JPWO2003023036A1 - 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子 - Google Patents
硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2003023036A1 JPWO2003023036A1 JP2003527101A JP2003527101A JPWO2003023036A1 JP WO2003023036 A1 JPWO2003023036 A1 JP WO2003023036A1 JP 2003527101 A JP2003527101 A JP 2003527101A JP 2003527101 A JP2003527101 A JP 2003527101A JP WO2003023036 A1 JPWO2003023036 A1 JP WO2003023036A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- sulfated fucogalactan
- seq
- sulfated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチド。
Description
技術分野
本発明は、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドに関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化フコース含有多糖が含まれている。例えば、▲１▼フコースと硫酸基のみからなる硫酸化フカン、▲２▼グルクロン酸、マンノース、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロノマンナン、例えば国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ（構成糖及びそのモル比がフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基＝約１０：７：４：５：２０、以下、Ｕ−フコイダンと称す）、▲３▼フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコガラクタン、例えば、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ（構成糖及びそのモル比がフコース：ガラクトース＝約１０：１、以下、Ｆ−フコイダンと称す）、あるいは国際公開公報第００／５０４６４号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｇ（構成糖及びそのモル比がガラクトース：フコース＝約２：１、以下、Ｇ−フコイダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られている。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総て陰イオン性高分子であるため、様々な精製工程において理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そのため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離されることなく、そのまま生物活性が調べられることが多く、見出された生物活性を担うものがどの硫酸化フコース含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
現在までに活性と分子の相関関連が知られているのは、アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４４巻、第８号、第１９６５頁〜第１９６６頁（１９８０）記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン画分、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレット記載の癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を担うＵ−フコイダンである。
硫酸化フカン画分の抗凝血作用に関しては、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてきた。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性すなわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを得る必要があり、その方法が求められていた。
同様に、Ｕ−フコイダンに関しても癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Ｕを簡便に得る必要があり、その方法が求められていた。
一般的に、多糖の構造解析やオリゴ糖の製造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法である。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にその他の多糖と分離することができる。
従来よりアワビ、ホタテ貝、ウニ、海洋微生物などが上記の硫酸化フコース含有多糖を分解する酵素を生産していることが報告されている。しかし、これらの酵素は一般に生体内に微量しか含まれていない上に複数の硫酸化フコース含有多糖分解酵素を持っているために、単一の酵素を得るための様々な精製工程が必要となっていた。例えば、国際公開公報第００／５０４６４号パンフレット記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素は活性を指標に分離したものであり、単一のタンパク質として単離されているかどうかは不明である。このように、単一の天然の硫酸化フコガラクタン分解酵素を大量に精製・採取することは困難であった。また、上記の硫酸化フコガラクタン分解酵素を海洋微生物から採取する場合においては、培養液中に硫酸化フコガラクタン、あるいは硫酸化フコガラクタンを含む硫酸化フコース含有多糖を添加することが必要であり、培養操作が繁雑であり、コスト高になるという問題があった。
さらに、上記方法により天然の硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパクが十分採取できなければ該酵素のアミノ酸配列及び核酸配列の情報を得ることはまず不可能であり、仮に十分量採取できた場合でも該酵素タンパクのＮ末がブロッキングされていたならば、Ｎ末アミノ酸配列の情報を得られないという問題があった。
また、上記酵素をコードする遺伝子が取得できた場合においても、発現プロモーターあるいは宿主との相性により、発現しないか、発現しても低発現である、あるいは封入体となって酵素活性を保持した組換体酵素を得ることができないなど予測がつかない問題があった。
発明の目的
本発明の目的は、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドを提供することにある。
発明の概要
本願の発明者らは、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかにするために、硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する微生物の遺伝子について鋭意研究を進めた結果、フラボバクテリウム属細菌由来の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が少なくとも２種類存在することを明らかにし、その塩基配列を決定した。また、該ポリペプチドのアミノ酸配列を明らかにし、さらに該遺伝子を用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを工業的に有利に生産する方法をも開発することに成功し、本発明を完成させた。
本発明の第１の発明は、下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドに関する：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
本発明の第２の発明は、下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸に関する：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基が欠失、付加、挿入または置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；および
（ｆ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列に少なくとも５０％の相同性を有する塩基配列である核酸。
本発明の第２の発明において、硫酸化フコガラクタンに作用して、該硫酸化フコガラクタンを低分子化し、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有することを特徴とするポリペプチドが提供される：
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈである）。
本発明の第３の発明は、第２の発明の核酸を含んでなる組換えＤＮＡに関する。
本発明の第４の発明は、第３の発明の組換えＤＮＡが挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクターに関する。
本発明の第５の発明は、第３の発明の組換えＤＮＡまたは第４の発明の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
本発明の第６の発明は、第５の発明の形質転換体を培養する工程および該培養物より硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。
本発明の第７の発明は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られる、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドに関する。
本発明の第８の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させて採取されることを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物に関する。
本発明の第９の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物の製造方法に関する。
本発明の第９の発明において、脱アセチル処理した脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを作用させることを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物の製造方法が提供される。
本発明の第１０の発明は、第２の発明の遺伝子あるいはその一部をプローブとして用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングする工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のスクリーニング方法に関する。
本発明の第１１の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする、多糖類の構造解析方法に関する。
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本発明において硫酸化フコガラクタンとは、国際公開公報第００／５０４６４号パンフレットに記載の硫酸化フコース含有多糖のことをいい、構成糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１であり、例えば、２：１の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平均分子量は、例えば、ＨＰＬＣゲルろ過法で約１３万（分子量分布は、約１０万〜約２０万）の硫酸化多糖である。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組成、アセチル基含量及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従って、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量はその１例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件により、その分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載のＵ−フコイダン分解酵素及びＦ−フコイダン分解酵素を用いて硫酸化フコガラクタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を示す硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタンを調製することができる。例えば、硫酸化フコガラクタンの主要な構成糖は、６糖あたりおよそ５残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸基含量は減少するものである。すなわち、硫酸化フコガラクタンから意図的に脱硫酸することが可能である。また、脱硫酸の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整することができる。また、同様の処理によりエステル結合しているアセチル基も切断することができる。従って、本発明において硫酸化フコガラクタンは、前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のものを包含する。
本発明において硫酸化フコガラクタンの主骨格は、下記一般式（Ｖ）に表される。下記一般式において、ｎは、１以上の整数であり、例えば、１〜１０００の範囲、さらに好ましくは１〜５００の範囲のものが硫酸化フコガラクタンに含まれる。
（式中、ＲはＨ、ＳＯ３Ｈ又はＣＯＣＨ３である）
本発明において硫酸化フコガラクタンが由来する褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴメ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ）由来のものを調製することができる。特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダンには、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン及びＧ−フコイダンが含まれている。
本発明において硫酸化フコガラクタンの塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
本発明において硫酸化フコガラクタン低分子化物とは、硫酸化フコガラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースである。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド
本発明において、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド（本明細書においては、単に硫酸化フコガラクタン分解酵素と記載する場合がある）とは、硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させるポリペプチドをいう。また、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットには、フコース硫酸含有多糖−Ｆを分解するエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明における硫酸化フコガラクタンを分解しない。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの一例として、本発明において単離精製されたフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２株由来の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドがあげられる。該硫酸化フコガラクタン分解酵素は、硫酸化フコガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエンド的に分解する酵素である。
本発明における硫酸化フコガラクタンを分解する酵素を生産する菌株としては、例えば、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２［国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日］として寄託）があげられる。
本発明の硫酸化フコガラクタン活性を有するポリペプチドの一例としては、フラボバクテリウム属細菌由来の下記硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドがあげられる。
（Ｉ）作用▲１▼：構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１である硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約７〜９付近にある。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５℃付近にある。
本発明において硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドとは、天然型の硫酸化フコガラクタン分解酵素のみならず、硫酸化フコガラクタン分解活性を有する限り天然型のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。また、ここで言う天然型硫酸化フコガラクタン分解酵素としては、例えばフラボバクテリウム属細菌由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、その他の細菌類はもちろん、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物等の生物体由来のものも、本発明のアミノ酸配列、塩基配列と相同性を有していれば含まれる。
本発明のポリペプチドは、硫酸化フコガラクタン分解活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、該配列に１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示される機能的に同等の活性を有するポリペプチドを包含する。
本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多型や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）〕など、アミノ酸置換によって目的とする活性を示す場合がある。
また、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、相同性を有することが多い。したがって、本発明のポリペプチドと相同性を有し、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドも本発明に含まれる。
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
また、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列表の配列番号２８、３０）に３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５９％以上の相同性を有するアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドは、硫酸化フコガラクタン分解活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれている硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させることができるので、分子量分画と組み合わせることによって硫酸化フコガラクタンを選択的に除去することが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様々な生物活性があることが報告されている。これまで、褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得ることができる。
さらに例えば、硫酸化フコグルクロノマンナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があることが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た硫酸化フコグルクロノマンナンに夾雑する硫酸化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得ることができる。
硫酸化フコガラクタンを除去する方法としては、たとえば、硫酸化フコガラクタン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、及び使用する酵素力価を考慮して選定すればよい。硫酸化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近が好ましい。次に硫酸化フコガラクタン含有物溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応は通常３０℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物が除去された目的物を容易に調製することができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、硫酸化フコガラクタンに作用するため、硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることができる。
さらに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を用いれば、硫酸化フコガラクタンを含有する硫酸化フコース含有多糖から硫酸化フコガラクタン成分を選択的に除去することができる。例えば、硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
（２）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子と厳密な条件においてハイブリダイズすることができ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
上記塩基配列の相同性は、コンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０）、ＢＬＡＳＴ（バージョン２．０）によって測定することができる。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であり、具体的には、配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする核酸（１）、配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸（２）、および上記核酸（１）または（２）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるか、（１）または（２）の塩基配列に５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは６９％以上の相同性を有する塩基配列で、かつ硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする核酸（３）等である。
本発明における核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。上記核酸（２）がＲＮＡである場合は、例えば配列表の配列番号２７記載の塩基配列においてＴをＵで置換した塩基配列で示される。
本発明の核酸は、例えば、次のようにして得ることができる。
まず、配列表の配列番号２７，２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸（２）は、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを生産する微生物、植物、動物などより常法にしたがってゲノムＤＮＡを調製し、それを用いて作製したＤＮＡライブラリーから単離することができる。またこのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸を増幅することによっても取得できる。
また、本発明により提供される、本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列、例えば配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を基に、本発明のポリペプチドと同様の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸を取得することも可能である。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブに用いることにより、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、細胞から抽出したＤＮＡ、該ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物等からスクリーニングすることができる。あるいは上記の塩基配列から設計されたプライマーを使用したＰＣＲ等の遺伝子増幅法を用いることにより、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅することができる。また、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に合成することも可能である。かかる方法により、上記核酸（１）または（３）を得ることができる。
上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、それが目的の核酸の一部であることを確かめた上、該核酸断片、あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の核酸全体を取得することができる。
上記のプローブやプライマーは、その塩基配列が明らかとなっている場合においては、ＯｌｉｇｏＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）などのコンピュータープログラムを用いることにより、使用する目的、条件、環境に応じて最適な配列を設計することができる。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、１９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）等に記載された条件でハイブリダイズ可能なことを意味し、例えば、以下の条件でハイブリダイズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子核酸を含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たな核酸について、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件などをいう。
