JPH0856663A - 新規セルラーゼおよびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規セルラーゼおよびその遺伝子を提供す
る。 【構成】 セルラーゼ遺伝子をフミコーラ・インソレン
ス（Humicola insolens）株から単離し、セルラーゼ遺
伝子を宿主である微生物に導入し、発現させることによ
って目的とするセルラーゼを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、新規セルラーゼおよびその遺伝子に関し、更
に詳細には新規セルラーゼをコードするＤＮＡ配列、該
ＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、該ベクターにより
形質転換された微生物、並びに該微生物による新規セル
ラーゼの製造法に関する。

【０００２】背景技術 セルロースは、グルコースがβ−１，４−グリコシド結
合でつながった高分子多糖である。従って、これを加水
分解すればグルコースが得られ、グルコースの供給源と
してセルロースを有効に利用することができる。しか
し、セルロースは難分解性の物質であり、セルロース系
バイオマスの活用は実用にまでは至っていない。このセ
ルロースを効率よく加水分解し、そこからエネルギーを
取り出すための一連の反応を司るのがセルラーゼであ
る。従って、本酵素の特性を解明すること並びに本酵素
を効率よく生産することは、セルロース資源の有効活用
に関わる技術の根幹をなすものといえる。

【０００３】またセルラーゼは、産業用酵素剤として市
販され、洗剤、繊維加工用製剤、飼料添加剤、消化剤と
いった種々の製品の主要成分として用いられている。よ
って、セルラーゼの特性解明はこのような実用面でも大
いに役立つものと期待されうる。

【０００４】セルラーゼ系は、エンドグルカナーゼ、エ
キソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼの３種の酵素系
に大別され、これらのセルラーゼは、相互に作用しあ
い、相乗効果によりセルロースの分解を担っている。こ
れら切断様式の他にも、作用温度、作用ｐＨなど様々な
特性を有するセルラーゼ成分が、多岐にわたる微生物に
よって生産されており、その利用目的に応じて酵素系が
選択されてきた。しかし、目的によっては微生物から得
られる酵素成分の組成が必ずしも適切ではない場合もあ
り、これを最適化するために、微生物の培養条件をコン
トロールする他、変異株の獲得や、酵素の分画といった
手段がとられている。

【０００５】一方で、これらの酵素成分を遺伝子工学的
に単離し、利用することも試みられている。この方法に
よれば、極めて精製度の高い酵素を得ることが出来るた
め、その酵素の特性解明、およびその有効な利用が可能
になると考えられる。しかしながら、前述のようにセル
ラーゼは複合酵素系であることから個々のセルラーゼの
成分の特定は容易ではなく、全てのセルラーゼ遺伝子の
単離は未だなされていないのが現状である。

【０００６】

【発明の概要】今般本発明者らは、フミコーラ・インソ
レンス（Humicola insolens ）からセルラーゼの遺伝子
を単離し、その遺伝子から発現されるセルラーゼを得る
ことに成功した。従って、本発明は、セルラーゼおよび
前記セルラーゼをコードするＤＮＡ配列の提供をその目
的とする。また、本発明は、遺伝子組み換え操作によっ
て本発明によるセルラーゼを微生物中で発現させること
をその目的とする。

【０００７】本発明によるタンパク質は配列表１に記載
されるアミノ酸配列の一部もしくは全部を有するもの、
である。本発明によるタンパク質は、また、配列表１に
記載されるアミノ酸配列の１〜４２９番の配列からなる
もの、および更に−２２〜−１番の配列をそのＮ末端側
に有してなるものである。更に本発明によるＤＮＡ配列
は、上記アミノ酸配列をコードするもの、特に配列表２
に記載される塩基配列の一部または全部を有するもの、
である。

【０００８】微生物の寄託 本発明によるセルラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＭ３
−１（実施例５参照）で形質転換された大腸菌ＪＭ１０
９株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１４４５９の受託番号のもと工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【０００９】

【発明の具体的説明】セルラーゼおよびその遺伝子 本発明によるタンパク質は、配列表１に記載される配列
の一部または全部を有するもの、である。また、前記タ
ンパク質の誘導体としては、例えばアミノ酸の付加、挿
入、削除、欠失または置換などの改変が生じた配列表１
に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質であっ
て、依然としてセルラーゼ活性を保持するものが挙げら
れる。

【００１０】本発明によって提供されるタンパク質は、
また、配列表１に記載されるアミノ酸配列の１〜４２９
番までの配列からなるものである。また、この配列のＮ
末端に更に配列表１の−２２〜−１番までのアミノ酸配
列を有するタンパク質も本発明に包含される。本発明に
よるこれらのタンパク質は、セルラーゼ活性を有し、特
に中性領域のｐＨにおいて活性を有する。

【００１１】これらのタンパク質はＨ．インソレンスに
由来するものであり、この配列表１の１〜４２９番まで
の配列を有するタンパク質は成熟タンパク質であり、−
２２〜−１番の配列はシグナルペプチドと考えられる。

【００１２】なお、以下でこの配列表１に記載されるア
ミノ酸配列の１〜４２９番までの配列をセルラーゼＮＣ
Ｅ１、その遺伝子をセルラーゼＮＣＥ１遺伝子と言う場
合がある。

【００１３】本発明によれば、前記タンパク質のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列が提供される。このＤＮ
Ａ配列の典型的配列は、配列表２に記載される塩基配列
の一部または全部を有するものである。

【００１４】配列表２に記載される塩基配列は、Ｈ．イ
ンソレンスの染色体ＤＮＡを表したものである。配列表
２に記載される塩基配列は、配列番号３１０のＡＴＧで
始まり、配列番号１８９３のＴＡＡで終了するオープン
リーディングフレーム（読みとり枠）を有する。また、
配列番号３７６〜１８９０の塩基配列は４２９残基から
なる前記成熟タンパク質に対応する。更に、配列表２の
塩基配列中には４つのイントロンが存在することが確認
された（実施例７参照）。

【００１５】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれ
ば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、配列
表１に記載されるアミノ酸配列の全部または一部をコー
ドする種々の塩基配列を選択することができる。従っ
て、本発明による配列表１に記載されるアミノ酸配列の
一部または全部をコードするＤＮＡ配列とは、配列表２
に記載される一部または全部の塩基配列に加え、同一の
アミノ酸をコードする配列であって縮重関係にあるコド
ンを塩基配列として有する配列も意味するものとする。

【００１６】本発明によるタンパク質をコードする遺伝
子の塩基配列は、これまでにクローン化され、そして塩
基配列が明らかにされたいかなるセルラーゼ遺伝子のそ
れと相違するものである。これは、核酸データベースＧ
ｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｒ７７．０、Ｊｕｎｅ，１
９９３に登録されているセルラーゼ遺伝子と比較するこ
とによって既に確認されている。

【００１７】本発明によるＤＮＡは、天然由来のもので
あっても、全合成したものであってもよい。また、天然
物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであっ
てもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、Ｈ．イ
ンソレンス由来の染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡラ
イブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方
法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した
適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方
法、等が挙げられる。また、前記した寄託菌より得るこ
とも可能である。

