JP2021177713A - デアミノノイラミン酸特異的シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】デアミノノイラミン酸を選択的に糖鎖から遊離させるシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質の利用方法の提供。【解決手段】１態様において、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌由来デアミノノイラミン酸を選択的に糖鎖から遊離させるシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列と９０％以上の同一性を有し該活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、または該タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し該活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸、該核酸を含む剤を用いた該活性を有するタンパク質の製造方法、および該タンパク質の糖鎖解析への利用方法。【選択図】なし
Description
本明細書は、デアミノノイラミン酸特異的シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用に関する。
シアリダーゼは、シアル酸のO−グリコシド結合を加水分解してシアル酸を遊離させる酵素である。シアル酸は、ノイラミン酸を基本骨格としてそのアミノ基やヒドロキシ基の水素原子が置換された物質を総称するものである。シアル酸は、生体内においては、概して、糖タンパク質や糖脂質にある糖鎖の非還元末端に存在している。
シアル酸としては、例えば、ノイラミン酸の５位のアミノ基の水素原子がグリコール酸で置換されたＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、同様に水素原子がアセチル基で置換されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、５位の窒素が水酸基に置換されたデアミノノイラミン酸（２−ケトー３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト ノノン酸、ＫＤＮ）などが天然に存在している。
ＫＤＮ残基は、広く普遍的に生物界に存在しているが、ＫＤＮを結合したスフィンゴ糖脂質であるＫＤＮ−ガングリオシドは、ニジマスの生殖器官、富栄養環境の海で発生する植物プランクトン（Emiliania huxleyi）、ヒトにおいては、奇形腫瘍、肺がん、赤血球や咽頭がんにおいて微量見出されているにすぎず、その機能についてはほとんど知られていない。
ＫＤＮを末端に有する糖鎖からＫＤＮを遊離させるシアリダーゼとしては、Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕ５ＡｃとともにＫＤＮを遊離するシアリダーゼが報告されているほか、他のノイラミン酸に比してＫＤＮを選択的に糖鎖から加水分解して遊離させるシアリダーゼ（以下、ＫＤＮａｓｅともいう。）も報告されている（特許文献１）。
特許文献１による方法では、ＫＤＮオリゴサッカライドアルジトールをＫＤＮａｓｅ誘導剤として合成し、当該誘導剤を唯一の炭素源として利用して、マス漁場の下水泥床から分離され選抜された細菌の培養液を、超音波破砕後、硫安沈殿し、ゲル濾過クロマトグラフィー及びニジマス卵巣液から調製されるオリゴ／ポリＫＤＮ含有糖タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィーで、粗精製物としてＫＤＮａｓｅを取得している。細菌は、Sphingobacterium multivorumと同定され、分離されたＫＤＮａｓｅの分子量は約５万であったことが報告されている。
特許文献１によって既に報告されているＫＤＮａｓｅの取得方法は、極めて煩雑であるほか高コストであり、十分な量を取得することはできないという問題があった。一方、特許文献１には、ＫＤＮａｓｅは、酵素活性等については報告されているが、ＫＤＮａｓｅをコードする遺伝子は同定されておらず、そのアミノ酸配列も報告されていなかった。
本発明者らは、ＫＤＮａｓｅ活性を有する細菌群についての全ゲノム解析を利用したところ、報告されている、Sphingobacterium multivorumとは異なる、Sphingobacterium属の他の細菌に由来するＫＤＮａｓｅを発見した。
ＫＤＮａｓｅをコードする核酸は、ＫＤＮａｓｅを工業的に生産することや、そのアミノ酸配列に変異を導入して変異体を作製して糖鎖に関連する疾患や診断の分野に利用することにおいて有用である。
現在までのところ、工業的に利用できる程度にＫＤＮａｓｅを取得することは未だできていない。
本明細書は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用を提供する。
本発明者らは、糖グリコシドからＫＤＮを遊離するシアリダーゼ活性を有する細菌群についての全ゲノム解析から、６種のシアリダーゼ候補遺伝子を特定し、さらに、ＫＤＮのみを遊離する活性をもつ遺伝子を同定した。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
［１］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を含む、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造するための剤。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［２］前記（ｂ）において、前記同一性は、９５％以上である、［１］に記載の剤。
［３］前記（ｄ）において、前記同一性は、９５％以上である、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［５］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［６］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であって、ＮａＣｌ濃度が０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のとき、ＮａＣｌ濃度が０Ｍ時のＫＤＮａｓｅ活性に対して１．５倍以上のＫＤＮａｓｅ活性を有する、タンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［７］ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法であって、
以下の（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種を被験タンパク質として、ＫＤＮａｓｅ活性を評価する工程、
を備える、方法。
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［８］糖鎖含有化合物を、［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
［９］前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、［８］に記載の処理方法。
［１０］前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記剤で処理する工程である、［８］又は［９］に記載の処理方法。
［１１］糖鎖含有化合物を［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程、
を備える、糖鎖特性の決定方法。
［１２］糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるＫＤＮ及び／又はＫＤＮ脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。
［１３］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を備える、ＫＤＮａｓｅ発現ベクター。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［１４］ＫＤＮａｓｅ発現キットであって、
［１３］に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［２］前記（ｂ）において、前記同一性は、９５％以上である、［１］に記載の剤。
［３］前記（ｄ）において、前記同一性は、９５％以上である、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［５］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［６］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であって、ＮａＣｌ濃度が０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のとき、ＮａＣｌ濃度が０Ｍ時のＫＤＮａｓｅ活性に対して１．５倍以上のＫＤＮａｓｅ活性を有する、タンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［７］ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法であって、
