WO2013077563A1 - 우렁쉥이（멍게）유래의 시알산 전이효소 및 이를 이용한 시알화 복합당질 합성 방법 - Google Patents

우렁쉥이（멍게）유래의 시알산 전이효소 및 이를 이용한 시알화 복합당질 합성 방법 Download PDF

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transferase
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acid transferase
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권오석
김성훈
이윤호
오두병
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한국생명공학연구원
한국해양연구원
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    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)

Definitions

  • a gene encoding sialic acid transferase derived from the squirrel (Yellow), an active sialic acid transferase expressing the gene in a heterologous host, and sialic acid is added to sugars, glycoproteins, and glycolipids by using the same. It relates to a technique for synthesizing sialated complex sugars.
  • glycoproteins, glycolids, and proteoglycans on the surface of cell membranes are responsible for bacterial and viral host cell infection, bacterial toxin adhesion, and cellular It is known to be deeply involved in the long-term life phenomena of multicellular society by interactions such as fertilization and development including cancer induction and cancer metastasis, induction of differentiation of immune and immune cells and neurons, and recognition and adhesion between cells in the process of differentiation. have.
  • Glycoconjugates which are present in glycolipids and proteoglycans, are collectively called glycoconjugates, and each sugar chain is constructed and redesigned by glycosyltransferases that synthesize their sugar chains and glycosidases that degrade it.
  • glycogenes The genes encoding these two groups of enzymes are referred to as glycogenes.
  • Sugar chain synthesis and protein synthesis in contrast is built into the secondary transfer by "control of the control by the enzyme or a sugar chain-degrading enzymes per code that is in direct without being governed by a sugar chain gene of the gene.
  • Glycotransferase transfers a single glycoside from the donor sugar nucleotide to the receptor to form a new glycoside-binding.
  • Glycotransferase transfers a single glycoside from the donor sugar nucleotide to the receptor to form a new glycoside-binding.
  • Glc glucose
  • galactose Gal
  • N-acetylglucosamine GlcNAc
  • N-acetylgalactosamine GalNAc
  • glucuronic acid xylose
  • Mannose Man
  • sialic acid NeuAc, NeuGc
  • Receptors include monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, peptides, proteins, glycoproteins, lipids, glycolipids, and proteoglycans. Since sugar chain synthesis is performed by sugar transferases specific for the anomer structure ( ⁇ -, ⁇ -) and glycosidic binding sites of sugars and the sugar chains formed, about 200 to 300 different glycotransferases in vivo Glycosaccharide chain reaction occurs in the Golgi apparatus (Hatomori and Kannagi (1983) J. Natl. Cancer Inst. 71: 231-251; Weisgerber et al.
  • sialic acid transferase which has the most important function among glycotransferases, was first purified in 1982 by ST6Gal I, and cloned cDNA from the expression library in 1987. Then, in 1992, ST3Gal I and m cDNA were cloned using the partial amino acid sequence of the protein obtained by purification by affinity chromatography using CDP-hexanolamine.
  • the sialic acid transferase is a type of sugar residue such as galactose (Gal), galactosamine (GalNAc), or sialic acid (NeuAc) at the end of the sialic acid receptor sugar chain to which sialic acid is added and ⁇ (2) to which sialic acid is added.
  • ⁇ 3) ⁇ according to the characteristics of ⁇ (2,6)-and ⁇ (2,8) -binding, it is classified into 20 kinds, and it is known that sialic acid transferase is found in almost all higher animals except plants ( Paulson and Rademacher (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16: 1121-1122).
  • Sialic acid transferase has been cloned from several tissues of various higher animals to interpret its function (Harduin-Lepers et al., (2005) Glycobiology 15: 805-817), and prokaryotic genes are being studied.
  • sialic acid transfer enzymes have been reported in bacteria, and ⁇ -galactoside a -2,6-sialyl transferase cloned from the marine photosynthetic bacterium Photobacteriiwi species, and lipooligosaccharide ⁇ -2, 3 cloned from the pathogenic bacterium Afe / sse / -sylyl transferase, and polysialic acid synthase gene clone cloned from E.
  • sialic acid plays an important role in cellular phenomena in mammals, including intercellular interactions, the role of mediators in cellular signaling, and the stabilization of glycoproteins.
  • sialic oxidized sugar chains in vivo are known as one of the first recognized sugar chains during pathogen infection (Sasisekharan and Myette (2003) Am. Sci. 91: 432-441; Vimr and Lichtensteiger (2002) Trends Microbiol.
  • Sialic acid present on the cell surface is known as a component of polysaccharide ligosaccharides in the form of capsules for immune evasion reactions or cell protection even in the pathogenic microorganisms themselves (Vimr et al., (2004) Microbiol.Mol. 68: 132-153).
  • Pathogenic microbial synthesis of sialic acid by itself is synthesized through the sialic acid metabolic circuit in the cell, or sialic acid after transporting sialic acid outside the cell into the cell through a sialic acid transporter present on the cell surface. It is known to synthesize sialic acid via metabolic pathways (Vimr and Lichtensteiger (2002) Trends Microbiol. 10: 254-257).
  • Sialic acid is difficult to chemically synthesize because it contains carboxyl groups linked to the anionic position of the second carbon, deoxy of the third carbon, and glycerol branched to the sixth carbon. It is known that the yield is very low.
  • the sialic acid-added sugar chain has many functional groups in the sialic acid receptor sugar chain in addition to the complex chemical structure of sialic acid, so it is not easy to react to add sialic acid at a desired position. It is produced by chemical-enzyme synthesis, which combines acid transferase sialyltransferase reaction and chemical synthesis.
  • sialic acid transferases derived from marine invertebrates enables the addition and redesign of sialic acid of glycoprotein products such as medical proteins where sialic acid sugar chains are important so that the future sugar chain control technology of biosimilar products It will be useful for
  • sialic oxidation of glycoproteins through sialic acid addition reaction of bisialic acid glycoproteins using sialic acid transferase of the present invention can enhance the efficacy and safety of medicinal glycoproteins for which sialic acid is important, It is expected to be used in the process of improving existing glycoprotein products by reducing side effects and improving existing medicines or applying them to new indications.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 encoding the sialic acid transferase derived from the above.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a transformant transformed with an expression vector. To provide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing an active sialic acid transferase derived from larvae.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a sialated complex sugar to which sialic acid is added.
  • the present invention provides a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having sialic acid transferase activity derived from locust (Halocynthia rorentzi)
  • the present invention also provides a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 encoding a sialic acid transferase derived from the above.
  • the present invention also provides an expression vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the expression vector.
  • the present invention provides a method for preparing an active sialic acid transferase derived from the larvae.
  • the present invention provides a method for producing oligosaccharide, glycolipid, glycopeptide or glycoprotein to which sialic acid is added.
  • the present invention provides a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having sialic acid transferase activity derived from Loch (Halocynthia weyji /). .
  • One enzyme provides a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to "enzyme".
  • the present inventors provide a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to "enzyme".
