JP4122428B2 - 新規なキシログルカン分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なキシログルカン分解酵素、キシログルカン分解活性を有する特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体、および該形質転換体を培養して上記ポリペプチドを製造する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシログルカンは、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ-１，４-グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、キシロースがα-１，６キシロシド結合で高頻度に分岐結合した構造を基本とすることから、キシログルカンと呼称されている。このキシログルカンは、植物の一次細胞壁の構成成分として、またタマリンド豆に代表される熱帯産マメ科植物の種子貯蔵多糖として重要な役割を担っており、その構造や機能が注目されている。特に、植物の一次細胞壁中におけるキシログルカンは、セルロースと密接に関わって存在していると考えられており、セルロースとの相対的な存在形態が、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられている。このようなキシログルカンの役割を解明するために種々の手法が用いられているが、中でもキシログルカンを分解することのできる各種グリコシダーゼは、重要で強力な分析手段を提供する。
【０００３】
上述のようにキシログルカンはグルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とし、かつ主鎖の構造がセルロースと同様なものであることから、これを分解できるグリコシダーゼとして、エンド-１，４-β-D-グルカナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素、α-キシロシダーゼ、β-グルコシダーゼおよびα-フコシダーゼが知られており、キシログルカンの構造や機能の解明に、各種起源のこれら酵素が用いられてきた。
【０００４】
高分子量のキシログルカンを直接分解できるキシログルカン分解酵素は、酵素の分類からはエンド-１，４-β-D-グルカナーゼの一種と見なされており、キシログルカンのみを特異的に分解する酵素と、セルロースや大麦β-グルカンなどキシログルカン以外のβ-グルカンも分解できる酵素が知られている（たとえば特許文献1〜4）
【０００５】
【特許文献１】
特許第2099167号 明細書
【特許文献２】
国際公開第94/14953号 パンフレット
【特許文献３】
国際公開第99/02663号 パンフレット
【特許文献４】
国際公開第02/077242号 パンフレット
【０００６】
これら従来知られているキシログルカン分解酵素は、キシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、側鎖キシロースを認識しないか、または分解される結合からみて非還元末端側のグルコース残基に結合するキシロース側鎖を認識してキシログルカンを分解する酵素に限られていた（たとえば特許文献１あるいは非特許文献１）。
【０００７】
【非特許文献１】
Jean-Paul Vincken, Gerrit Beldman and Alphons G. J. Voragen 、
Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity?、
「カーボハイドレート リサーチ（Carbohydrate Research）」、（オランダ）、 (1997)、298巻、4号、p.243-346
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
キシログルカンの構造を解明するために、キシログルカン分解酵素は重要な役割を果たしてきた。しかしながら、キシログルカンの複雑な構造をさらに解明するための新しい分析手段として、既知酵素とは異なる作用様式をもつ、新しいキシログルカン分解酵素の開発が嘱望されていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、タマリンド豆より調製したキシログルカンから、側鎖キシロースの数の異なる一連のキシログルカンオリゴ糖を調製することに成功し、キシログルカン分解酵素の作用様式を詳細に検討することを可能にした。そこで、自然界よりキシログルカンを炭素源として生育できる微生物のスクリーニングを行い、さらに分離微生物の生産するキシログルカン分解酵素を、側鎖キシロースの数の異なるキシログルカンオリゴ糖を分解基質として精査することにより、これまで知られていない分解様式でキシログルカンを分解する酵素の存在の可能性について鋭意検討した。その結果、酵母菌の一種であり、高純度キシログルカンオリゴ９糖の大量調製に有効な菌株として知られているゲオトリカム属の一菌株（ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株）が 既知酵素とは異なる作用様式でキシログルカンを分解する酵素を生産することを見出し、該酵素のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に示されるとおりのものである。
（１）配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
（２）開始コドンが付加された上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された上記（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
（６）上記（５）に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
（７）上記（６）に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（８）ポリペプチドが、キシログルカン分解活性を有するものである上記（７）に記載のポリペプチドの製造方法。
（９）キシログルカン分解活性が、エンド型であって、かつ、主鎖中にキシロース側鎖を有しないグルコース残基を有するとともに、該グルコース残基の還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基がキシロース側鎖を有する構造を持つキシログルカンにおいて、該キシロース残基を有しないグルコース残基の還元末端側β−１，４−グルコシド結合を切断することによりキシログルカンを分解するものである上記（８）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１１】
なお、本発明においては、「アミノ酸配列を有するポリペプチド」あるいは「塩基配列を有するポリヌクレオチド」というとき、該記載において指摘するアミノ酸配列または塩基配列のみではなく、これら配列をその部分として含有するポリペプチド、ポリヌクレオチドも包含する。
【００１２】
本発明におけるキシログルカン分解酵素は、ゲオトリカム（Geotrichum）属に属する微生物由来のエンド型酵素あって、主鎖中にキシロース側鎖を有しないグルコース残基を有するともに、その還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基がキシロース側鎖を有する構造を有するキシログルカンにおいて、該キシロース残基を有しないグルコース残基の還元末端側のβ−１，４−グルコシド結合を切断する作用を有する。
この酵素は、より具体的には、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株により生産され、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株は、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株、FERM P-16454として産業技術総合研究所、特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１３】
上記ゲオトリカム（Geotrichum ）属に属する微生物より、本発明の酵素を生産するためには、通常、タマリンド種子キシログルカンを炭素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスのような無機または有機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または固体培地を用い、２０〜３０℃で、４〜１０日程度、好気的に培養される。本発明の酵素は、菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の場合は培養後、濾過或いは遠心分離した上澄液を、そして固体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中には、本発明の酵素以外にキシログルカンを分解する種々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要があるが、公知のクロマトグラフィーにより、本発明の酵素以外の共存するグリコシダーゼ活性を除去することができる。
【００１４】
上記のようにして得られた本発明の酵素（精製物）は、以下のような性質を有している。
【００１５】
（１）分子量および等電点；精製された本発明の酵素は、分子量が約８１,０００で、等電点ｐＨは約４.８である。
【００１６】
（２）作用；本発明の酵素は、各種起源のキシログルカンにエンド型の作用様式で作用し、主鎖を構成するβ-グルコシド結合を分解する。このとき、主鎖のキシロース側鎖をもたないグルコース残基の還元末端側β-１，４ーグルコシド結合が分解されるが、該グルコース残基から還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基にキシロース測鎖を有することが必要である。
すなわち、禾本科植物の細胞壁に含まれるキシログルカンのように、キシロース側鎖の出現頻度が低いキシログルカンに作用させると、上記分解作用により、主鎖の非還元末端にグルコース残基がひとつ残ったオリゴ糖を生成する。
【００１７】
また、キシログルカン以外のキシロース側鎖をもたないβ-グルカン類については、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、大麦β-グルカン、ラミナラン、パキマン、カードラン、グルコマンナンのいずれも分解しない。
【００１８】
同様に、重合度２から６の直鎖セロオリゴ糖にも作用しない。したがって本発明の酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解し、セルロースには作用しないキシログルカン分解酵素である。
【００１９】
（３）作用ｐＨおよび最適作用ｐＨ；キシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の作用ｐＨ範囲は、４５℃で１０分間作用させた場合、ｐＨ４〜６であり、最適作用ｐＨは約５．５付近に認められた。
【００２０】
（４）安定ｐＨ範囲；本発明の酵素をクエン酸-リン酸塩緩衝液中で、４５℃，３０分放置してその残存活性からみた安定ｐＨ範囲は約ｐＨ５．５〜６．５であった。
【００２１】
（５）作用温度範囲および最適作用温度；キシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の作用温度範囲は、ｐＨ５．５で１０分間作用させた場合、約５５℃まで作用が認められたが、最適作用温度は５０℃であった。