以下の（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種を被験タンパク質として、ＫＤＮａｓｅ活性を評価する工程、
を備える、方法。
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
［８］糖鎖含有化合物を、［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
［９］前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、［８］に記載の処理方法。
［１０］前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記剤で処理する工程である、［８］又は［９］に記載の処理方法。
［１１］糖鎖含有化合物を［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程、
を備える、糖鎖特性の決定方法。
［１２］糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を［５］又は[６]に記載のタンパク質で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるＫＤＮ及び／又はＫＤＮ脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。
［１３］以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を備える、ＫＤＮａｓｅ発現ベクター。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
［１４］ＫＤＮａｓｅ発現キットであって、
［１３］に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
本明細書は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用を提供する。
本明細書に開示されるＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質（以下、本タンパク質ともいう。）は、本発明者らが、Sphingobacterium属に属する菌のゲノム情報から取得した配列番号１で表される塩基配列に関連している。この塩基配列は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードしており、この塩基配列及びアミノ酸配列は、ＫＤＮａｓｅに関する配列として初めて同定されたものである。
ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列が同定されたことで、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列も同定できた。このため、従来、非効率的であったＫＤＮａｓｅを遺伝子工学的に生産すること、及び、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を意図に応じて改変することが可能となる。
細胞表面に露出される糖鎖は、発生、分化、がんなどの疾患の発症、転移等に関連しているほか、植物プランクトンなどの広く生物界において、細胞の特性と深く関連している。ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質及び当該タンパク質をコードする核酸によれば、こうした細胞の識別や捕捉、ひいては、疾患の診断や治療などの用途に向けた利用や改変が可能となる。
本明細書において、ＫＤＮａｓｅとは、O−グリコシド結合により結合したＫＤＮ残基を、O−グリコシド結合の加水分解により遊離させる酵素をいう。また、ＫＤＮａｓｅ活性とは、O−グリコシド結合の加水分解によりＫＤＮを遊離する活性をいう。
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用」を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
なお、本明細書において、「以上」の語は、下限として以上のほか超としての意義を有する。また、「以下」の語は、上限値として以下のほか未満の意義を有する。したがって、「以上」及び「以下」として記載される範囲は、以上及び以上のほか、超及び以下、超及び未満、以上及び未満の意義を有する。
以下、本タンパク質を製造するための剤（以下、単に、本剤ともいう。）及びその利用に関し、各種実施形態を詳細に説明する。
（ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造するための剤）
本剤は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質（本タンパク質）を製造するための剤であり、本タンパク質をコードする塩基配列を備える核酸を有している。なお、本剤における核酸とは、本タンパク質を製造するのに用いることができる限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのキメラである一本鎖及び当該一本鎖を組み合わせてなる二本鎖を意味している。以下、本剤が製造しようとする、本タンパク質についてまず説明する。なお、本タンパク質は、それ自体、糖鎖末端からＫＤＮを遊離させるための剤（ＫＤＮａｓｅ活性のための剤）として用いることができる。
本剤は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質（本タンパク質）を製造するための剤であり、本タンパク質をコードする塩基配列を備える核酸を有している。なお、本剤における核酸とは、本タンパク質を製造するのに用いることができる限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのキメラである一本鎖及び当該一本鎖を組み合わせてなる二本鎖を意味している。以下、本剤が製造しようとする、本タンパク質についてまず説明する。なお、本タンパク質は、それ自体、糖鎖末端からＫＤＮを遊離させるための剤（ＫＤＮａｓｅ活性のための剤）として用いることができる。
（本タンパク質）
本タンパク質は、以下の４つの態様からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むことができる。
本タンパク質は、以下の４つの態様からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むことができる。
（ａ）第１の態様
第１の態様の本タンパク質は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本発明者らがSphingobacterium属菌から取得した、配列番号１で表される塩基配列によってコードされるＫＤＮａｓｅである。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１０８位のアミノ酸が除去されたアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質もＫＤＮａｓｅ活性を有していることを確認しており、配列番号４で表されるアミノ酸配列（当該アミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によってコードされる。）を有するタンパク質は、ＫＤＮａｓｅ活性の観点において、第１の態様の本タンパク質といえる。
第１の態様の本タンパク質は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本発明者らがSphingobacterium属菌から取得した、配列番号１で表される塩基配列によってコードされるＫＤＮａｓｅである。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１０８位のアミノ酸が除去されたアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質もＫＤＮａｓｅ活性を有していることを確認しており、配列番号４で表されるアミノ酸配列（当該アミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によってコードされる。）を有するタンパク質は、ＫＤＮａｓｅ活性の観点において、第１の態様の本タンパク質といえる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基数が５３７個であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、同数が４２９個である。第１の態様の本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、その１７５位〜１７７位に相当する位置に、細菌から哺乳類まで広く保存されているシアリダーゼモチーフであるＲＩＰを備えている。また、同アミノ酸配列の２１２位〜２１９位に相当する位置に、アスパラギン酸ボックス（Ａｓｐボックス）（ＳＸＤＸＧＸＴＷ、Xは任意のアミノ酸））としてのＳＲＤＧＧＬＴＷ、３０９位〜３１６位に相当する位置に、同様にＡｓｐボックスとしてのＳＥＤＮＧＲＴＷ、３６８位〜３７５位に相当する位置に、同様にＡｓｐボックスとしてのＳＫＤＧＧＴＴＷを備えている。
配列番号２で表される本タンパク質は、電気泳動によりその質量が５９ｋＤａであり、特許文献１に開示されるＫＤＮａｓｅとは相違している。本タンパク質が備えるＫＤＮａｓｅ活性については、後段で説明する。
（ｂ）第２の態様
