CN114958943A - 一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，包括，分别在大肠杆菌中表达并纯化酵母来源的糖基转移酶Alg1以及人源的糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT‑I、糖基转移酶GnT‑II和糖基转移酶GalT以及幽门螺旋杆菌来源的糖基转移酶FuT，以PPGn2与GDP‑Man作为初始底物，在体外成功制备了典型复合型寡糖PPGn2‑Man3Gn2、PPGn2‑Man3Gn2Gal2以及其他非典型N‑寡糖。本发明解决了膜蛋白在原核表达体系极易降解和纯化困难的问题，并克服了有机合成的困难，利用化学酶法催化得到多种具有生物活性的寡糖结构，推动糖化学和糖生物学的发展。

Description

一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及到一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法。

背景技术

糖基化是真核细胞翻译后修饰方式之一，主要是对蛋白质或脂质进行修饰，形成糖复合物。蛋白上的糖链修饰对其结构和功能有重要的影响。复合型N-寡糖广泛存在于细胞中的成熟糖蛋白上，因其生物学意义而得到了大量研究。目前复合型寡糖的制备主要通过化学法和从鸡蛋中提取，其中化学法因需要立体和区域选择性的合成糖苷键具有很高难度，而提取法步骤繁琐耗时，两者产生的副产物多且效率低。化学酶法可以克服上述的困难，以高效的酶催化反应高产率得到目标产物。目前未有报道通过化学酶法合成带有脂肪链的复合型寡糖，主要原因是这一系列的糖基转移酶都是膜蛋白，表达和纯化都较为困难；另外，作为底物的脂质磷酸连接的寡糖较难得到。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

本发明的其中一个目的是提供一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，在体外成功制备了典型复合型寡糖PPGn2-Man3Gn2、PPGn2-Man3Gn2Gal2以及其他非典型N-寡糖。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，包括，

分别在大肠杆菌中表达酵母来源的糖基转移酶Alg1以及人来源的糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT；

以PPGn2与GDP-Man作为初始底物，在糖基转移酶Alg1和糖基转移酶Alg2的催化下得到第一产物；

将第一产物与UDP-GlcNAc作为底物，在糖基转移酶GnT-I和糖基转移酶GnT-II催化下得到第二产物；

将第二产物与UDP-Gal作为底物，在糖基转移酶GalT催化下得到复合型寡糖。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述第一产物为PPGn2-Man3，所述第二产物包括PPGn2-Man3-Gn和PPGn2-Man3-Gn2；

所述第二产物为PPGn2-Man3-Gn时，所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-GnGal；

所述第二产物为PPGn2-Man3-Gn2时，所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-Gn2Gal2。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：还包括在大肠杆菌中表达幽门螺旋杆菌来源的糖基转移酶FuT；

以所述复合型寡糖与GDP-Fuc作为底物，在糖基转移酶FuT催化下的寡糖终产物。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-GnGal时，所述寡糖终产物为PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal；

所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-Gn2Gal2时，所述寡糖终产物为PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述在糖基转移酶Alg1和糖基转移酶Alg2的催化下得到第一产物，反应体系中还含有MES、柠檬酸钾、MgCl₂或MnCl₂和NP-40；

相对于50μL的转化底物，所述PPGn2的浓度为100μM，所述GDP-Man的浓度为2mM，所述MES的终浓度为14mM，所述柠檬酸钾的终浓度为4mM，所述MgCl₂的终浓度为10mM，所述NP-40的终浓度为0.05％；

向反应体系中依次加入100μg/mL糖基转移酶Alg1，125μg/mL糖基转移酶Alg2，反应温度为37℃，时间分别为1～2h。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述将第一产物与UDP-GlcNAc作为底物，在糖基转移酶GnT-I和糖基转移酶GnT-II催化下得到第二产物，向合成第一产物的反应体系中加入2mM UDP-GlcNAc，依次加入100μg/mL糖基转移酶GnT-I和300μg/mL糖基转移酶GnT-II，反应温度为37℃，时间分别为2～12h。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述将第二产物与UDP-Gal作为底物，在糖基转移酶GalT催化下得到复合型寡糖，向合成所述第二产物的反应体系中加入2mM UDP-Gal，加入200μg/mL糖基转移酶GalT，反应温度为37℃，时间为4～12h。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述以所述复合型寡糖与GDP-Fuc作为底物，在糖基转移酶FuT催化下的寡糖终产物，向合成所述复合型寡糖的反应体系中加入2mM GDP-Fuc，并加入100μg/mL糖基转移酶FuT，反应温度37℃，时间为12～24h。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述糖基转移酶Alg1为酵母来源的Alg1ΔTM；所述糖基转移酶Alg2为人来源的Trx-Alg2；所述糖基转移酶GnT-I为人来源的GnT-IΔTM；所述糖基转移酶GnT-II为人来源的Trx-GnT-IIΔTM；所述糖基转移酶GalT为人来源的GalTΔTM；所述糖基转移酶FuT为幽门螺旋杆菌来源的FuTΔ66；