  • CDNA was extracted and synthesized. ⁇ Using this, cDNA encoding the sialic acid sialic acid transferase was obtained to determine its nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1), and it was confirmed that it was a novel nucleotide sequence. In addition, the amino acid sequence of the sialic acid-derived sialic acid transferase was identified using the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2), which was found to include all sialyl motifs of typical eukaryotic sialic acid transferase (sialyltransferase).
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the expression vector.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide.
  • a method for preparing an active sialic acid transferase derived from the squill (Halocynthia / re /? ⁇ /) Including the step of recovering sialic acid transferase from the culture of step 2).
  • Jun ⁇ 1 is preferably, but not limited to, L—yeast-, ⁇ -development po ⁇ to- ⁇ dong fl fl ⁇ — ⁇ ⁇ .
  • the bacterium is Staphylococcus aureus (5 / 3 ⁇ 4? / 0 « ⁇ « / 5 aureus), Escherichia coli (.coin, Bacillus cereus), Salmonella
  • the yeast is Saccharomyces (5ac rc j ⁇ es), Kluberomyces (/ i7i / y eri3 ⁇ 47yces), Pichia (/ z / a), Or it is preferably any one selected from the group consisting of transformants characterized in belonging to the genus Candida, Saccharomyces cerevisiae (5a «:?
  • a / 3 ⁇ 4 ces cerevisiae) FGY217 strain is more preferred, but Not determined
  • the present inventors inserted the cDNA of the sialic acid-derived sialic acid transferase into a vector tagged with yEGFP to prepare an ' active sialic acid transferase expression vector, which is a heterologous host Sacchawmyces cerevisiae FGY217 ( MATa, ura3-52, lys2A201, and ⁇ 4 ⁇ ) strains were compared with those of human-derived sialic acid transferase expressed in the same manner.
  • the sialated receptor is preferably any one selected from the group consisting of monosaccharides, loligosaccharides, polysaccharides, peptides, protein glycoproteins, lipids, glycolipids, and proteoglycans, but is not limited thereto.
  • the sialic donor is preferably any one selected from the group consisting of CMP-sialic acid and CMP-sialic acid derivatives, but is not limited thereto.
  • the present invention conducted sialic reactions in vitro using sialic acid-transferase sialic acid transferase as a substrate, and confirmed the sialylated protein by lectin blot analysis.
  • sialic acid transferase derived from the larvae of the present invention is selectively targeted to the yeast Golgi apparatus and has excellent sialic acid addition activity to the receptor, It is possible to produce sialic acid transferase in heterostem host
  • sialic acid can be added, it can be usefully used as an enzymatic resource for sialic oxidation of therapeutic glycoproteins.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the sialic acid-transferase derived from Ruri Shungi;
  • FIG. 1 Schematic diagram when sialic acid transferase expressed in fused form with fluorescent protein (GFP) is expressed on yeast Golgi membrane.
  • FIG. 2 is a photograph showing the expression of fluorescent protein (GFP) and sialic acid transferase in fusion form in yeast Golgi using confocal microscopy;
  • eV yeast transformed with only cloning vectors used as negative controls
  • hST3Gal expression of fluorescent protein (GFP) used as a positive control and human sialic acid transferase protein in fusion form;
  • HrorST expression of sialic acid-derived sialic acid transferase protein fused with fluorescent protein.
  • FIG. 3 is a diagram confirming the degree of sialic acid addition to the model sialic acid receptor protein asialoafetuin using sialic acid transferase through a texin blot;
  • eV crude cell extract sample of yeast containing only cloning vector used as negative control
  • h ' ST3Gal Sample of crude cell extract treatment of recombinant yeast expressing human-derived sialic acid transferase used as a positive control group;
  • fetuin fetuin, a positive control
  • asialofetuin bisial oxidized fetuin, a negative control
  • Fig. 4 shows the expression of the sialic acid transferase fused with the fluorescent protein.
  • the recombinant yeast expressing the sialic acid transferase expression was confirmed by Western blot using a fluorescent protein detection antibody;
  • eV crude cell extract of yeast containing only cloning vectors used as negative controls
  • hST3Gal cell crude extract of recombinant yeast expressing human-derived sialic acid transferase fused with fluorescent protein used as a positive control group;
  • HrorST A crude cell extract of recombinant yeast expressing leucine-derived sialic acid transferase fused with fluorescent protein.
  • Loosen (Halocynthia roretzi) ⁇ Highly conserved mot if (VS-motif from L-mot if) fragments at 95 ° C for 3 minutes, total degeneration at 94 ° C, 30 seconds at 45 ° C, 45 seconds at 54 ° C and amplified by 30 cycles of PCR with 0.5 minute extension at 72 ° C. Based on this, the full length sialic acid transferase gene was obtained through rapid amplification of cDNA ends (RACE) and cloned into pSPORTl vector.
  • the cDNA encoding the sialic acid transferase cloned into the vector was determined using the T7 promoter primer and the SP6 primer to determine the base sequence of the sialic acid transferase derived from the locust (SEQ ID NO: 1). Confirmed.
  • the inventors of the present invention analyzed the amino acid sequence of sialic acid-transferase derived from locust (Halocynthia rorentzi) through the nucleotide sequence of the sialic acid-transferase derived from locust.
  • amino acid sequencing was performed using Dnasis 3.1 or its bioinformatics program based on the nucleotide sequence of the sialic acid-derived sialic acid transfer enzyme determined in ⁇ Example 1>.
  • the present inventors transformed the yeast by constructing an expression vector to express the worm-derived sialic acid transferase in a yeast which is a heterologous host. Specifically, when the squid is derived from ⁇ Example 1>
  • Hzi2 Formward primer 5 '-ACCCCGGATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCATGATAAGACCCArrTACCAGCGT-3' (SEQ ID NO: 3) and Hzi2_Reverse primer 5 '-mMCTGGMCTmATAmAAMGG (AGGAGMTGGMCTCMCMTATA-3) (SEQ ID NO: 95 ° C) using the pSPORTl vector as a template
  • the gene of the sialic acid-transferase derived from the larvae was amplified under 40 cycles of PCR conditions of 3 minutes of total degeneration, 30 seconds of degeneration at 94 ° C, 45 seconds of annealing at 60 ° C, and 3 minutes of extension at 72 ° C.
  • Clones containing the sialic acid transferase coding gene in the correct cloning position on the vector of the recombinant plasmid obtained from E. coli were identified and selected through restriction enzyme treatment and DNA sequencing.
  • strains of Saccharomyces cerevisiae (5ai:? Ar (3 ⁇ 4 c: es cerevisiae) FGY217 (MAT ⁇ , ura3-52, lys2A201, ⁇ 4 ⁇ ) strain were transformed by lithium acetate method. The resulting colonies were analyzed.
  • yEGFP was tagged when sialic acid transferase was expressed .
  • the present inventors observed by confocal microscopy (confocal microscopy) to confirm the expression of the sialic acid-transferase oolong derived from yeast.