本タンパク質、また例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
本タンパク質、また例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
本明細書において、同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)やUniＰrotＫＢのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProt KBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いることができる。
本タンパク質は、例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有することができるが、前記同一性は、また例えば、同８５％以上、また例えば、同８６％以上、また例えば、同８７％以上、また例えば、同８８％以上、また例えば、同８９％以上、また例えば、同９０％以上、また例えば、同９１％以上、同９２％以上、また例えば、同９５％以上、また例えば同９６％以上、また例えば、同９７％以上、また例えば、同９８％以上、また例えば、同９９％以上、また例えば、９９．５％以上である。
この態様の本タンパク質は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７５位〜１７７位に相当する位置にＲＩＰを備えることができる。また例えば、同アミノ酸配列の２１２位〜２１９位に相当する位置に、ＳＲＤＧＧＬＴＷなどのアスパラギン酸ボックス（Ａｓｐボックス）を備えることができる。同様に、例えば、同アミノ酸配列の３０９位〜３１６位に相当する位置にＳＲＤＧＧＬＴＷなどのＡｓｐボックスを備えることができる。また例えば、同アミノ酸配列の３６８位〜３７５位に相当する位置にＳＥＤＮＧＲＴＷなどのＡｓｐボックス、また例えば、３６８位〜３７５位に相当する位置にＳＫＤＧＧＴＴＷなどのＡｓｐボックスを備えている。
例えば、この態様の本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１７５位〜１７７位に相当する位置にＲＩＰ及び同アミノ酸配列の２１２位〜２１９位に相当する位置、同アミノ酸配列の３０９位〜３１６位に相当する位置及び同アミノ酸配列の３６８位〜３７５位に相当する位置にそれぞれＡｓｐボックスを備えるときには、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、また例えば、８５％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、９５％以上の同一性を有することができる。
このように、この態様の本タンパク質は、第１の態様の本タンパク質と同様、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＲＩＰに相当する位置におけるＲＩＰ及び同アミノ酸配列のアスパラギン酸ボックス（Ａｓｐボックス）に相当する位置における３つのアスパラギン酸ボックス（ＳＸＤＸＧＸＴＷ）からなる群から選択される１個又は２個以上の特定領域を備えることができる。当該特定領域を備えるとき、変異は、これの特定領域に導入されてもこれらの特定領域を維持するように、ＡｓｐボックスのＸに変異が導入されるか、これらの領域以外に変異が導入される。
この態様の本タンパク質は、配列番号２又は４に対するアミノ酸配列と異なっているが、当該相違については、特に限定するものではないが、例えば、後段の第３の変異態様において記載される変異の態様が挙げられる。例えば、この態様の本タンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、例えば９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有しているとき、より具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６０個以下又は５４個以下のアミノ酸残基が異なるか、欠失しているか、挿入しているかなどの変異を有する場合及び配列番号４で表されるアミノ酸配列において、４５個以下又は４３個以下のアミノ酸残基が異なるか、欠失しているか、挿入しているかなどの変異を有する場合が挙げられる。
（ｃ）第３の態様
本タンパク質は、また例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
本タンパク質は、また例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
この態様の本タンパク質が有する変異数は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下であるが、例えば、５４個以下であり、また例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２５個以下であり、また例えば、２０個以下であり、また例えば、１５個以下であり、また例えば、１０個以下であり、また例えば、８個以下であり、また例えば、６個以下であり、また例えば、４個以下である。
本タンパク質は、また例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
この態様の本タンパク質が有する変異数は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下であるが、例えば、４３個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２５個以下であり、また例えば、２０個以下であり、また例えば、１５個以下であり、また例えば、１０個以下であり、また例えば、８個以下であり、また例えば、６個以下であり、また例えば、４個以下である。
この態様の本タンパク質が備える変異の態様は、特に限定するものではないが、例えば、アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
この態様のタンパク質が備える変異態様は、第２の態様や第４の態様の本タンパク質も備えることができる。
この態様の本タンパク質は、第２の態様の本タンパク質と同様、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＲＩＰに相当する位置におけるＲＩＰ及びアスパラギン酸ボックス（Ａｓｐボックス）に相当する位置における３つのアスパラギン酸ボックス（ＳＸＤＸＧＸＴＷ、例えば、ＳＲＤＧＧＬＴＷ、ＳＥＤＮＧＲＴＷ及びＳＫＤＧＧＴＴＷ）からなる群から選択される１個又は２個以上を備えることができる。当該特定領域を備えるとき、変異は、これの特定領域に導入されてもこれらの特定領域を維持するように導入されているか、あるいは、備えられる特定領域以外に変異が導入される。
（ｄ）第４の態様
本タンパク質は、また例えば、配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
本タンパク質は、また例えば、配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質である。
タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列の同一性が、例えば、９０％以上であるとき、アミノ酸配列自体の同一性や類似性も高く、配列番号１で表される塩基配列によってコードされる配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同じＫＤＮａｓｅ活性を有することができる。なお、このようなタンパク質は、例えば、配列番号１で表される塩基配列に対して変異を導入して、その変異配列によって得られる変異体につき、ＫＤＮａｓｅ活性を評価するなどにより取得することができる。なお、配列番号１で表される塩基配列の一部と、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどによって得られたＤＮＡについて、ＫＤＮａｓｅ活性を評価することによっても取得することができる。
この態様の本タンパク質も、第２及び第３の態様の本タンパク質と同様に、当該特定領域を備えるとき、変異は、これの特定領域に導入されてもこれらの特定領域を維持するように導入されているか、あるいは、備えられる特定領域以外に変異が導入される。
（ＫＤＮａｓｅ活性）
本タンパク質は、いずれも、ＫＤＮａｓｅ活性を有している。すなわち、基質特異性として、O−グリコシド結合によって結合された末端ノイラミン酸残基であるＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮのうち、ＫＤＮを選択的に加水分解して遊離させる活性を有している。ＫＤＮに対する遊離活性を１００とした場合において、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｓに対する遊離活性は、それぞれ、例えば、０以上１０以下であり、また例えば、０以上５以下であり、また例えば、０以上１以下である。
本タンパク質は、いずれも、ＫＤＮａｓｅ活性を有している。すなわち、基質特異性として、O−グリコシド結合によって結合された末端ノイラミン酸残基であるＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮのうち、ＫＤＮを選択的に加水分解して遊離させる活性を有している。ＫＤＮに対する遊離活性を１００とした場合において、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｓに対する遊離活性は、それぞれ、例えば、０以上１０以下であり、また例えば、０以上５以下であり、また例えば、０以上１以下である。