所述Alg1ΔTM为截掉N-端跨膜结构域的糖基转移酶Alg1，所述Trx-Alg2为融合了Trx标签的糖基转移酶Alg2，所述GnT-IΔTM为截掉N-端跨膜结构域的糖基转移酶，所述Trx-GnT-IIΔTM为融合了Trx标签截掉N-端跨膜结构域的糖基转移酶GnT-II，所述GalΔTM为截掉N-端跨膜结构域的糖基转移酶，所述FuTΔ66为截掉C-端66个氨基酸的糖基转移酶。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述糖基转移酶Alg1ΔTM基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶Alg2基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GnT-IΔTM基因具有如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GnT-IIΔTM基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GalΔTM基因具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶FuTΔ66基因具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：表达糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT的大肠杆菌为Rosetta原核表达宿主菌，所述糖基转移酶GnT-II的大肠杆菌为Rosetta gami2原核表达宿主菌。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：使用pET28a质粒构建所述糖基转移酶Alg1基因的表达载体、所述糖基转移酶GnT-I基因的表达载体、所述糖基转移酶GnT-II基因的表达载体以及所述糖基转移酶GalT基因的表达载体；

使用pET32a质粒构建所述糖基转移酶Alg2基因的表达载体；

使用pET21b质粒构建所述糖基转移酶FuT的表达载体。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：还包括对经过大肠杆菌表达的糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT进行纯化的步骤。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述纯化，将原核表达了糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT的重组大肠杆菌分别超声破碎后，分别离心制备糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2膜成分，将所述糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2膜成分分别溶于1％TritonX-100缓冲液得到糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2膜蛋白；

将糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶Gal以及糖基转移酶FuT的重组大肠杆菌超声破碎后离心得到糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT上清蛋白；

将所述糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2膜蛋白分别经镍离子亲和层析纯化，将糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT上清蛋白经镍离子亲和层析纯化。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述分别离心制备糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2膜成分，将所述原核表达了糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2的重组大肠杆菌分别超声破碎后，于4000r/min离心20min，弃沉淀，收集上清，加1％TritonX-100在冰上孵育30min，9000r/min离心30min，弃沉淀收集上清。

作为本发明植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法的一种优选方案，其中：所述制备糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT上清蛋白，其中将所述原核表达了糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT的重组大肠杆菌分别超声破碎后，与9000/min离心30min，弃沉淀，收集上清，将所述糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT以及糖基转移酶FuT上清蛋白分别经镍离子亲和层析纯化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明原核表达纯化了酵母来源的Alg1ΔTM，以及人源Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM以及幽门螺旋杆菌来源的FuTΔ66，并在体外成功制备了典型复合型寡糖PPGn2-Man3Gn2、PPGn2-Man3Gn2Gal2以及其他非典型N-寡糖，包括但不限于PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2、PPGn2-Man3-GnGal、PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal，利用糖基转移酶的高效性和立体选择性克服了有机合成的困难，实现了复合型寡糖及多种非典型N-寡糖的化学酶法制备，推动糖化学与糖生物学的发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为酿酒酵母Alg1ΔTM、人源Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM以及幽门螺旋杆菌FuTΔ66蛋白纯化的SDS-PAGE考马斯亮蓝图。

图2为化学酶法合成PPGn2-Man3-Gn2Gal2的流程图(图2A)；除底物PPGn2外，依次加入Alg1ΔTM、Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM以及GalTΔTM，顺次合成PPGn2-Man1、PPGn2Man3、PPGn2-Man3-Gn、PPGn2-Man3-Gn2、PPGn2-Man3-Gn2Gal2等五种结构(图2B)。

图3为终产物PPGn2-Man3Gn2Gal2酸解纯化后的ESI-MS确定其分子量的结果图(图3A)；对产物结构进行酶切验证，Gn2-Man3-Gn2Gal2经半乳糖苷酶处理后生成Gn2-Man3-Gn2；经N-乙酰葡糖胺糖苷酶酶处理后生成Gn2Man3；经过α1,3甘露糖苷酶处理形成Gn2-Man2，同时经过α1,3甘露糖苷酶和α1,6甘露糖苷酶得到Gn2-Man1，经过β1,4甘露糖苷酶处理得到Gn2(图3B)。

图4为化学酶法合成PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2的流程图(图4A)、PPGn2-Man3GnGal和PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal的流程图(图4B)；底物PPGn2-Man3-Gn2Gal2加入FuTΔ66合成PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2(图4C)；底物PPGn2-Man3-Gn分别加入GalTΔTM以及FuTΔ66，依次合成PPGn2-Man3-GnGal和PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal(图4D)；