【００１８】本発明によるＤＮＡ配列は以下のようにし
て決定した。 （１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製 Ｈ．インソレンスを培養し、集菌して菌体を得た。この
菌体より、全ＤＮＡをHoriuchi et al.,Journal of Bac
teriology(1988) 170,272 に記載される方法に準じて調
製した。得られたＤＮＡを制限酵素で部分的に分解した
後、９〜２３ｋｂの断片を主体とするＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡを基に、市販されているベクター・キッ
トを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。

【００１９】（２）クローン化用ＤＮＡプローブの作成 Ｈ．インソレンスを培養し、セルラーゼ活性を指標とし
て、各種クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動を用
いてセルラーゼを精製した。次いで、この精製セルラー
ゼをプロテアーゼによって分解し、アミノ酸配列をペプ
チドシークエンサーによって決定した。このアミノ酸配
列に基づいて、可能な塩基配列をすべて含むオリゴヌク
レオチドの混合物を調製し、これを基にしてＰＣＲ法に
よる増幅を行った結果、８９塩基対のオリゴヌクレオチ
ドが得られ、これをプローブとして用いた。

【００２０】（３）セルラーゼ遺伝子のクローン化 上記（１）により得られたＤＮＡライブラリー（例え
ば、ファージＤＮＡライブラリー）を大腸菌に感染さ
せ、生じたプラークをナイロンメンブランへブロット
し、アルカリ変性および中和処理を行った後、上記
（２）により得られたプローブとハイブリダイズさせて
陽性プラークを選択した。

【００２１】（４）塩基配列の決定 上記のようにして選択されたクローン（計８個）のうち
１個についてＤＮＡを調製し、常法に従い（例えば、Ｄ
ＮＡシークエンサーを用いて）塩基配列を決定した。ま
た、塩基配列を基にＮ末端とＣ末端のオリゴヌクレオチ
ド・プライマーを合成し、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡの全
塩基配列を得た。鋳型は、Ｈ．インソレンス株から得た
ｍＲＮＡに、逆転写酵素を働かせることにより合成した
ｃＤＮＡを用いた。このｃＤＮＡ全塩基配列と前記ＤＮ
Ａ配列を比較することによってイントロン、読みとり枠
の存在が明らかになった（実施例７および配列表２参
照）。

【００２２】発現ベクターおよび形質転換された微生物 また、本発明によれば、前記の本発明によるＤＮＡ配列
を、宿主微生物内で複製可能でかつそのＤＮＡ配列がコ
ードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現
ベクターが提供される。更に、本発明によれば、この発
現ベクターによって形質転換された微生物が提供され
る。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、
大腸菌、放線菌、酵母、カビなどを用いた系、および、
それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現
系などを用いることができる。本発明によるベクター構
築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されて
いるものを用いることができる。

【００２３】本発明による発現ベクターは、これを実際
に宿主微生物に導入して所望のタンパク質を発現させる
ためには、前記の本発明によるＤＮＡ配列の他に、その
発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺
伝子マーカー等を含んでいてもよい。配列表２の塩基配
列はこれらの制御配列なども含んでいると考えられるこ
とから、この塩基配列をそのまま利用することも場合に
よって有利であると考えられる。また、この発現ベクタ
ーは、セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を反復した形
（タンデム）で含んでいてもよい。これらは常法に従い
発現ベクターに存在させてよく、このベクターによる微
生物の形質転換の方法も、この分野で慣用されているも
のを用いることができる。

【００２４】この形質転換体を適当な培地で培養し、そ
の培養物から上記した本発明によるタンパク質を単離し
て得ることができる。従って、本発明の別の態様によれ
ば、前記の本発明による新規タンパク質の製造法が提供
される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する
微生物についてのそれと本質的に同様であってよい。ま
た、培養液からの本発明による新規タンパク質の回収、
精製も常法に従って行うことができる。

【００２５】

【実施例】実施例１ セルラーゼＮＣＥ１の精製 Ｈ．インソレンス株を下記組成の（Ｎ）培地中で３７℃
で培養した。（Ｎ）培地の組成：アビセル（５．０
％）、酵母エキス（２．０％）、ポリペプトン（０．１
％）、塩化カルシウム（０．０３％) 、硫酸マグネシウ
ム（０．０３％) 、ｐＨ ６．８。７日間培養の後、得
られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心すること
により、菌体を除いた。得られた培養上澄を、凍結乾燥
後、５％（ｗ／ｖ) となるように２５ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ ９．０）に溶解し、陰イオン交換カラム
（ｍｏｎｏＱ（６０／１００),ファルマシアバイオテク
社製）に適用し、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）で溶出した。このカラムに吸着しなかった画分
を、凍結乾燥後、１０％（ｗ／ｖ）となるように５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．４) に溶解し、フェニル
スーパーロースカラム(phenyl-superroseHR5/5,ファル
マシアバイオテク社製）に適用し、５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ ９．４）中、１．５〜０Ｍの濃度勾配を
かけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。この
うち、０．５〜０．４Ｍの濃度勾配のとき得られた画分
は、ｐＨが中性の領域においてセルラーゼ活性を示すこ
とが確認された。クロマトグラフ処理したセルラーゼＮ
ＣＥ１は、 SDS-PAGE により分析した。電気泳動的に分
離されたタンパク質はクマーシーブルーR250で染色して
検出した。ゲルは単一の染色バンドを示し、酵素が純粋
であることを示していた。このタンパク質の見かけ分子
量は、既知のマーカータンパクの移動速度と比較するこ
とによって、約４３ｋＤであると算出された。

【００２６】実施例２ セルラーゼＮＣＥ１の部分アミ
ノ酸配列 （１） Ｎ末端側アミノ酸残基の同定 実施例１と同様に電気泳動分離を行った後、マルチフォ
ーII電気泳動装置（ファルマシアバイオテク社製）を用
いて、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電
気的に写しとった。さらに、ポンソーＳ色素で染色した
後、４３ＫＤのタンパク質がブロットされている部分を
切り出し、水で洗浄後風乾した。これをプロテインシー
ケンサーModel 477A（ＡＢＩ社製）に供し、Ｎ末端側ア
ミノ酸配列の決定を試みたが、エドマン分解により切り
出されるアミノ酸が得られず、Ｎ末端側アミノ酸が修飾
保護されていることが判明した。そこで、先の風乾物上
のタンパク質を、Podell,D.N. et al.,Biochem. Biophy
s.Res.Commun.(1978)81,176 に記載される方法に従っ
て、牛肝臓ピログルタメートペプチダーゼ（ベーリンガ
ー社製）を用いて処理することにより、修飾Ｎ末端アミ
ノ酸残基を除去し、次いで、水で洗浄し、風乾した後、
再度前記プロテインシーケンサーにより、Ｎ末端側アミ
ノ酸配列を５残基決定した。得られた配列は、グルタミ
ン―アラニン―グリシン―トレオニン―イソロイシンの
順序であった。