基質特異性は、例えば、以下の方法で測定することができる。すなわち、合成基質として４ＭＵ−ＫＤＮ（２´−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−シアル酸ナトリウム（シアル酸ナトリウム：２−ケトー３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト ノノン酸ナトリウム）を準備し、後述の実施例２に記載される条件（ｐＨ６．０、２５℃、遮光３０分）によって反応させ、得られた分解生成物である４ＭＵに基づく蛍光シグナルを検出することなどによって行うことができる。なお、同様にして、対照としてのＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃに対する遊離活性も測定することができる。
本タンパク質は、さらに、ＫＤＮａｓｅ活性に関し、以下の比活性を有することもできる。本タンパク質が有するＫＤＮａｓｅ活性の比活性は、１分間で１ｎｍｏｌの４ＭＵ−ＫＤＮを加水分解する活性を１ｕｎｉｔとすると、例えば、４０００ｕｎｉｔ／ｍｇ以上であり、また例えば、４５００ｕｎｉｔ／ｍｇ以上であり、また例えば、４８００ｕｎｉｔ／ｍｇ以上であり、また例えば、５０００ｕｎｉｔ／ｍｇ以上である。比活性は、実施例２に記載の比活性に関する方法（ｐＨ６．０、１Ｍ ＮａＣｌ、２５℃、１５分遮光）で反応させて測定することができる。
本タンパク質は、さらに、ＫＤＮａｓｅ活性に関し、以下の至適ｐＨを有することもできる。本タンパク質が有するＫＤＮａｓｅ活性の至適ｐＨは、例えば、５．８以上６．８以下であり、また例えば、６．０以上６．５以下である。ＫＤＮａｓｅの至適ｐＨは、緩衝するｐＨ域のバッファのみを異ならせて、実施例２に記載の方法（ＮａＣｌ０．５Ｍ、２５℃、遮光３０分）で反応させることにより測定することができる。
本タンパク質は、さらに、ＫＤＮａｓｅ活性に関し、以下の至適温度を有することもできる。本タンパク質が有するＫＤＮａｓｅ活性の至適温度が、例えば、１５℃以上３７℃以下であり、また例えば、２５℃以上３７℃以下である。至適温度は、実施例２の至適温度に関して記載される方法（ｐＨ６．０、遮光３０分）によって測定することができる。
本タンパク質は、さらに、ＫＤＮａｓｅ活性に関し、以下のＮａＣｌ濃度依存性を有することもでききる。本タンパク質が有するＫＤＮａｓｅ活性は、例えば、ＮａＣｌ濃度が０Ｍ超１Ｍ以下の範囲で濃度依存的にＫＤＮａｓｅ活性が向上する。また例えば、ＫＤＮａｓｅ活性のＮａＣｌ濃度依存性は、実施例２のＮａＣｌ依存性に関する方法（ｐＨ６．０、２５℃、３０分遮光）によって測定することができる。本タンパク質は、例えば、０．１Ｍ〜０．１Ｍ、また例えば、０．５〜１．０Ｍ、また例えば、０．７５〜１．０ＭのＮａＣｌ中において安定してＫＤＮａｓｅ活性を呈することができる。また、ＮａＣｌ濃度が０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のとき、ＮａＣｌ濃度（ＮａＣｌ濃度以外は同条件下）が０Ｍ時のＫＤＮａｓｅ活性に対して、例えば１．５倍以上、また、０．２５Ｍ以上１．０Ｍ以下のときには、例えば２．０倍以上のＫＤＮａｓｅ活性を有する。
本剤は、上記した各種の本タンパク質の少なくとも１種をコードする塩基配列を有する核酸（以下、本核酸ともいう。）を含んでいる。したがって、本剤が有する核酸は、（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列（第１の態様の本タンパク質）、（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列に対して、例えば、９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列（第４の態様の本タンパク質）、（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（第１の態様の本タンパク質）、（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と、例えば、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列（第１の態様の本タンパク質）、（ｅ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個以上数十個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列（第３の態様の本タンパク質）からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を有する核酸を含むことができる。
上記（ｂ）及び（ｄ）における、同一性は、いずれも、例えば、８０％以上であり、また例えば、８５％以上であり、また例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９７％以上であり、また例えば、９８％以上であり、また例えば、９９％以上であり、また例えば、９９．５％以上である。
また、上記（ｅ）における変異数は、配列番号２で表されるアミノ酸配列においては、例えば、６０個以下であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列においては、例えば、４５個以下であるほか、すでに記載した第３の態様において例示した各種の変異数とすることができる。
本核酸を含む本剤によれば、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を、例えば、遺伝子工学的手法により、純度が高い本タンパク質を、ＫＤＮａｓｅの生産誘導のためのＫＤＮ誘導剤を使用することなく、簡易な精製操作により取得することができる。これにより、工業用途及び診断や治療などの医療用途に、本タンパク質を用いることができる。なお、こうした核酸は、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を生産するためのほかに、他のＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質の開発が可能となる。
（本核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法）
本核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法は、当業者であれば、適宜実施することができる。例えば，遺伝子工学的に本タンパク質を生産する手法は、当業者においてよく知られている。すなわち、本核酸であるＤＮＡを合成するか、又は、Sphingobacterium属細菌などのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法などの公知の方法により取得し、当該ＤＮＡを、適当な宿主細胞においてタンパク質をコードする遺伝子として発現可能に構成した発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養することで、培養産物として本タンパク質を取得することができる。
本核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法は、当業者であれば、適宜実施することができる。例えば，遺伝子工学的に本タンパク質を生産する手法は、当業者においてよく知られている。すなわち、本核酸であるＤＮＡを合成するか、又は、Sphingobacterium属細菌などのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法などの公知の方法により取得し、当該ＤＮＡを、適当な宿主細胞においてタンパク質をコードする遺伝子として発現可能に構成した発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養することで、培養産物として本タンパク質を取得することができる。
なお、配列番号２及び４で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸変異を有する本タンパク質は、例えば、配列番号１及び３で表される塩基配列を有するＤＮＡ又はその相補鎖の少なくとも一部をプローブとして用いたハイブリダイゼーション、エラープローンＰＣＲや公知の変異導入方法に従い取得することができる。こうしたタンパク質については、そのアミノ酸配列やＫＤＮａｓｅ活性を評価することで、本タンパク質であることを確認することができ、本タンパク質として製造することができる。
宿主細胞としては、特に限定するものではなく、公知の宿主細胞を用いることができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。例えば、本シアリダーゼは、Rosetta gami２など大腸菌（Ｋ−１２株）由来の宿主細胞を用いることで、本タンパク質を、高い収量で取得することができる。
また、発現ベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して適宜選択することができる。例えば、発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス性の発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、また、宿主細胞内で複製可能であってもよいし、宿主染色体に組み込まれて複製可能に構成されていてもよい。発現ベクターは、適宜、商業的に入手可能な種々のプラスミドなどを用いて構築することができる。