图5为终产物PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2酸解纯化后的ESI-MS确定其分子量的结果图(图5A)；终产物PPGn2-Man3-GnGal酸解纯化后的ESI-MS确定其分子量的结果图(图5B)；终产物PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal酸解纯化后的ESI-MS确定其分子量的结果图(图5C)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例中所涉及的试剂：限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶、连接酶等购于日本宝生物工程有限公司(大连)；胶回收、PCR产物纯化和质粒提取试剂盒及IPTG购于上海生工；GDP-Man、UDP-GlcNAc和UDP-Gal购于Sigma-Aldrich；α1,3Mannosidase、α1,6Mannosidase和β1,4Mannosidase购于New England Biolabs；α1,2Mannosidase购于ProZyme。引物合成以及测序均在苏州安达升。

实施例1

酿酒酵母Alg1ΔTM、人源Trx-Alg2、GnT-IΔTM、Trx-GnT-IIΔTM和GalTΔTM以及幽门螺旋杆菌来源FuTΔ66的原核表达及纯化。

构建原核载体：根据NCBI上的酿酒酵母Alg1(NCBI登记号：NC_001134.8)、人源Alg2(NCBI登记号：NC_000009.12)、GnT-I(NCBI登记号：NC_000005.10)、GnT-II(NCBI登记号：NC_000014.9)和GalT(NCBI登记号：NC_000009.12)以及幽门螺旋杆菌来源FuT(NCBI登记号：AF008596.1)的核酸序列设计相关引物，引物信息详见表1。PCR获得目标基因片段，PCR产物纯化后，进行双酶切，核酸胶回收后连接对应载体，涂布于相应的抗性筛选平板上，挑选菌落PCR阳性的单克隆，提取质粒送测序。

截掉Alg1的N-端跨膜结构域，得到Alg1ΔTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

Trx-Alg2为融合了Trx标签的糖基转移酶Alg2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

截掉GnT-I的N-端跨膜结构域，得到GnT-IΔTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

将GnT-II融合了Trx标签并截掉N-端跨膜结构域，得到Trx-GnT-IIΔTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

截掉GalT的N-端跨膜结构域，得到GalΔTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

截掉FuT的C-端66个氨基酸，得到FuTΔ66，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

将Alg1ΔTM、GnT-IΔTM、Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM基因片段构建到质粒pET28a上，分别得到重组质粒pET28a-Alg1ΔTM、pET28a-GnT-IΔTM、pET28a-Trx-GnT-IIΔTM、pET28a-GalTΔTM；将Trx-Alg2基因片段构建到质粒pET32a上，得到重组质粒pET32a-Trx-Alg2；将FuTΔ66基因片段构建到质粒pET21b上，得到重组质粒pET21b-FuTΔ66。

表1

将重组原核表达质粒pET32a-Trx-Alg2和pET21b-FuTΔ66分别转化至Rosetta原核表达宿主菌，涂布于LB+Amp+氯霉素，次日从转化平板中挑取单菌落，接种于5mL LB+Amp+氯霉素液体培养基中，37℃震荡过夜培养。取2mL过夜培养的菌液接种于200mL TB+Amp+氯霉素液体培养基中，37℃，220r震荡培养3h，待OD值达到0.8～1.0，然后转移到16℃继续培养1h，加入0.1mM的IPTG诱导12～16h；

将重组原核表达质粒pET28a-Alg1ΔTM、pET28a-GnT-IΔTM、pET28a-GalTΔTM分别转化至Rosetta原核表达宿主菌，涂布于LB+Kan+氯霉素，次日从转化平板中挑取单菌落，接种于5mL LB+Kan+氯霉素液体培养基中，37℃震荡过夜培养。取2mL过夜培养的菌液接种于200mL TB+Kan+氯霉素液体培养基中，37℃，220r震荡培养3h，待OD值达到0.8～1.0，然后转移到16℃继续培养1h，加入0.1mM的IPTG诱导12～16h；

将重组原核表达质粒pET28a-Trx-GnT-IIΔTM转化至Rosetta gami2原核表达宿主菌，涂布于LB+Kan+氯霉素+四环素+链霉素，次日从转化平板中挑取单菌落，接种于5mLLB+Kan+氯霉素+四环素+链霉素液体培养基中，37℃震荡过夜培养。取2mL过夜培养的菌液接种于200mL TB+Kan+氯霉素+四环素+链霉素液体培养基中，37℃，220r震荡培养4-5h，待OD值达到0.8～1.0，然后转移到16℃继续培养1h，加入0.1mM的IPTG诱导12～16h。

将上述表达的蛋白离心收集菌体，重悬于15mL缓冲溶液I(25mM Tris-HCl pH8.0,0.3M NaCl)，超声破碎，其中Alg1ΔTM和Trx-Alg2蛋白4000r/min离心20min，弃沉淀收集上清，加入1％Trton X-100冰上孵育30min，9000r/min离心30min，收集上清用于纯化，GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM以及FuTΔ66等蛋白9000r/min离心30min，收集上清用于纯化。