【００２２】
（６）熱安定性；本発明の酵素を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）のもとで、各温度で１５分間加熱処理した残存活性は５０℃までは殆ど失活せず、５５℃で約１０％、６０℃で約８５％が活性を失った。
【００２３】
（７）阻害剤；各種金属イオンのうちで、１ｍＭ以上の水銀イオンにより、本発明の酵素は強く阻害された。
【００２４】
（８）精製法；本発明の酵素は、培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を濃縮して、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過を行うことで、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分離精製することができた。
【００２５】
（９）活性測定法；本発明の酵素は、キシログルカンを特異的に分解することから、タマリンドガムより調製したキシログルカンの０．５％水溶液０．５ミリリットル（ｐＨ５．５）に対して、適量の酵素を添加して全量を１ミリリットルとし、４５℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をネルソン-ソモギー法により測定し、活性を求めた。この条件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
【００２６】
本発明の新規なキシログルカン分解酵素は、分泌蛋白であり、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、該配列中、残基１−２０はシグナル配列である。本酵素の成熟体蛋白は、この残基１−２０の配列が除かれたものであり、このアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【００２７】
したがって、本発明のポリペプチドとして好適なものは、少なくともこの配列番号１５のアミノ酸配列を有するものであるが、また、このポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、キシログルカン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号１３で示されるような、上記シグナル配列を有する前駆体ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、スプライシングによりキシログルカン分解活性を有するポリペプチドを産生可能なものも挙げることができる。
【００２９】
さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え手段を用いて製造することができる。この場合、例えば、上記配列番号１５に示されるアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン由来のメチオニンが付加したものであってもよく、例えば、配列番号１９に示されるポリペプチドについて、キシログルカン分解活性を有することが確認されている。
【００３０】
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、該酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、例えば以下のようなポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
【００３１】
（１）配列番号１４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドの１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）上記（１）のポリヌクレオチドに開始コドンが付加されているポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に示されるポリヌクレオチドにシグナル配列に対応する塩基配列が付加されたポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおける１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有し、かつスプライシングにより成熟体を発現可能なポリヌクレオチドであって、具体的には配列番号１２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００３２】
さらに、このほか上記（１）〜（３）のポリヌクレオチドに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドがキシログルカン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
なお、ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち0.5％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Denhartz's、0.１％ウシ血清アルブミン（BSA ）、0.１％ポリビニルピロリドン、0.１％フィコール400 〕および100μg/mlサケ精子DNAを含む６×SSC （１×SSCは、0.15 mol/l NaCl 、0.015mol/lクエン酸ナトリウム、pH7.0 ）中で、50℃−65℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００３３】
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述したキシログルカン分解酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の新規なキシログルカン分解酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
【００３４】
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製された本酵素蛋白質を直接エドマン分解法〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第256巻、第7990〜7997頁（1981）〕によりアミノ酸配列分析〔Model 494 cLC Procise、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等〕に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００３５】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、新規なキシログルカン分解酵素遺伝子をクローニングする。一般的に、 PCRを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法を用いることができる。
【００３７】
また、 PCR法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。まず、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。
【００３８】
PCR法は、PCRテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stocktonpress）、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に新規なキシログルカン分解酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の酵素遺伝子の一部を取得することができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)および ３′−ＲＡＣＥ法等を行うことによって、新規なキシログルカン分解酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３９】
本発明においては、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を用い、PCR法を利用して、キシログルカン分解酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。この塩基配列は配列番号１２に示される。
これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１３に記載した。 このアミノ酸配列のうち、Ｎ末端１〜２０のアミノ酸残基はシグナル配列を示し、成熟体のポリペプチドは、２１番目のバリンから始まるアミノ酸配列を有し（配列番号１５）、該成熟体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号１４に示すとおりである。
なお、配列番号１３あるいは１５に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号１２あるいは１４に記載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
また、配列番号１３あるいは１５に記載のアミノ酸配列や配列番号１２あるいは１４に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子ポリヌクレオチドを得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。
【００４１】
さらに、ゲオトリカム・エスピーM128株を用いて全塩基配列が明らかにされた新規なキシログルカン分解酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他のキシログルカン分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーから、配列表１２の新規なキシログルカン分解酵素遺伝子と相同性の高いDNAを選別することができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物から得たゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×SSC 、 0.5％SDS 、５×デンハルツ、100 μg/mlサケ精子DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、65℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、65℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む２×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む0.２×SSC中、45℃で30分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするDNAを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００４３】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からPCR反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてPCR反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００４４】