なお、発現ベクターは、遺伝子発現に必要な種々のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。また、適宜、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などの適宜選択マーカーを有することができる。以上のような、遺伝子工学的な手法については、当業者であれば、例えば、適宜、Molecular Cloning: A Laboratory Manualに記載の方法に準じて行なうことができる。
形質転換した宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に応じて一般的な方法を用いることができる。培養条件については、例えば、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。また、形質転換細胞からの本タンパク質の分離回収等についても、当業者の周知の方法で実施できる。
（本タンパク質を製造するための発現ベクター及びキット）
本明細書によれば、本タンパク質を発現するための発現ベクターのほか、当該発現ベクターを備える、発現キットも提供される。発現ベクターは、既述の本核酸をＤＮＡなどとして備えることができる。発現ベクターの態様については、既に説明したとおりである。
本明細書によれば、本タンパク質を発現するための発現ベクターのほか、当該発現ベクターを備える、発現キットも提供される。発現ベクターは、既述の本核酸をＤＮＡなどとして備えることができる。発現ベクターの態様については、既に説明したとおりである。
さらに、かかるキットは、本タンパク質の発現などに適した大腸菌などの宿主細胞も備えることができる。さらにまた、この種の発現ベクターに用いる公知の他の試薬も適宜備えることができる。
（ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法）
本明細書によれば、ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法も提供される。すなわち、上記第２〜第４の態様からなる群から選択される少なくとも１種を被験タンパク質として、ＫＤＮａｓｅ活性を評価する工程を備える方法が提供される。この少なくとも方法によれば、ＫＤＮａｓｅ活性の発揮のためにより好適な、例えば、より活性の高い、また例えば、より熱的安定性に優れるなどの本タンパク質を取得することができる。
本明細書によれば、ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法も提供される。すなわち、上記第２〜第４の態様からなる群から選択される少なくとも１種を被験タンパク質として、ＫＤＮａｓｅ活性を評価する工程を備える方法が提供される。この少なくとも方法によれば、ＫＤＮａｓｅ活性の発揮のためにより好適な、例えば、より活性の高い、また例えば、より熱的安定性に優れるなどの本タンパク質を取得することができる。
スクリーニングにあたって，被験タンパク質は、種々の方法で準備することができ、例えば、既述したように、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ又はその相補鎖の少なくとも一部をプローブとして用いたハイブリダイゼーション、エラープローンＰＣＲや公知の変異導入方法に従い取得したＤＮＡを用いて、遺伝子工学的に取得することができる。
（ＫＤＮａｓｅ活性のための剤の利用）
ＫＤＮ活性のための剤は、そのＫＤＮａｓｅ活性を利用して、糖鎖含有化合物の処理、糖鎖特性の決定及び糖鎖分解産物の生産方法等に利用することができる。ＫＤＮ活性のための剤によれば、ＫＤＮ分解遊離の特異性等により、ＫＤＮを有する糖鎖含有化合物又はその化合物を提示する細胞からＫＤＮを遊離させることができる。
ＫＤＮ活性のための剤は、そのＫＤＮａｓｅ活性を利用して、糖鎖含有化合物の処理、糖鎖特性の決定及び糖鎖分解産物の生産方法等に利用することができる。ＫＤＮ活性のための剤によれば、ＫＤＮ分解遊離の特異性等により、ＫＤＮを有する糖鎖含有化合物又はその化合物を提示する細胞からＫＤＮを遊離させることができる。
（糖鎖の処理方法）
本明細書に開示される糖鎖の処理方法は、糖鎖含有化合物を本ＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程を備えることができる。本処理方法によれば、糖鎖含有化合物の有する糖鎖から効率的にＫＤＮ残基を遊離させて、ＫＤＮ残基が除去された糖鎖含有化合物とすることができる。
本明細書に開示される糖鎖の処理方法は、糖鎖含有化合物を本ＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程を備えることができる。本処理方法によれば、糖鎖含有化合物の有する糖鎖から効率的にＫＤＮ残基を遊離させて、ＫＤＮ残基が除去された糖鎖含有化合物とすることができる。
本明細書において、「糖鎖」とは、糖がグリコシド結合によって連結した化合物をいう。糖鎖含有化合物とは、かかる糖鎖からなる化合物のほか、かかる糖鎖が他の化合物と結合した化合物をいい、例えば、タンパク質と糖鎖とが結合した糖タンパク質、脂質と糖鎖が結合した糖脂質及びプロテオグリカンなどの複合糖質が挙げられる。なお、糖鎖含有化合物における糖鎖は、１以上の単糖が結合したものであればよい。
ここで、糖タンパク質は、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に１又は２以上の糖鎖が結合したものである。糖鎖は、概して、数本〜数十本であり、主として細胞膜タンパク質や分泌タンパク質上に存在する。糖鎖が結合するアミノ酸は、典型的には、アスパラギン（Ｎ型糖鎖）、セリン及びスレオニン（Ｏ型糖鎖）が挙げられる。また、糖タンパク質を構成する糖鎖の構成単糖としては、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎｅｕ５Ａｃ及びキシロースなどが挙げられる。
プロテオグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸などの１００〜２００程度の単糖からなる糖鎖を有し、グリコサミノグリカンがタンパク質に結合した複合体をいう。糖鎖は、二糖の繰り返し構造を概して備える。プロテオグリカンは、典型的には、線維タンパク質間を充填するように存在している。
糖脂質としては、糖鎖が結合した脂質をいい、糖とグリセリンとのエーテル結合を含むグリセロ糖脂質と糖とスフィンゴシンとのグリコシド結合を含むスフィンゴ糖脂質とに大別される。スフィンゴ糖脂質は、糖としてヘキソース１分子をもつ単純なセレブロシドのほか、ガラクトース、グルコース、N‐アセチルガラクトサミン、N‐アセチルグルコサミン、フコースなどのヘキソース糖やシアル酸を含むガングリオシド、硫酸化糖を含むスルファチドなどがある。
処理工程に供される糖鎖含有化合物としては、糖タンパク質や糖脂質が、ＫＤＮ残基を含む場合が多いため、かかる複合糖質の処理にＫＤＮ活性のための剤は有用である。また、本処理方法の処理工程は、遊離した状態の糖鎖含有化合物をＫＤＮ活性のための剤で処理するほか、細胞表層に存在する糖鎖含有化合物をＫＤＮ活性のための剤で処理することを含む。ＫＤＮ活性のための剤は、細胞障害性の低い条件で高いシアリダーゼ活性を発揮できるため、細胞の処理に有用である。
処理工程では、糖鎖含有化合物とＫＤＮ活性のための剤とを、ＫＤＮ活性のための剤のＫＤＮ活性を発揮可能な条件下、液性媒体中で接触させることにより、そのＫＤＮａｓｅ活性によりＫＤＮ残基が遊離させることができる。処理工程における反応濃度は、本ＫＤＮ活性のための剤が安定的に作用する温度域、ｐＨ域等であれば特に限定するものではない。
また、処理工程における反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
処理工程における反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の活性等を考慮して適宜決定できる。本シアリダーゼ単剤を利用する場合には、特に限定するものではないが、例えば、１０分〜１６時間の範囲で適宜設定することができる。
本処理方法によれば、ＫＤＮ活性のための剤によるＫＤＮａｓｅ活性が、ＫＤＮ残基を選択的に遊離させることができる。このため、ＫＤＮ残基が脱離された糖鎖含有化合物を容易に取得できる。したがって、例えば、ＫＤＮ残基による影響を評価しやすくなる。
本処理方法においては、適宜、ＫＤＮ活性のための剤以外のシアリダーゼや他のグリコシダーゼ、例えば、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼなどのエキソグリコシダーゼから選択される１種又は２種以上を同時にあるいは順次処理することもできる。
（糖鎖特性の決定方法）
本明細書に開示される糖鎖特性の決定方法（以下、単に、本決定方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物ＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程と、ＫＤＮ活性のための剤の処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、を備えることができる。ここで、糖鎖特性とは、糖鎖含有化合物の有する糖鎖の構成糖の組成や順序をいう。本決定方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様で実施することができる。また、本決定方法における検出工程は、特に限定するものではないが、例えば、処理工程後の反応液中のシアル酸残基などを、各種マススペクトロメトリー、各種のクロマトグラフィー、各種ＮＭＲ、各種電気泳動により分離同定する工程とすることができる。なお、分離同定に先立って、あるいは同時に、分離後に、遊離したシアル酸残基を、蛍光標識などのシグナル要素が付加された又は付加可能に形成されたレクチンや特異的抗体と結合させてもよい。こうした、糖鎖のフィンガープリントについては、適宜公知の手法を適用することができる。
