성(5)

반응조건

반응조성:

PA당쇄(10pmol/㎕) 2.5㎕

5mM CMP-시알산(20mM 카코딜산 완충액(pH5)중) 5㎕

3M NaCl 2.5㎕

효소액 5㎕(0.1mU)

반응온도: 20℃

반응시간: ISH467-N2C0에서는 3시간, ISH224-N1C0에서는 16시간, FAJ-N1C0에서는 24시간

본 발명은, 신규한 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소 및 그것을 코드하는 핵산을 제공함으로써, 생체내에 있어서, 중요한 기능을 갖는 것이 분명해진 당쇄의 합성·생산 수단을 제공한다. 특히, 시알산은, 생체내의 복합 당질당쇄에 있어서 비환원 말단에 존재하는 일이 많고, 당쇄기능이라는 관점에서 특히 중요한 당이기 때문에, 시알산 전이효소는 당전이효소 중에서도 가장 수요가 높은 효소의 하나이다. 본 발명의 신규한 시알산 전이효소는, 당쇄를 응용한 의약품, 기능성 식품 등의 개발에 이용하는 것이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO INC. <120> A Novel β-galactoside-α2,3-sialyltransferase, a gene encoding thereof, and a method for producing therof. <130> YCT-1154 <150> PCT/JP2005/007340 <151> 2005-04-15 <150> PCT/JP2005/010814 <151> 2005-06-13 <160> 45 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1230 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> CDS <222> (1)..(1230) <223> /gene="467-23ST" /product="β-galactoside-α2,3-sialyltransferase" <400> 1 atg ttc gtt ttt tgt aaa aaa ata ttt ttt ttg att ttt att tca cta 48 Met Phe Val Phe Cys Lys Lys Ile Phe Phe Leu Ile Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 atg att ctg ggg ggc tgt aat agt gac tct aag cac aat aac tca gat 96 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 ggt aat att aca aaa aat aaa aca ata gaa gtt tat gtt gat aga gca 144 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 aca tta cca act att caa caa atg act cag att att aat gaa aat tca 192 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 aat aat aag aaa ctt att tct tgg tct cga tac cct att aat gat gaa 240 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 acg tta tta gaa tca att aat gga tca ttt ttt aaa aat agg cca gag 288 Thr Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Arg Pro Glu 85 90 95 cta att aaa tct ctt gat tct atg ata ctt act aat gag att aaa aaa 336 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys Lys 100 105 110 gta atc att aat ggt aat acc tta tgg gca gta gat gtc gtt aat att 384 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Val Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 ata aaa tca att gaa gct ctt gga aaa aaa aca gag att gaa cta aat 432 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Leu Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 ttt tat gat gac ggt agt gca gaa tat gtt cga tta tat gac ttt tca 480 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 aga tta cct gaa tca gaa caa gaa tat aaa ata tcc tta tca aag gat 528 Arg Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 aac att caa tca agt ata aat gga act caa cca ttt gat aac tca att 576 Asn Ile Gln Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asn Ser Ile 180 185 190 gaa aat atc tat ggc ttt tcg cag tta tac cca aca aca tat cat atg 624 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 ctc aga gca gat att ttt gaa act aat tta cct ttg acc tct ttg aaa 672 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Thr Ser Leu Lys 210 215 220 aga gta ata tca aat aat att aag caa atg aaa tgg gat tat ttt aca 720 Arg Val Ile Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Thr 225 230 235 240 act ttt aat tcc caa cag aag aat aaa ttc tat aat ttc acg gga ttt 768 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 aac cca gaa aaa att aag gaa caa tat aaa gca agc cct cat gaa aat 816 Asn Pro Glu Lys Ile Lys Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro His Glu Asn 260 265 270 ttt att ttt atc gga act aat tca gga aca gca acg gca gag caa caa 864 Phe Ile Phe Ile Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 ata gat att ctt aca gaa gct aaa aag cca gat agc ccg ata ata act 912 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Lys Pro Asp Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 aat tca att caa gga ttg gat ttg ttt ttc aaa gga cat ccg agt gca 960 Asn Ser Ile Gln Gly Leu Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 act tat aat caa caa atc att gat gct cat aat