Alg1ΔTM、Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM和FuTΔ66等蛋白的纯化：HisTrap HP 1mL亲和层析柱先用10倍体积缓冲溶液I(25mM Tris-HCl pH8.0,0.3MNaCl)流速1mL/min平衡后，将上清蛋白上柱，然后分别用含有20、60、250mM咪唑的缓冲液I洗脱10mL，分别收集于离心管中，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示。图1显示已成功表达并纯化得到Alg1ΔTM、Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM和FuTΔ66等蛋白。

实施例2

化学酶法合成植烷醇连接的复合型寡糖PPGn2-Man3-Gn2Gal2

标准的酶反应条件如下：14mM/50μL MES pH 6.0、4mM/50μL potassium citrate、10mM/50μL MgCl₂、10mM/50μL MnCl₂、0.05％NP-40、100μM/50μL PPGn2、2mM/50μL GDP-Man、2mM/50μL UDP-GlcNAc、2mM/50μL UDP-Gal、2mM/50μL GDP-Fuc。反应Buffer都为：14mM/50μL MES pH 6.0、4mM/50μL potassium citrate，0.05％NP-40。

如图2流程图所示，为了酶法合成PPGn2-Man3-Gn2Gal2结构，以PPGn2为底物，加入100μg/mL Alg1ΔTM、2mM GDP-Man、10mM MgCl₂，37℃反应1.5h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man1；

向上述PPGn2-Man1反应体系中加入125μg/mL Trx-Alg2、2mM GDP-Man、10mMMgCl₂，37℃反应1h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3；

向上述PPGn2-Man3反应体系中加入100μg/mL GnT-IΔTM、2mM UDP-GlcNAc、10mMMnCl₂，37℃反应2h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-Gn；

向PPGn2-Man3-Gn反应体系中加入300μg/mL Trx-GnT-IIΔTM、2mM UDP-GlcNAC、10mM MnCl₂，37℃反应4h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-Gn2；

向PPGn2-Man3-Gn2反应体系中加入200μg/mL GalTΔTM、2mM UDP-Gal、10mMMgCl₂，37℃反应12h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-Gn2Gal2。

反应结束后加入0.1mL终浓度为20mM的HCl于100℃下酸解1h，释放糖链与脂肪链Phytanol。酸解出产物15000r/min离心10min，上清通过1mL固相萃取填料SupelcleanENVI-Carb Slurry进行纯化，糖链分别用3mL 25％的乙腈洗脱后冷冻干燥。最终得到的纯化糖链粉末溶解于40μL的80％的乙腈中，通过超高液相色谱仪DionexμLtimate 3000UPLC(ThermoScientific)自动进样10μL到氨基色谱柱(Waters Acquity UPLC BEH AmideColumn 1.7um 2.1×100mm)，乙腈线性梯度洗脱(溶液A:CH3CN；溶液B:H20；洗脱条件：0-2min，20％B；2-15min，20-50％；15-18min，50％B；流速：0.2mL/min)分离底物和产物。流出液通过ESI-MS仪器TSQ QuantumμLtra(ThermoScientific)同步检测分子量(正离子模式下扫描400-2000m/z分质量范围)。

图3A的ESI-MS结果显示最终产物Gn2-Man3Gn2Gal2加钠后的分子量为1664.72，与预测的一致。

实施例3

为了进一步确定Gn2-Man3Gn2Gal2的立体结构，终产物分别加入不同的水解酶进行水解反应。反应体系如下：对半乳糖苷酶：1μL商业缓冲液(10*)，8μL寡糖(2.5nmol)，1μL酶，37℃反应4-12h；对于葡糖胺水解酶：1μL商业缓冲液(10*)，1μL BSA(10*)，8μL寡糖(2.5nmol)，1μL酶，37℃反应12h；对于α1,3Mannnosidase和α1,6Mannnosidase：1μL商业缓冲液(10*)，1μL BSA(10*)，8μL寡糖(2.5nmol)，0.1μL酶(分别为3.2和4U)25℃反应16h；对于β1,4Mannosidase:50mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.0)，8μL寡糖(2.5nmol)，0.1U酶，25℃反应16h。

结果如图3B所示，Gn2-Man3Gn2Gal2经过半乳糖苷酶处理后生成Gn2-Man3Gn2，经过N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理形成Gn2-Man3；经过α1,3Mannnosidase处理形成Gn2-Man2；同时经过α1,3Mannnosidase和α1,6Mannnosidase处理后形成Gn2-Man1；经过β1,4Mannosidase处理后生成Gn2。综上所述：通过体外化学酶法合成的产物结构与细胞内的结构一致。