本明細書に開示される糖鎖特性の決定方法（以下、単に、本決定方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物ＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程と、ＫＤＮ活性のための剤の処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、を備えることができる。ここで、糖鎖特性とは、糖鎖含有化合物の有する糖鎖の構成糖の組成や順序をいう。本決定方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様で実施することができる。また、本決定方法における検出工程は、特に限定するものではないが、例えば、処理工程後の反応液中のシアル酸残基などを、各種マススペクトロメトリー、各種のクロマトグラフィー、各種ＮＭＲ、各種電気泳動により分離同定する工程とすることができる。なお、分離同定に先立って、あるいは同時に、分離後に、遊離したシアル酸残基を、蛍光標識などのシグナル要素が付加された又は付加可能に形成されたレクチンや特異的抗体と結合させてもよい。こうした、糖鎖のフィンガープリントについては、適宜公知の手法を適用することができる。
また、さらに、本決定方法は、ＫＤＮ活性のための剤による処理後の糖鎖化合物と糖転移酵素を作用させてその反応性や特異的抗体により、処理により露出された糖鎖末端を検出する工程を備えていてもよい。糖転移酵素としては、適宜、公知の糖転移酵素を用いることができる。
なお、本決定方法においても、本処理方法と同様、ＫＤＮ活性のための剤以外のシアリダーゼ及び各種グリコシダーゼを、同時にあるいは順次処理することもできる。そして、これらのグリコシダーゼによって遊離される残基や残存末端を、それぞれ検出して、糖鎖特性を決定することもできる。
（糖鎖分解産物の生産方法）
本明細書に開示される糖鎖分解産物の生産方法（以下、本生産方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物をＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程と、前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び／又は前記シアル酸残基脱離物を回収する回収工程と、を備えることができる。本生産方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様を採ることができる。
本明細書に開示される糖鎖分解産物の生産方法（以下、本生産方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物をＫＤＮ活性のための剤で処理する処理工程と、前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び／又は前記シアル酸残基脱離物を回収する回収工程と、を備えることができる。本生産方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様を採ることができる。
本生産方法における回収工程は、処理工程における分解産物、すなわち、遊離したシアル酸残基及びシアル酸残基脱離物の少なくとも一部を分離回収する工程である。本生産方法は、予定される遊離シアル酸残基及びシアル酸残基脱離物の少なくとも一部を回収する工程であればよく、これらの分離回収方法は、例えば、本決定方法において決定に際して用いる分離同定工程を、回収工程として実施することができる。
なお、本生産方法においても、本処理方法と同様、ＫＤＮ活性のための剤以外のシアリダーゼ及び各種グリコシダーゼを、同時にあるいは順次処理することもできる。そして、これらのグリコシダーゼによって遊離される残基や残存末端を、それぞれ回収することもできる。
なお、本明細書によれば、ＫＤＮ活性のための剤を用いて、糖鎖含有化合物を処理後、残余の糖鎖末端に１又は２以上の糖転移酵素を用いて新たに糖鎖を結合する工程を備える、糖鎖の生産方法も提供される。
（キット）
本明細書に開示されるキットは、ＫＤＮ活性のための剤を備えることができる。本キットは、ＫＤＮ活性のための剤を用いて糖鎖含有化合物を処理し、糖鎖特性を決定し、又は、糖鎖分解産物を生産等に用いるためのキットである。本キットは、ＫＤＮ活性のための剤を備えるほか、その他のシアリダーゼを含む各種グリコシダーゼをさらに備えていてもよい。また、本キットは、そのほか、本キットの目的に応じて、遊離が予定されるＫＤＮ残基やシアル酸脱離後の糖鎖含有化合物に特異的に結合する標識されていてもよい抗体やレクチンなどを備えることもできる。本キットは、そのほか、糖鎖研究や糖鎖解析に適用される試薬やデバイスを備えることもできる。
本明細書に開示されるキットは、ＫＤＮ活性のための剤を備えることができる。本キットは、ＫＤＮ活性のための剤を用いて糖鎖含有化合物を処理し、糖鎖特性を決定し、又は、糖鎖分解産物を生産等に用いるためのキットである。本キットは、ＫＤＮ活性のための剤を備えるほか、その他のシアリダーゼを含む各種グリコシダーゼをさらに備えていてもよい。また、本キットは、そのほか、本キットの目的に応じて、遊離が予定されるＫＤＮ残基やシアル酸脱離後の糖鎖含有化合物に特異的に結合する標識されていてもよい抗体やレクチンなどを備えることもできる。本キットは、そのほか、糖鎖研究や糖鎖解析に適用される試薬やデバイスを備えることもできる。
以下、本開示を具現化した実施例について説明するが、本開示は、はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」、「部」等は質量基準である。また、操作手順は特に記載しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。
（組換え体シアリダーゼの調製）
配列番号２で表されるアミノ酸配列から分泌シグナルと推定される疎水性領域の配列（１−１４ＡＡ）を除いたアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ配列を準備した。このｃＤＮＡ配列を、常法に従い、ｐＥＴ３２ａベクターにクローニングし、このベクターを用いてＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）（メルク株式会社）を形質転換し、ＬＡプレート上でシングルコロニーを得た。シングルコロニーを５ｍｌ ＬＡ培地に植菌し、３７℃、１７時間振盪培養した。この培養液を２００ｍｌ ＬＡ培地に全量移し、さらに３７℃、２時間３０分振盪培養を行いＯＤ６００が０．４付近になることを確認した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列から分泌シグナルと推定される疎水性領域の配列（１−１４ＡＡ）を除いたアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ配列を準備した。このｃＤＮＡ配列を、常法に従い、ｐＥＴ３２ａベクターにクローニングし、このベクターを用いてＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）（メルク株式会社）を形質転換し、ＬＡプレート上でシングルコロニーを得た。シングルコロニーを５ｍｌ ＬＡ培地に植菌し、３７℃、１７時間振盪培養した。この培養液を２００ｍｌ ＬＡ培地に全量移し、さらに３７℃、２時間３０分振盪培養を行いＯＤ６００が０．４付近になることを確認した。
培養液に終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトシド）を加え、１５℃、４時間さらに振盪培養した。培養液を４℃、６，３００ｇ、３分の遠心で菌体を回収し、４０ｍｌ ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、２０ｍｌ平衡バッファ（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、さらに終濃度１ｍＭとなるようにＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ：終濃度１μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌベンザミジン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を加え懸濁した。