  • the pRS424GAL-derived recombinant vector of ⁇ Example 3> was transformed into a strain of Saccharomyces cerevisiae FGY217 (MATa, ura3-52, lys2 ′ 201, pep4A) using a lithium acetate method. Switched. Then, the Saccharomyces cerevisiae FGY217 strain containing the recombinant vector of ⁇ Example 3> derived from pRS424GAL having an auxotroph marker was cultured in SOLeu medium which is a dropout medium.
  • sialic acid transferase was present in a spot shape which is a typical form observed in the Golgi apparatus.
  • sialic acid-transferase derived from the larvae was more effectively targeted to the Golgi membrane of the yeast cells and located in a dot shape (FIG. 2).
  • the pRS424GAL-derived recombinant vector of ⁇ Example 3> was transformed into a strain of Saccharomyces cerevisiae FGY217 (MATa, ura3-52, lys2A201, pep4 ′) using a lithium acetate method. I was. Thereafter, Saccharomyces cerevisiae FGY217 strain containing the recombinant vector having a nutritional marker was cultured in SOLeu medium which is a dropout medium.
  • Crude extract was prepared by taking the non-removal of the crushed cells, and then the supernatant from the 6,000 rpm for eu cells with disrupted by "using a bead beater, and a centrifugal separator after the cells recovered, to confirm the expressed protein in the crude extract using a Western blot It was.
  • the inventors performed in vitro sialylation reaction using bisiaalfetuin as a substrate to confirm the activity of sialic acid-transferase-derived sialic acid-derived sialic acid, followed by lectin blot analysis.
  • _It was a mark __
  • TEV Tobacco Etch Virus
  • PBS phosphate buffered salin
  • the sialase enzyme reaction was mixed with 5 ⁇ Lae ⁇ ⁇ buffer and boiled for 10 minutes, followed by electrophoresis with 8% SDS-PAGE gel. Protein was separated. The separated protein was transferred to a nitrocellulose membrane, which was blocked in PBST containing 0.5% Tween containing 3% bovine serum albumin and blocking for 1 hour.
  • the membrane was placed in 3% BSA-PBS containing 1 mg / mL MAA lectin (EY Laboratories, San Mateo, CA) or 1 mg / mL SNA—I lectin (EY. Laboratories, San Mateo, CA). Incubate at room temperature for 4 hours. After incubation, the membrane was washed six times with PBST for 10 minutes and then reacted with 0.2 mg / mL horseradish peroxidase (HRP) one conjugated streptavidin (l: 500; Sigma_Aldr ich) for one hour. After the reaction, the membrane was washed six times with PBST for 10 minutes in the same manner, and the sialated protein was confirmed by ECL kit (GE Healthcare).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the inventors of the present invention found that the scavenging activity of other substrates of sialic acid-transferase derived from rhubarb.
  • the free sugar chain (Free. Glycan) was determined by sialic acid transfer after performing an in-v-i o-sialylation reaction.
  • CMP—Sialic acid 0.1-0.5 mg / mL, 10 ⁇ MnCl 2 , 1% Triton X— 100 and 0.02 Unit TEV (Tobacco Etch Virus) protease were mixed with PBS for 1 to 12 hours at 20 to 40 ° C. I responded. After reaction, measurement of the product of sialic acid transferase was performed by phosphatase on cyclic monophosphate (CMP), which is released after sialic acid transfer to the sugar receptor from CMP-sialic acid after sialic acid transferase reaction. Wu et al. It was confirmed according to the method described in (Glycobiology 21, 727 (2011)).
  • the present inventors have cleaved sialic acid by treating binding specific sialidase to confirm sialic acid binding of bisiaalfetuin sialated by sialic acid-transferase-derived sialic acid transferase, and then confirmed by lectin analysis. It was.
  • sialic acid donor CMP-sialic acid 0.5 mg / mL, 10 mM MnCl 2 and 1% Triton X-100, 0.02 Unit Tobacco Etch Virus (TEV) protease were mixed with PBSCphosphate buffered saline and reacted at 25 ° C. for 1 to 12 hours.
  • TSV Tobacco Etch Virus

Abstract

본 발명은 치료용 당단백질의 당쇄 리모델링에 필요한 시알산화를 위한 해양무척추 동물 유래 시알산 전이효소에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 우렁쉥이(멍게, Halocynthia rorentzi)에서 유래한 시알산 전이효소를 코딩하는 신규한 유전자, 상기 신규한 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 형질전환한 형질전환체, 이종숙주인 형질전환체에서 발현된 활성형의 시알산 전이효소 단백질, 및 이를 사용하여 시알산을 부가하는 기술을 이용해 시알산이 부가된 올리고당, 당지질, 당단백질을 생산하는 방법은 치료용 당단백질의 안정성을 증가시키고, 체내 체류시간 및 원하는 부위로의 표적화에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
우렁쉥이 (멍게) 유래의 시알산 전이효소 및 이를 이용한 시알화 복합당질 합성 방법
【기술분야】
우렁쉥이 (멍게)에서 유래한 시알산 전이효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 이종 숙주에서 발현시킨 활성형의 시알산 전이효소, 및 이를 이용하여 시알산을 을리고당， 당단백질， 당지질에 부가하여 시알화 복합당질를 합성하는 기술에 관한 것이다.