【００２７】（２） ペプチドマッピング タンパク質内部のアミノ酸配列を決定するために、先の
風乾物をジチオスレイトールで還元後、ヨード酢酸を用
いてカルボキシメチル化した。その後、０．５％ポリビ
ニルピロリドン―40の１００ｍＭ酢酸溶液で処理した
後、水洗を行った。これを、０．１％重炭酸アンモニウ
ム（ｐＨ８）緩衝液（１０％アセトニトリルを含む）中
で、トリプシン（生化学工業社製）処理を行った。トリ
プシンはブロットされたセルラーゼＮＣＥ１の１／５０
量、約２０μｇを添加し、３７℃で一晩かけて分解を行
った。これを、Model 172 μプレパラティブＨＰＬＣシ
ステム（ＡＢＩ社製）を用いてカラム（C8 220X2.1mm
）クロマトグラフィーを行った。溶離はアセトニトリ
ルグラジェント（０−３５％）で行った。得られた２種
類のペプチドＮｏ．５とペプチドＮｏ．９に関して、気
相プロテインシーケンサーＰＳＱ−１（島津製作所社
製）を用いてアミノ酸配列決定を行った。得られたペプ
チドのアミノ酸配列を以下に示す（（Ｘ）は不明アミノ
酸残基を表す）。

【００２８】実施例３ ゲノムＤＮＡライブラリーの作
製 ゲノムＤＮＡの単離はHoriuchi et al.,Journal of Bac
teriology(1988)170,272に記載される方法に従って行っ
た。まず、Ｈ．インソレンス株を前述（Ｎ）培地で２日
間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１０分）によっ
て菌体を回収した。得られた菌体をＳＤＳで溶菌させ
て、フェノール処理、プロテイナーゼＫおよびリボヌク
レアーゼＡ処理、さらにＰＥＧ沈殿化によりゲノムＤＮ
Ａを得た。次いで、Ｈ．インソレンスゲノムＤＮＡをＳ
ａｕ３ＡＩにより部分消化し、９−２３ｋｂの範囲の分
子を含有する画分とファージベクター, EMBL 3( ストラ
タジーン社製）のＢａｍＨＩ消化物とを４対１モル比、
１２５μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度において混合し、ライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用い、２６℃で一晩
かけて連結させた。ＤＮＡをエタノール沈殿後、５μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。連結混合物の１．２５μ
ｇを、Hohn,B., Method in Enzymology(1979)68,299-30
9 に記載されている方法に従って凍結したパッケージ成
分（アマシャム社製パッケージングキット）を用いて、
試験管内においてラムダヘッドにパッケージし、得られ
たファージをE. coli LE392 株上にプレートした。得ら
れた２×１０^５個のファージライブラリーを用いて目的
遺伝子のクローン化を行った。

【００２９】実施例４ ＰＣＲ法による長鎖プローブの
作成 Ｈ．インソレンス株の全ＤＮＡを鋳型にし、ＰＣＲ法を
用いてロングプローブの作成を行った。

【００３０】（１） ＰＣＲ用プライマーＤＮＡの作成 プローブとしては実施例２の＊印で示したアミノ酸に対
応するＤＮＡを合成した。不明のアミノ酸（Ｘ）はシス
テインとし、これに対応するＤＮＡを合成した。ＰＣＲ
法で増幅されるＤＮＡの塩基配列をより容易に決定する
ため、いずれのプライマーにも次に示すアンカーＤＮＡ
部分を合成し付加した。また、Maristella De O. Azeve
do et al.,J. General Microbiology(1990)136,2569-25
78に記載された内容により、ペプチドＮｏ．９の方がペ
プチドＮｏ．５に比較して、タンパク質のＮ末端により
近く位置すると判断された。作成したプライマーの塩基
配列は以下の通りである。 ペプチドＮｏ．９より作成したプライマー 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT AA(CT)GGITG(CT)GA(CT)TA(CT)A
A-3' ペプチドＮｏ．５より作成したプライマー 5'-CAGGAAACAGCTATGACC TTICC(AG)TA(AG)AA(AG)TC(CT)T
T-3' （I ：イノシン） Ｈ．インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマ
ーを各１μＭ加え、９４℃で１分、５５℃で２分、７２
℃で３分を１サイクルとし４０回反応を繰り返してＰＣ
Ｒ法によるＤＮＡの増幅を行った。その結果、８９ｂｐ
のＤＮＡが増幅した。

【００３１】（２） ＰＣＲ産物の塩基配列決定 ＰＣＲ産物を電気泳動し、未反応物と目的物を分離した
後、目的物を含む寒天片を切り出し、SUPREC-01 フィル
ター付き遠心チューブ（宝酒造社製）により抽出し、エ
タノール沈殿法にて精製濃縮した。５０ｎｇ相当の鋳型
をAmpli Taq cycle sequencing kit（宝酒造社製）にて
以下の５’末端アイソトープ標識したプライマーでサイ
クルシーケンスを行った。

【００３２】（１）に用いたプライマー以外の新たに解
読されたＤＮＡの塩基配列の結果は下記の通りである。 5'-C CCC TAC CGC ATG GGC AAC-3' 新たに判明した１９ｂｐの塩基配列から予想できるアミ
ノ酸のうちプロリンとチロシンおよびメチオニンの位置
が、先に求めた、ペプチドＮｏ．９とペプチドＮｏ．５
のアミノ酸配列順序と一致したので、以後この８９ｂｐ
の増幅ＤＮＡを遺伝子クローン化のためのプローブとし
て使用した。

【００３３】実施例５ セルラーゼＮＣＥ１遺伝子のク
ローン化 （１）プラークハイブリダイゼーションによるスクリー
ニング ＰＣＲ法により増幅させた８９ｂｐのＤＮＡ断片を１０
０ｎｇとり、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリン
グ検出システム（アマシャム社製）に添付されている、
ラベリング溶液およびグルタルアルデヒドとを混合し、
あらかじめ、３７℃で１０分間反応させておいた。ファ
ージプラークは、HyBond N+ ナイロントランスファーメ
ンブラン（アマシャム社製）に写しとり、０．４Ｎ 水
酸化ナトリウムで変性後、５×ＳＳＣで洗浄し、乾燥さ
せＤＮＡを固定した。キットに記載の方法に従って、１
時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先
の標識化したプローブを添加し、４時間（４２℃）ハイ
ブリダイゼーションを行った。ラベルの洗浄はキットの
方法に従った。まず、０．５×ＳＳＣ（６Ｍ 尿素，
０．４％ ＳＤＳ）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰
り返し、次に、２×ＳＳＣで、室温下で５分間の洗浄を
２回行った。次に、添付されている検出溶液に１分間浸
したあと、Hyperfilm-ECL （アマシャム社製）に感光さ
せ８個の陽性クローンを得た。

【００３４】（２）ファージＤＮＡの調製 E. coli LE392 にファージを感染させ、８時間後ファー
ジ粒子を集め、Grossberger,D.,Nucleic Acids. Res.
(1987)15,6737に記載される方法により、プロテイナー
ゼＫおよびフェノール処理後、エタノール沈殿により、
ファージＤＮＡを分離した。