細胞懸濁液を超音波破砕し、４℃、２２，３００ｇ、１０分の遠心で上清を粗精製画分（Ｃｒｕｄｅ）として回収した。粗精製画分に終濃度５０ｍＭとなるようにイミダゾールを加え、平衡バッファであらかじめ平衡化した２ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに供し、４℃で１５分回転混和した。通過画分（Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ画分）を回収した後、５ｍｌ洗浄バッファ（１０ｍＭイミダゾール、１Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、洗浄して洗浄画分（Ｗａｓｈ画分）を回収した。さらに、５ｍｌ溶出バッファ（１００ｍＭイミダゾール，０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、ヒスタグ付きタンパク質が溶出される溶出画分（Ｅｌｕｔｅ画分）を回収した。最後に５ｍｌストリップバッファ（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、ストリップ画分（Ｓｔｒｉｐ画分）を回収した。溶出画分はＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２０（ＭＷＣＯ＝１００００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて限外濾過し、０．５ｍｌまで脱塩濃縮し精製画分（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ画分）とした。
各画分に含まれるタンパク質は、ウエスタンブロッティングおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＣＢＢ染色によって確認した。結果を図２に示す。図２に示すように、タグ付き組換え体シアリダーゼは、溶出画分（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ画分）に約７１ｋＤａのタンパク質として精製されたことがわかった。
さらに、精製画分４５０μｌに３ｕｎｉｔのＨｉｓタグ付きエンテロカイネースおよび１０×反応バッファを加え、４℃、１６時間回転混和を行い、Ｎ末端側に付加されたヒスタグを切断した。反応液にＮｉ−ＮＴＡアガロース１０μｌを加え、４℃、１時間回転混和し、４℃、２，００ｇ、５分で遠心分離をすることでタグ付きシアリダーゼおよびエンテロカイネースを沈殿させ除去した。
この上清をＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２０（ＭＷＣＯ＝１００００）を用いて８０μｌまで濃縮した。濃縮した画分は、１０μｌずつ分注し、−８０℃に保存した。シアリダーゼのタグが外れたことを確認するためウエスタンブロッティングおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によってエンテロカイネース消化前後でシアリダーゼがシフトしていることを確認し、その結果を併せて図２に示した。
図２に示すように、エンテロカイネース処理により、タグなしの組換え体シアリダーゼが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、質量約５２ｋＤａのタンパク質として精製されたことがわかった。また、タグなしシアリダーゼ濃度は、２００μｇ／ｍｌであり、タグなしシアリダーゼの収量が２００ｍｌ菌体あたり、１６μｇであることがわかった。
２‘−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−シアル酸ナトリウム（4MU-Sialic acid）を用いたシアリダーゼ活性測定
（１）ｐＨ依存性
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆ（住友ベークライト、Ｔｏｋｙｏ）に１０μｌの各種０．５Ｍバッファを加えた。０．５Ｍバッファは、ｐＨ４．０〜６．０の範囲で酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．５〜７．０の範囲でリン酸バッファ、ｐＨ６．０〜８．０の範囲でＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファ、ｐＨ７．５〜１０．０の範囲でトリス−塩酸バッファを用いた。次に、４０μｌの反応溶液として、４ＭＵ−ＫＤＮ（終濃度４０μＭ）、ＮａＣｌ（終濃度０．５Ｍ）、２０ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼ（以下、同じ）を加え、２５℃で３０分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspire(PerkinElmer, Waltham, MS, USA)を用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図３に示す。
（１）ｐＨ依存性
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆ（住友ベークライト、Ｔｏｋｙｏ）に１０μｌの各種０．５Ｍバッファを加えた。０．５Ｍバッファは、ｐＨ４．０〜６．０の範囲で酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．５〜７．０の範囲でリン酸バッファ、ｐＨ６．０〜８．０の範囲でＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファ、ｐＨ７．５〜１０．０の範囲でトリス−塩酸バッファを用いた。次に、４０μｌの反応溶液として、４ＭＵ−ＫＤＮ（終濃度４０μＭ）、ＮａＣｌ（終濃度０．５Ｍ）、２０ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼ（以下、同じ）を加え、２５℃で３０分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspire(PerkinElmer, Waltham, MS, USA)を用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図３に示す。
図３に示すように、シアリダーゼの至適ｐＨは、６．０または６．５にあることがわかった。
（２）温度依存性
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに５０μｌ反応溶液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、4０μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、4ｎｇシアリダーゼ）を加え、遮光条件で３０分、４、１５、２５、３７、５０、６０℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図４に示す。
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに５０μｌ反応溶液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、4０μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、4ｎｇシアリダーゼ）を加え、遮光条件で３０分、４、１５、２５、３７、５０、６０℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すように、シアリダーゼは、１５℃以上３７℃以下、より具体的には、２５℃以上３７℃以下で良好なシアリダーゼ活性を示した。
（３）基質特異性
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌ反応溶液（０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、４０μＭ ４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃまたは４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ｇｃまたは４ＭＵ−ＫＤＮ）を加え、２０ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、遮光条件下で３０分、２５ ℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図５に示す。
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌ反応溶液（０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、４０μＭ ４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃまたは４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ｇｃまたは４ＭＵ−ＫＤＮ）を加え、２０ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、遮光条件下で３０分、２５ ℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図５に示す。
図５に示すように、シアリダーゼは４ＭＵ−ＫＤＮにのみ加水分解活性を示した。
（４）ＮａＣｌ依存性
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌの反応溶液（４０μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、０、０．１、０．２５、０．５及び１．０Ｍ ＮａＣｌ）を加え、４ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、室温で３０分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図6に示す。