【배경기술】
세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질 (glycoprotein), 당지질 (glycol ipid) 및 프로테오글라이칸 (proteoglycan)의 당쇄 (glycan)는 박테리아 및 바이러스의 숙주세포로의 감염， 세균 독소의 접착， 세포의 암화 및 암전이， 면.역세포와 신경세포의 분화 유도 등을 포함한 수정 및 발생, 분화 과정에서 세포간의 인식， 접착 등의 상호 작용에 의한 다세포 사회의 기간적인 생명현상에 깊이 관여하고 있는 것이 알려져 있다. 당지질，프로테오글리칸 등에 존재하는 당쇄는 복합당질 (glycoconjugates)로 총칭되고， 각각의 당쇄는 그들 당쇄를 합성하는 당전이효소 (glycosyltransferase)와 분해하는 당쇄분해효소 (glycosidase)에 의하여 구축 및 재설계되는데， 일반적으로 이러한 2개의 효소군을 코드하는 유전자를 당쇄유전자 (glycogene)로 일컫는다. 당쇄 합성은 단백질 합성과는 달리 유전자의 직접적인 지배를 받지 않고 당쇄유전자에 코드되어 있는 당전이효소나 당쇄분해효소에 의한 조절적인 제어에 ' 의해 2차적으로 구축되어진다. 당전이효소는 공여체인 당뉴클레오티드로부터 단당을 수용체에 전이하여 새로운 글리코시드 결합^ _형^^}—는—일—련-의ᅳ호 를ᅳ총칭-현 ^다 ^ 공여체의ᅵ 경우， 당뉴클레오티드의 뉴클레오티드 부분에 의해 서로 다르게 존재하며， 글루코스 (Glc), 갈락토스 (Gal), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), 글루쿠론산, 자일로오스 (：
만노스 (Man),시알산 (NeuAc, NeuGc)등이 있다. 수용체로는 단당，올리고당，다당， 펩티드,단백질,당단백질，지질,당지질，프로테오글리칸 등이 있다. 당쇄 합성은 당의 아노머 구조 ( α-, β-)와 글리코시드 결합 부위 및 형성되는 당쇄에 대해서 각각 특이적인 당전이효소에 의해 행해지므로， 생체내에는 약 200 내지 300 종의 서로 다른 당전이효소가 존재하고 있으며， 세포내에서 일어나는 복합당질 당쇄의 당전이 반웅은 주로 골지체에서 일어난다 (Hatomori and Kannagi (1983) J. Natl. Cancer Inst. 71: 231-251； Weisgerber et al . (1991) Glycobiology 1： 357-365) . 당전이효소 중에서 가장 중요한 기능을 하고 있는 시알산 전이효소는 1982년 ST6Gal I이 최초로 정제되었고, 이를 이용하여 1987년 expression library로부터 cDNA가 클로닝되었다. 그 후， 1992년 ST3Gal I과 m의 cDNA가 CDP-hexanolamine을 이용한 친화력 크로마토그래피에 의해 정제되어 얻어진 단백질의 부분적 아미노산 서열을 이용하여 클로닝되었다. 시알산 전이효소는， 시알산이 부가되는 시알산 수용체 당쇄 말단의 갈락토즈 (Gal), 갈락토사민 (GalNAc), 혹은 시알산 (NeuAc) 등 당잔기의 종류와 여기에 시알산이 부가되는 α(2ᅳ 3)ᅳ, α(2,6)-, α (2, 8)-결합의 특성에 따라 20여 가지로 구분하며， 식물을 제외한 거의 모든 고등동물에서 시알산 전이효소가 발견된다고 알려져 있다 (Paulson and Rademacher (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16: 1121-1122). 다양한 고등동물의 여러 조직으로부터 시알산 전이효소가 클로닝되어 기능이 해석되었으며 (Harduin-Lepers et al. , (2005) Glycobiology 15: 805-817), 원핵생물 유래의 유전자에 대해서도 연구가 진행 중이다. 최근에는 박테리아에서도 시알산 전이 효소가 보고되고 있으며, 해양성 광합성 세균인 Photobacteriiwi종으로부터 클로닝된 β -galactoside a -2,6-sialyl transferase, 병원성 세균인 Afe/sse/로부터 클로닝된 lipooligosaccharide α -2, 3-sialyl transferase, 및 E. coli Kl으로부터 클로닝된 polysialic acid synthase 유전지 ᅳ^ ᅵᅳ관ᅳ한ᅳ연 :각ᅳ진행-돠고ᅳ 있다 (Aok'i et al. , (1992) Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 89： 4319-4323； Burke et al. , (1992) J. Biol. Chem. 267： 24433-24440； Breton et al . , (1998) Glycobiology 8： 87-94； Weston et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 4]
시알산 (sialic acid)은 당쇄 말단에 부가되는 음극성 (negative charge)을 띄는 성분당으로 자연계에서 지금까지 약 50여종의 시알산 유도체들이 발견되었다. 시알산은 포유류에 있어서 세포간 상호작용, 세포 내의 시그널을 결정하는 매개체의 역할， 당단백질의 안정화 등 세포 내의 생물학적 현상에 중요한 역할을 한다. 특히， 생체 내의 시알산화 당쇄는 병원체 감염시 최초 인지되는 당쇄 중의 하나로 알려져 있으며 (SasisekharanandMyette (2003) Am. Sci . 91: 432-441； Vimr and Lichtensteiger (2002) Trends Microbiol. 10： 254-257)， 세포표면에 존재하는 시알산은 병원 미생물 자체에서도 면역 회피 반웅이나 세포 보호를 위한 캡슐 형태의 다당성 을리고당을 구성하는 성분으로 알려져 있다 (Vimr et al., (2004) Microbiol . Mol . Biol . Rev.68： 132-153) . 병원성 미생물 증 자체적으로 시알산을 합성하는 경우 세포 내에서 시알산 대사회로를 통해 합성되거나， 세포 외부의 시알산을 세포표면에 존재하는 시알산 트랜스포터 (transporter)를 통해 세포 내로 이동시킨 후 시알산 대사 경로를 통해 시알산을 합성한다고 알려져 있다 (Vimr and Lichtensteiger (2002) Trends Microbiol. 10： 254-257) .
시알산은 화학구조상으로 두 번째 탄소의 아노머릭 (anonieric) 위치에 연결되어 있는 카복실 그룹， 세 번째 탄소의 디옥시 (deoxy), 그리고 여섯 번째 탄소에 분기되어 있는 글리세를을 포함하고 있어 화학합성이 어렵고 수율이 매우 낮다고 알려져 있다. 또한 시알산이 부가된 당쇄의 경우 시알산의 복잡한 화학구조 이외에도 시알산 수용체 당쇄에도 작용기가 많아서 원하는 위치에 시알산을 부가하는 반웅이 쉽지 않기 때문에， 시알산이 부가된 당쇄의 대다수는 천연물에서 추출하거나 시알산 전이효소인 시알릴트랜스퍼라아제 (sialyltransferase) 반응과 화학합성법을 병행하는 화학 -효소 합성으로 생산되고 있다. 화학 -효소 합성은 시알산 수용체 당쇄와 시알산 공여체로 _^Ml^^lH^¾.Cneu l-eo-Ud©=s - ar-)-¾l- 시스티딘 -5-모노포스포— N-아세틸-베타-뉴라믹산 (CMP-NeuAc)이 필요하다. 이때 사용되는 시알산 전이효소의 경우， 현재 쥐， 사람 등의 고등동물 유래의 효소만이 제한적으로 사용되고 있다.하지만 최근 해양생물 유전체
따라, 해양무척추 동물에서 다양한 당쇄 합성 유전자가 발견되었으며， 특히 시알산 전이효소와 유사한 단백질을 코당하는 유전자 염기서열이 다수 보고되었다 (Harduin-Lepers et al . , (2005) Glycobiology 15： 805—817). 진화적 측면에서 하위단계인 해양무척추동물 유래의 시알산 전이효소는 광범위한 기질 특이성을 갖고 있어 안정적인 효소원이 확보된다면 시알산 부가 당쇄 합성 및 시알산전이 반응을 개선하기 위한 소재로 활용될 수 있을 것이다. 아을러 해양무척추 동물 유래의 시알산 전이효소의 효과적인 시알산 전이 반응은 시알산 당쇄가 중요한 의료용 단백질과 같은 당단백질 제품의 시알산 부가 및 재설계를 가능하게 하여 향후 바이오시밀러 제품의 당쇄 제어 기술에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
따라서， 본 발명의 우렁쉥이 (멍게) 유래 시알산 전이효소를 이용한 비시알산 당단백질의 시알산 부가 반웅을 통한 당단백질의 시알산화는 시알산이 중요한 의료용 당단백질의 효능과 안전성을 증진시키고 면역반웅 등의 부작용을 줄여， 기존의 의약품의 개량 또는 새로운 적응증에의 적용으로 인한 기존 당단백질 제품의 개량 공정에 활용될 것으로 기대된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 우렁쉥이 (멍게, Halocynthia ore? /)에서 유래한 시알산 전이효소 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩되드를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은 상기 우렁쉥이에서 유래한 시알산 전이효소를 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클 뾰 H힘!하-는 .발현 백터를 제공하는 것.이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 발현 .백터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은 우렁쉥이에서 유래한 활성형 시알산 전이효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러， 본 발명의 또 다른 목적은 시알산이 부가된 시알화 복합당질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi)에서 유래한 시알산 전이효소 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다
또한， 본 발명은 상기 우렁쉥이에서 유래한 시알산 전이효소를 코딩하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 제공한다. 또한， 본 발명은 발현 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한， 본 발명은 우렁쉥이에서 유래한 활성형 시알산 전이효소의 제조방법을 제공한다.