得られた遺伝子が目的のキシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の新規なキシログルカン分解酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造および相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、キシログルカン分解酵素活性を測定することにより、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
【００４５】
本発明のキシログルカン分解酵素遺伝子を用いて、キシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。まず、目的の酵素遺伝子により発現ベクターを組み換え、該遺伝子を含む組換えベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、新規なキシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドを生産させる。この際、キシログルカン分解活性を有する成熟体ポリペプチドを得るには、該ポリペプチドのＮ末端にメチオニン残基が付いていないため、該成熟体ポリペプチドに対応する塩基配列において開始コドン（atg）を付加し、さらに、必要に応じ終止コドンを付加する(taa/tag/tga）。
【００４６】
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる.動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
このうち、真核細胞を用いる場合においては、例えば、遺伝子として、配列番号１２に示すような、シグナル配列に対応する塩基配列を有する前駆体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いても、スプライシングにより成熟体ポリペプチドが生産される。
【００４７】
発現の確認や発現産物の確認は、新規なキシログルカン分解酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００４８】
形質転換体の培養物から新規なキシログルカン分解活性を有するポリペプチドを精製するには上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
【００４９】
一方、本発明によりキシログルカン分解酵素の一次構造および遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のキシログルカン分解酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、キシログルカン分解酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適pH、安定pH、基質特異性等の性質が少しづつ異なったキシログルカン分解酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら酵素活性を有するポリペプチドを製造することが可能となる。
【００５０】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第79巻、第1408−1412頁（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕dNTP存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Gene）、第64巻、第313 −319頁（1988）〕、 PCRを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第224巻、第347−353頁（1995）〕等を用いることができる。
【００５１】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（gapped duplex ）法、ヌクレイックアシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12巻、第24号、第9441〜9456頁（1984）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第200巻、第81−88頁（1992）、ジーン、第102巻、第67−70頁（1991）〕、dut （dUTPase ）とung （ウラシルDNAグリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル オブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第82巻、第488−492頁（1985）〕、 DNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber ：ODA）法、ジーン、第152巻、第271 −275頁（1995）、特開平7-289262号公報〕、 DNAの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、 DNA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖DNAベクターと２種類のプライマーを用いたPCRによる方法〔ジーン、第103巻、第73−77頁（1991）〕、アンバー変異を利用したPCRによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等を用いることができる。
【００５２】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップドデュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G（宝酒造社製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（宝酒造社製）、ODA法を用いたMutan （登録商標）-Express Km（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （宝酒造社製）等を用いることができる。
【００５３】
このように、本発明により、キシログルカン分解酵素の一次構造および遺伝子構造が提供されたことにより、キシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において％はW/V％で示した。
【００５４】
【実施例】
【実施例１】
タマリンド種子キシログルカン１％とペプトン０．８％と硫酸マグネシウム０．０５％とリン酸一カリウム０．２％と酵母エキス０．０５％とを含む培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌを２００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、常法により殺菌した後、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株（ＦＥＲＭ Ｐ−16454）を接種し、３０℃で６日間通気培養した。その後、遠心分離により除菌し、得られた上澄液について前記活性測定法により活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当り０．１８単位であった。
【００５５】
【実施例２】
前記実施例１と同様な組成の培養液４０００ｍｌを調製し、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を接種して同様に培養し、培養上清を得た。培養液中の全酵素活性は６９５単位であった。培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行い、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過により精製した。精製酵素はＳＤＳ−電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養濾液に対して１１．２％であった。また、精製酵素タンパク質１ｍｇ当たりの活性は、６８単位であった。
【００５６】
【実施例３】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．１単位を、表１に示す各種起源のキシログルカン、セルロース類、各種多糖類をそれぞれ０.５％含む反応液１ミリリットルに加え、ｐＨ５．５，４５℃で１８時間作用させた後、分解作用により生じた直接還元糖をネルソンーソモギー法で、また全糖をフェノールー硫酸法で測定して分解率を求めた。その結果、本酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解し、セルロースやそのほかの多糖類には全く作用しないことが示された。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【実施例４】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．０１単位を、表２に示す各種のセロオリゴ糖およびキシログルカンオリゴ糖を０.５％含む溶液０.１ミリリットルに添加し、ｐＨ５.５、４５℃、１８時間作用させた後、高速液体クロマトグラフィーにより生成オリゴ糖を分析した。加えた基質のピークが完全に消失したものを分解率１００％として分解率を測定した結果、表２に示すように直鎖セロオリゴ糖には全く作用せず、また分解される主鎖の結合からみて、非還元末端側のグルコース残基に存在するキシロース側鎖は酵素の分解作用に影響しないことが、非還元末端側のイソプリメベロース単位を逐次削除したキシログルカンオリゴ１４，１２，１０糖が分解されることで明らかになった。一方、還元末端側ののイソプリメベロース単位を逐次削除した、キシログルカンオリゴ１３，１１糖は本酵素により速やかに分解されるが、さらにイソプリメベロース単位を削除したキシログルカンオリゴ９糖はごくわずかしか分解されず、またオリゴ９糖の分解産物の分析結果から、分解される結合が通常の位置より非還元末端側にひとつずれること明らかになった。このことは、本酵素がキシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、主鎖中のキシロース側鎖をもたないグルコース残基の還元末端側にグルコース残基一つおいて結合する、グルコース残基におけるキシロース測鎖を認識して分解する新規キシログルカン分解酵素であることを示している。
【００５９】
【表２】
【００６０】
【実施例５】
〈ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株由来の新規なキシログルカン分解酵素をコードする遺伝子の単離〉
【００６１】
本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えばSambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2001）に従って行った。
【００６２】
〔部分アミノ酸配列の決定〕