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）
また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
本発明においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなくとも、それが硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりである。
目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できれば、このベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシ法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）〕により決定することができる。決定された塩基配列を硫酸化フコガラクタン分解酵素のＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって、得られたＤＮＡ断片中の遺伝子の構造及び該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を知ることができる。
また、上記の硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列をもとに得られたオリゴヌクレオチドを用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得る方法として、ＰＣＲ法を用いることができる。中でもカセットＤＮＡ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法は、短時間で少ないアミノ酸配列情報からハイブリダイゼーション法に使用可能な目的遺伝子の断片を得る方法である。
例えば、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の培養菌体から常法にしたがって抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結する。この混合物を鋳型として、上記の部分アミノ酸配列の情報をもとにデザインした該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）とを用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。カセットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例えば宝酒造社製のものを利用することができる。カセットＤＮＡは、２種類のカセットプライマーに対応する配列を含んでいるものが好ましく、まず連結した制限酵素サイトから遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の一部を鋳型としてさらに内側のプライマーを用いて２回目のＰＣＲ反応を行うと効果的である。さらに、該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーについても、並んで２種類をデザイン、合成し、上流のプライマーを１回目のＰＣＲ反応に用い、２回目のＰＣＲ反応では下流のプライマーを用いると該遺伝子の特異性が高くなり、目的ＤＮＡ断片の特異的な増幅の可能性が高くなる。
しかしながら、目的の遺伝子の塩基配列は不明であるため、カセットＤＮＡの連結に用いた制限酵素サイトが部分アミノ酸配列をコードする領域からＰＣＲによる増幅反応に適当な位置にあるとは限らない。そのため、多くの種類の制限酵素サイトのカセットＤＮＡを用いてみる必要がある。また、ＰＣＲは、例えばＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．Ａ．）編集、ストックトンプレス社、１９８９年発行〕に記載されているような、一般に用いられている条件で行うことができるが、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さや硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、アニーリング温度、サイクル数、マグネシウム濃度、耐熱性ポリメラーゼ濃度等を検討し、非特異的な増幅バンドが最も少なくなるような最適条件を選ぶ必要がある。
ＰＣＲ反応液は、アガロースゲルなどの電気泳動に供し、増幅したＤＮＡ断片を確認する。これら断片は、常法に従って抽出、精製し、通常に用いられるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのクローニングベクターに挿入後、例えばジデオキシ法により塩基配列を解析することができる。あるいは回収した増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応に用いたカセットプライマーを用いて直接塩基配列を解析してもよい。その結果、プライマーの配列以外に、先に決定した硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列をコードしているものが得られれば、該酵素をコードする遺伝子あるいはそれにホモロジーを示す遺伝子の断片が得られたことになる。
このようにしてサザンハイブリダイゼーション法あるいは、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子の一部であった場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによるゲノムライブラリーのスクリーニングを行なうか、あるいは該ＤＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行なうことにより、目的の酵素をコードする遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。さらに上述のように得られた硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子あるいは、その一部をプローブとしてフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション法によって解析すれば、検出されたバンドの位置から、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡ制限酵素断片サイズの情報が得られ、また、検出されたバンドの数によって、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびそれに相補性を示す遺伝子の数が予想され、これら遺伝子を含むＤＮＡ断片は、前述と同様の方法により単離することができる。
このようにして得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子を含むかどうかは、最終的に単離された該ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、該ベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いでこの形質転換体の培養を行い、発現されたポリペプチドの硫酸化フコガラクタン分解活性を測定することにより確認することができる。
（３）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有した形質転換体。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列表の配列番号２７、２９記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製することができる。該組換えＤＮＡの作製に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。
さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を作製することができる。形質転換体の作製に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリペプチドを産生させることにより、本発明のポリペプチドを大量に製造することが可能となる。
本発明の核酸、例えば配列番号２７、２９に示される塩基配列を有する核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。配列番号２７に示される塩基配列からは配列番号２８に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号２９に示される塩基配列からは配列番号３０に示されるアミノ酸配列のポリペプチドがそれぞれ生成する。
以下、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２を例として本発明を具体的に説明する。
このフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２として国際寄託されている。
フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２が産生する硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を取得するには、例えば、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法、あるいはこれらを組合わせた方法を利用することができる。これらの方法には該遺伝子にハイブリダイズ可能なプローブ、あるいはＰＣＲ法によって該遺伝子またはその一部を増幅可能なプライマーが必要であるが、これらの菌株の産生する硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く知られていないため、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドを作製することができない。そこでまず、上記微生物の産生する硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドの作製を検討する。
まず、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２を培養し、次いでその培養物から、産生された硫酸化フコガラクタン分解酵素をそれぞれ単離、精製する。次に、精製された硫酸化フコガラクタン分解酵素について、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えば硫酸化フコガラクタン分解酵素を直接常法に従ってエドマン分解法によるアミノ酸配列分析（例えばプロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ社製、を用いることができる）に供することにより、硫酸化フコガラクタン分解酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定する。上記フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２から精製した酵素は、ポリペプチドのＮ末端がブロックされており、Ｎ末端アミノ酸配列の情報は得られなかった。この場合、精製硫酸化フコガラクタン分解酵素に、特異性の高いタンパク質加水分解酵素、例えばアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣを用いて分離、精製した後、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行えば、多くのアミノ酸配列情報が得られる。
こうして得られる硫酸化フコガラクタン分解酵素に特異的な部分アミノ酸配列に関する情報を選択し、該情報をもとに塩基配列の縮重したオリゴヌクレオチドをデザインし合成する。このとき縮重の程度が低く長いオリゴヌクレオチド、言換えれば、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に特異性の高いオリゴヌクレオチドを合成することが必要であり、オリゴヌクレオチドのデザインが硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングに重要な要因となる。
次にサザンハイブリダイゼーション法によって合成オリゴヌクレオチドと硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との特異的ハイブリダイゼーションの条件を検討する必要がある。
例えば、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、常法に従いナイロン膜等にブロッティングする。ハイブリダイゼーションは、まず、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇの塩化ナトリウム及び４．４１ｇのクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃で数時間保温してナイロン膜をブロッキングした後、例えば３２Ｐ等でラベルした合成オリゴヌクレオチドを加えて４２℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで４２℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このとき、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さや硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、保温温度や洗浄溶液の塩濃度等を検討し最適条件を選ぶのが効果的である。
このようにして検出された硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る方法としては、直接検出されたバンドの位置に相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、サザンハイブリダイゼーション法と同様の条件でコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行って、目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離すればよい。あるいは直接フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、同様にハイブリダイゼーション法で目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離してもよい。
上記のようにして得られた核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製することができる。該組換えＤＮＡの作製に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して本発明の形質転換体を作製することができる。形質転換体の作製に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。
（４）本発明のポリペプチドの製造方法
用いられる宿主−ベクター系としては公知のものが使用でき、例えば大腸菌を宿主としたｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクター、あるいはラムダファージなどのファージベクター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。これら宿主−ベクター系の種類や取扱い方法は一般に用いられる種類や方法を用いれば良く、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）〔Ｊ．サムブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー １９８９年発行〕に記載されている。
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
さらに、目的のタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端の数十アミノ酸を欠失させたタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込ませることにより、目的のタンパク質を発現させることができる。
また、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来の単離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
一般に遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。また、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列あるいはプレ・プロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、あるいは活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を発現するポリペプチドである。このような、シグナルペプチド、プロ配列、プレプロ配列は、活性をもつペプチドとしての発現を阻害する場合もある。このような場合には、ポリペプチドのＮ末端を数アミノ酸残基から数十アミノ酸残基削ることにより、活性をもつペプチドの収量を向上させることもできる。
さらに、本発明のプラスミドｐＥＡ１０１、ｐＥＢ１０１のいずれか１つを導入した形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のポリペプチドを精製してもよい。
形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドは、ｌａｃプロモーターやＴ７ファージプロモーターの下流に本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌を通常の培養条件、例えば、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で対数増殖期まで培養後、１ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３７℃で培養することにより、培養菌体中にポリペプチドを発現させることができる。また、ペプチドのＮ末端を削ったポリペプチドを発現させることもでき、例えば本発明のペプチドｓｆｇＡの場合は、全長のアミノ酸配列のＮ末端から２３アミノ酸残基を削ることにより、またｓｆｇＢの場合は３０アミノ酸残基を削ることにより、それらの発現量を向上させることもできる。
培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を超音波で破砕し、さらに遠心分離して上清を集め、無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液は硫酸化フコガラクタン分解活性を示す。さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを精製することができる。上記の精製過程において得られる部分精製品も、当然ながら硫酸化フコガラクタン分解活性を示す。
（５）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のスクリーニング方法
本発明の遺伝子の塩基配列を用いて、硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば以下の方法が適用できる。
まず目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を例えば３２Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号２８、３０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む配列、又はその一部をコードする塩基配列であればよく、例えば、配列表の配列番号２７、２９のいずれかで表される塩基配列、又はその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流した後、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のポリペプチドをコードする遺伝子が挿入されている。
得られた遺伝子は、例えば次のように塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的の硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかを確認する。塩基配列の決定は、形質転換体がプラスミドで形質転換された大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージベクターが用いられた場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を決定することができる。これらの培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第二版〔Ｊ．サムブルークほか著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー １９８９年発行〕等に記載されている。
得られた遺伝子が目的の硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列あるいはそのコードしているアミノ酸配列を本発明の配列表の配列番号２７、２９のいずれかで表される塩基配列あるいは配列表の配列番号２８、３０のいずれかで表されるアミノ酸配列と比較する。
得られた遺伝子が硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする領域のすべてを含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の遺伝子にハイブリダイズする硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドの全コード領域の塩基配列を決定することができる。
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
次に得られた遺伝子を発現させ、硫酸化フコガラクタン分解活性を測定し、得られた遺伝子の機能を確定する。
このように本発明により、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの一次構造及び遺伝子構造が提供される。また、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造が可能となる。
本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドを得ることが可能となる。
硫酸化フコガラクタン分解酵素を産生するフラボバクテリウム属細菌を培養して硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する方法は、同時にプロテアーゼや他の多糖分解酵素が生産されるため、目的の硫酸化フコガラクタン分解酵素を単離するためには、極めて厄介なこれら酵素との分離精製が必要であったが、本発明により安価に、高純度な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの提供が可能となった。
本発明の塩基配列がコードするポリペプチドの硫酸化フコガラクタン分解活性の確認は、例えば、該ポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させて得られる分解物をＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定することによって、あるいは生成する還元末端を常法により測定することによって行なうことができる。
（６）硫酸化フコガラクタン低分子化物の製造方法、該製造方法における脱アセチル化の影響
本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物に作用させることによって調製することができる。硫酸化フコガラクタン含有物としては、例えば硫酸化フコガラクタンの部分精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
本発明の遺伝子がコードする硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを、硫酸化フコガラクタンに作用させて得られる低分子化物は、特に限定はないが、例えば２糖類〜６糖類が挙げられる。低分子化物中に存在する硫酸基の置換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたものであれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物の化学構造は、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に示される。その中で、下記一般式（ＩＩＩ）は、前述の硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈである）
また、本発明の低分子化物は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ（ダウケミカル社製）等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の硫酸化フコガラクタンの低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。
本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、この細胞を培養することによって調製することができる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩の精製に使用することができる。さらに、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウイルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用である。
また、硫酸化フコガラクタン又はその塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学用試薬として用いることができる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、該低分子化物のＰＡ化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。
本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の製造方法において、硫酸化フコガラクタンを脱アセチル化することにより、低分子化物の収量を向上させることができる。脱アセチル化する方法は特に限定はされないがアルカリ性の水溶液で処理する方法やデアセチラーゼで処理する方法などがあり、例えば硫酸化フコガラクタンを１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で、２５℃、２４時間の処理条件で脱アセチル化することにより、低分子化物の収量を上げることができる。すなわち、本発明の低分子化物の製造方法においては、硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタンのいずれもが原料として好適に使用できる。
実施例
本発明を実施例により具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１ 硫酸化フコガラクタンの調製
乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び国際公開第ＷＯ９７／２６８９６号パンフレット記載のアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１００９株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成８年２月１３日よりＦＥＲＭ Ｐ−１５４３６として寄託され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７［国際寄託への移管請求日：平成８年１１月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から得られたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁した。２５℃で２日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖による強い粘弾性が完全に消失したので、低分子化した硫酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１０％ エタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％ エタノールを含む１００ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎ 塩酸でｐＨ２．０とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎ 水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍ 塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭ 塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２［国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から得られたエンド型フコイダン分解酵素を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭ 塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）にかけ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭ 塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭ 塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過器により濃縮後、１０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。この画分について、糖組成分析を行った。まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従い、フコース量を定量した。
次に、得られた硫酸化フコガラクタンの乾燥標品を１Ｎ 塩酸に０．５％ 濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグ リージェント キット（宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置；Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム；パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；宝酒造社製）
溶離液；７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１
検出；蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速；０．３ｍｌ／分
カラム温度；６５℃
次に、アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。さらに、バイオケミカル ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
以上の結果、得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
参考例２ 硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性測定方法
参考例１で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を以下のように測定した。すなわち、６０μｌの５０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、４．８μｌの２．５％ 硫酸化フコガラクタン画分溶液と、６μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、３７．２μｌの水と１２μｌの硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、硫酸化フコガラクタン分解酵素の代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化フコガラクタン画分のガラクトシル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクトシル結合の量は下記式により求めた。
｛（４．８×１０００×２．５／１００）／ＭＧ｝×｛（ＭＧ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１２）｝＝Ｕ／ｍｌ
４．８×１０００×２．５／１００：反応系中に添加した硫酸化フコガラクタン（μｇ）
ＭＧ：基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化フコガラクタンが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１２：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
参考例３ 硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製
参考例２記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素は以下の方法により調製された。フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）をグルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
得られた菌体を、１２００ｍｌの０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
得られた活性画分を０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍｌ ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ〜０．４Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、４Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２０ｍｌ Ｐｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍ〜１Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍｌ Ｐｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させた。得られた活性画分をまとめて、精製酵素を得た。
実施例１ 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子のクローニング
（１） ゲノムＤＮＡの調製
硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産菌株であるフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を、１２０℃、２０分の条件で滅菌したグルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地５００ｍｌが入った２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２３時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、その半量の菌体を１０ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））中に懸濁後、１ｍｌの抽出緩衝液に溶解した２０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム（シグマ社製）溶液を添加し、氷浴上で３０分間保持した。次いで、１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液（１ｍｇ／ｍｌ プロイテナーゼＫ（宝酒造社製）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を添加した後、５０℃で２時間保温した。この後室温に戻し、等量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）飽和フェノールを加えて１時間穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。この上層に、等量のＴＥ緩衝液飽和フェノール／クロロホルム１：１を加えて穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。再度フェノール／クロロホルム抽出をおこなった後、水層に０．１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えさらに２倍量のエタノールを加えてＤＮＡを析出させガラス棒で巻き取った後、８０％ エタノールでリンスして軽く風乾した。このゲノムＤＮＡを２０ｍｌの２０μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）が溶解したＴＥ緩衝液中に溶解させ、３７℃で５時間保温してＲＮＡを分解した。フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出の後、前記と同様にしてエタノール添加後ＤＮＡを回収し、５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約２０ｍｇを得た。
（２） ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ １００μｇを１０Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）により３７℃で１分４０秒間消化して部分分解させ、フェノール／クロロホルム抽出し上層を回収した。上層に１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）および２．５倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収した後、８０％エタノールでリンスして風乾した。得られた部分分解物を、１．２５−５Ｍ塩化ナトリウム密度勾配超遠心法によりサイズ分画をおこない、１０−２０ｋｂｐのサイズを含む画分からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたゲノムＤＮＡ部分分解物０．２μｇとラムダブルースターＢａｍＨＩアーム（ノバジェン社製）０．６μｇと混ぜ、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、ギガパックＩＩゴールドキット（ストラタジーン社製）を用いてラムダファージにパッケージングを行い、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
（３） 硫酸化フコガラクタン分解酵素のアミノ酸配列の決定
参考例３のようにして得られたフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパク質 ８４μｇを、水で平衡化した脱塩用のカラム（ファーストデソルティングカラムＰＣ３．２／１０、ファルマシア社製）にアプライ後、水で溶出し、緩衝液を置換した。溶出液をガラスバイアルに集め濃縮乾固後、ピリジン２００μｌ、４−ビニルピリジン４０μｌ、トリ−Ｎ−ブチルフォスフィン４０μｌ、水２００μｌの入った一回り大きなガラス試験管の中にガラスバイアルごと試料を入れ、ガラス試験管を封かんした後、１００℃で７分間反応させてピリジルエチル化した。反応終了後ガラスバイアルを取り出し、数回水と共沸させて揮発性成分を除いた。
得られたピリジルエチル化された硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパク質を、３０μｌの８Ｍ 尿素を含む１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）、３０μｌの１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）及び４０ｐｍｏｌのアクロモバクタープロテアーゼＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で一晩消化し、得られた消化物からペプチド断片をＨＰＬＣシステム（スマートシステム、ファルマシア社製）にて精製した。カラムは、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０（ファルマシア社製）を用い、１００μｌ／ｍｉｎの流速で行った。溶出は、溶出液として０．１％ トリフルオロ酢酸水溶液（溶出液Ａ）および０．１％ トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（溶出液Ｂ）を用い、溶出液Ｂの割合を０％でサンプルをアプライし、１００分間で溶出液Ｂの割合を４０％にまであげる直線濃度勾配法にて溶出し、得られた溶出画分から各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列表の配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ１６２（配列番号６）、およびＳ２９２（配列番号７）を決定した。
（４） 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の塩基配列決定
実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ １．２μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、 ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ（いずれも宝酒造社製）各３０Ｕで各々３７℃で５時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出した。消化物をエタノール沈殿により回収した。この各消化物 約０．６μｇを、ＢｇｌＩＩ消化物にはＳａｕ３ＡＩカセット、ＥｃｏＲＩ消化物にはＥｃｏＲＩカセット、ＥｃｏＴ２２ＩおよびＰｓｔＩ消化物にはＰｓｔＩカセット、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物にはＨｉｎｄＩＩＩカセット、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ消化物にはＸｂａＩカセット（各カセットＤＮＡはいずれも宝酒造社製）各５０ｎｇと混合後、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた。ＥｃｏＴ１４ＩおよびＮｃｏＩ消化物は配列表の配列番号８、９記載の２本の合成オリゴヌクレオチドから作製したＮｃｏＩカセットと連結させた。反応物をエタノール沈殿により回収して５μｌの水に溶解し、カセットＤＮＡを用いたＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。
一方、実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｓ３９（配列表の配列番号３）の１〜７のアミノ酸配列からＳＦＧ−３９１Ｆプライマー（配列番号１０）、８〜１５のアミノ酸配列からＳＦＧ−３９２Ｆプライマー（配列番号１１）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と同じ向きに合成した。また、Ｓ４２（配列番号４）の１〜８のアミノ酸配列からＳＦＧ−４２１Ｆプライマー（配列番号１２）、６〜１４のアミノ酸配列からＳＦＧ−４２２Ｆプライマー（配列番号１３）とＳＦＧ−４２３Ｆプライマー（配列番号１４）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と同じ向きに合成した。
８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、カセットプライマーＣ１（宝酒造社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドＳＦＧ−３９１Ｆ（配列番号１０）またはＳＦＧ−４２１Ｆ（配列番号１２）１００ｐｍｏｌ、および滅菌水を加えて５０μｌとし、Ａｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ１００（宝酒造社製）を添加した後７０℃で３分間加熱後室温で１０分間放置した。ここに１０μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液（宝酒造社製）、先に調製した鋳型ＤＮＡ各１μｌ、２ユニットのタカラＥｘタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、宝酒造社製）、および滅菌水を加えて１００μｌとした。この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ 、宝酒造社製）による増幅反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で０．５分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応を１サイクルとし、３０サイクル行った。
次に、１回目のＰＣＲ反応液の一部を鋳型ＤＮＡとして２回目のＰＣＲ反応を行った。すなわち、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、カセットプライマーＣ２（宝酒造社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドＳＦＧ−３９２Ｆ（配列番号１１）またはＳＦＧ−４２２Ｆ（配列番号１３）またはＳＦＧ−４２３Ｆ（配列番号１４）１００ｐｍｏｌ、および滅菌水を加えて５０μｌとし、Ａｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ１００を添加した後７０℃で３分間加熱後室温で１０分間放置した。ここに１０μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液（宝酒造社製）、１μｌの１回目のＰＣＲ反応液、２ＵのタカラＥｘタック ＤＮＡポリメラーゼ、および滅菌水を加えて１００μｌとした。この混合液を９４℃で０．５分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応を１サイクルとして２５サイクル行った。また同時に、それぞれの反応液に対してカセットプライマーＣ２のみあるいは混合オリゴヌクレオチドのみの反応液についてもＰＣＲ反応を行い、各プライマーの非特異的増幅産物のコントロールとした。
アガロースゲル電気泳動で反応液を分析し、非特異的増幅産物のコントロールと比較したところ、多くの反応液で特異的な増幅バンドが検出された。これらの中から比較的バックグランドが低く、強く増幅されていたＳｐｅＩ消化物−ＸｂａＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−３９２Ｆプライマーによる約０．８ｋｂのバンド、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物−ＨｉｎｄＩＩＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−４２３Ｆプライマーによる約１．４ｋｂのバンド、ＥｃｏＲＩ消化物−ＥｃｏＲＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−４２３Ｆプライマーによる約１．１ｋｂのバンドを抽出、精製した。これらのＤＮＡ断片とｐＴ７ブルーＴ−ベクター（ｐＴ７ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ノバジェン社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．００４％のＸ−Ｇａｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、目的のサイズのバンドが挿入されたプラスミドを選択し、各々Ｓ３９２１、Ｈ４２３１、Ｒ４２３１と命名した。これらの挿入配列をジデオキシ法により塩基配列分析を行った。Ｓ３９２１とＲ４２３１は各々２回目のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列に続いて部分アミノ酸配列をコードする領域が見出された。また、Ｓ３９２１とＲ４２３１は挿入断片の塩基配列が一部重なっており、両塩基配列をつなげると約１．６ｋｂｐになった。この中には部分アミノ酸配列Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ１６２（配列番号６）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ２９２（配列番号７）、Ｓ３９（配列番号３）をコードする領域を含む読み取り枠の一部が含まれており、硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の一部であることが明らかとなった。
また、実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｓ２３（配列番号２）の６〜１３のアミノ酸配列からＳＦＧ−２３１Ｒプライマー（配列番号１５）、ＳＦＧ−２３２Ｒプライマー（配列番号１６）、３〜９のアミノ酸配列からＳＦＧ−２３９Ｒプライマー（配列番号１７）、ＳＦＧ−２３０Ｒプライマー（配列番号１８）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と逆向きに合成し、上記と同様の方法でカセットライブラリーからのスクリーニングを試みた。アガロースゲル電気泳動で反応液を分析し、非特異的増幅産物のコントロールと比較したところ、多くの反応液で特異的な増幅バンドが検出された。これらの中から比較的バックグランドが低く、強く増幅されていたＥｃｏＴ１４Ｉ消化物−ＮｃｏＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−２３９Ｒプライマーによる約１．４ｋｂのバンドを抽出、精製した。このＤＮＡ断片とｐＴ７ブルーＴ−ベクターを連結し、上記と同様に目的のサイズのバンドが挿入されたプラスミドを選択し、Ｔ２３９２と命名した。その挿入配列の塩基配列分析を行ったところ、上記で分析した１．６ｋｂｐの塩基配列と１部重なっており、つなげあわせると約２．８ｋｂｐの塩基配列を決定することができた。この中には１６０２塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠が見出され、この読み取り枠がコードするアミノ酸配列中に実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列と非常に高い相同性を示す領域が見出された。この１６０２ｂｐの読み取り枠をｓｆｇＡと命名した。
ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列中には実施例１−（３）で決定した硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、およびＳ２９２（配列番号７）と一致する配列が、また、部分アミノ酸配列Ｓ４９（配列番号５）およびＳ１６２（配列番号６）と非常に相同性の高い配列が見出された。このようにｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列は、実施例１−（３）の硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列分析により明らかとなった全てのアミノ酸配列と一致あるいは高い相同性を示すことから、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の硫酸化フコガラクタン分解酵素を実質的にコードしていると考えられた。
一方、Ｈ４２３１は２回目のＰＣＲ反応に用いたＳＦＧ−４２３Ｆの配列に続いて部分アミノ酸配列Ｓ４２（配列番号４）の１５番目以降のアミノ酸をコードする領域が見出されたが、１９番目と２０番目のアミノ酸が異なっていた。Ｈ４２３１の挿入断片の全塩基配列を決定したところ、上記２．８ｋｂｐの塩基配列と一部重なっており、ｓｆｇＡの上流にｓｆｇＡと相同性の高い読み取り枠の一部があることがわかった。
（５） ｓｆｇＡホモログの単離
実施例１−（２）で調製したフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーから硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子を含むクローンを、以下のようにプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。まず、ゲノムＤＮＡのファージライブラリーを大腸菌ＥＲ１６４７に感染させ、１０ｃｍ×１４ｃｍのシャーレに入ったＬ培地プレート３枚に、１枚当たり約１３００個のプラークを形成させた。これらのプレートにナイロン膜ハイボンドＮ＋（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を約２分間接触させファージを写し取った。このナイロン膜を０．５Ｍ 水酸化ナトリウム、１．５Ｍ 塩化ナトリウムの溶液中で５分間変性し、次いで、０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ 塩化ナトリウムの溶液中で５分間中和処理し、２×ＳＳＣでリンスした後風乾した。このナイロン膜を８０℃で１時間加熱してＤＮＡを固定した。
一方、実施例１−（４）で得られたＴ２３９２のプラスミドＤＮＡ 約１５μｇをベクター由来のＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、遊離する約１．４ｋｂの硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の一部を含む断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてジゴキシゲニンで標識し、取扱説明書に従い以下のようにプラークハイブリダイゼーションを行った。上記調製したフィルターをハイブリダイゼーション溶液中、６０℃で４時間プレハイブリダイゼーションを行った後、熱変性した標識プローブを約６０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加え、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、まず２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で５分間２回、さらに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃で１５分間２回洗浄した。その後、上記検出キットを用いて検出した結果、２４個のポジティブシグナルが得られた。元のプレートよりポジティブシグナル付近のプラークをかきとり、ＳＭ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１％ゼラチン）に懸濁しファージを回収した。得られたファージ液のいくつかについて、再度新しいプレートにプラークを形成させ、同様の操作を繰り返すことにより５個のポジティブシグナルを与えるファージを単離した。