实施例4

化学酶法合成植烷醇连接的寡糖PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2

如图4A流程图所示，为了酶法合成PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2，向合成所述PPGn2-Man3-Gn2Gal2的反应体系中加入100μg/mL FuTΔ66、2mM GDP-Fuc、10mM MnCl₂，37℃反应16h，在100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2。

实施例5

化学酶法合成植烷醇连接的寡糖PPGn2-Man3-GnGal和PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal

如图4B流程图所示，向合成所述PPGn2-Man3-Gn的反应体系中加入GalTΔTM 2μg、2mM UDP-Gal、10mM MgCl₂，于37℃反应12h，100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-GnGal，向所述PPGn2-Man3-GnGal反应体系中加入100μg/mL FuTΔ66、2mM GDP-Fuc、10mM MnCl₂，于37℃反应16h，100℃下5min灭活，离心收集上清得到PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal。

实施例4和实施例5结束后的处理及其LC-MS条件与实施例3一致，结果如图5所示。

通过不同糖基转移酶的顺序加入，我们能够依次合成糖PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2、PPGn2-Man3-GnGal、PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal等三种寡糖结构，上述结构都通过ESI-MS确定其分子量，如图5所示PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2在ESI-MS中发现989.30[M+2Na]²⁺，PPGn2-Man3-GnGal在ESI-MS中发现1298.16[M+Na]⁺，PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal在ESI-MS中发现1444.61[M+Na]⁺,结果显示均与预测的完全一致。

本发明原核表达纯化了酿酒酵母来源的Alg1ΔTM、人的Trx-Alg2、GnT-IΔTM，Trx-GnT-IIΔTM、GalTΔTM以及幽门螺旋杆菌来源FuTΔ66等糖基转移酶，并在体外成功制得PPGn2-Man3Gn、PPGn2-Man3Gn2、PPGn2-Man3Gn2Gal2、PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2、PPGn2-Man3-GnGal、PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal等寡糖，解决了膜蛋白在原核表达体系极易降解和纯化困难的问题，并克服了有机合成的困难，利用化学酶法催化得到多种具有生物活性的寡糖结构，推动糖化学和糖生物学的发展。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1248

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagtcgacca aaaaaaggat catcatattt gtgctgggtg atgtaggaca ctctccaagg 60

atatgctatc acgctataag tttcagtaag ttaggttggc aagtcgagct atgcggttat 120

gtggaggaca ctctacccaa aattatttcc agtgatccaa atatcaccgt ccatcatatg 180

tcaaacttga aaagaaaggg aggcggaaca tcagttatat ttatggtaaa gaaggtgctt 240

tttcaagttt taagtatttt caaattactt tgggaattga gaggaagcga ttacatacta 300

gttcaaaatc caccgagcat acccattctt ccgattgctg tgctatacaa gttgaccggt 360

tgtaaactaa ttattgattg gcacaatcta gcatattcga tattgcaact aaaatttaaa 420

ggaaactttt accatccttt agtgttgata tcttacatgg tagagatgat attcagcaaa 480

tttgctgatt ataacttgac tgttactgaa gcaatgagga aatatttaat tcaaagcttt 540

cacttgaatc caaagagatg tgctgttctc tacgaccgcc cggcttccca atttcaacct 600

ttggcaggtg acatttctcg tcaaaaagcc ctaactacca aagcctttat aaagaattat 660

attcgcgatg attttgatac agaaaaaggc gataaaatta ttgtgacttc aacatcattc 720

acccctgatg aagatattgg tattttatta ggtgccctaa agatttacga aaactcttat 780

gtcaaatttg attcaagttt gcctaagatc ttgtgtttta taacgggtaa aggaccacta 840

aaggagaaat atatgaagca agtagaagaa tatgactgga agcgctgtca aatcgaattt 900

gtgtggttgt cagcagagga ttacccaaag ttattacaat tatgcgatta cggagtttcc 960

ctgcatactt caagttcagg gttggacctg ccaatgaaaa ttttagatat gtttggctca 1020

ggtcttcctg ttattgcaat gaactatcca gtgcttgacg aattagtaca acacaatgta 1080

aatgggttaa aatttgttga tagaagggag cttcatgaat ctctgatttt tgctatgaaa 1140

gatgctgatt tataccaaaa attgaagaaa aatgtaacgc aggaagctga gaacagatgg 1200

caatcaaatt gggaacgaac aatgagagat ttgaagctaa ttcattga 1248

<210> 2

<211> 1248

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggaggagc agggccggga acgggactcg gttcccaagc cgtcggtgct gttcctccac 60