実施例２で得られたキシログルカン分解酵素の精製標品を、アミノ酸配列分析機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕に供し、配列番号１に示す６残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、実施例２で得られたキシログルカン分解酵素の精製標品をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）による分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分のうち二つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号２および３に示す１２残基の内部アミノ酸配列を決定した。
【００６３】
【００６４】
全ＲＮＡの調製 実施例1と同様に培養を行い、常法によりＲＮＡ単離キット（FastRNA Kit-RED、BIO 101社製）を用いて、添付の説明書に従って全ＲＮＡを調整し、ｍＲＮＡ調製キット〔QuickPrep mRNA Purification Kit、アマシャムファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット〔TimeSaver cDNA Synthesis kit、アマシャム ファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いて、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を行った。
【００６５】
ＰＣＲによる増幅 配列番号２および３の内部アミノ酸配列をもとに、配列番号４および５に示すセンス・プライマーと配列番号６および７に示すアンチセンス・プライマーの４種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【００６６】
【００６７】
配列番号４に示すセンス・プライマーと配列番号６に示すアンチセンス・プライマーを用いて、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００６８】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００６９】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、５分） １サイクル
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（４５℃、３０秒）伸長（７２℃、２分）３０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００７０】
PCR反応後の反応溶液を鋳型として、配列番号５に示すセンス・プライマーと配列番号７に示すアンチセンス・プライマーを用いて、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００７１】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、PCR反応後の反応溶液０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００７２】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、５分） １サイクル
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（４５℃、３０秒）伸長（７２℃、２分）３０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００７３】
得られた約６００ｂｐのＤＮＡ断片をpGEM-T Easy〔プロメガ（Promega）社製〕にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。
【００７４】
〔５′末端および３′末端の決定〕
前記ＤＮＡの塩基配列をもとにして、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)用のアンチセンス・プライマーとして配列番号８および配列番号９で示される２種のプライマーを作製し、ｃＤＮＡを鋳型として、５′−ＲＡＣＥ法により５′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。また、同様に、３′−ＲＡＣＥ用のセンス・プライマーとして配列番号１０および配列番号１１で示される２種のプライマーを作製し、３′−ＲＡＣＥ法により３′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。
【００７５】
【００７６】
決定されたキシログルカン分解酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１２に示す。得られたｃＤＮＡは全長２７５５塩基対からなり、２０２〜２０４番目の開始コドン（atg）から２５３０〜２５３２番目の終止コドン（tag）で終了する、配列番号１３に示す７７６アミノ酸からなる蛋白質をコードすると予想されるオープンリーディングフレームを有する。このアミノ酸配列中には、Ｎ末端領域アミノ酸配列（配列番号１）および内部アミノ酸配列（配列番号２および３）が見出された。
翻訳開始部位から、成熟体のＮ末端領域アミノ酸（配列番号１）の直前までの配列（残基１〜２０）は、シグナル配列であり、本発明の酵素が分泌蛋白であることを示唆している。
成熟体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１５に、該成熟体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１４に示す。
【００７７】
【００７８】
【００７９】
本発明はキシログルカン分解活性を有する前記の配列のポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドからなる更に長いポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
【００８０】
実施例６
〈新規なキシログルカン分解酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築〉
成熟体のＮ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１６に示すセンス・プライマーと配列番号１７に示すアンチセンス・プライマーを作製した。この際、Ｎ末端領域側のセンス・プライマーの５’側には、制限酵素Nde I認識配列（catatg）を、Ｃ末端領域側のアンチセンス・プライマーの５’側には制限酵素Bgl II認識配列（agatct）を付加した。制限酵素認識配列のさらに５’側に付加されている複数の塩基は、制限酵素の切断効率を増加させるためのものである。
【００８１】
【００８２】
これらのプライマーとゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００８３】
＜ＰＣＲ反応液＞１０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、１０μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１０μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００８４】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９６℃、１分） １サイクル
ステージ２： 変性（９６℃、１０秒）アニールおよび伸長（６８℃、４分）30サイクル
【００８５】
得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素Nde IおよびBgl IIで切断し、制限酵素Nde IおよびBgl IIで切断したpET29a(+)〔ノバジェン（Novagen）社製〕にクローニングした。塩基配列が正しいことを確認した後、大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕に導入した。得られた形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB培地で３７℃で振盪培養した。培地にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを最終濃度が１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して生産誘導後、３０℃で振盪培養すると、目的の遺伝子産物は菌体内に蓄積した。
【００８６】
上述のようにして培養した菌体を集菌後、蛋白質抽出キット〔バグバスター（BugBuster）、ノバジェン（Novagen）社製〕を用いて菌体の破砕を行い菌体内に蓄積した遺伝子産物を抽出し、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーとトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過による精製を行った。
【００８７】
得られたポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、また、該アミノ酸配列を対応する塩基配列を配列番号１８に示す。該ポリペプチドのキシログルカン分解活性について、表１および２に示した各種多糖を基質として検討した結果、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株から得られた酵素とまったく同様な結果を得た。すなわち、この組み換え酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解しする酵素活性を有していた。
【００８８】
【００８９】
これらの結果より、本発明で得られた新規なキシログルカン分解酵素遺伝子を用いて、組換え酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認された。
【００９０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、キシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、主鎖中のキシロース側鎖を有しないグルコース残基から還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基におけるキシロース側鎖を認識して、キシログルカンを分解する作用を有する新規なエンド型キシログルカン分解酵素を提供するとともに、さらにそのアミノ酸配列、その遺伝子の構造を明らかにしたものであり、本発明によれば、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられているキシログルカンの構造や機能を解明するための新しい分析手段が提供でき、これにより。この種の研究のさらなる発展が期待できる。