ノバジェン社のラムダブルースター取り扱い説明書に従って、得られた各ファージを大腸菌ＢＭ２５．８に感染させたのち１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレートに広げ、アンピシリン耐性のコロニーを選択することによりファージをプラスミドの形に変換した。得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法により再度プラスミドＤＮＡを調製した。得られた各クローンのプラスミドをそれぞれｐＢｓｆｇ５、７、１３、１７およびｐＢｓｆｇ１８と命名した。各プラスミドをそれぞれ、適当な制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、各挿入断片の制限酵素地図を作成して解析した。その結果、アガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色でそれぞれ良く似たサイズのバンドが複数検出されることから、各プラスミドにはほぼ同じ位置のゲノムＤＮＡで、約３〜１４ｋｂｐの断片が挿入されていると推定された。
上記で得られたプラスミドのうち、約７ｋｂｐの挿入断片を持つｐＢｓｆｇ１７について、さらに挿入断片の解析を行った。すなわち、ｐＢｓｆｇ１７約１μｇをＫｐｎＩ消化し、遊離する約７ｋｂｐの断片を抽出精製した。このＫｐｎＩ断片をアンピシリン耐性ベクターであるｐＵＣ１１９（宝酒造社製）のＫｐｎＩ消化物と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌ アンピシリン、０．００４％ Ｘ−Ｇａｌ、および１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素消化後アガロースゲル電気泳動を行って解析した。その結果、ｐＢｓｆｇ１７由来の約７ｋｂｐ ＤＮＡがベクターＤＮＡに対してそれぞれ逆向きに挿入されたｐＵＣ１７Ｋ１およびｐＵＣ１７Ｋ３を得た。これらプラスミドについて直接プライマー伸長法によって、あるいは制限酵素消化後サブクローニング等を行ってジデオキシ法によって詳しく塩基配列を解析したところ、ｓｆｇＡおよびｓｆｇＡの上流に１６２６塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠が見出され、この読み取り枠がコードするアミノ酸配列はｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列と非常に高い相同性を示した。この読み取り枠をｓｆｇＢと命名した。
ｓｆｇＢがコードするアミノ酸配列中にも、硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ１６２（配列番号６）、およびＳ２９２（配列番号７）と相同性の高い配列が見出された。ｓｆｇＡとｓｆｇＢを比較すると塩基配列およびアミノ酸配列の相同性は各々約６７％および約５９％と高いことからｓｆｇＢも硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードしていると考えられた。以上のようにして、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）およびその遺伝子に非常に高い相同性を示す遺伝子（ｓｆｇＢ）の全塩基配列が決定された。ｓｆｇＡの塩基配列を配列表の配列番号１９に、ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２０に示す。更にｓｆｇＢの塩基配列を配列表の配列番号２１に、ｓｆｇＢがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。
以上、本発明により実質的に硫酸化フコガラクタン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）およびその遺伝子に相同性を示し、硫酸化フコガラクタン分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＢ）が決定された。
（６） ｓｆｇＡ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素
ｓｆｇＡ遺伝子全長を発現ベクターに挿入して、硫酸化フコガラクタン分解酵素を発現させたが、その活性が低かったため、以下のようにＮ末端を削ったポリペプチドの発現を試みた。
まず、実施例１−（５）で得られた、実質的に硫酸化フコガラクタン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）の発現ベクターを以下のように構築した。ｓｆｇＡＬ５プライマー（配列番号２３）は、そのコードするタンパク質のＮ末端より２３番目までのアミノ酸を欠失させ、なおかつＮｄｅＩサイトを導入するように設計した。ｓｆｇＡＲ４プライマー（配列番号２４）は終始コドンの代わりにＸｈｏＩの認識配列をもち、ｓｆｇＡＬ５プライマーと反対鎖にハイブリダイズするよう設計した。これら２種類のプライマーを用いて、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ反応を以下のように行なった。０．５ｍｌ ＰＣＲ用チューブにプライマーｓｆｇＡＬ５、ｓｆｇＡＲ４を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートの染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、５μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを添加し、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング、７２℃で２分間の合成反応を１サイクルとして２５サイクル行なった。この増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離し、２４番目以降のアミノ酸配列をコードする約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を切り出して抽出精製した。
一方、Ｔ７ ｌａｃプロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩサイトとＸｈｏＩサイトで切断後、先に調製した約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入し、これをｐＥＡ１０１と命名した。つまりこのハイブリッドベクターにより発現されるタンパク質はｓｆｇＡによってコードされる２４番目以降のアミノ酸からなるポリペプチドの両末端にベクター由来の２２アミノ酸が付加したものである。なおＮ末端には１０個の連続したヒスチジンからなる配列（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）を持つ。こうして得られたｐＥＡ１０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１を３０ｍｌの液体Ｌ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を新たに３リットルのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に植菌し、３７℃、回転数２００ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで対数増殖期まで培養した。この培養には５ｌ容ミニジャー（エイブル社製）を用いた。濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．４の段階で終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに２５℃、回転数１２０ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで一晩培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して約２１ｇの菌体を集め、そのうち約７．０ｇを以下の精製に使用した。なお、この際にはＮ末領域のＨｉｓ・Ｔａｇを利用し、Ｈｉｓ・Ｔａｇ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン社製）を利用して行なった。４０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール）で菌体を懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、得られた上清を、Ｎｉを付加しその後Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで平衡化した１０ｍｌのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎにアプライした。そのカラムを５０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、さらに３０ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した。その後５０ｍｌのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ イミダゾール）で目的のタンパク質を回収した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、精製された形で目的タンパク質が検出され、硫酸化フコガラクタン分解活性を参考例２に記載した方法で測定した結果、５８０ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、ｓｆｇＡがコードするポリペプチドは硫酸化フコガラクタン分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１の培養液１ｍｌ中に、約５８ｍＵの硫酸化フコガラクタン分解活性を有するｓｆｇＡがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かった。このＮ末端を削ったｓｆｇＡがコードするポリペプチドの塩基配列を配列表の配列番号２７に、このポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２８に示す。なお、このｐＥＡ１０１プラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３８０として、平成１３年６月２０日より寄託されており、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９［国際寄託への移管請求日：平成１４年８月１３日］として寄託されている。
（７） ｓｆｇＢ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素
ｓｆｇＢ遺伝子全長を発現ベクターに挿入して、硫酸化フコガラクタン分解酵素を発現させたが、その活性が見られなかったため、以下のようにＮ末端を削ったポリペプチドの発現を試みた。
実施例１−（５）で得られた硫酸化フコガラクタン分解活性を有すると思われる新規ポリペプチドをコードする遺伝子（ｓｆｇＢ）の発現ベクターを構築した。ｓｆｇＢＬ７プライマー（配列番号２５）は、そのコードするタンパク質のＮ末端より３０番目までのアミノ酸を欠失させ、なおかつＮｄｅＩサイトを導入するように設計した。ｓｆｇＢＲ３プライマー（配列番号２６）は終始コドンの代わりにＸｈｏＩの認識配列をもち、ｓｆｇＢＬ７プライマーと反対鎖にハイブリダイズするよう設計した。これら２種類のプライマーを用いて、実施例１−（６）と同様の条件でフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ反応を行なった。この増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離し、３１番目以降のアミノ酸配列をコードする約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を切り出して抽出精製した。この断片を同酵素で切断したｐＥＴ１６ｂに挿入し、これをｐＥＢ１０１と命名した。つまりこのハイブリッドベクターにより発現されるタンパク質はｓｆｇＢによってコードされる３１番目以降のアミノ酸からなるポリペプチドの両末端にベクター由来の２２アミノ酸が付加したものである。なおＮ末端には１０個の連続したヒスチジンからなる配列（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）を持つ。
こうして得られたｐＥＢ１０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１を３０ｍｌの液体Ｌ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を新たに３リットルのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に植菌し、３７℃、回転数２００ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで対数増殖期まで培養した。この培養には５リットル容ミニジャー（エイブル社製）を用いた。濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．４の段階で終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに２５℃、回転数１２０ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで一晩培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して約２３ｇの菌体を集め、そのうち約７．７ｇを以下の精製に使用した。なお、この際にはＮ末領域のＨｉｓ・Ｔａｇを利用しＨｉｓ・Ｔａｇ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン社製）を利用して行なった。５０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール）で菌体を懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、得られた上清を、Ｎｉを付加しその後Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで平衡化した２０ｍｌのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎにアプライした。そのカラムを１００ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、さらに６０ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した。その後５０ｍｌのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ イミダゾール）で目的のタンパク質を回収した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、精製された形で目的タンパク質が検出され、硫酸化フコガラクタン分解活性を参考例２に記載した方法で測定した結果、３．０５ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、ｓｆｇＢがコードするポリペプチドは硫酸化フコガラクタン分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１の培養液１ｍｌ中に約０．３ｍＵの硫酸化フコガラクタン分解活性を有するｓｆｇＢがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かった。このＮ末端を削ったｓｆｇＢがコードするポリペプチドの塩基配列を配列表の配列番号２９に、このポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号３０に示す。なお、このｐＥＢ１０１プラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３８１として、平成１３年６月２０日より寄託されており、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０［国際寄託への移管請求日：平成１４年８月１３日］として寄託されている。
実施例２ 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の相同性検索
実施例１において得られた硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と塩基配列について、ホモロジー検索を行なった。検索プログラムは、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって算出した。
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴで遺伝子データベースをｓｆｇＡ、ｓｆｇＢに関して検索した。その結果、ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列に対して最も相同性の高かったものは全長の配列に対して８％、塩基配列で最も相同性の高かったものは全長の配列に対して１％の相同性であった。また、ｓｆｇＢがコードするアミノ酸に対しては、同様に７％、塩基配列は１％であった。
さらに、検索プログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）のＭａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇを用いて、国際公開第９９／１１７９７号パンフレット記載のフラボバクテリウム由来エンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｆｄｌＡ、ｆｄｌＢとの相同性を算出した。その結果、ｓｆｇＡはｆｄｌＡ、ｆｄｌＢに対してそれぞれ塩基配列で５４％、５２％、それらがコードするアミノ酸配列で３４％、３０％の相同性を有していた。同様にｓｆｇＢはｆｄｌＡ、ｆｄｌＢに対してそれぞれ塩基配列で５３％、５２％、それらがコードするアミノ酸配列で３３％、３０％の相同性を有していた。
また、ｓｆｇＡとｓｆｇＢの相同性は、塩基配列で６９％、コードするアミノ酸配列で５９．４％であった。
実施例３ 硫酸化フコガラクタンの脱アセチル化の影響
参考例１に記載の硫酸化フコガラクタン画分２００ｍｇを２０ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し２５℃で２４時間放置した。本操作によりＯ−アセチル基を選択的に加水分解することができる。得られた脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを１０％エタノール中で充分透析し、高分子画分を凍結乾燥して、１３７ｍｇの脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを得た。
実施例１−（６）で得られたｓｆｇＡ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素を、硫酸化フコガラクタン及び脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに作用させその低分子化の程度をＨＰＬＣにより確認した。
すなわち、１２０μｌの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２４μｌの２．５％硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタン、及び１２μｌの４Ｍ 塩化ナトリウム、８２．９μｌの水を混合後、１．１μｌの８８５ｍＵ／ｍｌの硫酸化フコガラクタン分解酵素を混合し、３０℃で２４時間反応した。反応液を参考例２記載の方法によりＨＰＬＣで分析し、基質の低分子化の程度を比較した。その結果、硫酸化フコガラクタンを基質として用いた場合は分解後の平均分子量が約１６０，０００、脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを基質に用いた場合は分解後の分子量が約１０，０００以下であった。本酵素を用いて硫酸化フコガラクタンオリゴ糖を得る場合、硫酸化フコガラクタンを脱アセチル化することにより、分子量の小さいオリゴ糖を得られることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドが提供される。
【配列表】
本発明は、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドに関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化フコース含有多糖が含まれている。例えば、▲１▼フコースと硫酸基のみからなる硫酸化フカン、▲２▼グルクロン酸、マンノース、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロノマンナン、例えば国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ（構成糖及びそのモル比がフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基＝約１０：７：４：５：２０、以下、Ｕ−フコイダンと称す）、▲３▼フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコガラクタン、例えば、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ（構成糖及びそのモル比がフコース：ガラクトース＝約１０：１、以下、Ｆ−フコイダンと称す）、あるいは国際公開公報第００／５０４６４号パンフレットに記載のフコース硫酸含有多糖−Ｇ（構成糖及びそのモル比がガラクトース：フコース＝約２：１、以下、Ｇ−フコイダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られている。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総て陰イオン性高分子であるため、様々な精製工程において理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そのため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離されることなく、そのまま生物活性が調べられることが多く、見出された生物活性を担うものがどの硫酸化フコース含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
現在までに活性と分子の相関関連が知られているのは、アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４４巻、第８号、第１９６５頁〜第１９６６頁（１９８０）記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン画分、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレット記載の癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を担うＵ−フコイダンである。
硫酸化フカン画分の抗凝血作用に関しては、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてきた。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性すなわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを得る必要があり、その方法が求められていた。
同様に、Ｕ−フコイダンに関しても癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Ｕを簡便に得る必要があり、その方法が求められていた。
一般的に、多糖の構造解析やオリゴ糖の製造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法である。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にその他の多糖と分離することができる。
従来よりアワビ、ホタテ貝、ウニ、海洋微生物などが上記の硫酸化フコース含有多糖を分解する酵素を生産していることが報告されている。しかし、これらの酵素は一般に生体内に微量しか含まれていない上に複数の硫酸化フコース含有多糖分解酵素を持っているために、単一の酵素を得るための様々な精製工程が必要となっていた。例えば、国際公開公報第００／５０４６４号パンフレット記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素は活性を指標に分離したものであり、単一のタンパク質として単離されているかどうかは不明である。このように、単一の天然の硫酸化フコガラクタン分解酵素を大量に精製・採取することは困難であった。また、上記の硫酸化フコガラクタン分解酵素を海洋微生物から採取する場合においては、培養液中に硫酸化フコガラクタン、あるいは硫酸化フコガラクタンを含む硫酸化フコース含有多糖を添加することが必要であり、培養操作が繁雑であり、コスト高になるという問題があった。
さらに、上記方法により天然の硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパクが十分採取できなければ該酵素のアミノ酸配列及び核酸配列の情報を得ることはまず不可能であり、仮に十分量採取できた場合でも該酵素タンパクのＮ末がブロッキングされていたならば、Ｎ末アミノ酸配列の情報を得られないという問題があった。
また、上記酵素をコードする遺伝子が取得できた場合においても、発現プロモーターあるいは宿主との相性により、発現しないか、発現しても低発現である、あるいは封入体となって酵素活性を保持した組換体酵素を得ることができないなど予測がつかない問題があった。
発明の目的
本発明の目的は、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドを提供することにある。
発明の概要
本願の発明者らは、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかにするために、硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する微生物の遺伝子について鋭意研究を進めた結果、フラボバクテリウム属細菌由来の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が少なくとも２種類存在することを明らかにし、その塩基配列を決定した。また、該ポリペプチドのアミノ酸配列を明らかにし、さらに該遺伝子を用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを工業的に有利に生産する方法をも開発することに成功し、本発明を完成させた。