atg att gaa att tat 1008 Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 aat aag ata cca ttt gaa gct cta ata atg act gat gca ttg cct gat 1056 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 gct gtc ggt gga atg gga agt tcg gta ttt ttt agc ttg cca aat aca 1104 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 gta gag aat aaa ttt att ttt tat aaa agt gat acg gat att gaa aat 1152 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 aat gct ctt ata caa gta atg att gaa ctg aat atc gtt aat aga aat 1200 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 gat gtt aag ttg ata agt gat ttg cag taa 1230 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 2 <211> 409 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 2 Met Phe Val Phe Cys Lys Lys Ile Phe Phe Leu Ile Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Arg Pro Glu 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys Lys 100 105 110 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Val Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Leu Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 Arg Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 Asn Ile Gln Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asn Ser Ile 180 185 190 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Thr Ser Leu Lys 210 215 220 Arg Val Ile Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Thr 225 230 235 240 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 Asn Pro Glu Lys Ile Lys Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro His Glu Asn 260 265 270 Phe Ile Phe Ile Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Lys Pro Asp Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Ile Gln Gly Leu Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 3 <211> 1397 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <400> 3 gctgacgagc ggcggacggg tgagtaatgc ctgggaatat accctgatgt gggggataac 60 tattggaaac gatagctaat accgcataat ctcttcggag caaagagggg gaccttcggg 120 cctctcgcgt caggattagc ccaggtggga ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca 180 aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgatcagcca cactggaact gagacacggt 240 ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca 300 gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag tactttcagt tgtgaggaag 360 gcgttggagt taatagcttc agcgcttgac gttagcaaca gaagaagcac cggctaactc 420 cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 480 agcgcatgca ggcggtctgt taagcaagat gtgaaagccc ggggctcaac ctcggaacag 540 cattttgaac tggcagacta gagtcttgta gaggggggta gaatttcagg tgtagcggtg 600 aaatgcgtag agatctgaag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga 660 cgctcagatg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 720 aaacgatgtc tacttgaagg ttgtggcctt gagccgtggc tttcggagct aacgcgttaa 780 gtagaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 840 cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg 900 acatccagag aattcgctag agatagctta gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg 960 catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020 cttatccttg tttgccagca cgtaatggtg ggaactccag ggagactgcc ggtgataaac 1080 cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt 1140 gctacaatgg cgtatacaga gggctgcaag ctagcgatag tgagcgaatc ccacaaagta 1200 cgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc 1260 gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320 atgggagtgg gctgcaccag aagtagatag cttaaccttc gggagggcgt ttaccacggt 1380 gtggttcatg actgggg 1397 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa refers to any amino acid <400> 4 Xaa Asn Ser Asp Ser Lys His Asn Asn Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 5 Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 6 Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Pro Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 7 Gly His Pro Ser Ala Thr Tyr Asn Gln Gln Ile Ile Asp Ala His Asn 1 5 10 15 Met Ile Glu Ile