【００９１】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なキシログルカン分解酵素、キシログルカン分解活性を有する特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体、および該形質転換体を培養して上記ポリペプチドを製造する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシログルカンは、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ-１，４-グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、キシロースがα-１，６キシロシド結合で高頻度に分岐結合した構造を基本とすることから、キシログルカンと呼称されている。このキシログルカンは、植物の一次細胞壁の構成成分として、またタマリンド豆に代表される熱帯産マメ科植物の種子貯蔵多糖として重要な役割を担っており、その構造や機能が注目されている。特に、植物の一次細胞壁中におけるキシログルカンは、セルロースと密接に関わって存在していると考えられており、セルロースとの相対的な存在形態が、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられている。このようなキシログルカンの役割を解明するために種々の手法が用いられているが、中でもキシログルカンを分解することのできる各種グリコシダーゼは、重要で強力な分析手段を提供する。
【０００３】
上述のようにキシログルカンはグルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とし、かつ主鎖の構造がセルロースと同様なものであることから、これを分解できるグリコシダーゼとして、エンド-１，４-β-D-グルカナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素、α-キシロシダーゼ、β-グルコシダーゼおよびα-フコシダーゼが知られており、キシログルカンの構造や機能の解明に、各種起源のこれら酵素が用いられてきた。
【０００４】
高分子量のキシログルカンを直接分解できるキシログルカン分解酵素は、酵素の分類からはエンド-１，４-β-D-グルカナーゼの一種と見なされており、キシログルカンのみを特異的に分解する酵素と、セルロースや大麦β-グルカンなどキシログルカン以外のβ-グルカンも分解できる酵素が知られている（たとえば特許文献1〜4）
【０００５】
【特許文献１】
特許第2099167号 明細書
【特許文献２】
国際公開第94/14953号 パンフレット
【特許文献３】
国際公開第99/02663号 パンフレット
【特許文献４】
国際公開第02/077242号 パンフレット
【０００６】
これら従来知られているキシログルカン分解酵素は、キシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、側鎖キシロースを認識しないか、または分解される結合からみて非還元末端側のグルコース残基に結合するキシロース側鎖を認識してキシログルカンを分解する酵素に限られていた（たとえば特許文献１あるいは非特許文献１）。
【０００７】
【非特許文献１】
Jean-Paul Vincken, Gerrit Beldman and Alphons G. J. Voragen 、
Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity?、
「カーボハイドレート リサーチ（Carbohydrate Research）」、（オランダ）、 (1997)、298巻、4号、p.243-346
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
キシログルカンの構造を解明するために、キシログルカン分解酵素は重要な役割を果たしてきた。しかしながら、キシログルカンの複雑な構造をさらに解明するための新しい分析手段として、既知酵素とは異なる作用様式をもつ、新しいキシログルカン分解酵素の開発が嘱望されていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、タマリンド豆より調製したキシログルカンから、側鎖キシロースの数の異なる一連のキシログルカンオリゴ糖を調製することに成功し、キシログルカン分解酵素の作用様式を詳細に検討することを可能にした。そこで、自然界よりキシログルカンを炭素源として生育できる微生物のスクリーニングを行い、さらに分離微生物の生産するキシログルカン分解酵素を、側鎖キシロースの数の異なるキシログルカンオリゴ糖を分解基質として精査することにより、これまで知られていない分解様式でキシログルカンを分解する酵素の存在の可能性について鋭意検討した。その結果、酵母菌の一種であり、高純度キシログルカンオリゴ９糖の大量調製に有効な菌株として知られているゲオトリカム属の一菌株（ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株）が 既知酵素とは異なる作用様式でキシログルカンを分解する酵素を生産することを見出し、該酵素のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に示されるとおりのものである。
（１）配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
（２）開始コドンが付加された上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された上記（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
（６）上記（５）に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
（７）上記（６）に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（８）ポリペプチドが、キシログルカン分解活性を有するものである上記（７）に記載のポリペプチドの製造方法。
（９）キシログルカン分解活性が、エンド型であって、かつ、主鎖中にキシロース側鎖を有しないグルコース残基を有するとともに、該グルコース残基の還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基がキシロース側鎖を有する構造を持つキシログルカンにおいて、該キシロース残基を有しないグルコース残基の還元末端側β−１，４−グルコシド結合を切断することによりキシログルカンを分解するものである上記（８）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１１】
なお、本発明においては、「アミノ酸配列を有するポリペプチド」あるいは「塩基配列を有するポリヌクレオチド」というとき、該記載において指摘するアミノ酸配列または塩基配列のみではなく、これら配列をその部分として含有するポリペプチド、ポリヌクレオチドも包含する。
【００１２】
本発明におけるキシログルカン分解酵素は、ゲオトリカム（Geotrichum）属に属する微生物由来のエンド型酵素あって、主鎖中にキシロース側鎖を有しないグルコース残基を有するともに、その還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基がキシロース側鎖を有する構造を有するキシログルカンにおいて、該キシロース残基を有しないグルコース残基の還元末端側のβ−１，４−グルコシド結合を切断する作用を有する。
この酵素は、より具体的には、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株により生産され、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株は、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株、FERM P-16454として産業技術総合研究所、特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１３】
上記ゲオトリカム（Geotrichum ）属に属する微生物より、本発明の酵素を生産するためには、通常、タマリンド種子キシログルカンを炭素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスのような無機または有機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または固体培地を用い、２０〜３０℃で、４〜１０日程度、好気的に培養される。本発明の酵素は、菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の場合は培養後、濾過或いは遠心分離した上澄液を、そして固体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中には、本発明の酵素以外にキシログルカンを分解する種々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要があるが、公知のクロマトグラフィーにより、本発明の酵素以外の共存するグリコシダーゼ活性を除去することができる。
【００１４】
上記のようにして得られた本発明の酵素（精製物）は、以下のような性質を有している。
【００１５】
（１）分子量および等電点；精製された本発明の酵素は、分子量が約８１,０００で、等電点ｐＨは約４.８である。
【００１６】
（２）作用；本発明の酵素は、各種起源のキシログルカンにエンド型の作用様式で作用し、主鎖を構成するβ-グルコシド結合を分解する。このとき、主鎖のキシロース側鎖をもたないグルコース残基の還元末端側β-１，４ーグルコシド結合が分解されるが、該グルコース残基から還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基にキシロース測鎖を有することが必要である。
すなわち、禾本科植物の細胞壁に含まれるキシログルカンのように、キシロース側鎖の出現頻度が低いキシログルカンに作用させると、上記分解作用により、主鎖の非還元末端にグルコース残基がひとつ残ったオリゴ糖を生成する。
【００１７】
また、キシログルカン以外のキシロース側鎖をもたないβ-グルカン類については、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、大麦β-グルカン、ラミナラン、パキマン、カードラン、グルコマンナンのいずれも分解しない。
【００１８】
同様に、重合度２から６の直鎖セロオリゴ糖にも作用しない。したがって本発明の酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解し、セルロースには作用しないキシログルカン分解酵素である。
【００１９】
（３）作用ｐＨおよび最適作用ｐＨ；キシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の作用ｐＨ範囲は、４５℃で１０分間作用させた場合、ｐＨ４〜６であり、最適作用ｐＨは約５．５付近に認められた。
【００２０】
（４）安定ｐＨ範囲；本発明の酵素をクエン酸-リン酸塩緩衝液中で、４５℃，３０分放置してその残存活性からみた安定ｐＨ範囲は約ｐＨ５．５〜６．５であった。
【００２１】
（５）作用温度範囲および最適作用温度；キシログルカンを分解基質としたとき、本発明の酵素の作用温度範囲は、ｐＨ５．５で１０分間作用させた場合、約５５℃まで作用が認められたが、最適作用温度は５０℃であった。
【００２２】
（６）熱安定性；本発明の酵素を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）のもとで、各温度で１５分間加熱処理した残存活性は５０℃までは殆ど失活せず、５５℃で約１０％、６０℃で約８５％が活性を失った。
【００２３】
（７）阻害剤；各種金属イオンのうちで、１ｍＭ以上の水銀イオンにより、本発明の酵素は強く阻害された。
【００２４】