【００３５】（３）目的遺伝子のサブクローン化 ８種のファージＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、アガロー
ス電気泳動に供した。ＤＮＡをSouthern,E.M., J.Mol.B
iol.(1975) 98,503-517 に記載される方法により、ナイ
ロンメンブランに写しとり、先のプラークハイブリダイ
ゼーションと同一の条件で、８９ｂｐのプローブを用い
ハイブリダイズさせ、４．４ｋｂの目的遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を検出した。その結果、３種のファージＤＮＡ
が同一サイズのＢａｍＨＩ断片を有していた。この４．
４ｋｂのＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップキッ
ト（ファルマシアバイオテク社製）を用いて分離し、E.
coli JM109 を用いプラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
部位にサブクローン化を行った。得られたプラスミドを
ｐＭ３−１とした（図１）。

【００３６】（４）ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイ
ゼーション Ｈ．インソレンスのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断
後、アガロース電気泳動に供し、Southern,E.M., J.Mo
l.Biol.(1975) 98,503-517 に記載されている方法に従
い、ナイロンメンブランに写しとった。先のプラークハ
イブリダイゼーションと同一の条件で、８９ｂｐのプロ
ーブを用いハイブリダイズするＤＮＡ断片のサイズを求
めた。また同時に、３種類のファージＤＮＡが有する
４．４ｋｂの断片に関しても同一操作を行った。その結
果、クローン化した断片とゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ切
断断片のサイズが同一であることを確認した。

【００３７】実施例６ 塩基配列の決定 塩基配列解析装置は、A.L.F. ＤＮＡシーケンサーII
（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシ
ングゲルは、レディミックスゲル（ファルマシアバイオ
テク社製）、またはハイドロリンクロングレンジャー
（AT Biochem社製）のアクリルアミド担体を使用した。
ゲル作成用各種試薬（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ
ルエチレンジアミン、尿素、過硫酸アンモニウム）はフ
ァルマシアバイオテク社製A.L.F グレードの試薬を用い
た。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシング
キットまたはオートサイクルシーケンシングキット（フ
ァルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作成条件、
反応条件と泳動条件の各々は、各説明書の詳細を参照し
て設定された。

【００３８】（１） 塩基配列解読用鋳型プラスミド
（以下単に「テンペレート」ということがある）の調製 テンペレートとして、ｐＭ３−１，ｐＭ５，ｐＭ７およ
びｐＭ８を用いた。これらの構築方法は以下の通りであ
る。ｐＭ５はｐＭ３−１（実施例５（３）参照）をＳａ
ｌＩで切断し、５００ｂｐの消化断片をＳａｌＩで切断
したｐＵＣ１１８に連結し、クローン化した。ｐＭ７は
ｐＭ３−１をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、1100
bpの消化断片をＫｐｎＩおよびＳｍａｌで切断したｐＵ
Ｃ１１８に連結し、クローン化した。ｐＭ８はｐＭ３−
１をＢｇｌIIおよびＥｃｏＲＶで切断し、２３００ｂｐ
の消化断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで切断したｐ
ＵＣ１１８に連結し、クローン化した。４．４ｋｂＢａ
ｍＨＩ断片の制限酵素地図とｐＭ５、ｐＭ７およびｐＭ
８との関係は図２に示す通りである。

【００３９】（２）塩基配列の解読（Ｉ） 実施例４の８９ｂｐのＰＣＲ増幅断片の塩基配列からFI
TC標識シーケンシングプライマーＤＮＡ（ＷＡＴＡ−０
１，ＷＡＴＡ−０２）を合成した。 ＷＡＴＡ−０１：5'-AACCC CTACC GCATG GGCAA CAA-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−０２：5'-TTGTT GCCCA TGCGG TAGGG GTT-3'
(23mer) テンペレートとプライマーとの組み合わせをｐＭ３−１
／ＷＡＴＡ−０１，ｐＭ３−１／ＷＡＴＡ−０２，ｐＭ
５／ユニバーサル，ｐＭ５／リバース，ｐＭ７／ユニバ
ーサル，ｐＭ７／リバース，ｐＭ８／ユニバーサル，ｐ
Ｍ８／リバース（ユニバーサルおよびリバースの各プラ
イマーはキットに添付されているプライマーを示す）と
して、オートサイクルシーケンシングキットで反応させ
た。２μｇのテンペレートおよびｄＮＴＰｓと１ｐＭの
プライマーおよびＴｔｈポリメラーゼを、９４℃で３６
秒、５０℃で３６秒、７２℃で８４秒を１サイクルとし
て２５回反応を繰り返した。これらの産物をA.L.F.ＤＮ
ＡシーケンサーIIを用いて解読したところ、配列表２に
記す１〜３５０および６４５〜２２８５ｂｐの塩基配列
が判明した。３５１−６４４ｂｐの塩基配列は、下記Ｗ
ＡＴＡ−０３からなるシーケンシングプライマーを合成
し、ｐＭ８と反応させることにより１−２２８５ｂｐの
塩基配列を連結した。 ＷＡＴＡ−０３：5'-GGCGA ACTCG TTGTT CATCA GGG-3'
(23mer)

【００４０】（３）塩基配列解読（II） （２）の結果をもとに、ＷＡＴＡ−１１〜ＷＡＴＡ−２
２からなるＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーＤＮ
Ａを合成し、これらプライマーとｐＭ８とのオートリー
ドシーケンシングキットによる反応を行った。まず、１
０μｇのプラスミドを２Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ
変性させ一本鎖プラスミドとし、エタノール沈殿により
回収した。これを各々のプライマーとアニーリングし、
Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。 ＷＡＴＡ−１１：5'-GGCCG GAAGG AAATC TTGCT CAG-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１２：5'-ACAAG TGGAC CAGCC AGTGC AGC-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１３：5'-TCTGT ACTTC GTCGC CATGG AGG-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１４：5'-CAACA ACTGC GGTGG TACCT ACTC-3'
(24mer) ＷＡＴＡ−１５：5'-TTCGA TGACC GCAAC CGCTT CGC-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１６：5'-TCAGG TCGTC TGGTC CAACA TCC-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１７：5'-CAATC TCAAT ATGTA GCAGG ACG-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１８：5'-TGGAG TCGAG CCAGA GCATG TTG-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−１９：5'-CCTGG ACGAA GAACT GAGAG AGC-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−２０：5'-ACTCC CAAAC GTCGA TCTCA GCG-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−２１：5'-TCATC AGGGT GAACA TCTGG TAC-3'
(23mer) ＷＡＴＡ−２２：5'-CGAGC ACCTC TTCCA GGTCA TCC-3'
(23mer) その結果、ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌII断片のうち２２８５ｂ
ｐの塩基配列を配列表２の様に決定した。

【００４１】実施例７ イントロンの決定 イントロンの決定にはｃＤＮＡを合成し、この塩基配列
と染色体由来のそれとを比較することにより判定するの
が一般的である(Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Mo
lecular Cloning A laboratory manual", Cold Sprig H
arbor Laboratory Press(1989)) 。この方法に従い、以
下の様にイントロン領域を決定した。