아울러， 본 발명은 시알산이 부가된 올리고당, 당지질, 당펩타이드 또는 당단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 우렁쉥이 (멍게, Halocynthia weyji /)에서에서 유래한 시알산 전이효소 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. .
스 한 ί알 ~신ᅳ전"의효소 "^암효화하는—ᅳ 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공한다-. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 우
추출하여 cDNA를 합성하였고 ,■ 이를 이용하여 우렁쉥이 시알산 전이효소를 코딩하는 cDNA를 확보하여 그 염기서열을 결정하였고 (서열번호 1)， 신규한 염기서열임을 확인하였다. 또한， 상기 염기서열을 이용하여 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 아미노산 서열을 확인하였으며 (서열번호 2)， 이는 전형적인 진핵생물 시알산 전이효소 (sialyltransferase)의 sialyl motif를 모두 포함하고 있는 것을 알 수 있었고, sialyl motif에서 발견되는 시스테인 (cystein) 잔기를 포함하고 있어 단백질의 구조적인 특성을 갖게 하는 이황화 결합 (disulfide bond)을 형성할 것으로 추정되었으며， 골지 (golgi) 타켓팅 (targeting) 신호 (signal)를 포함하고 있어 골지막에 발현되면서 루멘 (lumen)의 방향에 활성 도메인 (catalytic domain)을 갖는 전형적인 type II transmembrane 단백질일 것으로 추정된다. 아울러, 골지 루멘으로 위처하는 촉매 도메인의 경우 다수의 N-당쇄부가 위치 (N-1 inked glycosylation site)를 포함하고 있어 당단백질 (glycoprotein) 형태로 세포에 발현될 것으로 판단된다 (도 1A 및 1B).
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또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 발현 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 또한， 본 발명은
1) 상기 발현 백터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계;
2) 단계 1)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배양물로부터 시알산 전이효소를 회수하는 단계를 포함하는 포함하는 우렁쉥이 (멍게, Halocynthia / re/?^/)에서 유래한 활성형 시알산 전이효소의 제조방법을 제공한다.
섶 ᅵ^준 ᅵ1는ᅳ ^으 L—효모-，ᅳ곤출ᅩ 포~또-^동■ fl 인ᅳ짖—을ᅳ특징으-로- 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스 ( 5/¾? /0«^«/5 aureus) , 대장균 ( . coin,바실러스 세레우스 ( . cereus) ,살모넬라
typi murium) , 살모넬라 콜레라수이스 choleraesuis) , 여시니아 엔테로콜리티카 ( s/2/a enter ocolitj'ca) 및 리스테리아 모노사이토게네스 a/s e a ??o/ o^ e/7es)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 효모는 사카로마이세스 (5ac ?rc j^es), 클루베로마이세스 (/i7i/y eri¾7yces), 피키아 (/ z/a)，
Figure imgf000009_0001
또는 캔디다 속에 속하는 것을 특징으로 하는 형질전환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며， 사카로마이세스 세레비시아 (5a«:?a/ ¾ ces cerevisiae) FGY217 균주인 것이 더욱 바람직하나 이에 한.정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 상기 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 cDNA를 yEGFP가 태깅되어 있는 백터에 삽입하여 '활성형 시알산 전이효소 발현 백터를 제작하여 이를 이종 숙주인 Sacchawmyces cerevisiae FGY217(MATa , ura3-52, lys2A201, ρερ4Δ)균주에 형질전환하여 그 발현 양상 및 발현량을 같은 방법으로 발현한 인간 유래 시알산 전이효소와 비교하였다. 그 결과, 인간 유래 시알산 전이효소에 비해 본 발명의 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소가 효모의 골지체 막에 더욱 효과적으로 타겟팅되어 있음을 공촛점현미경 (confocal microscopy)를 통해 확인하였으며 (도 2 참조), 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 대조군인 인간 유래 시알산 전이효소의 발현량과 비교한 결과 유사한 정도의 발현량을 보였다 (도 4 참조). 이를 통해， 종래의 인간 유래 시알산 전이효소와 비슷한 정도로 발현함에 불구하고 월등한 표적성을 보임을 알 수 있었다.
，ᅳ I발명 -와^ ^ᅳ유 -래 ᅵᅳ알산ᅳ전 _의효소를ᅳ발 _현-하 _는_^기
Figure imgf000009_0002
및 형질전환체는 기존의 시알산 전이효소보다 월등히 특이적인 시알산 전이효소를 효과적으로 발현할 수 있다. 또한， 본 발명은
1) 상기 우렁쉥이에서 유래한 시알산 전이효소, 시알화 수용체 및 시알산 공여체를 흔합하는 단계; 및
2) 단계 1)의 흔합물을 반웅시켜 수용체에 시알산을 부가하는 단계를 포함하는 시알산이 부가된 시알화 수용체의 생산 방법을 제공한다.
상기 시알화 수용체는 단당， 을리고당， 다당， 펩티드， 단백질 당단백질， 지질， 당지질， 프로테오글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 시알화 공여체는 CMP-시알산 (sialic acid) 및 CMP-시알산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본. 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 시알산 전이 활성을 비시알산화페투인 (asialofetuin)을 기질로 이용하여 시알화 반웅을 in vitro — 수행하여 시알화된 단백질을 렉틴 블롯 분석으로 확인한 결과， Neu5Ac α(2,3) Gal β (1,4) GlcNAc의 α 2， 3- 1 i nkage를 인식하는 Maackia amurensisi kk) 렉틴 및 Neu5Ac α(2,6) Gal 과 Neu5Ac α (2,6) GalNAc을 인지하는 Sambucus nigra k-\) 랙틴 블롯이 모두 확인되었으며 (도 3)， 유리당쇄 (free glycan)를 기질로 이용하여 시알화 반응을 in vitro — 수행하여 시알산 전이효소에 의한 시알화된 산물을 시알산이 당 수용체에 전달된 후 유리되는 Cyclic monophosphate (CMP)에 대한 phosphatase의 효소 반응을 이용하여 확인한 결과，시알산 전이효소의 비시알산화 유리당쇄 (asialo freeglycan)에 대한 활성을 확인할 수 있었다 (표 1 참조).