Tyr 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 is inosine <400> 8 aaywsngayw snaarcayaa yaa 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV2 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 refers to inosine <400> 9 gaywsnaarc ayaayaayws 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467N-RV3 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 6 refers to inosine <400> 10 aaywsngayw snaarcayaa yaa 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1RV <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <400> 11 athathgayg cncayaayat g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1FW <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n at position 10 refers to any nucleobase <400> 12 catrttrtgn gcrtcdatda t 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1RV2 <400> 13 tayaaycarc arathathga ygc 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in1FW2 <400> 14 gcrtcdatda tytgytgrtt rta 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in2RV <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n at position 15 refers to any nucleobase <400> 15 tayaayttya cnggnttyaa ycc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467in2FW <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n at position 9 refers to any nucleobase <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 refers to any nucleobase <400> 16 ggrttraanc cngtraartt rta 23 <210> 17 <211> 929 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n at position 39 refers to any nucleobase <400> 17 aactggactg gaagcattat aactcagatg gtaatattnc aaaaaataaa ccaatagaag 60 tttatgttga tagagcaaca ttaccaacta ttcaacaaat gactcagatt attaatgaaa 120 attcaaataa taagaaactt atttcttggt ctcgataccc tattaatgat gaaacgttat 180 tagaatcaat taatggatca ttttttaaaa ataggccaga gctaattaaa tctcttgatt 240 ctatgatact tactaatgag attaaaaaag taatcattaa tggtaatacc ttatgggcag 300 tagatgtcgt taatattata aaatcaattg aagctcttgg aaaaaaaaca gagattgaac 360 taaattttta tgatgacggt agtgcagaat atgttcgatt atatgacttt tcaagattac 420 ctgaatcaga acaagaatat aaaatatcct tatcaaagga taacattcaa tcaagtataa 480 atggaactca accatttgat aactcaattg aaaatatcta tggcttttcg cagttatacc 540 caacaacata tcatatgctc agagcagata tttttgaaac taatttacct ttgacctctt 600 tgaaaagagt aatatcaaat aatattaagc aaatgaaatg ggattatttt acaactttta 660 attcccaaca gaagaataaa ttctataatt tcacgggatt taacccagaa aaaattaagg 720 aacaatataa agcaagccct catgaaaatt ttatttttat cggaactaat tcaggaacag 780 caacggcaga gcaacaaata gatattctta cagaagctaa aaagccagat agcccgataa 840 taactaattc aattcaagga ttggatttgt ttttcaaagg acatccgagt gcaacttata 900 atcaacaaat catcgacgcg cacaacatg 929 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV1 <400> 18 tgttgataga gcaacattac c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV2 <400> 19 tggtaatacc ttatgggcag 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV3 <400> 20 gaacagcaac ggcagagc 18 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinRV4 <400> 21 ctaattcaat tcaaggattg g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinFW1 <400> 22 tggtaatgtt gctctatcaa c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinFW2 <400> 23 actgcccata aggtattacc 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23STinFW3 <400> 24 gctctgccgt tgctgttc 18 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23ST-N2-Nco <400> 25 gggctgtacc atggactcta agcacaataa ctcag 35 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 467-23ST-CO-Bm <400> 26 cttagaatgg atccttactg caaatcactt atcaac 36 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 467-23ST-N0-Pci <400> 27 aagggaatac atgttcgttt tttgtaaaaa aata 34 <210> 28 <211> 1230 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1230) <223> /gene="224-23ST" /product="꺚-galactoside-꺙-2,3-sialyltransferase" <400> 28 atg ctc gtt ttt tgt aaa aaa atg ttt ttt tca gtt ttt att tca cta 48 Met Leu Val Phe Cys Lys Lys Met Phe Phe Ser Val Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 