ccagacctgg gcgtgggcgg cgctgagcgg ctggtgttgg acgcggcgct ggcgctgcag 120

gcgcgcgggt gtagcgtgaa gatctggaca gcgcactacg acccgggcca ctgtttcgcc 180

gagagccgcg agctaccggt gcgctgtgcc ggggactggc tgccgcgagg cctgggctgg 240

ggcggccgcg gcgccgccgt ctgcgcctac gtgcgcatgg ttttcctggc gctctacgtg 300

ctgttcctcg ccgacgagga gttcgacgtg gtagtgtgcg accaggtgtc tgcctgtatc 360

ccagtgttca ggctggctag acggcggaag aagatcctat tttactgtca cttcccagat 420

ctgcttctca ccaagagaga ttcttttctt aaacgactat acagggcccc aattgactgg 480

atagaggaat acaccacagg catggcagac tgcatcttag tcaacagcca gttcacagct 540

gctgttttta aggaaacatt caagtccctg tctcacatag accctgatgt cctctatcca 600

tctctaaatg tcaccagctt tgactcagtt gttcctgaaa agctggatga cctagtcccc 660

aaggggaaaa aattcctgct gctctccatc aacagatacg aaaggaagaa aaatctgact 720

ttggcactgg aagccctagt acagctgcgt ggaagattga catcccaaga ttgggagagg 780

gttcatctga tcgtggcagg tggttatgac gagagagtcc tggagaatgt ggaacattat 840

caggaattga agaaaatggt ccaacagtcc gaccttggcc agtatgtgac cttcttgagg 900

tctttctcag acaaacagaa aatctccctc ctccacagct gcacgtgtgt gctttacaca 960

ccaagcaatg agcactttgg cattgtccct ctggaagcca tgtacatgca gtgcccagtc 1020

attgctgtta attcgggtgg acccttggag tccattgacc acagtgtcac agggtttctg 1080

tgtgagcctg acccggtgca cttctcagaa gcaatagaaa agttcatccg tgaaccttcc 1140

ttaaaagcca ccatgggcct ggctggaaga gccagagtga aggaaaaatt ttcccctgaa 1200

gcatttacag aacagctcta ccgatatgtt accaaactgc tggtataa 1248

<210> 3

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcgcccag cacctggcag gccaccctca gtcagcgctc tcgatggcga ccccgccagc 60

ctcacccggg aagtgattcg cctggcccaa gacgccgagg tggagctgga gcggcagcgt 120

gggctgctgc agcagatcgg ggatgccctg tcgagccagc gggggagggt gcccaccgcg 180

gcccctcccg cccagccgcg tgtgcctgtg acccccgcgc cggcggtgat tcccatcctg 240

gtcatcgcct gtgaccgcag cactgttcgg cgctgcctgg acaagctgct gcattatcgg 300

ccctcggctg agctcttccc catcatcgtt agccaggact gcgggcacga ggagacggcc 360

caggccatcg cctcctacgg cagcgcggtc acgcacatcc ggcagcccga cctgagcagc 420

attgcggtgc cgccggacca ccgcaagttc cagggctact acaagatcgc gcgccactac 480

cgctgggcgc tgggccaggt cttccggcag tttcgcttcc ccgcggccgt ggtggtggag 540

gatgacctgg aggtggcccc ggacttcttc gagtactttc gggccaccta tccgctgctg 600

aaggccgacc cctccctgtg gtgcgtctcg gcctggaatg acaacggcaa ggagcagatg 660

gtggacgcca gcaggcctga gctgctctac cgcaccgact ttttccctgg cctgggctgg 720

ctgctgttgg ccgagctctg ggctgagctg gagcccaagt ggccaaaggc cttctgggac 780

gactggatgc ggcggccgga gcagcggcag gggcgggcct gcatacgccc tgagatctca 840

agaacgatga cctttggccg caagggtgtg agccacgggc agttctttga ccagcacctc 900

aagtttatca agctgaacca gcagtttgtg cacttcaccc agctggacct gtcttacctg 960

cagcgggagg cctatgaccg agatttcctc gcccgcgtct acggtgctcc ccagctgcag 1020

gtggagaaag tgaggaccaa tgaccggaag gagctggggg aggtgcgggt gcagtatacg 1080

ggcagggaca gcttcaaggc tttcgccaag gctctgggtg tcatggatga ccttaagtcg 1140

ggggttccga gagctggcta ccggggtatt gtcaccttcc agttccgggg ccgccgtgtc 1200

cacctggcgc ccccactgac gtgggagggc tatgatccta gctggaatta g 1251

<210> 4

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggcccga caaaggaaga acgaggccct cgccccaccg 360