本発明の第１の発明は、下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドに関する：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
本発明の第２の発明は、下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸に関する：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基が欠失、付加、挿入または置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；および
（ｆ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列に少なくとも５０％の相同性を有する塩基配列である核酸。
本発明の第２の発明において、硫酸化フコガラクタンに作用して、該硫酸化フコガラクタンを低分子化し、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有することを特徴とするポリペプチドが提供される：
本発明の第３の発明は、第２の発明の核酸を含んでなる組換えＤＮＡに関する。
本発明の第４の発明は、第３の発明の組換えＤＮＡが挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクターに関する。
本発明の第５の発明は、第３の発明の組換えＤＮＡまたは第４の発明の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
本発明の第６の発明は、第５の発明の形質転換体を培養する工程および該培養物より硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。
本発明の第７の発明は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られる、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドに関する。
本発明の第８の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させて採取されることを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物に関する。
本発明の第９の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物の製造方法に関する。
本発明の第９の発明において、脱アセチル処理した脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを作用させることを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物の製造方法が提供される。
本発明の第１０の発明は、第２の発明の遺伝子あるいはその一部をプローブとして用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングする工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のスクリーニング方法に関する。
本発明の第１１の発明は、第１の発明または第７の発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする、多糖類の構造解析方法に関する。
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本発明において硫酸化フコガラクタンとは、国際公開公報第００／５０４６４号パンフレットに記載の硫酸化フコース含有多糖のことをいい、構成糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１であり、例えば、２：１の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平均分子量は、例えば、ＨＰＬＣゲルろ過法で約１３万（分子量分布は、約１０万〜約２０万）の硫酸化多糖である。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組成、アセチル基含量及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従って、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量はその１例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件により、その分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載のＵ−フコイダン分解酵素及びＦ−フコイダン分解酵素を用いて硫酸化フコガラクタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を示す硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分布、糖組成、アセチル基含量あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタンを調製することができる。例えば、硫酸化フコガラクタンの主要な構成糖は、６糖あたりおよそ５残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸基含量は減少するものである。すなわち、硫酸化フコガラクタンから意図的に脱硫酸することが可能である。また、脱硫酸の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整することができる。また、同様の処理によりエステル結合しているアセチル基も切断することができる。従って、本発明において硫酸化フコガラクタンは、前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のものを包含する。
本発明において硫酸化フコガラクタンの主骨格は、下記一般式（Ｖ）に表される。下記一般式において、ｎは、１以上の整数であり、例えば、１〜１０００の範囲、さらに好ましくは１〜５００の範囲のものが硫酸化フコガラクタンに含まれる。
本発明において硫酸化フコガラクタンが由来する褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴメ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ）由来のものを調製することができる。特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダンには、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン及びＧ−フコイダンが含まれている。
本発明において硫酸化フコガラクタンの塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
本発明において硫酸化フコガラクタン低分子化物とは、硫酸化フコガラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースである。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド
本発明において、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド（本明細書においては、単に硫酸化フコガラクタン分解酵素と記載する場合がある）とは、硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させるポリペプチドをいう。また、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレットには、フコース硫酸含有多糖−Ｆを分解するエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明における硫酸化フコガラクタンを分解しない。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの一例として、本発明において単離精製されたフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２株由来の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドがあげられる。該硫酸化フコガラクタン分解酵素は、硫酸化フコガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエンド的に分解する酵素である。
本発明における硫酸化フコガラクタンを分解する酵素を生産する菌株としては、例えば、国際公開公報第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２［国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日］として寄託）があげられる。
本発明の硫酸化フコガラクタン活性を有するポリペプチドの一例としては、フラボバクテリウム属細菌由来の下記硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドがあげられる。
（Ｉ）作用▲１▼：構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１である硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約７〜９付近にある。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５℃付近にある。
本発明において硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドとは、天然型の硫酸化フコガラクタン分解酵素のみならず、硫酸化フコガラクタン分解活性を有する限り天然型のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。また、ここで言う天然型硫酸化フコガラクタン分解酵素としては、例えばフラボバクテリウム属細菌由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、その他の細菌類はもちろん、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物等の生物体由来のものも、本発明のアミノ酸配列、塩基配列と相同性を有していれば含まれる。
本発明のポリペプチドは、硫酸化フコガラクタン分解活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、該配列に１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示される機能的に同等の活性を有するポリペプチドを包含する。
本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多型や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）〕など、アミノ酸置換によって目的とする活性を示す場合がある。
また、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、相同性を有することが多い。したがって、本発明のポリペプチドと相同性を有し、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドも本発明に含まれる。
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
また、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列表の配列番号２８、３０）に３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５９％以上の相同性を有するアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドは、硫酸化フコガラクタン分解活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれている硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させることができるので、分子量分画と組み合わせることによって硫酸化フコガラクタンを選択的に除去することが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様々な生物活性があることが報告されている。これまで、褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得ることができる。
さらに例えば、硫酸化フコグルクロノマンナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があることが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た硫酸化フコグルクロノマンナンに夾雑する硫酸化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得ることができる。
硫酸化フコガラクタンを除去する方法としては、たとえば、硫酸化フコガラクタン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、及び使用する酵素力価を考慮して選定すればよい。硫酸化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近が好ましい。次に硫酸化フコガラクタン含有物溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応は通常３０℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物が除去された目的物を容易に調製することができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、硫酸化フコガラクタンに作用するため、硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることができる。
さらに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を用いれば、硫酸化フコガラクタンを含有する硫酸化フコース含有多糖から硫酸化フコガラクタン成分を選択的に除去することができる。例えば、硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
（２）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子と厳密な条件においてハイブリダイズすることができ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
上記塩基配列の相同性は、コンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０）、ＢＬＡＳＴ（バージョン２．０）によって測定することができる。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であり、具体的には、配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする核酸（１）、配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸（２）、および上記核酸（１）または（２）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるか、（１）または（２）の塩基配列に５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは６９％以上の相同性を有する塩基配列で、かつ硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする核酸（３）等である。
本発明における核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。上記核酸（２）がＲＮＡである場合は、例えば配列表の配列番号２７記載の塩基配列においてＴをＵで置換した塩基配列で示される。
本発明の核酸は、例えば、次のようにして得ることができる。
まず、配列表の配列番号２７，２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸（２）は、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを生産する微生物、植物、動物などより常法にしたがってゲノムＤＮＡを調製し、それを用いて作製したＤＮＡライブラリーから単離することができる。またこのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を含む核酸を増幅することによっても取得できる。
また、本発明により提供される、本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列、例えば配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに記載の塩基配列を基に、本発明のポリペプチドと同様の硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸を取得することも可能である。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブに用いることにより、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、細胞から抽出したＤＮＡ、該ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物等からスクリーニングすることができる。あるいは上記の塩基配列から設計されたプライマーを使用したＰＣＲ等の遺伝子増幅法を用いることにより、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅することができる。また、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に合成することも可能である。かかる方法により、上記核酸（１）または（３）を得ることができる。
上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、それが目的の核酸の一部であることを確かめた上、該核酸断片、あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の核酸全体を取得することができる。
上記のプローブやプライマーは、その塩基配列が明らかとなっている場合においては、ＯｌｉｇｏＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）などのコンピュータープログラムを用いることにより、使用する目的、条件、環境に応じて最適な配列を設計することができる。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、１９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）等に記載された条件でハイブリダイズ可能なことを意味し、例えば、以下の条件でハイブリダイズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子核酸を含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たな核酸について、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件などをいう。
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）
また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
本発明においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなくとも、それが硫酸化フコガラクタン分解活性を示すポリペプチドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりである。
目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できれば、このベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシ法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）〕により決定することができる。決定された塩基配列を硫酸化フコガラクタン分解酵素のＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって、得られたＤＮＡ断片中の遺伝子の構造及び該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を知ることができる。
また、上記の硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列をもとに得られたオリゴヌクレオチドを用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得る方法として、ＰＣＲ法を用いることができる。中でもカセットＤＮＡ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法は、短時間で少ないアミノ酸配列情報からハイブリダイゼーション法に使用可能な目的遺伝子の断片を得る方法である。
例えば、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の培養菌体から常法にしたがって抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結する。この混合物を鋳型として、上記の部分アミノ酸配列の情報をもとにデザインした該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）とを用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。カセットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例えば宝酒造社製のものを利用することができる。カセットＤＮＡは、２種類のカセットプライマーに対応する配列を含んでいるものが好ましく、まず連結した制限酵素サイトから遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の一部を鋳型としてさらに内側のプライマーを用いて２回目のＰＣＲ反応を行うと効果的である。さらに、該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーについても、並んで２種類をデザイン、合成し、上流のプライマーを１回目のＰＣＲ反応に用い、２回目のＰＣＲ反応では下流のプライマーを用いると該遺伝子の特異性が高くなり、目的ＤＮＡ断片の特異的な増幅の可能性が高くなる。
しかしながら、目的の遺伝子の塩基配列は不明であるため、カセットＤＮＡの連結に用いた制限酵素サイトが部分アミノ酸配列をコードする領域からＰＣＲによる増幅反応に適当な位置にあるとは限らない。そのため、多くの種類の制限酵素サイトのカセットＤＮＡを用いてみる必要がある。また、ＰＣＲは、例えばＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．Ａ．）編集、ストックトンプレス社、１９８９年発行〕に記載されているような、一般に用いられている条件で行うことができるが、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さや硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、アニーリング温度、サイクル数、マグネシウム濃度、耐熱性ポリメラーゼ濃度等を検討し、非特異的な増幅バンドが最も少なくなるような最適条件を選ぶ必要がある。
ＰＣＲ反応液は、アガロースゲルなどの電気泳動に供し、増幅したＤＮＡ断片を確認する。これら断片は、常法に従って抽出、精製し、通常に用いられるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのクローニングベクターに挿入後、例えばジデオキシ法により塩基配列を解析することができる。あるいは回収した増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応に用いたカセットプライマーを用いて直接塩基配列を解析してもよい。その結果、プライマーの配列以外に、先に決定した硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列をコードしているものが得られれば、該酵素をコードする遺伝子あるいはそれにホモロジーを示す遺伝子の断片が得られたことになる。
このようにしてサザンハイブリダイゼーション法あるいは、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子の一部であった場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによるゲノムライブラリーのスクリーニングを行なうか、あるいは該ＤＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行なうことにより、目的の酵素をコードする遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。さらに上述のように得られた硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子あるいは、その一部をプローブとしてフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション法によって解析すれば、検出されたバンドの位置から、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡ制限酵素断片サイズの情報が得られ、また、検出されたバンドの数によって、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびそれに相補性を示す遺伝子の数が予想され、これら遺伝子を含むＤＮＡ断片は、前述と同様の方法により単離することができる。
このようにして得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子を含むかどうかは、最終的に単離された該ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、該ベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いでこの形質転換体の培養を行い、発現されたポリペプチドの硫酸化フコガラクタン分解活性を測定することにより確認することができる。
（３）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有した形質転換体。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列表の配列番号２７、２９記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製することができる。該組換えＤＮＡの作製に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。
さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を作製することができる。形質転換体の作製に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリペプチドを産生させることにより、本発明のポリペプチドを大量に製造することが可能となる。
本発明の核酸、例えば配列番号２７、２９に示される塩基配列を有する核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。配列番号２７に示される塩基配列からは配列番号２８に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号２９に示される塩基配列からは配列番号３０に示されるアミノ酸配列のポリペプチドがそれぞれ生成する。
以下、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２を例として本発明を具体的に説明する。
このフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２として国際寄託されている。
フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２が産生する硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を取得するには、例えば、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法、あるいはこれらを組合わせた方法を利用することができる。これらの方法には該遺伝子にハイブリダイズ可能なプローブ、あるいはＰＣＲ法によって該遺伝子またはその一部を増幅可能なプライマーが必要であるが、これらの菌株の産生する硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く知られていないため、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドを作製することができない。そこでまず、上記微生物の産生する硫酸化フコガラクタン分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドの作製を検討する。
まず、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２を培養し、次いでその培養物から、産生された硫酸化フコガラクタン分解酵素をそれぞれ単離、精製する。次に、精製された硫酸化フコガラクタン分解酵素について、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えば硫酸化フコガラクタン分解酵素を直接常法に従ってエドマン分解法によるアミノ酸配列分析（例えばプロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ社製、を用いることができる）に供することにより、硫酸化フコガラクタン分解酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定する。上記フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２から精製した酵素は、ポリペプチドのＮ末端がブロックされており、Ｎ末端アミノ酸配列の情報は得られなかった。この場合、精製硫酸化フコガラクタン分解酵素に、特異性の高いタンパク質加水分解酵素、例えばアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣを用いて分離、精製した後、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行えば、多くのアミノ酸配列情報が得られる。
こうして得られる硫酸化フコガラクタン分解酵素に特異的な部分アミノ酸配列に関する情報を選択し、該情報をもとに塩基配列の縮重したオリゴヌクレオチドをデザインし合成する。このとき縮重の程度が低く長いオリゴヌクレオチド、言換えれば、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に特異性の高いオリゴヌクレオチドを合成することが必要であり、オリゴヌクレオチドのデザインが硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングに重要な要因となる。
次にサザンハイブリダイゼーション法によって合成オリゴヌクレオチドと硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との特異的ハイブリダイゼーションの条件を検討する必要がある。
例えば、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、常法に従いナイロン膜等にブロッティングする。ハイブリダイゼーションは、まず、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇの塩化ナトリウム及び４．４１ｇのクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃で数時間保温してナイロン膜をブロッキングした後、例えば３２Ｐ等でラベルした合成オリゴヌクレオチドを加えて４２℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで４２℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このとき、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さや硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、保温温度や洗浄溶液の塩濃度等を検討し最適条件を選ぶのが効果的である。
このようにして検出された硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る方法としては、直接検出されたバンドの位置に相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、サザンハイブリダイゼーション法と同様の条件でコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行って、目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離すればよい。あるいは直接フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、同様にハイブリダイゼーション法で目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離してもよい。
上記のようにして得られた核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製することができる。該組換えＤＮＡの作製に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して本発明の形質転換体を作製することができる。形質転換体の作製に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。
（４）本発明のポリペプチドの製造方法
用いられる宿主−ベクター系としては公知のものが使用でき、例えば大腸菌を宿主としたｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクター、あるいはラムダファージなどのファージベクター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。これら宿主−ベクター系の種類や取扱い方法は一般に用いられる種類や方法を用いれば良く、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）〔Ｊ．サムブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー １９８９年発行〕に記載されている。
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
さらに、目的のタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端の数十アミノ酸を欠失させたタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込ませることにより、目的のタンパク質を発現させることができる。
また、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来の単離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
一般に遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。また、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列あるいはプレ・プロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、あるいは活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を発現するポリペプチドである。このような、シグナルペプチド、プロ配列、プレプロ配列は、活性をもつペプチドとしての発現を阻害する場合もある。このような場合には、ポリペプチドのＮ末端を数アミノ酸残基から数十アミノ酸残基削ることにより、活性をもつペプチドの収量を向上させることもできる。
さらに、本発明のプラスミドｐＥＡ１０１、ｐＥＢ１０１のいずれか１つを導入した形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のポリペプチドを精製してもよい。
形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドは、ｌａｃプロモーターやＴ７ファージプロモーターの下流に本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌を通常の培養条件、例えば、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で対数増殖期まで培養後、１ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３７℃で培養することにより、培養菌体中にポリペプチドを発現させることができる。また、ペプチドのＮ末端を削ったポリペプチドを発現させることもでき、例えば本発明のペプチドｓｆｇＡの場合は、全長のアミノ酸配列のＮ末端から２３アミノ酸残基を削ることにより、またｓｆｇＢの場合は３０アミノ酸残基を削ることにより、それらの発現量を向上させることもできる。
培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を超音波で破砕し、さらに遠心分離して上清を集め、無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液は硫酸化フコガラクタン分解活性を示す。さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを精製することができる。上記の精製過程において得られる部分精製品も、当然ながら硫酸化フコガラクタン分解活性を示す。
（５）硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のスクリーニング方法
本発明の遺伝子の塩基配列を用いて、硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば以下の方法が適用できる。
まず目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を例えば３２Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号２８、３０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む配列、又はその一部をコードする塩基配列であればよく、例えば、配列表の配列番号２７、２９のいずれかで表される塩基配列、又はその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流した後、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のポリペプチドをコードする遺伝子が挿入されている。
得られた遺伝子は、例えば次のように塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的の硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかを確認する。塩基配列の決定は、形質転換体がプラスミドで形質転換された大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージベクターが用いられた場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を決定することができる。これらの培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第二版〔Ｊ．サムブルークほか著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー １９８９年発行〕等に記載されている。
得られた遺伝子が目的の硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列あるいはそのコードしているアミノ酸配列を本発明の配列表の配列番号２７、２９のいずれかで表される塩基配列あるいは配列表の配列番号２８、３０のいずれかで表されるアミノ酸配列と比較する。
得られた遺伝子が硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする領域のすべてを含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の遺伝子にハイブリダイズする硫酸化フコガラクタン分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドの全コード領域の塩基配列を決定することができる。
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
次に得られた遺伝子を発現させ、硫酸化フコガラクタン分解活性を測定し、得られた遺伝子の機能を確定する。
このように本発明により、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの一次構造及び遺伝子構造が提供される。また、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造が可能となる。
本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドを得ることが可能となる。
硫酸化フコガラクタン分解酵素を産生するフラボバクテリウム属細菌を培養して硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する方法は、同時にプロテアーゼや他の多糖分解酵素が生産されるため、目的の硫酸化フコガラクタン分解酵素を単離するためには、極めて厄介なこれら酵素との分離精製が必要であったが、本発明により安価に、高純度な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの提供が可能となった。
本発明の塩基配列がコードするポリペプチドの硫酸化フコガラクタン分解活性の確認は、例えば、該ポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させて得られる分解物をＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定することによって、あるいは生成する還元末端を常法により測定することによって行なうことができる。
（６）硫酸化フコガラクタン低分子化物の製造方法、該製造方法における脱アセチル化の影響
本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物に作用させることによって調製することができる。硫酸化フコガラクタン含有物としては、例えば硫酸化フコガラクタンの部分精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
本発明の遺伝子がコードする硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを、硫酸化フコガラクタンに作用させて得られる低分子化物は、特に限定はないが、例えば２糖類〜６糖類が挙げられる。低分子化物中に存在する硫酸基の置換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたものであれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物の化学構造は、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に示される。その中で、下記一般式（ＩＩＩ）は、前述の硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
また、本発明の低分子化物は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ（ダウケミカル社製）等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の硫酸化フコガラクタンの低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。
本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、この細胞を培養することによって調製することができる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩の精製に使用することができる。さらに、本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウイルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用である。
また、硫酸化フコガラクタン又はその塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学用試薬として用いることができる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、該低分子化物のＰＡ化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。
本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の製造方法において、硫酸化フコガラクタンを脱アセチル化することにより、低分子化物の収量を向上させることができる。脱アセチル化する方法は特に限定はされないがアルカリ性の水溶液で処理する方法やデアセチラーゼで処理する方法などがあり、例えば硫酸化フコガラクタンを１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で、２５℃、２４時間の処理条件で脱アセチル化することにより、低分子化物の収量を上げることができる。すなわち、本発明の低分子化物の製造方法においては、硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタンのいずれもが原料として好適に使用できる。
実施例
本発明を実施例により具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１ 硫酸化フコガラクタンの調製
乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び国際公開第ＷＯ９７／２６８９６号パンフレット記載のアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１００９株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成８年２月１３日よりＦＥＲＭ Ｐ−１５４３６として寄託され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７［国際寄託への移管請求日：平成８年１１月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から得られたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁した。２５℃で２日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖による強い粘弾性が完全に消失したので、低分子化した硫酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１０％ エタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％ エタノールを含む１００ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎ 塩酸でｐＨ２．０とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎ 水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍ 塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭ 塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２［国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から得られたエンド型フコイダン分解酵素を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭ 塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）にかけ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭ 塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭ 塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過器により濃縮後、１０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。この画分について、糖組成分析を行った。まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従い、フコース量を定量した。
次に、得られた硫酸化フコガラクタンの乾燥標品を１Ｎ 塩酸に０．５％ 濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグ リージェント キット（宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置；Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム；パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；宝酒造社製）
溶離液；７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１
検出；蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速；０．３ｍｌ／分
カラム温度；６５℃
次に、アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。さらに、バイオケミカル ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
以上の結果、得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
参考例２ 硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性測定方法
参考例１で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を以下のように測定した。すなわち、６０μｌの５０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、４．８μｌの２．５％ 硫酸化フコガラクタン画分溶液と、６μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、３７．２μｌの水と１２μｌの硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、硫酸化フコガラクタン分解酵素の代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化フコガラクタン画分のガラクトシル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクトシル結合の量は下記式により求めた。
｛（４．８×１０００×２．５／１００）／ＭＧ｝×｛（ＭＧ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１２）｝＝Ｕ／ｍｌ
４．８×１０００×２．５／１００：反応系中に添加した硫酸化フコガラクタン（μｇ）
ＭＧ：基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化フコガラクタンが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１２：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
参考例３ 硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製
参考例２記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素は以下の方法により調製された。フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）をグルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
得られた菌体を、１２００ｍｌの０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
得られた活性画分を０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍｌ ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ〜０．４Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、４Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２０ｍｌ Ｐｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍ〜１Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍｌ Ｐｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させた。得られた活性画分をまとめて、精製酵素を得た。