【００４２】（１）全ＲＮＡの調製 Ｈ．インソレンスをセルラーゼ誘導培地、好ましくは前
述（Ｎ）培地で２日間培養し、菌体を遠心分離（３５０
０ｒｐｍ，１０分）により回収した。そのうち２ｇの菌
体を滅菌水で洗い、液体窒素で凍結したままブレンダー
（日本精機社製ホモジナイザーAM-3）で粉砕した。これ
を４Ｍグアニジンチオシアン酸塩を含む変性溶液１０ｍ
ｌ（４Ｍグアニジンチオシアン酸塩，２５ｍＭクエン酸
３ナトリウム，Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム
０．５％，０．１Ｍメルカプトエタノール）に懸濁し
た。室温で数分攪拌した後、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４．５）で中和し、１０ｍｌのＴＥ飽和フェノ
ールを加えさらに攪拌した。ここに２ｍｌのクロロホル
ム―イソアミルアルコール（２４：１）を加え、よく攪
拌の後、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１０分）によりフ
ェノールで変成した菌体成分を除去した。上層（水層）
を吸い取り１０ｍｌのイソプロパノールで核酸を沈殿化
した。同沈殿を遠心分離（３５００ｒｐｍ，１０分）で
核酸を回収し、７０％エタノール―水で再遠心分離によ
り沈殿を洗った。同沈殿は、３．５ｍｌのＴＥ緩衝液に
溶解の後、８８０μｌの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加
え、５℃で２時間冷却した後、遠心分離（１２０００ｒ
ｐｍ，１０分）により沈殿を回収した。同沈殿は７０％
エタノール−水で洗い、これを全ＲＮＡ画分とした。収
量は２．７ｍｇ，収率は０．１４％であった。

【００４３】（２）ｍＲＮＡの調製 ｍＲＮＡの調製はｍＲＮＡピュアリフィケーションキッ
ト（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。ま
ず（１）で調製した全ＲＮＡのうち１ｍｇを１ｍｌのエ
リューションバッファーに溶解し、これに６５℃，１０
分の熱変性処理を加えた。氷中で急冷した後、０．２ｍ
ｌのサンプルバッファーを加えた。この全量のＲＮＡ溶
液をオリゴ（dT）セルロースカラムに適用し、ハイソル
トバッファーで３回、ロウソルトバッファーで３回カラ
ムを洗浄した後、６５℃に加温したエリューションバッ
ファーで溶出した。このカラム操作を２回繰り返し、ｍ
ＲＮＡ画分とした。収量は１９．２μｇ、収率は２％で
あった。

【００４４】（３）ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡ合成はタイムセーバーｃＤＮＡ合成キット（フ
ァルマシアバイオテク社製）を使用した。まず、５μｇ
のｍＲＮＡを２０μｌのサンプルバッファーに溶解し
た。６５℃，１０分の熱処理後、ファーストストランド
合成ミックスにジチオスレイトール溶液、オリゴ（dT）
プライマーと共に添加し、３７℃で１時間反応させた。
次に、この全量をセカンドストランドミックスに加え、
１２℃で３０分、次いで２２℃で１時間反応させ、これ
をｃＤＮＡとした。

【００４５】（４）ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅 合成したｃＤＮＡのうち１μｇを鋳型とし、目的のｃＤ
ＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。上流および下流の
各プライマーＤＮＡの配列は以下の通りである。 上流プライマー:5'-ATG CAG ATC AAG AGC TAC ATC C-3'
(22mer) 下流プライマー:5'-GAC GTT GAC GGT CGA GCC GAT G-3'
(22mer) アンプリタックＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、１
μＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、
１．２５ＵｎｉｔのｒＴａｑポリメラーゼの組成を用
い、熱変性を９４℃で１分、アニーリングを５０℃で２
分、および伸長を７２℃で３分の１サイクルを４０回繰
り返すことにより増幅した。増幅された断片はアガロー
スゲル電気泳動の結果、１．３ｋｂｐの大きさであっ
た。これを、エタノール沈殿化により濃縮し、ｐＴ７ブ
ルーＴ―ベクターキット（ノバジェン社製）によりクロ
ーン化した（プラスミド名：ｐＰＲ１）。

【００４６】（５）ｃＤＮＡの塩基配列解析 シーケンシング反応は前述同様オートリードシーケンシ
ングキットを用いて行った。プラスミドｐＰＲ１を２Ｍ
水酸化ナトリウムでアルカリ変性し、エタノールで沈殿
化した。この一本鎖プラスミドをテンペレートとし、Ｔ
７ポリメラーゼで反応させた。プライマーはキット添付
のユニバーサルとリバース、前記合成プライマーＷＡＴ
Ａ−１３，ＷＡＴＡ−１４，ＷＡＴＡ−１５，ＷＡＴＡ
−１９，ＷＡＴＡ−２０，ＷＡＴＡ−２１を用いた。そ
れぞれの組み合わせで二回ずつ反応し、配列を解読し
た。その結果ゲノムＤＮＡには８８０〜９５６ｂｐ（Ｉ
ｎｔｒｏｎｅ Ｉ）、１２９０〜１３４８ｂｐ（Ｉｎｔ
ｒｏｎｅ II）、１５９３〜１６４８ｂｐ（Ｉｎｔｒｏ
ｎｅ III)と１７８０〜１８３５ｂｐ（Ｉｎｔｒｏｎｅ
IV）の計４つのイントロンが存在していることが判明
した。

【００４７】配列表２において、イントロン配列の非翻
訳開始認識配列、その終了配列、およびイントロン内部
の調節配列は下記の通りであった（数字は配列表２の配
列番号である）： ＩｎｔｒｏｎｅＩ 880〜 885、 934〜 936、 921〜 9
27、 ＩｎｔｒｏｎｅII 1290〜1295、1346〜1348、1333〜13
39、 ＩｎｔｒｏｎｅIII 1593〜1598、1646〜1648、1630〜16
36、 ＩｎｔｒｏｎｅIV 1780〜1785、1833〜1835、1819〜18
25。

【００４８】実施例８ 組み換えプラスミドの調製 Ｈ．インソレンスにＮＣＥ１遺伝子を再導入するため
に、まずＡ．ニデュランスｔｒｐＣの遺伝子のプロモー
ターとターミネーター（Mullaney E.J.,et al.,Mol.Ge
n.Genet.(1985)199,37-45) を用いてビアホラス耐性遺
伝子（bar:ThompsonC.J.,et al.,EMBO J.(1987)6,2519-
2523)をＨ．インソレンスで発現可能にした遺伝子を作
製した。これをＮＣＥ１遺伝子を含むプラスミドｐＭ３
−１のＸｂａＩ部位に導入し、組み換えプラスミドｐＮ
ＣＥ１を作製した。