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌの反応溶液（４０μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、０、０．１、０．２５、０．５及び１．０Ｍ ＮａＣｌ）を加え、４ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、室温で３０分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図6に示す。
図６に示すように、ＮａＣｌ濃度依存的にシアリダーゼの４ＭＵ−ＫＤＮ加水分解活性が向上した。また、例えば、０．１Ｍ〜１．０Ｍ、また例えば、０．２５Ｍ〜１．０Ｍ（また例えば、０．５〜１．０Ｍ、また例えば、０．７５〜１．０Ｍ）のＮａＣｌ中において安定してＫＤＮａｓｅ活性（ＮａＣｌ ０Ｍ時に対して１．５倍又は２．０倍以上）を呈した。
（５）比活性の測定
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌの反応溶液（１００μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、１．０Ｍ ＮａＣｌ）を加え、１ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、室温で１５分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーＥｎｓｐｉｒｅを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆに４０μｌの反応溶液（１００μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、１．０Ｍ ＮａＣｌ）を加え、１ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼを加え５０μｌに調整し、室温で１５分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーＥｎｓｐｉｒｅを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。
２５℃において、１分間で１ｎｍｏｌの４ＭＵ−ＫＤＮを加水分解する活性を１ｕｎｉｔとすると、上記の実験結果から、シアリダーゼの比活性は５０５２ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
配列番号２で表されるアミノ酸配列から１−１０８ＡＡを除いたアミノ酸配列（配列番号４）に対応するｃＤＮＡ配列（配列番号３）を準備し、このＤＮＡをクローニングしたｐＥＴ３２ａベクターにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＡ培地１ｍｌで３７℃、一晩振盪培養し、１００μｌをＬＡ培地３ｍｌへと移し、さらに３７℃、２時間振盪培養をした。培養後、終濃度０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃、４時間振盪培養を行った。大腸菌を１００００×ｇ、１分で遠心し回収し、ＰＢＳで洗浄後、１５０μｌのＰＢＳ中で超音波破砕した。破砕液を４℃、１５０００×ｇ、１０分の遠心により分画した。上清を集めた後、沈殿に対し１５０μｌのＰＢＳを加え、超音波破砕を行うことで沈殿画分とした。その上清、沈殿画分に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によってタンパク質の発現を確認した結果を図７に示した。
図７に示すように、ＩＰＴＧ誘導した大腸菌では、６１ｋＤａのタンパク質が誘導されており、そのほとんどが沈殿へと分画された。
次に、６１ｋＤａのバンドとして検出された配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質がＫＤＮａｓｅ活性を有しているかどうかを確認するために、かかるタンパク質がより少なく分画されていると考えられるＩＰＴＧ誘導した大腸菌破砕液の上清を１００倍希釈した後１０μｌを９６穴プレートに加えた。各ウェルに４０μｌ反応溶液（０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．０）、４０μＭ ４ＭＵ−ＫＤＮ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え、遮光条件下で３０分、３７℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図８に示す。
図８に示すように、上清はＫＤＮａｓｅ活性を示した。これらの結果によれば、図７に示すように上清にほとんどタンパク質が含まれていないものの、その微量なタンパク質であってもＫＤＮａｓｅ活性を示したことから、本実施例でＩＰＴＧ誘導したタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＫＤＮａｓｅ活性を
示すことがわかった。
示すことがわかった。
Claims (14)
- 以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を含む、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造するための剤。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 - 前記（ｂ）において、前記同一性は、９５％以上である、請求項１に記載の剤。
- 前記（ｄ）において、前記同一性は、９５％以上である、請求項１又は２に記載の剤。
- 以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を用いて、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質を製造する方法。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入からなる群から選択される１種又は２種以上の変異を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 - 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質 - 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であって、ＮａＣｌ濃度が０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のとき、ＮａＣｌ濃度が０Ｍ時のＫＤＮａｓｅ活性に対して１．５倍以上のＫＤＮａｓｅ活性を有する、タンパク質。
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質 - ＫＤＮａｓｅ活性のための剤のスクリーニング方法であって、
以下の（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種を被験タンパク質として、ＫＤＮａｓｅ活性を評価する工程、
を備える、方法。
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質 - 糖鎖含有化合物を、請求項５又は６に記載のタンパク質で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
- 前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、請求項８に記載の処理方法。
- 前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記剤で処理する工程である、請求項８又は９に記載の処理方法。
- 糖鎖含有化合物を請求項５又は６に記載のタンパク質で処理する処理工程、
を備える、糖鎖特性の決定方法。 - 糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を請求項５又は６に記載のタンパク質で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるＫＤＮ及び／又はＫＤＮ脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。 - 以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を備える、ＫＤＮａｓｅ発現ベクター。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列
（ｂ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上６０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個以上４５個以下のアミノ酸の置換、欠失及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列を有し、ＫＤＮａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 - ＫＤＮａｓｅ発現キットであって、
請求項１３に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
Priority Applications (1)
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