実施例１ 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子のクローニング
（１） ゲノムＤＮＡの調製
硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産菌株であるフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を、１２０℃、２０分の条件で滅菌したグルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地５００ｍｌが入った２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２３時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、その半量の菌体を１０ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））中に懸濁後、１ｍｌの抽出緩衝液に溶解した２０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム（シグマ社製）溶液を添加し、氷浴上で３０分間保持した。次いで、１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液（１ｍｇ／ｍｌ プロイテナーゼＫ（宝酒造社製）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を添加した後、５０℃で２時間保温した。この後室温に戻し、等量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）飽和フェノールを加えて１時間穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。この上層に、等量のＴＥ緩衝液飽和フェノール／クロロホルム１：１を加えて穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。再度フェノール／クロロホルム抽出をおこなった後、水層に０．１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えさらに２倍量のエタノールを加えてＤＮＡを析出させガラス棒で巻き取った後、８０％ エタノールでリンスして軽く風乾した。このゲノムＤＮＡを２０ｍｌの２０μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）が溶解したＴＥ緩衝液中に溶解させ、３７℃で５時間保温してＲＮＡを分解した。フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出の後、前記と同様にしてエタノール添加後ＤＮＡを回収し、５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約２０ｍｇを得た。
（２） ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ １００μｇを１０Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）により３７℃で１分４０秒間消化して部分分解させ、フェノール／クロロホルム抽出し上層を回収した。上層に１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）および２．５倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収した後、８０％エタノールでリンスして風乾した。得られた部分分解物を、１．２５−５Ｍ塩化ナトリウム密度勾配超遠心法によりサイズ分画をおこない、１０−２０ｋｂｐのサイズを含む画分からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたゲノムＤＮＡ部分分解物０．２μｇとラムダブルースターＢａｍＨＩアーム（ノバジェン社製）０．６μｇと混ぜ、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、ギガパックＩＩゴールドキット（ストラタジーン社製）を用いてラムダファージにパッケージングを行い、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
（３） 硫酸化フコガラクタン分解酵素のアミノ酸配列の決定
参考例３のようにして得られたフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパク質 ８４μｇを、水で平衡化した脱塩用のカラム（ファーストデソルティングカラムＰＣ３．２／１０、ファルマシア社製）にアプライ後、水で溶出し、緩衝液を置換した。溶出液をガラスバイアルに集め濃縮乾固後、ピリジン２００μｌ、４−ビニルピリジン４０μｌ、トリ−Ｎ−ブチルフォスフィン４０μｌ、水２００μｌの入った一回り大きなガラス試験管の中にガラスバイアルごと試料を入れ、ガラス試験管を封かんした後、１００℃で７分間反応させてピリジルエチル化した。反応終了後ガラスバイアルを取り出し、数回水と共沸させて揮発性成分を除いた。
得られたピリジルエチル化された硫酸化フコガラクタン分解酵素タンパク質を、３０μｌの８Ｍ 尿素を含む１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）、３０μｌの１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）及び４０ｐｍｏｌのアクロモバクタープロテアーゼＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で一晩消化し、得られた消化物からペプチド断片をＨＰＬＣシステム（スマートシステム、ファルマシア社製）にて精製した。カラムは、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０（ファルマシア社製）を用い、１００μｌ／ｍｉｎの流速で行った。溶出は、溶出液として０．１％ トリフルオロ酢酸水溶液（溶出液Ａ）および０．１％ トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（溶出液Ｂ）を用い、溶出液Ｂの割合を０％でサンプルをアプライし、１００分間で溶出液Ｂの割合を４０％にまであげる直線濃度勾配法にて溶出し、得られた溶出画分から各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列表の配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ１６２（配列番号６）、およびＳ２９２（配列番号７）を決定した。
（４） 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の塩基配列決定
実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ １．２μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、 ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ（いずれも宝酒造社製）各３０Ｕで各々３７℃で５時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出した。消化物をエタノール沈殿により回収した。この各消化物 約０．６μｇを、ＢｇｌＩＩ消化物にはＳａｕ３ＡＩカセット、ＥｃｏＲＩ消化物にはＥｃｏＲＩカセット、ＥｃｏＴ２２ＩおよびＰｓｔＩ消化物にはＰｓｔＩカセット、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物にはＨｉｎｄＩＩＩカセット、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ消化物にはＸｂａＩカセット（各カセットＤＮＡはいずれも宝酒造社製）各５０ｎｇと混合後、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた。ＥｃｏＴ１４ＩおよびＮｃｏＩ消化物は配列表の配列番号８、９記載の２本の合成オリゴヌクレオチドから作製したＮｃｏＩカセットと連結させた。反応物をエタノール沈殿により回収して５μｌの水に溶解し、カセットＤＮＡを用いたＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。
一方、実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｓ３９（配列表の配列番号３）の１〜７のアミノ酸配列からＳＦＧ−３９１Ｆプライマー（配列番号１０）、８〜１５のアミノ酸配列からＳＦＧ−３９２Ｆプライマー（配列番号１１）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と同じ向きに合成した。また、Ｓ４２（配列番号４）の１〜８のアミノ酸配列からＳＦＧ−４２１Ｆプライマー（配列番号１２）、６〜１４のアミノ酸配列からＳＦＧ−４２２Ｆプライマー（配列番号１３）とＳＦＧ−４２３Ｆプライマー（配列番号１４）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と同じ向きに合成した。
８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、カセットプライマーＣ１（宝酒造社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドＳＦＧ−３９１Ｆ（配列番号１０）またはＳＦＧ−４２１Ｆ（配列番号１２）１００ｐｍｏｌ、および滅菌水を加えて５０μｌとし、Ａｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ１００（宝酒造社製）を添加した後７０℃で３分間加熱後室温で１０分間放置した。ここに１０μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液（宝酒造社製）、先に調製した鋳型ＤＮＡ各１μｌ、２ユニットのタカラＥｘタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、宝酒造社製）、および滅菌水を加えて１００μｌとした。この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ 、宝酒造社製）による増幅反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で０．５分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応を１サイクルとし、３０サイクル行った。
次に、１回目のＰＣＲ反応液の一部を鋳型ＤＮＡとして２回目のＰＣＲ反応を行った。すなわち、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、カセットプライマーＣ２（宝酒造社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドＳＦＧ−３９２Ｆ（配列番号１１）またはＳＦＧ−４２２Ｆ（配列番号１３）またはＳＦＧ−４２３Ｆ（配列番号１４）１００ｐｍｏｌ、および滅菌水を加えて５０μｌとし、Ａｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ１００を添加した後７０℃で３分間加熱後室温で１０分間放置した。ここに１０μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液（宝酒造社製）、１μｌの１回目のＰＣＲ反応液、２ＵのタカラＥｘタック ＤＮＡポリメラーゼ、および滅菌水を加えて１００μｌとした。この混合液を９４℃で０．５分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応を１サイクルとして２５サイクル行った。また同時に、それぞれの反応液に対してカセットプライマーＣ２のみあるいは混合オリゴヌクレオチドのみの反応液についてもＰＣＲ反応を行い、各プライマーの非特異的増幅産物のコントロールとした。
アガロースゲル電気泳動で反応液を分析し、非特異的増幅産物のコントロールと比較したところ、多くの反応液で特異的な増幅バンドが検出された。これらの中から比較的バックグランドが低く、強く増幅されていたＳｐｅＩ消化物−ＸｂａＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−３９２Ｆプライマーによる約０．８ｋｂのバンド、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物−ＨｉｎｄＩＩＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−４２３Ｆプライマーによる約１．４ｋｂのバンド、ＥｃｏＲＩ消化物−ＥｃｏＲＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−４２３Ｆプライマーによる約１．１ｋｂのバンドを抽出、精製した。これらのＤＮＡ断片とｐＴ７ブルーＴ−ベクター（ｐＴ７ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ノバジェン社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．００４％のＸ−Ｇａｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、目的のサイズのバンドが挿入されたプラスミドを選択し、各々Ｓ３９２１、Ｈ４２３１、Ｒ４２３１と命名した。これらの挿入配列をジデオキシ法により塩基配列分析を行った。Ｓ３９２１とＲ４２３１は各々２回目のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列に続いて部分アミノ酸配列をコードする領域が見出された。また、Ｓ３９２１とＲ４２３１は挿入断片の塩基配列が一部重なっており、両塩基配列をつなげると約１．６ｋｂｐになった。この中には部分アミノ酸配列Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ１６２（配列番号６）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ２９２（配列番号７）、Ｓ３９（配列番号３）をコードする領域を含む読み取り枠の一部が含まれており、硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の一部であることが明らかとなった。
また、実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｓ２３（配列番号２）の６〜１３のアミノ酸配列からＳＦＧ−２３１Ｒプライマー（配列番号１５）、ＳＦＧ−２３２Ｒプライマー（配列番号１６）、３〜９のアミノ酸配列からＳＦＧ−２３９Ｒプライマー（配列番号１７）、ＳＦＧ−２３０Ｒプライマー（配列番号１８）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と逆向きに合成し、上記と同様の方法でカセットライブラリーからのスクリーニングを試みた。アガロースゲル電気泳動で反応液を分析し、非特異的増幅産物のコントロールと比較したところ、多くの反応液で特異的な増幅バンドが検出された。これらの中から比較的バックグランドが低く、強く増幅されていたＥｃｏＴ１４Ｉ消化物−ＮｃｏＩカセットのＣ２−ＳＦＧ−２３９Ｒプライマーによる約１．４ｋｂのバンドを抽出、精製した。このＤＮＡ断片とｐＴ７ブルーＴ−ベクターを連結し、上記と同様に目的のサイズのバンドが挿入されたプラスミドを選択し、Ｔ２３９２と命名した。その挿入配列の塩基配列分析を行ったところ、上記で分析した１．６ｋｂｐの塩基配列と１部重なっており、つなげあわせると約２．８ｋｂｐの塩基配列を決定することができた。この中には１６０２塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠が見出され、この読み取り枠がコードするアミノ酸配列中に実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列と非常に高い相同性を示す領域が見出された。この１６０２ｂｐの読み取り枠をｓｆｇＡと命名した。
ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列中には実施例１−（３）で決定した硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、およびＳ２９２（配列番号７）と一致する配列が、また、部分アミノ酸配列Ｓ４９（配列番号５）およびＳ１６２（配列番号６）と非常に相同性の高い配列が見出された。このようにｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列は、実施例１−（３）の硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列分析により明らかとなった全てのアミノ酸配列と一致あるいは高い相同性を示すことから、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の硫酸化フコガラクタン分解酵素を実質的にコードしていると考えられた。
一方、Ｈ４２３１は２回目のＰＣＲ反応に用いたＳＦＧ−４２３Ｆの配列に続いて部分アミノ酸配列Ｓ４２（配列番号４）の１５番目以降のアミノ酸をコードする領域が見出されたが、１９番目と２０番目のアミノ酸が異なっていた。Ｈ４２３１の挿入断片の全塩基配列を決定したところ、上記２．８ｋｂｐの塩基配列と一部重なっており、ｓｆｇＡの上流にｓｆｇＡと相同性の高い読み取り枠の一部があることがわかった。
（５） ｓｆｇＡホモログの単離
実施例１−（２）で調製したフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーから硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子を含むクローンを、以下のようにプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。まず、ゲノムＤＮＡのファージライブラリーを大腸菌ＥＲ１６４７に感染させ、１０ｃｍ×１４ｃｍのシャーレに入ったＬ培地プレート３枚に、１枚当たり約１３００個のプラークを形成させた。これらのプレートにナイロン膜ハイボンドＮ＋（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を約２分間接触させファージを写し取った。このナイロン膜を０．５Ｍ 水酸化ナトリウム、１．５Ｍ 塩化ナトリウムの溶液中で５分間変性し、次いで、０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ 塩化ナトリウムの溶液中で５分間中和処理し、２×ＳＳＣでリンスした後風乾した。このナイロン膜を８０℃で１時間加熱してＤＮＡを固定した。
一方、実施例１−（４）で得られたＴ２３９２のプラスミドＤＮＡ 約１５μｇをベクター由来のＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、遊離する約１．４ｋｂの硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の一部を含む断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてジゴキシゲニンで標識し、取扱説明書に従い以下のようにプラークハイブリダイゼーションを行った。上記調製したフィルターをハイブリダイゼーション溶液中、６０℃で４時間プレハイブリダイゼーションを行った後、熱変性した標識プローブを約６０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加え、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、まず２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で５分間２回、さらに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃で１５分間２回洗浄した。その後、上記検出キットを用いて検出した結果、２４個のポジティブシグナルが得られた。元のプレートよりポジティブシグナル付近のプラークをかきとり、ＳＭ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１％ゼラチン）に懸濁しファージを回収した。得られたファージ液のいくつかについて、再度新しいプレートにプラークを形成させ、同様の操作を繰り返すことにより５個のポジティブシグナルを与えるファージを単離した。
ノバジェン社のラムダブルースター取り扱い説明書に従って、得られた各ファージを大腸菌ＢＭ２５．８に感染させたのち１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレートに広げ、アンピシリン耐性のコロニーを選択することによりファージをプラスミドの形に変換した。得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法により再度プラスミドＤＮＡを調製した。得られた各クローンのプラスミドをそれぞれｐＢｓｆｇ５、７、１３、１７およびｐＢｓｆｇ１８と命名した。各プラスミドをそれぞれ、適当な制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、各挿入断片の制限酵素地図を作成して解析した。その結果、アガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色でそれぞれ良く似たサイズのバンドが複数検出されることから、各プラスミドにはほぼ同じ位置のゲノムＤＮＡで、約３〜１４ｋｂｐの断片が挿入されていると推定された。
上記で得られたプラスミドのうち、約７ｋｂｐの挿入断片を持つｐＢｓｆｇ１７について、さらに挿入断片の解析を行った。すなわち、ｐＢｓｆｇ１７約１μｇをＫｐｎＩ消化し、遊離する約７ｋｂｐの断片を抽出精製した。このＫｐｎＩ断片をアンピシリン耐性ベクターであるｐＵＣ１１９（宝酒造社製）のＫｐｎＩ消化物と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌ アンピシリン、０．００４％ Ｘ−Ｇａｌ、および１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む液体Ｌ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素消化後アガロースゲル電気泳動を行って解析した。その結果、ｐＢｓｆｇ１７由来の約７ｋｂｐ ＤＮＡがベクターＤＮＡに対してそれぞれ逆向きに挿入されたｐＵＣ１７Ｋ１およびｐＵＣ１７Ｋ３を得た。これらプラスミドについて直接プライマー伸長法によって、あるいは制限酵素消化後サブクローニング等を行ってジデオキシ法によって詳しく塩基配列を解析したところ、ｓｆｇＡおよびｓｆｇＡの上流に１６２６塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠が見出され、この読み取り枠がコードするアミノ酸配列はｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列と非常に高い相同性を示した。この読み取り枠をｓｆｇＢと命名した。
ｓｆｇＢがコードするアミノ酸配列中にも、硫酸化フコガラクタン分解酵素部分アミノ酸配列Ｓ２１（配列番号１）、Ｓ２３（配列番号２）、Ｓ３９（配列番号３）、Ｓ４２（配列番号４）、Ｓ４９（配列番号５）、Ｓ１６２（配列番号６）、およびＳ２９２（配列番号７）と相同性の高い配列が見出された。ｓｆｇＡとｓｆｇＢを比較すると塩基配列およびアミノ酸配列の相同性は各々約６７％および約５９％と高いことからｓｆｇＢも硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードしていると考えられた。以上のようにして、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）およびその遺伝子に非常に高い相同性を示す遺伝子（ｓｆｇＢ）の全塩基配列が決定された。ｓｆｇＡの塩基配列を配列表の配列番号１９に、ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２０に示す。更にｓｆｇＢの塩基配列を配列表の配列番号２１に、ｓｆｇＢがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。
以上、本発明により実質的に硫酸化フコガラクタン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）およびその遺伝子に相同性を示し、硫酸化フコガラクタン分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＢ）が決定された。
（６） ｓｆｇＡ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素
ｓｆｇＡ遺伝子全長を発現ベクターに挿入して、硫酸化フコガラクタン分解酵素を発現させたが、その活性が低かったため、以下のようにＮ末端を削ったポリペプチドの発現を試みた。
まず、実施例１−（５）で得られた、実質的に硫酸化フコガラクタン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｓｆｇＡ）の発現ベクターを以下のように構築した。ｓｆｇＡＬ５プライマー（配列番号２３）は、そのコードするタンパク質のＮ末端より２３番目までのアミノ酸を欠失させ、なおかつＮｄｅＩサイトを導入するように設計した。ｓｆｇＡＲ４プライマー（配列番号２４）は終始コドンの代わりにＸｈｏＩの認識配列をもち、ｓｆｇＡＬ５プライマーと反対鎖にハイブリダイズするよう設計した。これら２種類のプライマーを用いて、フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ反応を以下のように行なった。０．５ｍｌ ＰＣＲ用チューブにプライマーｓｆｇＡＬ５、ｓｆｇＡＲ４を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートの染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、５μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを添加し、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング、７２℃で２分間の合成反応を１サイクルとして２５サイクル行なった。この増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離し、２４番目以降のアミノ酸配列をコードする約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を切り出して抽出精製した。