【００４９】実施例９ セルラーゼＮＣＥ１遺伝子の発
現（Ｉ） Ｈ．インソレンスを（Ｓ）培地中で３７℃で培養した。
（Ｓ）培地の組成は実施例１の（Ｎ）培地にグルコース
（３．０ ％）を加え、アビセルを除いたものである。
２４時間培養後得られた菌体を３０００ｒｐｍ１０分遠
心して菌体を集め、０．５Ｍシュークロースで１回洗浄
した。菌体を０．４５μｍのフィルターで濾過したプロ
トプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍｌ Novozyme234，５
ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10 ，０．５Ｍ シュ
ークロース）１０ｍｌで懸濁しＬ字管に入れた。３０℃
で約９０分振盪し、プロトプラスト化させた。滅菌した
綿で濾過して２５００ｒｐｍで１０分遠心しプロトプラ
ストを回収し、更にＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍ シュー
クロース，１０ｍＭ ＣａＣｌ_２，１０ｍＭトリス塩酸
ｐＨ７．５）で１回洗浄した。その後、プロトプラス
トを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液で懸濁し、このうち１００
μｌに対し１μｇ／μｌのプラスミドｐＮＣＥ１のＤＮ
Ａ溶液を１０μｌ加え氷中に５分静置した。４００μｌ
のＰＥＧ溶液（６０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００，１０
ｍＭ ＣａＣｌ_２，１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５）
を加え、氷中に２０分間静置し１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝
液を加え、２５００ｒｐｍで１０分遠心し洗浄した。更
に１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心してプロトプラストを集め、最終的に１
００μｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。形質転換体を選
択するため、あらかじめビアラホス２００μｇ／ｍｌを
添加したＹＭＧ培地に懸濁したプロトプラストをのせた
（ＹＭＧ培地の組成は、グルコース１％、酵母エキス
０．４％、モルトエキス０．２％、寒天１％、ｐＨ６．
８である）。その後、４５℃程度に温めておいたＹＭＧ
培地（寒天０．６％）を２ｍｌ注ぎプロトプラストに重
層した。３７℃で５日間培養した後、ビアラホスに耐性
を示すコロニーを釣菌し、アボーティブ株を除去した後
培養試験を行った。培養は、（Ｎ）培地中で３７℃で５
日間行った。培養上清をSDS-PAGEに供したところ、ＮＣ
Ｅ１タンパク質が３〜５倍に発現増強していることが確
認された。

【００５０】実施例１０ セルラーゼＮＣＥ１遺伝子の
発現（II） セルラーゼＮＣＥ１遺伝子のプロモーターおよびターミ
ネーターをアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillu
s nidulans）で発現させるために、開始コドンの直ぐ上
流および終始コドンの直ぐ下流にＢａｍＨＩ消化部位を
以下のように部位指定変異により導入した。プラスミド
ｐＭ８をＥ．ｃｏｌｉ ＣＪ２３６株に導入し、ヘルパ
ーファージＭ１３Ｋ０７を感染させた後、アンピリシ
ン、カナマイシンをそれぞれ１５０μｇ／ｍｌ、７０μ
ｇ／ｍｌの濃度で含む２０ｍｌの２×ＹＴ液体培地
（１．６％バクトトリプトン、０．８％酵母エキス、
０．５％ＮａＣｌ）で、３７℃、１６〜２０時間培養
し、培養上清よりプラスミドｐＭ８のｓｓＤＮＡを回収
した。このｓｓＤＮＡと２種の合成オリゴヌクレオチド
5'-CATCTTGTAAAGGATCCTGGTGAGATG-3' 、5'-GCAGAGCGGAT
CCTGATTTTGAGC -3' を用い、Ｍｕｔａｎ−Ｋキット（宝
酒造社製）を使用して部位指定変更処理を行なった。変
更が導入されたプラスミドｐＭ８−１をＢａｍＨＩで消
化し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。プロモータ
ーおよびターミネーターとして、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉ
ｇｅｒ）α‐アミラーゼ遺伝子プロモーター（０．６ｋ
ｂｐ）およびＡ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子ターミネ
ーター（０．７４ｋｂｐ）を、マーカー遺伝子として
Ａ．ニデュランスａｒｇＢ遺伝子をそれぞれ含むＡ．ニ
デュランス用発現ベクターのＢａｍＨＩ部位に、上述の
ＤＮＡ断片を挿入してプラスミドｐＮＣＥ２を作製し
た。

【００５１】このプラスミドｐＮＣＥ２を用いて、Ａ．
ニデュランスＦＧＳＣ８９株を以下のようにして形質転
換した。Ａ．ニデュランスＦＧＳＣ８９株より分生子を
調製し、１００ｍｌのプロトプラスト形成用培地（２％
可溶性澱粉、１％ポリペプトン、０．２％酵母エキス、
０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４）に植菌
し、３７℃で２０〜４０時間培養した。菌体をＧ−１ガ
ラスフィルターで濾過して集菌し、フィルター上で１．
２Ｍ ＭｇＳＯ_４を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．８）で充分洗浄した。５０ｍｇ Ｎｏｖｏ
ｚｙｍ ２３４、１０ｍｇ β‐グルクロニダーゼを１
０ｍｌの上述の緩衝液に溶解しておいた５０ｍｌ容のチ
ューブにこの菌体を移し、３０℃で１〜２時間ゆっくり
振盪してプロトプラストを形成させた。その後、Ｇ−２
ガラスフィルターで溶解しなかった菌糸を除き、ろ液を
遠心してプロトプラストを集めた。プロトプラストを２
回ＳＴＣ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２Ｍソルビトール）
で先浄した後、２００〜５００μｌのＳＴＣ緩衝液に懸
濁した。このプロトプラスト懸濁液１００μｌを、１０
μｌのＤＮＡ溶液と混合し、氷中に５分間放置した後、
２５μｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ_２）を混合してさらに氷中に２０分間放置した。１．
２５ｍｌＰＥＧ溶液を加え室温に２０分間放置した後、
１０ｍｌのＳＴＣ緩衝液でこれを希釈し、集菌し、２０
０μｌＳＴＣ緩衝液懸濁液とした。この懸濁液から一部
を採取し、重層用培地と混合して選択培地上に重層し
た。３７℃で培養し、出現したコロニーを形質転換体と
した。プラスミドｐＮＣＥ２による形質転換体を２％可
溶性澱粉を炭素源とする液体培地で培養し、その培養上
清について、４‐メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−セ
ロビオシドを基質としてセルラーゼ活性を測定した結
果、親株の１０〜２００倍のセルラーゼ活性が検出され
た。