atg att ctt ggg gga tgt aat agt gac tct aat cac aat aac tca gat 96 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Asn His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 gga aat att aca aaa aat aaa aca ata gaa gtt tat gtt gat aga gca 144 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 aca tta cca act att caa caa atg act cag att att aat gaa aat tca 192 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 aat aac aaa aaa ctg att tct tgg tca cga tac cct att aat gat gaa 240 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 gag tta ttg gaa tca att aat ggc tca ttt ttt aaa aat aat tca gag 288 Glu Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Asn Ser Glu 85 90 95 cta att aag tct ctt gat tct atg ata ctt act aat gat ata aaa aaa 336 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Asp Ile Lys Lys 100 105 110 gta atc atc aac ggt aat acc tta tgg gca gca gat gtc gtt aat att 384 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Ala Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 ata aaa tca att gaa gct ttt gga aaa aaa aca gaa ata gaa cta aat 432 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 ttt tat gat gat ggt agt gcg gaa tat gtt cgt tta tat gac ttt tca 480 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 aaa tta cca gaa tca gaa cag gaa tat aaa att tct ttg tca aag gat 528 Lys Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 aac att ctt tca agt ata aat gga act caa cca ttt gaa aat gtt gtt 576 Asn Ile Leu Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Glu Asn Val Val 180 185 190 gaa aac att tat ggt ttt tct cag tta tac cca acg aca tat cat atg 624 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 ctc aga gct gat att ttt gaa act aat tta cca ttg aga tcc ttg aaa 672 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Ser Leu Lys 210 215 220 ggg gta tta tca aat aat att aag caa atg aaa tgg gac tac ttt aaa 720 Gly Val Leu Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys 225 230 235 240 act ttc aat tca cag cag aag gat aaa ttt tat aat ttt aca ggc ttt 768 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 aac cca gac gaa att atg gag caa tat aaa gca agt cct aat aaa aac 816 Asn Pro Asp Glu Ile Met Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro Asn Lys Asn 260 265 270 ttt att ttt gtc ggt act aat tca gga act gca aca gca gag caa caa 864 Phe Ile Phe Val Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 att gat att ctg aca gaa gct aaa aat cca aat agt cct ata ata act 912 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Asn Pro Asn Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 aaa tca att caa ggg ttt gat ttg ttt ttt aaa gga cat cct agt gca 960 Lys Ser Ile Gln Gly Phe Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 act tat aat aaa caa atc ata gat gct cat aat atg att gaa att tat 1008 Thr Tyr Asn Lys Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 aat aag ata cca ttt gaa gct cta atc atg act gat gca ttg cct gat 1056 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 gct gtc ggt gga atg gga agt tcg gta ttt ttt agc ttg cca aat aca 1104 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 gta gag aat aaa ttt att ttt tat aaa agt gat acg gat att gaa aat 1152 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 aat gct ctt ata caa gtt atg att gaa cta aat att gtc aat aga aat 1200 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 gat gtt aag ttg ata agt gat ttg cag taa 1230 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 29 <211> 409 <212> PRT <213> Photobacterium sp. <400> 29 Met Leu Val Phe Cys Lys Lys Met Phe Phe Ser Val Phe Ile Ser Leu 1 5 10 15 Met Ile Leu Gly Gly Cys Asn Ser Asp Ser Asn His Asn Asn Ser Asp 20 25 30 Gly Asn Ile Thr Lys Asn Lys Thr Ile Glu Val Tyr Val Asp Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Pro Thr Ile Gln Gln Met Thr Gln Ile Ile Asn Glu Asn Ser 50 55 60 Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 Glu