（８）精製法；本発明の酵素は、培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を濃縮して、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過を行うことで、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分離精製することができた。
【００２５】
（９）活性測定法；本発明の酵素は、キシログルカンを特異的に分解することから、タマリンドガムより調製したキシログルカンの０．５％水溶液０．５ミリリットル（ｐＨ５．５）に対して、適量の酵素を添加して全量を１ミリリットルとし、４５℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をネルソン-ソモギー法により測定し、活性を求めた。この条件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
【００２６】
本発明の新規なキシログルカン分解酵素は、分泌蛋白であり、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、該配列中、残基１−２０はシグナル配列である。本酵素の成熟体蛋白は、この残基１−２０の配列が除かれたものであり、このアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【００２７】
したがって、本発明のポリペプチドとして好適なものは、少なくともこの配列番号１５のアミノ酸配列を有するものであるが、また、このポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、キシログルカン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号１３で示されるような、上記シグナル配列を有する前駆体ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、スプライシングによりキシログルカン分解活性を有するポリペプチドを産生可能なものも挙げることができる。
【００２９】
さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え手段を用いて製造することができる。この場合、例えば、上記配列番号１５に示されるアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン由来のメチオニンが付加したものであってもよく、例えば、配列番号１９に示されるポリペプチドについて、キシログルカン分解活性を有することが確認されている。
【００３０】
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、該酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、例えば以下のようなポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
【００３１】
（１）配列番号１４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドの１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）上記（１）のポリヌクレオチドに開始コドンが付加されているポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に示されるポリヌクレオチドにシグナル配列に対応する塩基配列が付加されたポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおける１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有し、かつスプライシングにより成熟体を発現可能なポリヌクレオチドであって、具体的には配列番号１２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００３２】
さらに、このほか上記（１）〜（３）のポリヌクレオチドに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドがキシログルカン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
なお、ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち0.5％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Denhartz's、0.１％ウシ血清アルブミン（BSA ）、0.１％ポリビニルピロリドン、0.１％フィコール400 〕および100μg/mlサケ精子DNAを含む６×SSC （１×SSCは、0.15 mol/l NaCl 、0.015mol/lクエン酸ナトリウム、pH7.0 ）中で、50℃−65℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００３３】
本発明のキシログルカン分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述したキシログルカン分解酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の新規なキシログルカン分解酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
【００３４】
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製された本酵素蛋白質を直接エドマン分解法〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第256巻、第7990〜7997頁（1981）〕によりアミノ酸配列分析〔Model 494 cLC Procise、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等〕に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００３５】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、新規なキシログルカン分解酵素遺伝子をクローニングする。一般的に、 PCRを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法を用いることができる。
【００３７】
また、 PCR法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。まず、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。
【００３８】
PCR法は、PCRテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stocktonpress）、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に新規なキシログルカン分解酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の酵素遺伝子の一部を取得することができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)および ３′−ＲＡＣＥ法等を行うことによって、新規なキシログルカン分解酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３９】
本発明においては、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を用い、PCR法を利用して、キシログルカン分解酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。この塩基配列は配列番号１２に示される。
これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１３に記載した。 このアミノ酸配列のうち、Ｎ末端１〜２０のアミノ酸残基はシグナル配列を示し、成熟体のポリペプチドは、２１番目のバリンから始まるアミノ酸配列を有し（配列番号１５）、該成熟体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号１４に示すとおりである。
なお、配列番号１３あるいは１５に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号１２あるいは１４に記載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
また、配列番号１３あるいは１５に記載のアミノ酸配列や配列番号１２あるいは１４に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子ポリヌクレオチドを得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。
【００４１】
さらに、ゲオトリカム・エスピーM128株を用いて全塩基配列が明らかにされた新規なキシログルカン分解酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他のキシログルカン分解酵素を産生する微生物のゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーから、配列表１２の新規なキシログルカン分解酵素遺伝子と相同性の高いDNAを選別することができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、新規なキシログルカン分解酵素を産生する微生物から得たゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×SSC 、 0.5％SDS 、５×デンハルツ、100 μg/mlサケ精子DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、65℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、65℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む２×SSC中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む0.２×SSC中、45℃で30分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするDNAを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００４３】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からPCR反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてPCR反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００４４】
得られた遺伝子が目的のキシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の新規なキシログルカン分解酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造および相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、キシログルカン分解酵素活性を測定することにより、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