ttgctggacg ccgaacccgc gcggggtgcc ggcggccgcg gtggggacca cccctctgtg 420

gctgtgggca tccgcagggt ctccaacgtg tcggcggctt ccctggtccc ggcggtcccc 480

cagcccgagg cggacaacct gacgctgcgg taccggtccc tggtgtacca gctgaacttt 540

gatcagaccc tgaggaatgt agataaggct ggcacctggg ccccccggga gctggtgctg 600

gtggtccagg tgcataaccg gcccgaatac ctcagactgc tgctggactc acttcgaaaa 660

gcccagggaa ttgacaacgt cctcgtcatc tttagccatg acttctggtc gaccgagatc 720

aatcagctga tcgccggggt gaatttctgt ccggttctgc aggtgttctt tcctttcagc 780

attcagttgt accctaacga gtttccaggt agtgacccta gagattgtcc cagagacctg 840

ccgaagaatg ccgctttgaa attggggtgc atcaatgctg agtatcccga ctccttcggc 900

cattatagag aggccaaatt ctcccagacc aaacatcact ggtggtggaa gctgcatttt 960

gtgtgggaaa gagtgaaaat tcttcgagat tatgctggcc ttatactttt cctagaagag 1020

gatcactact tagccccaga cttttaccat gtcttcaaaa agatgtggaa actgaagcag 1080

caagagtgcc ctgaatgtga tgttctctcc ctggggacct atagtgccag tcgcagtttc 1140

tatggcatgg ctgacaaggt agatgtgaaa acttggaaat ccacagagca caatatgggt 1200

ctagccttga cccggaatgc ctatcagaag ctgatcgagt gcacagacac tttctgtact 1260

tatgatgatt ataactggga ctggactctt caatacttga ctgtatcttg tcttccaaaa 1320

ttctggaaag tgctggttcc tcaaattcct aggatctttc atgctggaga ctgtggtatg 1380

catcacaaga aaacctgtag accatccact cagagtgccc aaattgagtc actcttaaat 1440

aataacaaac aatacatgtt tccagaaact ctaactatca gtgaaaagtt tactgtggta 1500

gccatttccc cacctagaaa aaatggaggg tggggagata ttagggacca tgaactctgt 1560

aaaagttata gaagactgca g 1581

<210> 5

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcgacctga gccgcctgcc ccaactggtc ggagtctcca caccgctgca gggcggctcg 60

aacagtgccg ccgccatcgg gcagtcctcc ggggagctcc ggaccggagg ggcccggccg 120

ccgcctcctc taggcgcctc ctcccagccg cgcccgggtg gcgactccag cccagtcgtg 180

gattctggcc ctggccccgc tagcaacttg acctcggtcc cagtgcccca caccaccgca 240

ctgtcgctgc ccgcctgccc tgaggagtcc ccgctgcttg tgggccccat gctgattgag 300

tttaacatgc ctgtggacct ggagctcgtg gcaaagcaga acccaaatgt gaagatgggc 360

ggccgctatg cccccaggga ctgcgtctct cctcacaagg tggccatcat cattccattc 420

cgcaaccggc aggagcacct caagtactgg ctatattatt tgcacccagt cctgcagcgc 480

cagcagctgg actatggcat ctatgttatc aaccaggcgg gagacactat attcaatcgt 540

gctaagctcc tcaatgttgg ctttcaagaa gccttgaagg actatgacta cacctgcttt 600

gtgtttagtg acgtggacct cattccaatg aatgaccata atgcgtacag gtgtttttca 660

cagccacggc acatttccgt tgcaatggat aagtttggat tcagcctacc ttatgttcag 720

tattttggag gtgtctctgc tctaagtaaa caacagtttc taaccatcaa tggatttcct 780

aataattatt ggggctgggg aggagaagat gatgacattt ttaacagatt agtttttaga 840

ggcatgtcta tatctcgccc aaatgctgtg gtcgggaggt gtcgcatgat ccgccactca 900

agagacaaga aaaatgaacc caatcctcag aggtttgacc gaattgcaca cacaaaggag 960

acaatgctct ctgatggttt gaactcactc acctaccagg tgctggatgt acagagatac 1020

ccattgtata cccaaatcac agtggacatc gggacaccga gctag 1065

<210> 6

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgttccaac ccctattaga cgcttatgta gaaagcgctt ccattgaaaa aatggcctct 60