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【—유보한 과丄
본 발명의 우렁쉥이에서 유래한 시알산 전이효소는 효모 골지체에 선택적으로 타켓팅되고 수용체에 대한 시알산 부가 활성이 뛰어나며， 이종숙주어 i서 시알산 전이효소의 생산이 가능하여， 광범
시알산을 부가할 수 있으므로, 치료용 당단백질의 시알산화를 위한 효소자원으로서 유용하게 이용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 모식도이다;
(A) : 아미노산 서열을 바탕으로 추정한 시알산 전이효소의 기능 및 구조 요소의 개략적인 모식도; 및
(B) : 형광 단백질 (GFP)과 융합 형태로 발현되는 시알산 전이효소가 효모 골지체 막에 발현됐을 때의 모식도.
도 2는 효모 골지체에서 형광 단백질 (GFP)과 융합 형태의 시알산 전이효소가 발현된 양상을 공촛점현미경 (confocal microscopy)을 이용하여 관찰한 사진이다;
eV: 음성 대조군으로 사용한 클로닝 백터만 형질전환 된 효모;
hST3Gal： 양성대조군으로 사용한 형광 단백질 (GFP)과 융합 형태의 인간 유래 시알산 전이효소 단백질의 발현; 및
HrorST: 형광단백질과 융합된 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소 단백질의 발현 .
도 3은 시알산 전이효소를 이용하여 모델 시알산 수용체 단백질인 비시알산화페투인 (asialofetuin)에 대한 시알산 부가 정도를 텍틴 블롯을 통해- 확인한 그림이다;
eV: 음성 대조군으로 사용한 클로닝 백터만 들어있는 효모의 세포 조추출액 처리 시료;
h'ST3Gal： 양성대조군으로 사용한 인간 유래 시알산 전이효소를 발현하는 재조합 효모의 세포 조추출액 처리 시료;
Hmr_SI 렁 1ᅳ유 ^L^Lᅳ€으효소를ᅳ발 -하^ ^조 _힙^ᅳ호모의ᅳ세ᅭ포— 조추출액 처리 시료；
fetuin: 양성 대조군인 페투인; asialofetuin: 음성대조군인 비시알산화페투인;
+ , -; 시알산 절단효소 (exo-a-sialidase)를 이용하여 해당 단백질로부터 시알산을 제거하기 전과 후의 시료;
위 ; Maackia amurensis{\\kk) 렉틴을 이용한 렉틴 블롯; 및
아래: Sambucus m'gra 렉틴을 이용한 렉틴 블롯.
도 4는 형광단백질과 융합된 형태 시알산 전이효소를 발현하는 재조합 효모를 .파쇄하여 해당 시알산 전이효소의 발현량을 형광단백질 검출 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 그림이다;
eV: 음성 대조군으로 사용한 클로닝 백터만 들어있는 효모의 세포 조추출액; '
hST3Gal： 양성대조군으로 사용한 형광단백질과 융합된 인간 유래 시알산 전이효소를 발현하는 재조합 효모의 세포 조추출액; 및
HrorST: 형광단백질과 융합된 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소를 발현하는 재조합 효모의 세포 조추출액.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은아니다.
<실시예 1> 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia 에서 유래한 시알산 전이효소의 염기서열 결정
본 발명자들은 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 유전자를 클로닝 하였다.
구체적으로, 구체적으로, 우렁쉥이 성체로부터 추출한 RNA로부터 합성한
—cBMᅳ라어 -브-라라에 -서ᅳ시-알산ᅳ전 -어-효―소를ᅳ코 -딩-하- 유ᅭ전 - 를ᅳ클 ^-하 -7—ᅵᅳ훠_하의ᅮ NCBI (National Center for Biotechnology Informat ion)에 등록된 시알산 전이효소 유전자의 DNA염기서열과 아미노산 서열상에서의 highly conserved mot if를 토대로 degenerated DNA probe를 합성하였다. 합성된 상기 1
우렁쉥이 (멍거 1， Halocynthia roretzi)^ highly conserved mot i f (L-mot i f 로부터 VS-motif) 단편을 95 °C에서 3분 전변성， 94 °C에서 30초 변성， 54 °C에서 45초 풀림 (a皿 ealing)및 72 °C에서 0.5분 연장의 30사이클의 PCR조건으로 증폭하였고 이를 토대로 RACE(rapid amplification of cDNA ends)를 통해 전장 시알산 전이효소 유전자를 확보하여 pSPORTl 백터에 클로닝하였다. 상기 백터에 클로닝된 시알산 전이효소를 코딩하는 cDNA를 T7 프로모터 프라이머 및 SP6 프라이머를 사용하여 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 염기서열을 결정하였으며 (서열번호 1)， NCBI의 BLAST를 통해 신규한서열임을 확인하였다.
<실시예 2>우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 아미노산서열 분석
본 발명자들은 발명자들은 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 아미노산 서열을 상기 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 염기서열을 통해 분석하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 1>에서 결정한 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소 염기서열을 바탕으로 Dnasis 3.1 또는 이와 동종의 바이오인포매틱스 프로그램을 사용하여 아미노산 서열분석을 하였다.
그 결과， 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 아미노산 서열을 확인하였으며 (서열번호 2)， 이는 전형적인 진핵생물 시알산 전이효소 (sialyltransferase)의 시알릴 모티브 (sialyl motif)를 모두 포함하고 있는 것을 확인하였고， 시알릴 모티브에서 발견되는 시스테인 (cystein) 잔기를 포함하고 있음을 확인하였다 (도 1A 및 1B). <실시예 3>우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의
—발 _현^1궤 2)잘— - 본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소를 이종 숙주인 효모에서 발현시키기 위하여 발현 백터를 제작하여 효모에 형질전환하였다. 구체적으로， 상기 <실시예 1>의 우렁쉥이 유래 시'
포함하고 있는 pSPORTl 백터를 주형으로 하여 Hzi2— Forward 프라이머 5 ' -ACCCCGGATTCTAGAACTAGTGGATCCCCCATGATAAGACCCArrTACCAGCGT-3 '(서열번호 3 ) 및 Hzi2_Reverse 프라이머 5 ' -mMCTGGMCTmATAmAAMGG ( AGGAGMTGGMCTCMCMTACC-3 '(서열번호 4 )를 사용하여， 95 °C에서 3분 전변성， 94 °C에서 30초 변성， 60 °C에서 45초 풀림 (annealing) 및 72 °C에서 3분 연장의 40 사이클의 PCR 조건으로 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 유전자를 증폭하였다. 이때, 양성 대조군을 위하여 인간 유래 시알산 전이효소 (hST3Gal, GenBank accession number： AAM66433)를 코딩하는 클론 hMU003315를 주형으로 하여 hST3Gal_Forward 프라이머 5 ' -ΑΟΟΟΟΟΟΑπθΤΑαΑΑΟΤΑαΤΟΟΑΤΟΟΟΟΟΑΤΟΟΤίΑΟίΑΑΟΤΟΟΟΟΟΤ06ΑΑΟ-3 '(서열번호 5 ) 및 hST3Galᅳ Reverse 프라이머 5'-
TT CTGGMCTmATATTTAAAAGGGGGAAGGACGTGAGGncnGATAGC-3 '(서열번호 6 )를 사용하여， 95 °C에서 3분 전변성, 94 °C에서 30초 변성, 60 °C에서 45초 풀림 (annealing) 및 72 °C에서 3분 연장의 40 사이클의 PCR 조건으로 PCR를 수행하였다. 그 후， 증폭된 각각의 DNA를 추출한 후 제한효소인 Spel/BamHI으로 미.리 잘라둔 yEGFP가 태깅되어 있는 pRS424GAL-yEGFP(URA+) 백터와 PCR로 증폭된 각각의 유전자를 연결 (ligation)하여 ^^궂 ^Escherichia coif) DH5 α 균주에 형질전환 (transformation)하였다. 대장균에서 얻어진 재조합 플라스미드 중 시알산 전이효소 코딩 유전자를 백터 상의 정확한 클로닝 위치에 포함하고 있는 클론을 제한효소 처리와 DNA 시퀀싱을 통해 확인 및 선별하였다. 또한， 사카로마이세스 세레비시아 (5ai: ?ar(¾ c:es cerevisiae) FGY217(MAT α , ura3-52, lys2A201, ρβρ4Δ) 균주 (strain)에 리튬 아세테이트 (lithium acetate) 방법으로 형질전환하여 생긴 콜로니를 분석하였다.