一方、Ｔ７ ｌａｃプロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩサイトとＸｈｏＩサイトで切断後、先に調製した約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入し、これをｐＥＡ１０１と命名した。つまりこのハイブリッドベクターにより発現されるタンパク質はｓｆｇＡによってコードされる２４番目以降のアミノ酸からなるポリペプチドの両末端にベクター由来の２２アミノ酸が付加したものである。なおＮ末端には１０個の連続したヒスチジンからなる配列（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）を持つ。こうして得られたｐＥＡ１０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１を３０ｍｌの液体Ｌ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を新たに３リットルのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に植菌し、３７℃、回転数２００ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで対数増殖期まで培養した。この培養には５ｌ容ミニジャー（エイブル社製）を用いた。濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．４の段階で終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに２５℃、回転数１２０ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで一晩培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して約２１ｇの菌体を集め、そのうち約７．０ｇを以下の精製に使用した。なお、この際にはＮ末領域のＨｉｓ・Ｔａｇを利用し、Ｈｉｓ・Ｔａｇ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン社製）を利用して行なった。４０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール）で菌体を懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、得られた上清を、Ｎｉを付加しその後Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで平衡化した１０ｍｌのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎにアプライした。そのカラムを５０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、さらに３０ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した。その後５０ｍｌのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ イミダゾール）で目的のタンパク質を回収した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、精製された形で目的タンパク質が検出され、硫酸化フコガラクタン分解活性を参考例２に記載した方法で測定した結果、５８０ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、ｓｆｇＡがコードするポリペプチドは硫酸化フコガラクタン分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１の培養液１ｍｌ中に、約５８ｍＵの硫酸化フコガラクタン分解活性を有するｓｆｇＡがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かった。このＮ末端を削ったｓｆｇＡがコードするポリペプチドの塩基配列を配列表の配列番号２７に、このポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２８に示す。なお、このｐＥＡ１０１プラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３８０として、平成１３年６月２０日より寄託されており、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９［国際寄託への移管請求日：平成１４年８月１３日］として寄託されている。
（７） ｓｆｇＢ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素
ｓｆｇＢ遺伝子全長を発現ベクターに挿入して、硫酸化フコガラクタン分解酵素を発現させたが、その活性が見られなかったため、以下のようにＮ末端を削ったポリペプチドの発現を試みた。
実施例１−（５）で得られた硫酸化フコガラクタン分解活性を有すると思われる新規ポリペプチドをコードする遺伝子（ｓｆｇＢ）の発現ベクターを構築した。ｓｆｇＢＬ７プライマー（配列番号２５）は、そのコードするタンパク質のＮ末端より３０番目までのアミノ酸を欠失させ、なおかつＮｄｅＩサイトを導入するように設計した。ｓｆｇＢＲ３プライマー（配列番号２６）は終始コドンの代わりにＸｈｏＩの認識配列をもち、ｓｆｇＢＬ７プライマーと反対鎖にハイブリダイズするよう設計した。これら２種類のプライマーを用いて、実施例１−（６）と同様の条件でフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ反応を行なった。この増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離し、３１番目以降のアミノ酸配列をコードする約１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を切り出して抽出精製した。この断片を同酵素で切断したｐＥＴ１６ｂに挿入し、これをｐＥＢ１０１と命名した。つまりこのハイブリッドベクターにより発現されるタンパク質はｓｆｇＢによってコードされる３１番目以降のアミノ酸からなるポリペプチドの両末端にベクター由来の２２アミノ酸が付加したものである。なおＮ末端には１０個の連続したヒスチジンからなる配列（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）を持つ。
こうして得られたｐＥＢ１０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１を３０ｍｌの液体Ｌ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を新たに３リットルのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に植菌し、３７℃、回転数２００ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで対数増殖期まで培養した。この培養には５リットル容ミニジャー（エイブル社製）を用いた。濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．４の段階で終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに２５℃、回転数１２０ｒｐｍ、通気１．０リットル／ｍｉｎで一晩培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して約２３ｇの菌体を集め、そのうち約７．７ｇを以下の精製に使用した。なお、この際にはＮ末領域のＨｉｓ・Ｔａｇを利用しＨｉｓ・Ｔａｇ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン社製）を利用して行なった。５０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール）で菌体を懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、得られた上清を、Ｎｉを付加しその後Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで平衡化した２０ｍｌのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎにアプライした。そのカラムを１００ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、さらに６０ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した。その後５０ｍｌのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ イミダゾール）で目的のタンパク質を回収した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、精製された形で目的タンパク質が検出され、硫酸化フコガラクタン分解活性を参考例２に記載した方法で測定した結果、３．０５ｍＵ／ｍｌであることがわかった。すなわち、ｓｆｇＢがコードするポリペプチドは硫酸化フコガラクタン分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１の培養液１ｍｌ中に約０．３ｍＵの硫酸化フコガラクタン分解活性を有するｓｆｇＢがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かった。このＮ末端を削ったｓｆｇＢがコードするポリペプチドの塩基配列を配列表の配列番号２９に、このポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号３０に示す。なお、このｐＥＢ１０１プラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３８１として、平成１３年６月２０日より寄託されており、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０［国際寄託への移管請求日：平成１４年８月１３日］として寄託されている。
実施例２ 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子の相同性検索
実施例１において得られた硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と塩基配列について、ホモロジー検索を行なった。検索プログラムは、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって算出した。
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴで遺伝子データベースをｓｆｇＡ、ｓｆｇＢに関して検索した。その結果、ｓｆｇＡがコードするアミノ酸配列に対して最も相同性の高かったものは全長の配列に対して８％、塩基配列で最も相同性の高かったものは全長の配列に対して１％の相同性であった。また、ｓｆｇＢがコードするアミノ酸に対しては、同様に７％、塩基配列は１％であった。
さらに、検索プログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）のＭａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇを用いて、国際公開第９９／１１７９７号パンフレット記載のフラボバクテリウム由来エンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｆｄｌＡ、ｆｄｌＢとの相同性を算出した。その結果、ｓｆｇＡはｆｄｌＡ、ｆｄｌＢに対してそれぞれ塩基配列で５４％、５２％、それらがコードするアミノ酸配列で３４％、３０％の相同性を有していた。同様にｓｆｇＢはｆｄｌＡ、ｆｄｌＢに対してそれぞれ塩基配列で５３％、５２％、それらがコードするアミノ酸配列で３３％、３０％の相同性を有していた。
また、ｓｆｇＡとｓｆｇＢの相同性は、塩基配列で６９％、コードするアミノ酸配列で５９．４％であった。
実施例３ 硫酸化フコガラクタンの脱アセチル化の影響
参考例１に記載の硫酸化フコガラクタン画分２００ｍｇを２０ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し２５℃で２４時間放置した。本操作によりＯ−アセチル基を選択的に加水分解することができる。得られた脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを１０％エタノール中で充分透析し、高分子画分を凍結乾燥して、１３７ｍｇの脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを得た。
実施例１−（６）で得られたｓｆｇＡ遺伝子由来硫酸化フコガラクタン分解酵素を、硫酸化フコガラクタン及び脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに作用させその低分子化の程度をＨＰＬＣにより確認した。
すなわち、１２０μｌの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２４μｌの２．５％硫酸化フコガラクタンあるいは脱アセチル化硫酸化フコガラクタン、及び１２μｌの４Ｍ 塩化ナトリウム、８２．９μｌの水を混合後、１．１μｌの８８５ｍＵ／ｍｌの硫酸化フコガラクタン分解酵素を混合し、３０℃で２４時間反応した。反応液を参考例２記載の方法によりＨＰＬＣで分析し、基質の低分子化の程度を比較した。その結果、硫酸化フコガラクタンを基質として用いた場合は分解後の平均分子量が約１６０，０００、脱アセチル化硫酸化フコガラクタンを基質に用いた場合は分解後の分子量が約１０，０００以下であった。本酵素を用いて硫酸化フコガラクタンオリゴ糖を得る場合、硫酸化フコガラクタンを脱アセチル化することにより、分子量の小さいオリゴ糖を得られることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、糖鎖工学用試薬、硫酸化フコース含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用な硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドが提供される。
Claims (13)
- 下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；および
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。 - 下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基が欠失、付加、挿入または置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；および
（ｆ）配列表の配列番号２７、２９のいずれか１つに示される塩基配列に少なくとも５０％の相同性を有する塩基配列である核酸。 - ポリペプチドが、硫酸化フコガラクタンに作用して、該硫酸化フコガラクタンを低分子化し、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有することを特徴とする請求項２記載の核酸：
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈである）。 - 請求項２記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ。
- 請求項４記載の組換えＤＮＡが挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター。
- 請求項４記載の組換えＤＮＡまたは該組換えＤＮＡが挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項６記載の形質転換体を培養する工程および該培養物より硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドの製造方法。
- 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られる、硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチド。
- 下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させて採取されることを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｄ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られるポリペプチド。 - 下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタン低分子化物の製造方法：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｄ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られるポリペプチド。 - 脱アセチル処理した脱アセチル化硫酸化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドを作用させることを特徴とする請求項１０に記載の硫酸化フコガラクタンの低分子化物の製造方法。
- 請求項２記載の遺伝子あるいはその一部をプローブとして用いて硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングする工程を包含することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
- 下記の群より選択され、かつ、硫酸化フコガラクタン分解活性を有することを特徴とするポリペプチドを硫酸化フコガラクタンに作用させる工程を包含することを特徴とする、多糖類の構造解析方法：
（ａ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその一部を含むポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２８、３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；および
（ｄ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４９又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＢ１０１ ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５０を培養して得られるポリペプチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001268250 | 2001-09-05 | ||
| JP2001268250 | 2001-09-05 | ||
| PCT/JP2002/009010 WO2003023036A1 (fr) | 2001-09-05 | 2002-09-05 | Gene de l'enzyme de digestion du fucogalactane sulfate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2003023036A1 true JPWO2003023036A1 (ja) | 2004-12-24 |
Family
ID=19094261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003527101A Pending JPWO2003023036A1 (ja) | 2001-09-05 | 2002-09-05 | 硫酸化フコガラクタン分解酵素遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7217552B2 (ja) |
| EP (1) | EP1424396A4 (ja) |
| JP (1) | JPWO2003023036A1 (ja) |
| CN (1) | CN1582338A (ja) |
| WO (1) | WO2003023036A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101627111A (zh) * | 2005-08-31 | 2010-01-13 | 森托科尔公司 | 用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系 |
| KR20210040360A (ko) * | 2018-07-27 | 2021-04-13 | 에이알시 메디컬 디바이시즈 인코포레이션 | 섬유성 유착 치료용 고순도 및/또는 개질 푸칸 조성물 |
| CN111040019B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-06-07 | 上海交通大学 | 一种用于与TfR蛋白特异性结合的配体多肽及其应用 |
| CN112402292B (zh) * | 2020-11-26 | 2022-01-04 | 中国海洋大学 | 一种天然活性成分抗炎修复精华液及其制备方法 |
| CN114107260B (zh) * | 2021-12-21 | 2022-11-11 | 中国海洋大学 | 岩藻聚糖硫酸酯降解酶OUC-FaFcn1及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69637747D1 (de) | 1995-04-28 | 2008-12-24 | Res Inst For Glycotechnology H | Zuckerverbindungen |
| AU720004B2 (en) * | 1996-01-26 | 2000-05-18 | Research Institute For Glycotechnology | Apoptosis inducers |
| CA2300797A1 (en) * | 1997-09-03 | 1999-03-11 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene |
| KR100601330B1 (ko) | 1999-02-23 | 2006-07-14 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 황산화 푸코갈락탄 |
-
2002
- 2002-09-05 US US10/487,097 patent/US7217552B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-05 JP JP2003527101A patent/JPWO2003023036A1/ja active Pending
- 2002-09-05 CN CNA028221087A patent/CN1582338A/zh active Pending
- 2002-09-05 WO PCT/JP2002/009010 patent/WO2003023036A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2002-09-05 EP EP02767888A patent/EP1424396A4/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-03-02 US US11/681,453 patent/US7410786B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003023036A1 (fr) | 2003-03-20 |
| US7217552B2 (en) | 2007-05-15 |
| CN1582338A (zh) | 2005-02-16 |
| EP1424396A1 (en) | 2004-06-02 |
| EP1424396A4 (en) | 2006-08-16 |
| US7410786B2 (en) | 2008-08-12 |
| US20070148752A1 (en) | 2007-06-28 |
| US20050202425A1 (en) | 2005-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009050271A (ja) | 硫酸化グルクロノフカン | |
| US7410786B2 (en) | Sulfated fucogalactan digesting enzyme gene | |
| JP2003199583A (ja) | コンドロイチン合成酵素及びそれをコードするｄｎａ | |
| WO1997020061A1 (en) | Synthesis of hyaluronic acid | |
| US7445921B2 (en) | Transglycosylation method and protein having transglycosylation activity | |
| JP4262601B2 (ja) | 硫酸化フカン | |
| JP5094461B2 (ja) | ヒアルロン酸加水分解酵素をコードする遺伝子 | |
| JP4656620B2 (ja) | スクロースホスホリラーゼの調製法 | |
| EP1010761B1 (en) | Gene of alteromonas | |
| JP2000509605A (ja) | テイコ酸酵素および検定法 | |
| JP4073787B2 (ja) | 硫酸化フコグルクロノマンナン | |
| JP3795925B2 (ja) | ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ | |
| JP3886061B2 (ja) | 新規なβ−ガラクトシダーゼ | |
| JP3837497B2 (ja) | 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法 | |
| Zhang et al. | Marine Bacteria as a Rich Source of Glycosaminoglycan‐degrading Enzymes | |
| JP4122428B2 (ja) | 新規なキシログルカン分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法 | |
| EP1767645B1 (en) | Transglycosylation method and method for producing glycoprotein | |
| JP4280390B2 (ja) | アルギン酸分解酵素 | |
| JP2006311821A (ja) | 新規微生物及び該微生物を利用したネオアガロビオースの製造方法 | |
| JP2005312459A (ja) | 遺伝子 | |
| Bosito et al. | Alkalihalobacillus lehensis M136, a Novel Alkaliphilic, Cyclodextrin Glucanotransferase (CGTase)-producing Isolate from Manleluag Hyperalkaline Spring in Pangasinan, Philippines. | |
| KR101075580B1 (ko) | 슈도알테로모나스 이사첸코니로부터 분리된 신규 엑소키티나아제 | |
| JP4270907B2 (ja) | Ｇｌｃヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4255111B2 (ja) | Ｇａｌヌクレオチドの生産方法 | |
| US20060068461A1 (en) | Transglycosylation method and protein having transglycosylation activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050816 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080805 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081002 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091006 |