【００５２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gln Ile Lys Ser Tyr -20 Ile Gln Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ala -15 -10 -5 Gln Gln Ala Gly Thr Ile Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Met Thr Trp 1 5 10 15 Lys Arg Cys Ser Gly Pro Gly Asn Cys Gln Thr Val Gln Gly Glu Val 20 25 30 Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asn Asn Gly Gln Asn Cys 35 40 45 Tyr Glu Gly Asn Lys Trp Thr Ser Gln Cys Ser Ser Ala Thr Asp Cys 50 55 60 Ala Gln Arg Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ser Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His 85 90 95 Glu Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Ala Asn Gln 100 105 110 Asn Lys Tyr Gln Met Phe Thr Leu Met Asn Asn Glu Phe Ala Phe Asp 115 120 125 Val Asp Leu Ser Lys Val Glu Cys Gly Ile Asn Ser Ala Leu Tyr Phe 130 135 140 Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser Asn Arg 145 150 155 160 Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Ala Arg 165 170 175 Asp Leu Lys Phe Ile Gly Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp Arg Pro 180 185 190 Ser Thr Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Pro Met Gly Ala Cys Cys 195 200 205 Ala Glu Ile Asp Val Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Phe Thr 210 215 220 Pro His Ala Cys Gly Ser Lys Asn Arg Tyr His Ile Cys Glu Thr Asn 225 230 235 240 Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Cys Asp 245 250 255 Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Lys Asp Phe 260 265 270 Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Thr Val Val 275 280 285 Ser Arg Phe Glu Arg Asn Arg Leu Ser Gln Phe Phe Val Gln Asp Gly 290 295 300 Arg Lys Ile Glu Val Pro Pro Pro Thr Trp Pro Gly Leu Pro Asn Ser 305 310 315 320 Ala Asp Ile Thr Pro Glu Leu Cys Asp Ala Gln Phe Arg Val Phe Asp 325 330 335 Asp Arg Asn Arg Phe Ala Glu Thr Gly Gly Phe Asp Ala Leu Asn Glu 340 345 350 Ala Leu Thr Ile Pro Met Val Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His 355 360 365 His Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Pro Pro Glu Lys Ala 370 375 380 Gly Leu Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val 385 390 395 400 Pro Ala Glu Val Glu Ala Gln Tyr Pro Asn Ala Gln Val Val Trp Ser 405 410 415 Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Val Asn Val 420 425

【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：２２８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｈ．インソレンス（Humicola insolens ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：３１０．．３７５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：３７６．．１８９０ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置 ：８８０．．９３６ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置 ：１２９０．．１３４８ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置 ：１７８０．．１８６３ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：２４０．．２４５ 他の情報 ：ＳａｌＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：６０３．．６０８ 他の情報 ：ＳａｌＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：７６０．．７６５ 他の情報 ：ＳａｌＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：１１５２．．１１５７ 他の情報 ：ＫｐｎＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：１２６７．．１２７２ 他の情報 ：ＳａｌＩ 配列 TCTCCAATAA CGACGAAGCG ACTGTTGGCT GATCAATTAG CTGGCGATGG GTCTGTGGTA 60 TGGAACGTCG GCTGAGTCTT CCATCTCCCA CCGTAGACGT GTTCCGCGGA TCAAGGTCTC 120 CCGCTCCGTA ACCGCCCAGG TGGCTCGGTT CTTGATGATG GGAAAGGGGC CGACGGCAGT 180 ATAAAGAGCC ATGGAAGCAT CCCTCGAGGC CGGAAGGAAA TCTTGCTCAG CCACCCGCAG 240 TCGACTTGTC TATCGATCTG AGCAGCAGTT GACCGGTCTT CTCTGTCATC TCAGCAGCAG 300 TCTTTCAAG ATG CAG ATC AAG AGC TAC ATC CAG TAC CTG GCC GCG 345 Met Gln Ile Lys Ser Tyr Ile Gln Tyr Leu Ala Ala -20 -15 GCT CTG CCG CTC CTG AGC AGC GTC GCT GCC CAG CAG GCC GGC ACC ATC 393 Ala Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ala Gln Gln Ala Gly Thr Ile -10 -5 1 5 ACC GCC GAG AAC CAC CCC AGG ATG ACC TGG AAG AGG TGC TCG GGC CCC 441 Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Met Thr Trp Lys Arg Cys Ser Gly Pro 10 15 20 GGC AAC TGC CAG ACC GTG CAG GGC GAG GTC GTC ATC GAC GCC AAC TGG 489 Gly Asn Cys Gln Thr Val Gln Gly Glu Val Val Ile Asp Ala Asn Trp 25 30 35 CGC TGG CTG CAC AAC AAC GGC CAG AAC TGC TAT GAG GGC AAC AAG TGG 537 Arg Trp Leu His Asn Asn Gly Gln Asn Cys Tyr Glu Gly Asn Lys Trp 40 45 50 ACC AGC CAG TGC AGC TCG GCC ACC GAC TGC GCG CAG AGG TGC GCC CTC 585 Thr Ser Gln Cys Ser Ser Ala Thr Asp Cys Ala Gln Arg Cys Ala Leu 55 60 65 70 GAC GGT GCC AAC TAC CAG TCG ACC TAC GGC GCC TCG ACC AGC GGC GAC 633 Asp Gly Ala Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp 75 80 85 TCC CTG ACG CTC AAG TTC GTC ACC AAG CAC GAG TAC GGC ACC AAC ATC 681 Ser Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Ile 90 95 100 GGC TCG CGC TTC TAC CTC ATG GCC AAC CAG AAC AAG TAC CAG ATG TTC 729 Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Ala Asn Gln Asn Lys Tyr Gln Met Phe 105 110 115 ACC CTG ATG AAC AAC GAG TTC GCC TTC GAT GTC GAC CTC TCC AAG GTT 777 Thr Leu Met Asn Asn Glu Phe Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Lys Val 120 125 130 GAG TGC GGT ATC AAC AGC GCT CTG TAC TTC GTC GCC ATG GAG GAG GAT 825 Glu Cys Gly Ile Asn Ser Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp 135 140 145 150 GGT GGC ATG GCC AGC TAC CCG AGC AAC CGT GCT GGT GCC AAG TAC GGC 873 Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser Asn Arg Ala Gly Ala Lys Tyr Gly 155 160 165 ACG GGC GTACGTTCTC TCCGTCCCGC CCCTACCAAA AGTATGACTC GTGCTGACGT 929 Thr Gly TTG ACAG TAC TGC GAT GCC CAA TGC GCC CGT GAC CTC AAG TTC ATT GGC 978 Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Ala Arg Asp Leu Lys Phe Ile Gly 170 175 180 GGC AAG GCC AAC ATT GAG GGC TGG CGC CCG TCC ACC AAC GAC CCC AAC 1026 Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp Arg Pro Ser Thr Asn Asp Pro Asn 185 190 195 GCC GGT GTC GGT CCC ATG GGT GCC TGC TGC GCT GAG ATC GAC GTT TGG 1074 Ala Gly Val Gly Pro Met Gly Ala Cys Cys Ala Glu Ile Asp Val Trp 200 205 210 GAG TCC AAC GCC TAT GCT TAT GCC TTC ACC CCC CAC GCC TGC GGC AGC 1122 Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Phe Thr Pro His Ala Cys Gly Ser 215 220 225 230 AAG AAC CGC TAC CAC ATC TGC GAG ACC AAC AAC TGC GGT GGT ACC TAC 1170 Lys Asn Arg Tyr His Ile Cys Glu Thr Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr 235 240 245 TCG GAT GAC CGC TTC GCC GGC TAC TGC GAC GCC AAC GGC TGC GAC TAC 1218 Ser Asp Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr 250 255 260 AAC CCC TAC CGC ATG GGC AAC AAG GAC TTC TAT GGC AAG GGC AAG ACC 1266 Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Lys Asp Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr 265 270 275 GTC GAC ACC AAC CGC AAG TTC AC GTAAGTTCCC TGGCCGCCTC TTCGACGACG CAG 1322 Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Th 280 285 AATGTCCGGA TGCTGACCCA GAACAG C GTT GTC TCC CGC TTC GAG CGT AAC AGG 1376 r Val Val Ser Arg Phe Glu Arg Asn Arg 290 295 CTC TCT CAG TTC TTC GTC CAG GAC GGC CGC AAG ATC GAG GTG CCC CCT 1424 Leu Ser Gln Phe Phe Val Gln Asp Gly Arg Lys Ile Glu Val Pro Pro 300 305 310 CCG ACC TGG CCC GGC CTC CCG AAC AGC GCC GAC ATC ACC CCT GAG CTC 1472 Pro Thr Trp Pro Gly Leu Pro Asn Ser Ala Asp Ile Thr Pro Glu Leu 315 320 325 TGC GAT GCT CAG TTC CGC GTC TTC GAT GAC CGC AAC CGC TTC GCC GAG 1520 Cys Asp Ala Gln Phe Arg Val Phe Asp Asp Arg Asn Arg Phe Ala Glu 330 335 340 ACC GGT GGC TTC GAT GCT CTG AAC GAG GCC CTC ACC ATT CCC ATG GTC 1568 Thr Gly Gly Phe Asp Ala Leu Asn Glu Ala Leu Thr Ile Pro Met Val 345 350 355 CTT GTC ATG TCC ATC TGG GAT GAC GTATGTGGCA CCAACCTCCA ACCGGGCATG AG 1624 Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp 360 365 ACCTGTACTG ACGTGTCTTG ACAG CAC CAC TCC AAC ATG CTC TGG CTC GAC TCC 1678 His His Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser 370 375 AGC TAC CCG CCC GAG AAG GCC GGC CTC CCC GGT GGC GAC CGT GGC CCG 1726 Ser Tyr Pro Pro Glu Lys Ala Gly Leu Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro 380 385 390 TGC CCG ACC ACC TCT GGT GTC CCT GCC GAG GTC GAG GCT CAG TAC CCC 1774 Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gln Tyr Pro 395 400 405 AAT GC GTACGTTACT ACCGCCGCTG CATCTGCAAA AAATACCGGT GCTAACCATT GTG 1832 Asn Al 410 CAG T CAG GTC GTC TGG TCC AAC ATC CGC TTC GGC CCC ATC GGC TCG ACC 1881 a Gln Val Val Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr 415 420 425 GTC AAC GTC TAAGCTATCA CGGCTCAAAA TCAGCGCCCG CTCTGCTCGT CCTGTTCGGC 1940 Val Asn Val GCGCCAGTAG GGGGATATGG GGCATTTCTT TGTTCAAGCA TTTTTCTCTT CGTCCTGCTA 2000 CATATTGAGA TTGTGTATCG TATGCACGCG TACAAAGTAG AAACCATGAT CAAGTCTCAT 2060 TGAACTATAC TGCTGCTCCC AAGATTAATT ATGCCGTAAT GGTCTGTTTG CTTTTTTTTT 2120 TTTTTTTTTT TGGTGCACTT GATCGTGTGG CACATTGGCC GCTGTATGTA TGGCTTCCCT 2180 CAATCGCCGA CTGACTCAAA ACGGCAGTAC AACAGAAGCC CCATTGCATC AGAAGAGAGG 2240 TTTTATAATG CCATGAGGTG TTCTCAGATG AAAGACTTCG AGTAT 2285