Leu Leu Glu Ser Ile Asn Gly Ser Phe Phe Lys Asn Asn Ser Glu 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Leu Asp Ser Met Ile Leu Thr Asn Asp Ile Lys Lys 100 105 110 Val Ile Ile Asn Gly Asn Thr Leu Trp Ala Ala Asp Val Val Asn Ile 115 120 125 Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Lys Lys Thr Glu Ile Glu Leu Asn 130 135 140 Phe Tyr Asp Asp Gly Ser Ala Glu Tyr Val Arg Leu Tyr Asp Phe Ser 145 150 155 160 Lys Leu Pro Glu Ser Glu Gln Glu Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Lys Asp 165 170 175 Asn Ile Leu Ser Ser Ile Asn Gly Thr Gln Pro Phe Glu Asn Val Val 180 185 190 Glu Asn Ile Tyr Gly Phe Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met 195 200 205 Leu Arg Ala Asp Ile Phe Glu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Ser Leu Lys 210 215 220 Gly Val Leu Ser Asn Asn Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys 225 230 235 240 Thr Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asn Phe Thr Gly Phe 245 250 255 Asn Pro Asp Glu Ile Met Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Pro Asn Lys Asn 260 265 270 Phe Ile Phe Val Gly Thr Asn Ser Gly Thr Ala Thr Ala Glu Gln Gln 275 280 285 Ile Asp Ile Leu Thr Glu Ala Lys Asn Pro Asn Ser Pro Ile Ile Thr 290 295 300 Lys Ser Ile Gln Gly Phe Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala 305 310 315 320 Thr Tyr Asn Lys Gln Ile Ile Asp Ala His Asn Met Ile Glu Ile Tyr 325 330 335 Asn Lys Ile Pro Phe Glu Ala Leu Ile Met Thr Asp Ala Leu Pro Asp 340 345 350 Ala Val Gly Gly Met Gly Ser Ser Val Phe Phe Ser Leu Pro Asn Thr 355 360 365 Val Glu Asn Lys Phe Ile Phe Tyr Lys Ser Asp Thr Asp Ile Glu Asn 370 375 380 Asn Ala Leu Ile Gln Val Met Ile Glu Leu Asn Ile Val Asn Arg Asn 385 390 395 400 Asp Val Lys Leu Ile Ser Asp Leu Gln 405 <210> 30 <211> 1209 <212> DNA <213> Vibrio sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1209) <223> /gene="FAJ16-23ST" 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Ile Asp Asn Leu Ile Ile His Gly Asn 100 105 110 aca ctc tgg tct ata gat gta gta gat ata ata aaa gaa gtt aat ctc 384 Thr Leu Trp Ser Ile Asp Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Val Asn Leu 115 120 125 ctc ggg aaa aac ata cca att gaa tta cat ttt tat gac gat ggt tca 432 Leu Gly Lys Asn Ile Pro Ile Glu Leu His Phe Tyr Asp Asp Gly Ser 130 135 140 gct gaa tat gtg aga ata tac gaa ttt tca aaa ctg cct gag tca gaa 480 Ala Glu Tyr Val Arg Ile Tyr Glu Phe Ser Lys Leu Pro Glu Ser Glu 145 150 155 160 caa aaa tac aaa acg tca cta tct aaa aac aac ata aaa ttc agc ata 528 Gln Lys Tyr Lys Thr Ser Leu Ser Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ser Ile 165 170 175 gat ggg act gat tca ttt aaa aac aca ata gaa aac att tat gga ttc 576 Asp Gly Thr Asp Ser Phe Lys Asn Thr Ile Glu Asn Ile Tyr Gly Phe 180 185 190 tca caa tta tac cca aca aca tat cac atg tta aga gcg gat ata ttc 624 Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met Leu Arg Ala Asp Ile Phe 195 200 205 gat aca aca tta aaa ata aac cca ttg aga gag ttg ctt tca aat aat 672 Asp Thr Thr Leu Lys Ile Asn Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ser Asn Asn 210 215 220 ata aaa caa atg aaa tgg gat tac ttt aaa gac ttt aat tat aaa caa 720 Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys Asp Phe Asn Tyr Lys Gln 225 230 235 240 aaa gat att ttt tac tct ttg act aac ttc aac cca aaa gaa ata cag 768 Lys Asp Ile Phe Tyr Ser Leu Thr Asn Phe Asn Pro Lys Glu Ile Gln 245 250 255 gaa gat ttc aac aaa aac tca aat aaa aac ttc att ttt ata gga agt 816 Glu Asp Phe Asn Lys Asn Ser Asn Lys Asn Phe Ile Phe Ile Gly Ser 260 265 270 aat agt gct aca gca aca gca gaa gag caa ata aat att att tca gaa 864 Asn Ser Ala Thr Ala Thr Ala Glu Glu Gln Ile Asn Ile Ile Ser Glu 275 280 285 gca aaa aaa gaa aat agt agc att ata aca aac tct ata tca gac tat 912 Ala Lys Lys Glu Asn Ser Ser Ile Ile Thr Asn Ser Ile Ser Asp Tyr 290 295 300 gat tta ttt ttc aaa ggc cac cca agc gcc aca ttc aac gaa caa ata 960 Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala Thr Phe Asn Glu Gln Ile 305 310 315 320 att aat gca cac gat atg atc gaa att aac aac aag atc cca ttc gaa 1008 Ile Asn Ala His Asp Met Ile Glu Ile Asn Asn Lys Ile Pro Phe Glu 325 330 335 gcg tta ata atg aca gga ata cta cct gat gct gta ggt ggg atg ggt 1056 Ala Leu Ile Met Thr Gly Ile Leu Pro Asp Ala Val Gly Gly Met Gly 340 345 350 agt tct gtt ttc ttt agc att cca aaa gaa gtg aaa aac aaa ttt gtt 1104 Ser Ser Val Phe Phe Ser Ile Pro Lys Glu Val Lys Asn Lys Phe Val 355 360 365 ttt tat aaa agc ggt acg gat ata gaa aac aat agc cta ata caa gta 1152 Phe Tyr Lys Ser Gly Thr Asp Ile Glu Asn Asn Ser Leu Ile Gln Val 370 375 380 atg cta aaa ctt aac tta ata aat cgt gac aat ata aaa cta atc agc 1200 Met Leu Lys Leu Asn Leu Ile Asn Arg Asp Asn Ile Lys Leu Ile Ser 385 390 395 400 gac att taa 1209 Asp Ile <210> 31 <211> 402 <212> PRT <213> Vibrio sp. <400> 31 Met Lys Asn Ile Ile Thr Lys Arg Met Leu Ile Ile Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ile Gly Cys Asn Asn Asp Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Ile Glu Ile Tyr Val Asp Arg Ala Thr Leu Pro Thr Ile Gln 35 40 45 Gln Met Thr Lys Ile Val Ser Gln Lys Thr Ser Asn Lys Lys Leu Ile 50 55 60 Ser Trp Ser Arg Tyr Pro Ile Thr Asp Lys Ser Leu Leu Lys Lys Ile 65 70 75 80 Asn Ala Glu Phe Phe Lys Glu Gln Phe Glu Leu Thr Glu Ser Leu Lys 85 90 95 Asn Ile Ile Leu Ser Glu Asn Ile Asp Asn Leu Ile Ile His Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Trp Ser Ile Asp Val Val Asp Ile Ile Lys Glu Val Asn Leu 115 120 125 Leu Gly Lys Asn Ile Pro Ile Glu Leu His Phe Tyr Asp Asp Gly Ser 130 135 140 Ala Glu Tyr Val Arg Ile Tyr Glu Phe Ser Lys Leu Pro Glu Ser Glu 145 150 155 160 Gln Lys Tyr Lys Thr Ser Leu Ser Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ser Ile 165 170 175 Asp Gly Thr Asp Ser Phe Lys Asn Thr Ile Glu Asn Ile Tyr Gly Phe 180 185 190 Ser Gln Leu Tyr Pro Thr Thr Tyr His Met Leu Arg Ala Asp Ile Phe 195 200 205 Asp Thr Thr Leu Lys Ile Asn Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ser Asn Asn 210 215 220 Ile Lys Gln Met Lys Trp Asp Tyr Phe Lys Asp Phe Asn Tyr Lys Gln 225 230 235 240 Lys Asp Ile Phe Tyr Ser Leu Thr Asn Phe Asn Pro Lys Glu Ile Gln 245 250 255 Glu Asp Phe Asn Lys Asn Ser Asn Lys Asn Phe Ile Phe Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Ser Ala Thr Ala Thr Ala Glu Glu Gln Ile Asn Ile Ile Ser Glu 275 280 285 Ala Lys Lys Glu Asn Ser Ser Ile Ile Thr Asn Ser Ile Ser Asp Tyr 290 295 300 Asp Leu Phe Phe Lys Gly His Pro Ser Ala Thr Phe Asn Glu Gln Ile 305 310 315 320 Ile Asn Ala His Asp Met Ile Glu Ile Asn Asn Lys Ile Pro Phe Glu 325 330 335 Ala Leu Ile Met Thr Gly Ile Leu Pro Asp Ala Val Gly Gly Met Gly 340 345 350 Ser Ser Val Phe Phe Ser Ile Pro Lys Glu Val Lys Asn Lys Phe Val 355 360 365 Phe Tyr Lys Ser Gly Thr Asp Ile Glu Asn Asn Ser Leu Ile Gln Val 370 375 380 Met Leu Lys Leu Asn Leu Ile Asn Arg Asp Asn Ile Lys Leu Ile Ser 385 390 395 400 Asp Ile <210> 32 <211> 1500 <212> DNA <213> Photobacterium sp. <400> 32 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggtaacagat tgatagcttg 60 ctatcaatgc tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgcct gggaatatac cctgatgtgg 120 gggataacta ttggaaacga tagctaatac cgcataatct cttcggagca aagaggggga 180 ccttcgggcc tctcgcgtca ggattagccc aggtgggatt agctagttgg tggggtaatg 240 gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctggaactga 300 gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc 360 ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagttg 420 tgaggaaggc agttaagtta atagcttagy tgtttgacgt tagcaacaga agaagcaccg 480 gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc gagcgttaat cggaattact 540 gggcgtaaag cgcatgcagg cggtctgtta agcaagatgt gaaagcccgg ggctcaacct 600 cggaacagca ttttgaactg gcagactaga gtcttgtaga ggggggtaga atttcaggtg 660 tagcggtgaa atgcgtagag atctgaagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca 720 aagactgacg ctcagatgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgtcta cttgaaggtt gtggccttga gccgtggctt tcggagctaa 840 cgcgttaagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa tgaattgacg 900 ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc 960 tactcttgac atccagagaa ttcgctagag atagcttagt gccttcggga actctgagac 1020 aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080 gcgcaaccct tatccttgtt tgccagcacg taatggtggg aactccaggg agactgccgg 1140 tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct 1200 acacacgtgc tacaatggcg tatacagagg gctgcaaact agcgatagta agcgaatccc 1260 acaaagtacg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320 tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccat gggagtgggc tgcaccagaa gtagatagct taaccttcgg gagggcgttt 1440 accacggtgt ggttcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccctag gggaacctgg 1500 <210> 33 <211> 1498 <212> DNA <213> Vibrio sp. <400> 33 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggaaacgaga agtagcttgc 60 tacttcggcg tcgagcggcg gacgggtgag taatgcatag gaagttgccc agtagagggg 120 gataaccatt ggaaacgatg gctaataccg cataacctct tcggagcaaa gcgggggacc 180 ttcgggcctc gcgctactgg atacgcctat gtgggattag ctagttggtg aggtaatggc 240 tcaccaaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300 cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct 360 gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagttgtg 420 aggaagggtg tgtagttaat aactgcgcat tttgacgtta gcaacagaag aagcaccggc 480 taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg 540 gcgtaaagcg catgcaggtg gtttgttaag tcagatgtga aagcccgggg ctcaacctcg 600 gaaggtcatt tgaaactggc aaactagagt actgtagagg ggggtagaat ttcaggtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat accagtggcg aaggcggccc cctggacaga 720 tactgacact cagatgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgccgtaaac gatgtctact tggaggttgt ggccttgagc cgtggctttc ggagctaacg 840 cgttaagtag accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaatg aattgacggg 900 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta 960 ctcttgacat ccagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tctgagacag 1020 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080 gcaaccctta tccttgtttg ccagcgagta atgtcgggaa ctccagggag actgccggtg 1140 ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac 1200 acacgtgcta caatggcgca tacagagggc agcaagctag cgatagtgag cgaatcccaa 1260 aaagtgcgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320 gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccatgg gagtgggctg caaaagaagt aggtagttta accttcggga ggacgcttac 1440 cactttgtgg ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccctaggg gaacctgg 1498 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-inRV1 <400> 34 caggaactgc aacagcagag 20 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-N0-Pci <400> 35 aagggaatac atgttcgttt tttgtaaaaa aatg 34 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 224-23ST-N1-Nco <400> 36 gggatgtacc atggactcta atcacaataa ctcag 35 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 224-23ST-C0new-Bm <400> 37 attaaaatgg atccttactg caaatcactt atcaac 36 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJEc3.6RV1 <400> 38 ttcaaaactg cctgagtcag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJEc3.6RV2 <400> 39 atttcatggt ctagataccc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinFW3 <400> 40 ctgactcagg cagttttgaa 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinFW4 <400> 41 gaaagcaact ctctcaatgg g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STinRV3 <400> 42 ataaacccat tgagagagtt g 21 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STN0-BspHI <400> 43 tggataactc atgaaaaaca ttataacaaa aagaatg 37 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STN1-BspHI <400> 44 tattatcgtc atgaacaatg ataacagcac tacc 34 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FAJ23STC0-BamHI <400> 45 tctttttagg atccttaaat gtcgctgatt agttttat 38