aaatctcccc cccccctaaa aatcgctgtg gcgaattggt ggggagatga agaaattaaa 120

gaatttaaaa atagcgttct ttattttatc ctaagccaac gctacacaat caccctccac 180

caaaacccca atgaattttc agatctcgtc tttggtaacc cccttggatc ggccagaaaa 240

atcttatcct atcaaaacgc taaacgagtg ttttacaccg gtgaaaacga atcgcctaat 300

ttcaacctct ttgattacgc cataggcttt gatgaattgg attttaatga tcgttatttg 360

agaatgcctt tatattatga taggctacac cataaagccg agagcgtgaa tgacaccact 420

gcgccctaca aactcaaaga taacagcctt tatgctttaa aaaaaccctc ccattgtttt 480

aaagaaaaac accccaattt atgcgcagta gtgaatgatg agagcgatcc tttgaaaaga 540

gggtttgcga gctttgtcgc gagcaaccct aacgccccta taaggaacgc tttctatgac 600

gctctaaatt ctattgaacc agttactggg ggagggagcg tgagaaacac tttaggctat 660

aacgtcaaaa acaaaaacga gtttttaagc caatacaagt tcaacctgtg ttttgaaaac 720

actcaaggct atggctatgt aactgaaaaa atcattgacg cttactttag ccataccatt 780

cctatttatt gggggagtcc tagcgtggcg aaagatttta accctaaaag ttttgtgaat 840

gtgcatgatt tcaaaaactt tgatgaagcg attgactata tcaaatactt gcacacgcac 900

aaaaacgctt atttagacat gctttatgaa aaccctttga acacccttga tgggaaagct 960

tacttttacc aaaatttgag ttttaaaaag atcctagctt tttttaaaac gattttagaa 1020

aacgatacga tttatcacga taaccctttc attttctgtc gtgatttgaa tgagccttta 1080

gtaactattg atgatttgag ggttaattat gatgatttga gggttaatta tgatgatttg 1140

agaattaatt atgatgattt gagggttaat tatgatgatt tgagaattaa ttatgatgat 1200

ttgagggtta attatgatga tttgagggtt aattat 1236

Claims (10)

1.一种植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：包括，

分别在大肠杆菌中表达酵母来源的糖基转移酶Alg1以及人来源的糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT；

以PPGn2与GDP-Man作为初始底物，在糖基转移酶Alg1和糖基转移酶Alg2的催化下得到第一产物；

将第一产物与UDP-GlcNAc作为底物，在糖基转移酶GnT-I和糖基转移酶GnT-II催化下得到第二产物；

将第二产物与UDP-Gal作为底物，在糖基转移酶GalT催化下得到复合型寡糖；

其中，所述第一产物为PPGn2-Man3，所述第二产物包括PPGn2-Man3-Gn和PPGn2-Man3-Gn2；

所述第二产物为PPGn2-Man3-Gn时，所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-GnGal；

所述第二产物为PPGn2-Man3-Gn2时，所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-Gn2Gal2。

2.如权利要求1所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述在糖基转移酶Alg1和糖基转移酶Alg2的催化下得到第一产物，反应体系中还含有MES、柠檬酸钾、MgCl₂或MnCl₂和NP-40；

相对于50μL的转化底物，所述PPGn2的浓度为100μM，所述GDP-Man的浓度为2mM；

所述MES的终浓度为14mM，所述柠檬酸钾的终浓度为4mM，所述MgCl₂或MnCl₂的终浓度为10mM，所述NP-40的终浓度为0.05％；

向反应体系中依次加入100μg/mL糖基转移酶Alg1，125μg/mL糖基转移酶Alg2，反应温度为37℃，时间分别为1～2h。

3.如权利要求2所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述将第一产物与UDP-GlcNAc作为底物，在糖基转移酶GnT-I和糖基转移酶GnT-II催化下得到第二产物，向合成第一产物的反应体系中加入2mM UDP-GlcNAc，依次加入100μg/mL糖基转移酶GnT-I和300μg/mL糖基转移酶GnT-II，反应温度为37℃，时间分别为2～12h。

4.如权利要求3所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述将第二产物与UDP-Gal作为底物，在糖基转移酶Gal催化下得到复合型寡糖，向合成所述第二产物的反应体系中加入2mM UDP-Gal，加入200μg/mL糖基转移酶GalT，反应温度为37℃，时间为4～12h。

5.如权利要求1～4中任一项所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：还包括对利用大肠杆菌表达的糖基转移酶Alg1、糖基转移酶Alg2、糖基转移酶GnT-I、糖基转移酶GnT-II、糖基转移酶GalT进行纯化的步骤。

6.如权利要求5所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述糖基转移酶Alg1基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶Alg2基因具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GnT-I基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GnT-II基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述糖基转移酶GalT基因具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1～4、6中任一项所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：还包括在大肠杆菌中表达幽门螺旋杆菌来源的糖基转移酶FuT；

以复合型寡糖与GDP-Fuc作为底物，在糖基转移酶FuT催化下的寡糖终产物；

其中，所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-GnGal时，所述寡糖终产物为PPGn2-Man3-Gn(Fuc)Gal；

所述复合型寡糖为PPGn2-Man3-Gn2Gal2时，所述寡糖终产物为PPGn2-Man3-Gn2(Fuc)2Gal2。

8.如权利要求7所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述以复合型寡糖与GDP-Fuc作为底物，在糖基转移酶FuT催化下的寡糖终产物，向合成复合型寡糖的反应体系中加入2mM GDP-Fuc，并加入100μg/mL岩藻糖基转移酶FuT，反应温度37℃，时间为12～24h。

9.如权利要求7所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：还包括对；利用大肠杆菌表达的糖基转移酶FuT进行纯化的步骤。

10.如权利要求8或9所述的植烷醇连接的复合型寡糖的合成方法，其特征在于：所述糖基转移酶FuT基因具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

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