【００４５】
本発明のキシログルカン分解酵素遺伝子を用いて、キシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。まず、目的の酵素遺伝子により発現ベクターを組み換え、該遺伝子を含む組換えベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、新規なキシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドを生産させる。この際、キシログルカン分解活性を有する成熟体ポリペプチドを得るには、該ポリペプチドのＮ末端にメチオニン残基が付いていないため、該成熟体ポリペプチドに対応する塩基配列において開始コドン（atg）を付加し、さらに、必要に応じ終止コドンを付加する(taa/tag/tga）。
【００４６】
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる.動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
このうち、真核細胞を用いる場合においては、例えば、遺伝子として、配列番号１２に示すような、シグナル配列に対応する塩基配列を有する前駆体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いても、スプライシングにより成熟体ポリペプチドが生産される。
【００４７】
発現の確認や発現産物の確認は、新規なキシログルカン分解酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００４８】
形質転換体の培養物から新規なキシログルカン分解活性を有するポリペプチドを精製するには上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
【００４９】
一方、本発明によりキシログルカン分解酵素の一次構造および遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のキシログルカン分解酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、キシログルカン分解酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適pH、安定pH、基質特異性等の性質が少しづつ異なったキシログルカン分解酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら酵素活性を有するポリペプチドを製造することが可能となる。
【００５０】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第79巻、第1408−1412頁（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕dNTP存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Gene）、第64巻、第313 −319頁（1988）〕、 PCRを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第224巻、第347−353頁（1995）〕等を用いることができる。
【００５１】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（gapped duplex ）法、ヌクレイックアシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12巻、第24号、第9441〜9456頁（1984）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第200巻、第81−88頁（1992）、ジーン、第102巻、第67−70頁（1991）〕、dut （dUTPase ）とung （ウラシルDNAグリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル オブ サイエンシーズ オブ ザUSA、第82巻、第488−492頁（1985）〕、 DNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber ：ODA）法、ジーン、第152巻、第271 −275頁（1995）、特開平7-289262号公報〕、 DNAの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、 DNA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖DNAベクターと２種類のプライマーを用いたPCRによる方法〔ジーン、第103巻、第73−77頁（1991）〕、アンバー変異を利用したPCRによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等を用いることができる。
【００５２】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップドデュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G（宝酒造社製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（宝酒造社製）、ODA法を用いたMutan （登録商標）-Express Km（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （宝酒造社製）等を用いることができる。
【００５３】
このように、本発明により、キシログルカン分解酵素の一次構造および遺伝子構造が提供されたことにより、キシログルカン分解酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において％はW/V％で示した。
【００５４】
【実施例】
【実施例１】
タマリンド種子キシログルカン１％とペプトン０．８％と硫酸マグネシウム０．０５％とリン酸一カリウム０．２％と酵母エキス０．０５％とを含む培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌを２００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、常法により殺菌した後、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株（ＦＥＲＭ Ｐ−16454）を接種し、３０℃で６日間通気培養した。その後、遠心分離により除菌し、得られた上澄液について前記活性測定法により活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当り０．１８単位であった。
【００５５】
【実施例２】
前記実施例１と同様な組成の培養液４０００ｍｌを調製し、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を接種して同様に培養し、培養上清を得た。培養液中の全酵素活性は６９５単位であった。培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行い、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過により精製した。精製酵素はＳＤＳ−電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養濾液に対して１１．２％であった。また、精製酵素タンパク質１ｍｇ当たりの活性は、６８単位であった。
【００５６】
【実施例３】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．１単位を、表１に示す各種起源のキシログルカン、セルロース類、各種多糖類をそれぞれ０.５％含む反応液１ミリリットルに加え、ｐＨ５．５，４５℃で１８時間作用させた後、分解作用により生じた直接還元糖をネルソンーソモギー法で、また全糖をフェノールー硫酸法で測定して分解率を求めた。その結果、本酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解し、セルロースやそのほかの多糖類には全く作用しないことが示された。
【００５７】
【表１】
【実施例４】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．０１単位を、表２に示す各種のセロオリゴ糖およびキシログルカンオリゴ糖を０.５％含む溶液０.１ミリリットルに添加し、ｐＨ５.５、４５℃、１８時間作用させた後、高速液体クロマトグラフィーにより生成オリゴ糖を分析した。加えた基質のピークが完全に消失したものを分解率１００％として分解率を測定した結果、表２に示すように直鎖セロオリゴ糖には全く作用せず、また分解される主鎖の結合からみて、非還元末端側のグルコース残基に存在するキシロース側鎖は酵素の分解作用に影響しないことが、非還元末端側のイソプリメベロース単位を逐次削除したキシログルカンオリゴ１４，１２，１０糖が分解されることで明らかになった。一方、還元末端側ののイソプリメベロース単位を逐次削除した、キシログルカンオリゴ１３，１１糖は本酵素により速やかに分解されるが、さらにイソプリメベロース単位を削除したキシログルカンオリゴ９糖はごくわずかしか分解されず、またオリゴ９糖の分解産物の分析結果から、分解される結合が通常の位置より非還元末端側にひとつずれること明らかになった。このことは、本酵素がキシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、主鎖中のキシロース側鎖をもたないグルコース残基の還元末端側にグルコース残基一つおいて結合する、グルコース残基におけるキシロース測鎖を認識して分解する新規キシログルカン分解酵素であることを示している。
【００５９】
【表２】
【実施例５】
〈ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株由来の新規なキシログルカン分解酵素をコードする遺伝子の単離〉
【００６１】
本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えばSambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2001）に従って行った。
【００６２】
〔部分アミノ酸配列の決定〕
実施例２で得られたキシログルカン分解酵素の精製標品を、アミノ酸配列分析機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕に供し、配列番号１に示す６残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、実施例２で得られたキシログルカン分解酵素の精製標品をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）による分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分のうち二つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号２および３に示す１２残基の内部アミノ酸配列を決定した。
【００６３】