【００５４】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Ala Gly Thr Ile 1 5

【００５５】配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Xaa Xaa Lys Asp Phe Tyr Gly Lys 1 5

【００５６】配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Ala Gly Tyr Xaa Asp Ala Asn Gly Xaa Asp Tyr Asn Pro Tyr 1 5 10 15

【００５７】配列番号：６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGTAAAACGA CGGCCAGTAA YGGNTGYGAY TAYAA 35

【００５８】配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGACCTT NCCRTARAART CYTT 34

【００５９】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCCTACCGC ATGGGCAAC 19

【００６０】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 AACCCCTACC GCATGGGCAA CAA 23

【００６１】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TTGTTGCCCA TGCGGTAGGG GTT 23

【００６２】配列番号：１１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 GGCGAACTCG TTGTTCATCA GGG 23

【００６３】配列番号：１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 GGCCGGAAGG AAATCTTGCT CAG 23

【００６４】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 ACAAGTGGAC CAGCCAGTGC AGC 23

【００６５】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TCTGTACTTC GTCGCCATGG AGG 23

【００６６】配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 CAACAACTGC GGTGGTACCT ACTC 24

【００６７】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TTCGATGACC GCAACCGCTT CGC 23

【００６８】配列番号：１７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TCAGGTCGTC TGGTCCAACA TCC 23

【００６９】配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 CAATCTCAAT ATGTAGCAGG ACG 23

【００７０】配列番号：１９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TGGAGTCGAG CCAGAGCATG TTG 23

【００７１】配列番号：２０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 CCTGGACGAA GAACTGAGAG AGC 23

【００７２】配列番号：２１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 ACTCCCAAAC GTCGATCTCA GCG 23

【００７３】配列番号：２２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 TCATCAGGGT GAACATCTGG TAC 23

【００７４】配列番号：２３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＦＩＴＣ標識 配列 CGAGCACCTC TTCCAGGTCA TCC 23

【００７５】配列番号：２４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCAGATCA AGAGCTACAT CC 22

【００７６】配列番号：２５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACGTTGACG GTCGAGCCGA TG 22

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭ３−１の制限酵素地図を示した
図である。

【図２】４．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図と
ｐＭ５、ｐＭ７およびｐＭ８との関係を示した図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青 柳 薫 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内 (72)発明者 浜 谷 徹 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 平 山 匡 男 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 村 上 健 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表１に記載されるアミノ酸配列の一部
   もしくは全部を有するタンパク質またはその誘導体。
2. 【請求項２】配列表１に記載されるアミノ酸配列の１〜
   ４２９番の配列からなる、請求項１に記載のタンパク
   質。
3. 【請求項３】配列表１の−２２〜−１番の配列をＮ末端
   側に更に有してなる、請求項２に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】セルラーゼ活性を有する、請求項１〜３い
   ずれか一項に記載のタンパク質。
5. 【請求項５】請求項１〜３いずれか一項に記載のアミノ
   酸配列をコードする、ＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】ＤＮＡ配列が配列表２に記載される塩基配
   列の一部または全部を有する、請求項５に記載のＤＮＡ
   配列。
7. 【請求項７】ＤＮＡ配列が配列表２の３１０〜１８９３
   番の塩基配列を有する、請求項６に記載のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】請求項５〜７いずれか一項に記載のＤＮＡ
   配列を含んでなる、発現ベクター。
9. 【請求項９】請求項８に記載の発現ベクターによって形
   質転換された微生物。
10. 【請求項１０】請求項９に記載の微生物を培養し、そし
    て培養物から請求項１〜４いずれか一項に記載のタンパ
    ク質を採取することを含んでなる、請求項１〜４いずれ
    か一項に記載のタンパク質の製造法。