그 결과， 시알산 전이효소 발현 시 yEGFP 태깅되어 있어 발현된 단백질의 발현양을ᅳ .센 Ϊᅳ전 ilLb_oleᅳ c_e.Ul,ᅳᅳ조 ^ Ccnudeᅳ exttact-)ᅳ및—― in situ SDS-PAGE에서 목적 단백질의 존재여부 및 정량적 양이 바로 확인 가능한 우렁쉥이 (멍게 , Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소가 코딩된 백터를 제작하였다.
<실험예 1>우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 이종 숙주인 효모에서의 타겟팅 및 발현 확인
<1-1> 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 이종 숙주인 효모에서의 타겟팅 확인
본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소가 효모에서 발현되는 양상을 확인하고자 공촛점현미경 (confocal microscopy)로 관찰하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 3>의 pRS424GAL 유래 재조합 백터를 사카로마이세스 세레비시아 FGY217(MATa , ura3-52, lys2ᅀ 201， pep4A) 균주 (strain)에 리튬 아세테이트 (lithium acetate) 방법으로 형질전환시켰다. 그 후， 영양요구주 (auxotroph) 마커 (marker)를 갖는 pRS424GAL 유래 상기 <실시예 3>의 재조합 백터를 포함하고 있는 상기 사카로마이세스 세레비시아 FGY217균주를 dropout 배지인 SOLeu 배지에서 배양하였다. 상기 형질전환된 균주의 싱글 콜로니를 2%글루코스가 포함된 SC-URA배지에서 24내지 48시간 동안 배양한 후， 상기 배양물의 1/KX)을 0.1% 글루코스가 포함 SC-URA 배지에서 OD600 값이 0.6 내지 0.8 이 되도록 배양하였다. 그 후， 20% D-갈락토스를 최종농도가 2%가 되도록 첨가하여 30 °C에서 배양하면서 세포 내에서의 단위 시간별 단백질의 위치화 (localization)를 공촛점현미경 (confocal microscopy)를 이용하여 시알산 전이효소에 태깅되어 있는 GFP를 관찰하였다.
그 결과， 시알산 전이효소가 골지 기구 (Golgi apparatus)에서 관찰되는 전형적인 형태인 점 (spot) 모양으로 존재함을 공촛점현미경 (confocal microscopy)을 통해 확인되었으며， 대조군인 인간 유래 시알산 전이효소에 비해， 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소가 효모 세포의 골지체 막에 더욱 효과적으로 타겟팅되어 점 (dot) 모양으로 위치함을 확인하였다 (도 2).
<1-2> 우렁쉥이 (멍게 , Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 이종 숙주인 효모에서의 발현 확인 본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의
확인하고자 웨스턴 블롯으로 관찰하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 3>의 pRS424GAL 유래 재조합 백터를 사카로마이세스 세레비시아 FGY217(MATa, ura3-52, lys2A201, pep4ᅀ) 균주 (strain)에 리튬 아세테이트 (lithium acetate) 방법으로 형질전환시켰다. 그 후， 영양요구주 마커를 갖는 상기 재조합 백터를 포함하고 있는 사카로마이세스 세레비시아 FGY217균주를 dropout 배지인 SOLeu 배지에서 배양하였다. 성글 콜로니를 2%글루코스가포함된 SC-URA배지에서 24내지 48시간 동안 배양한 후， 상기 배양물의 1/100을 0.1% 글루코스가 포함된 SC-URA 배지에서 OD600 값이 0.6 내지 0.8 이 되도록 배양하였다. 그 후， 20% D-갈락토스를 최종농도가 2%가 되도록 첨가하여 30 °C에서 배양하면서 세포 내에서의 단위 시간별 GFP가 태깅된 시알산 전이효소의 발현량조추출액에서 확인하였다. 조추출액은 세포 회수 후ᅳ 세포를 bead beater를' 이용하여 파쇄하고 원심분리기로 6,000 rpm에서 미파쇄된 세포를 제거한 후 상등액을 취하여 제조하였으며， 이 조추출액에서 발현된 단백질을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다.
그 결과， 대조군인 인간 유래 시알산 전이효소와 본 발명의 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 발현량이 유사한 정도로 확인되었다 (도 4).
<실험예 2>우렁쉥이 (멍게 , Halocynthia rorentzi) 유래 시알산 전이효소의 활성 확인
<2-1>비시알산화페투인 (Asialofetuin)을 이용한 시알산 전이효소의 시알산 전이 활성 확인
본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 활성 확인을 위해 비시알산화페투인 (asialofetuin)을 기질로 이용하여 in vitro 시알화 반응 (sialylation reaction)을 수행한 후， 시알화된 단백질을 렉틴 블롯 분석으로 _인표였봐_.ᅳ
구체적으로, in 시알화 반웅을 수행하기 위해， 앞서 단백질 발현에서 확인된 조추출액을 이용하여 시알화 수용체 비시알산화페투인 1 mg/mL, 시알산 공여체 CMP-시알산 0.5 mg/mL, 10 mM MnCl2 및 1% Tri
TEV(Tobacco Etch Virus)프로테아제를 PBS(phosphate buffered sal ine)와 흔합하여 25 °C에서 1내지 12시간 동안 반웅시켰다. 그 후， 효소 반응물의 시알화를 렉틴 블롯 분석을 통해 확인하기 위하여， 상기 시알화 효소 반응물을 5X램리 버퍼 (Lae隱 Π buffer)와 흔합하여 10분 동안 끓인 후, 8% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀를로스 (nitrocellulose) 막에 트랜스퍼 (transfer ) 하고， 이를 3% 소혈청알부민 (bovine serum albumin)이 포함된 PBST(0.5% Tween포함)에 넣어 1 시간 동안 블로킹 (blocking)하였다. 그 후, 1 mg/mL의 MAA렉틴 (EY Laboratories, San Mateo, CA) 또는 1 mg/mL의 SNA—I 렉틴 (EY. Laboratories, San Mateo, CA)이 들어있는 3% BSA-PBS에 막을 넣어 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후， 막을 PBST로 10 분 동안 6회 세척한 후， 0.2 mg/mL horseradish peroxidase(HRP)一 conjugated streptavidin(l:500; Sigma_Aldr ich)과 한 시간 동안 반웅시켰다. 반응 후， 같은 방법으로 막을 PBST로 10분 동안 6회 세척하여， ECL kit(GE Healthcare)로 시알화된 단백질을 확인하였다.