全ＲＮＡの調製 実施例1と同様に培養を行い、常法によりＲＮＡ単離キット（FastRNA Kit-RED、BIO 101社製）を用いて、添付の説明書に従って全ＲＮＡを調整し、ｍＲＮＡ調製キット〔QuickPrep mRNA Purification Kit、アマシャムファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット〔TimeSaver cDNA Synthesis kit、アマシャム ファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いて、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を行った。
【００６５】
ＰＣＲによる増幅 配列番号２および３の内部アミノ酸配列をもとに、配列番号４および５に示すセンス・プライマーと配列番号６および７に示すアンチセンス・プライマーの４種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【００６６】
配列番号４に示すセンス・プライマーと配列番号６に示すアンチセンス・プライマーを用いて、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００６８】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００６９】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、５分） １サイクル
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（４５℃、３０秒）伸長（７２℃、２分）３０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００７０】
PCR反応後の反応溶液を鋳型として、配列番号５に示すセンス・プライマーと配列番号７に示すアンチセンス・プライマーを用いて、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００７１】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、PCR反応後の反応溶液０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００７２】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、５分） １サイクル
ステージ２： 変性（９４℃、３０秒）アニール（４５℃、３０秒）伸長（７２℃、２分）３０サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００７３】
得られた約６００ｂｐのＤＮＡ断片をpGEM-T Easy〔プロメガ（Promega）社製〕にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。
【００７４】
〔５′末端および３′末端の決定〕
前記ＤＮＡの塩基配列をもとにして、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)用のアンチセンス・プライマーとして配列番号８および配列番号９で示される２種のプライマーを作製し、ｃＤＮＡを鋳型として、５′−ＲＡＣＥ法により５′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。また、同様に、３′−ＲＡＣＥ用のセンス・プライマーとして配列番号１０および配列番号１１で示される２種のプライマーを作製し、３′−ＲＡＣＥ法により３′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。
【００７５】
決定されたキシログルカン分解酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１２に示す。得られたｃＤＮＡは全長２７５５塩基対からなり、２０２〜２０４番目の開始コドン（atg）から２５３０〜２５３２番目の終止コドン（tag）で終了する、配列番号１３に示す７７６アミノ酸からなる蛋白質をコードすると予想されるオープンリーディングフレームを有する。このアミノ酸配列中には、Ｎ末端領域アミノ酸配列（配列番号１）および内部アミノ酸配列（配列番号２および３）が見出された。
翻訳開始部位から、成熟体のＮ末端領域アミノ酸（配列番号１）の直前までの配列（残基１〜２０）は、シグナル配列であり、本発明の酵素が分泌蛋白であることを示唆している。
成熟体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１５に、該成熟体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１４に示す。
【００７７】
本発明はキシログルカン分解活性を有する前記の配列のポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドからなる更に長いポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
【００８０】
実施例６
〈新規なキシログルカン分解酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築〉
成熟体のＮ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１６に示すセンス・プライマーと配列番号１７に示すアンチセンス・プライマーを作製した。この際、Ｎ末端領域側のセンス・プライマーの５’側には、制限酵素Nde I認識配列（catatg）を、Ｃ末端領域側のアンチセンス・プライマーの５’側には制限酵素Bgl II認識配列（agatct）を付加した。制限酵素認識配列のさらに５’側に付加されている複数の塩基は、制限酵素の切断効率を増加させるためのものである。
【００８１】
これらのプライマーとゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００８３】
＜ＰＣＲ反応液＞１０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、１０μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１０μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００８４】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９６℃、１分） １サイクル
ステージ２： 変性（９６℃、１０秒）アニールおよび伸長（６８℃、４分）30サイクル
【００８５】
得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素Nde IおよびBgl IIで切断し、制限酵素Nde IおよびBgl IIで切断したpET29a(+)〔ノバジェン（Novagen）社製〕にクローニングした。塩基配列が正しいことを確認した後、大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕に導入した。得られた形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB培地で３７℃で振盪培養した。培地にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを最終濃度が１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して生産誘導後、３０℃で振盪培養すると、目的の遺伝子産物は菌体内に蓄積した。
【００８６】
上述のようにして培養した菌体を集菌後、蛋白質抽出キット〔バグバスター（BugBuster）、ノバジェン（Novagen）社製〕を用いて菌体の破砕を行い菌体内に蓄積した遺伝子産物を抽出し、陰イオン交換体ポロス５０HQのカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーとトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過による精製を行った。
【００８７】
得られたポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、また、該アミノ酸配列を対応する塩基配列を配列番号１８に示す。該ポリペプチドのキシログルカン分解活性について、表１および２に示した各種多糖を基質として検討した結果、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株から得られた酵素とまったく同様な結果を得た。すなわち、この組み換え酵素は、キシログルカンのみを特異的に分解しする酵素活性を有していた。
【００８８】
これらの結果より、本発明で得られた新規なキシログルカン分解酵素遺伝子を用いて、組換え酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認された。
【００９０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、キシログルカンの主鎖を構成するβ-グルコシド結合を加水分解するにあたって、主鎖中のキシロース側鎖を有しないグルコース残基から還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基におけるキシロース側鎖を認識して、キシログルカンを分解する作用を有する新規なエンド型キシログルカン分解酵素を提供するとともに、さらにそのアミノ酸配列、その遺伝子の構造を明らかにしたものであり、本発明によれば、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられているキシログルカンの構造や機能を解明するための新しい分析手段が提供でき、これにより。この種の研究のさらなる発展が期待できる。
【００９１】
【配列表】
Claims (9)
- 配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
- 開始コドンが付加された請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された請求項２に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにおける１個若しくは複数個の核酸が欠失、付加、挿入若しくは置換された塩基配列を含むものであって、キシログルカン分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
- 請求項５に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
- 請求項６に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
- ポリペプチドが、キシログルカン分解活性を有するものである請求項７に記載のポリペプチドの製造方法。
- キシログルカン分解活性が、エンド型であって、かつ、主鎖中にキシロース側鎖を有しないグルコース残基を有するとともに、該グルコース残基の還元末端側に該グルコース残基を含めずに数えて２番目のグルコース残基がキシロース側鎖を有する構造を持つキシログルカンにおいて、該キシロース残基を有しないグルコース残基の還元末端側β−１，４−グルコシド結合を切断することによりキシログルカンを分解するものである請求項８に記載のポリペプチドの製造方法。
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