Claims (18)

1. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단리된 단백질.
2. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그보다 많은 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지고, 그리고, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는, 단리된 단백질.
3. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60%이상의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지고, 또한, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는, 단리된 단백질.
4. 서열번호1, 서열번호1의 염기 64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기 67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되고, 또한, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는, 단리된 단백질.
5. 서열번호1, 서열번호1의 염기 64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기 67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈가 가능한 염기서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되고, 또한, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는, 단리된 단백질.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 기재된, 비브리오과( Vibrionaceae ) 미생물 유래인 단리된 단백질.
7. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는, 단리된 핵산.
8. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 그보다 많은 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는, 단리된 핵산.
9. 서열번호2, 서열번호2의 아미노산 잔기 22~409, 서열번호29, 서열번호29의 아미노산 잔기 25~409, 서열번호31, 및 서열번호31의 아미노산 잔기 23~402로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 60%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는, 단리된 핵산.
10. 서열번호1, 서열번호1의 염기 64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기 67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 포함하여 이루어지는 단리된 핵산.
11. 서열번호1, 서열번호1의 염기 64~1230, 서열번호28, 서열번호28의 염기73~1230, 서열번호30, 및 서열번호30의 염기 67~1209로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈가 가능한 염기서열을 포함하는 단리된 핵산으로서, 해당 핵산은 β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 상기 단리된 핵산.
12. 제7항 내지 제11항의 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하여 이루어지는 재조합 벡터.
13. 제12항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환한 숙주세포.
14. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 기재된 단백질을 발현하는 비브리오과의 단리된 미생물.
15. 제14항에 있어서, 포토박테리움·포스포레움( Photobacterium phosphoreum ) JT-ISH-467주(기탁번호 NITE BP-88), 포토박테리움속( Photobacterium sp .) JT-ISH-224주(기탁번호 NITE BP-87), 또는, 비브리오속( Vibrio sp .)JT-FAJ-16주(기탁번호 NITE BP-98)인 미생물.
16. β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질의 제조방법으로서, 이하의 공정:

    1) β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 생산하는 미생물을 배양하고;

    2) 배양한 미생물 또는 배양상등액으로부터, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소를 단리 하는;

    것을 포함하여 이루어지는 상기 제조방법.
17. β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 재조합 단백질의 제조방법으로서, 이하의 공정:

    1) 제7항 내지 제11항의 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하여 이루어지는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하고;

    2) 형질전환한 해당 숙주세포를 배양하고; 그리고,

    3) 배양한 숙주세포 또는 배양상등액으로부터, β-갈락토시드-α2,3-시알산 전이효소활성을 갖는 단백질을 단리 하는;

    것을 포함하여 이루어지는 상기 제조방법.
18. 시알릴 당쇄의 제조방법으로서,

    (i) 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 기재된 단백질, 당공여체 기질, 및 당수용체 기질을 포함하는 용액을 조제하고;

    (ii) 해당 용액에 있어서, 시알산 전이반응을 행하고; 그리고

    (iii) 반응용액으로부터 생성한 시알릴 당쇄를 얻는;

    것을 포함하여 이루어지는 상기 방법.