그 결과， Hror_ST에서는 Neu5Ac α(2,3) Gal β(1,4) GlcNAc의 α2,3-결합을 인식하는 Maackia amurensisi kk) 렉틴 및 Neu5Ac α(2,6) Gal 과 Neu5Ac α(2,6) GalNAc을 인지하는 Sa bucus nigra(SM) 랙틴 블롯이 모두 확인되었으나, 음성 대조군인 비시알산화페투인에는 MM 와 SNA-I 렉틴은 거의 측정되지 않았으며， 양성 대조군인 페투인 (fetuin)에 대해서는 단지 SNA-I에서만 시그널이 확인되었다 (도 3).
<2-2> 유리당쇄 (Free glycan)를 이용한 시알산 전이효소의 시알산 전이 활성 확인
본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소의 다른 기질에 대한 활성의 ᅳ훼인 _을ᅳ ..위.해 . 유리당쇄 (Free . glycan)를一； _질 -로^ _용_하숴 _ in—v-i o— 알화 반응 (sialylation reaction)을 수행한 후， 시알산 전이 활성을 확인하였다.
구체적으로， in vitro시알화 반웅을 수행하기 위하여， 조추출액을 이용해 시알화 수용체 비시알산화당쇄 (asialoglycan) 0.01-10 i
CMP—시알산 0.1 내지 0.5 mg/mL, 10 ητΜ MnCl2, 1% Triton X— 100 및 0.02 Unit TEV(Tobacco Etch Virus)프로테아제를 PBS와 흔합한 후， 20내지 40 °C에서 1내지 12 시간 동안 반웅시켰다. 반웅 후， 시알산 전이 효소의 산물의 측정은 시알산 전이효소 반응 후 CMP-시알산에서 시알산이 당 수용체에 전달된 후 유리되는 사이클릭 모노포스페이트 (Cyclic monophosphate, CMP)에 대한 포스파타아제 (phosphatase)의 효소 반응을 이용하여 Wu et al . (Glycobiology 21, 727 (2011))에 기재된 방법에 따라 확인하였다.
그 결과, 시알산 전이효소의 비시알산화 유리 당쇄 (asialo free glycan)에 대한 활성을 확인할 수 있었다 (표 1). '
【표 11
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
<2-3>시알산 전이효소의 시알산 결합 (linkage) 확인
본 발명자들은 우렁쉥이 유래 시알산 전이효소에 의해 시알화된 비시알산화페투인 (asialofetuin)의 시알산 결합을 확인하기 위하여 결합 특이적 시알리다아제를 처리하여 시알산을 절단한 후 렉틴 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로 in ' ro시알화 반웅을 수행하기 위해， 앞서 단백질 발현에서 확인돤 조추출액을 이용하여 시알화 수용체 비시알산화페투인 1 nig/mL, 시알산 공여체 CMP-시알산 0.5 mg/mL, 10 mM MnCl2 및 1% Triton X-100, 0.02 Unit TEV(Tobacco Etch Virus)프로테아제를 PBSCphosphate buffered sal ine)와 흔합하여 25 °C에서 1내지 12시간 동안 반응시켰다. 그 후, /τϊ / / 시알화 반웅을 통해 합성된 ᅵ 시알화된 비시알산화페투인의 시알산 결합을 확인하기 위해, α(2,3)-시알산 결합 특이적 시알리다아제 (sialidase)인 Streptococcus pneumonia exo-시알리다아제 (Sigma-Mdrich) 및 Vibrio chorelae α 2，3(6)(8)-시알산 가수분해 시알리다아제 (Sigma-Aldrich)과 각각 30 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨 후， a2,3-linkage 확인을 위한 MAA 렉틴 또는 a2, 6ᅳ linkage 확인을 위한 SNA-I 렉틴을 사용하여 상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법의 렉틴 블롯 분석을 통해 시알산이 부가되어 있는 당단백질을 측정하여 시알산 전이효소에 의해 전이된 시알산의 결합 (linkage)을 확인하였다.
그 결과， α2,3—결합 시알산을 특이적으로 가수분해하는 penumoniae^ exo—시알리다아제를 처리했음에도 불구하고 MM 렉틴에 의한 시알화된 비시알산화페투인이 측정되었으며, 양성 대조군으로 사용한 hST3에서도 같은 결과가 관찰되었다 (도 3).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi)쒜\ 유래한 시알산 전이효소 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드.
【청구항 2】
제 1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 3】
제 2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 4]
제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터.
【청구항 5】
제 4항의 발현 백터로 형질전환된 형질전환체.
【청구항 6】
1) 제 4항의 발현 백터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계;
2) 단계 1)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배양물로부터 시알산 전이효소를 회수하는 단계를 포함하는 우렁쉥이 (멍게， Halocynthia rorentzi) 유래 활성형 시알산 전이효소의 제조방법 .
【청구항 7】
-제一 6-¾ 았어—서" Γᅳ상커—숙주-세-포는ᅳ빅테-라아^는ᅳ효 ~ —을ᅳ특짐 로ᅳ 하는 방법ᅳ
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스 C 7/zy ?co«7i/s aureus) , 대장균 ( ' coli) , 바실러스 세레우스 0?. cereus) , 살모넬라 타이피뮤림 (5a/»o?e//a typimurium) , 살모넬라 콜레라수이스 (5a//z?o½//a choleraesuis) , 여시니아 엔테로콜리티카 (½rs//?/a* enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스 ( /s e /a monocytogenes) 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
제 7항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 (5accAsro//7j^es), 피키아 (Λ'ί /a), 클루베로마이세스 ( i7i/j^e ¾ ces), 한세눌라 0¾/2se //a) 또는 캔디다 속에 속하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10]
제 9항에 있어서， 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시아 (5acc aro/yces cerevisiae) FGY217균주인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
1) 제 1항의 우렁쉥이 (멍게) 유래 시알산 전이효소， 시알화 수용체 및 시알산 공여체를 흔합하는 단계 ; 및 -
2) 단계 1)의 흔합물을 반응시켜 수용체에 시알산을 부가하는 단계를 포함하는 시알산이 부가된 시알화 복합당질의 생산 방법 .
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 시알화 수용체는 단당, 을리고당, 다당， 펩티드，
—단짹-질 당-단 ^질 ^ ^질^당지^ ^프로一테 글리_칸 ᅳ것ᅳ을ᅳ특^≤ 하^_방_법_.—
【청구항 13] 제 11항에 있어서， 상기 시알화 공여체는
Figure imgf000022_0001
CMP-시알산 유도체인 것을 특징으로 하는 방법 ·
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