JP2003164284A - 新規エンドグルカナーゼおよびエンドグルカナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新規なエンドグルカナーゼ、該酵素をコードす
る遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクター
によって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を
用いたエンドグルカナーゼの製造方法を提供すること。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む蛋白質、該蛋白
質をコードするエンドグルカナーゼ遺伝子、別の特定の
アミノ酸配列で表される塩基配列を含むDNAを含むエン
ドグルカナーゼ遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベ
クター、該組換えベクターを含む形質転換体、および前
記形質転換体を培養して得られる培養物からエンドグル
カナーゼ蛋白質を採取することを特徴とするエンドグル
カナーゼの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンドグルカナー
ゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え
ベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換
体及び該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼの製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンド−β−１，４−グルカナーゼ（EC
3.2.1.4、本明細書では、エンドグルカナーゼという）
は、セルロース、リケニン、β−Ｄ−グルカンの１，４
−β−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する酵素であり、
セルラーゼのと呼ばれる酵素のうちの一つである。セル
ロースは、植物の細胞壁の主要成分であり、そのセルロ
ースの内部のグリコシド結合を切断するエンドグルカナ
ーゼは、植物性成分の分解において重要な役割を果た
す。したがって、エンドグルカナーゼは、植物性バイオ
マスの分解、洗剤、食品加工など、幅広い産業分野にお
いて利用されており、活発な研究がなされてきた。エン
ドグルカナーゼについては、多数の報告がある。例え
ば、子嚢菌類由来では、アスペルギルス・ニガー（特表
平１１−５０２１１２）、アスペルギルス・アキュリア
タス（WO93/20193）、トリコデルマ・リーゼイ（特開平
７−５１０７１）等、担子菌類では、マクロフォミア・
ファセオリナ（Gene, 158(1):125-8, 1995）等、ツボカ
ビ類では、ルーメン真菌であるオルピノマイセス・ジョ
ヨニイ（Gene, 245(1),119-126, 2000）由来のものが知
られている。バクテリア由来のものでは、例えば、バチ
ルス・ラウタス（Gene, 93(1):55-60, 1990）、クロス
トリジウム・セルロボランス（Mol Gen Genet, 231(3):
472-9, 1992）由来のもの等が知られている。以上のエ
ンドグルカナーゼは、遺伝子についても報告されてい
る。また、アスペルギルス・カワチイ由来のエンドグル
カナーゼについて、塩基配列（Itoら、translations fr
om annotated coding regions in GenBank, BAB62317,
2001）・アミノ酸配列（Itoら、GenBank, AB055431, 20
01）が報告されている。エンドグルカナーゼに関する研
究の進んでいる糸状菌トリコデルマ・リーゼイについて
は、前述の他にも4種のエンドグルカナーゼ及びその遺
伝子が報告されている（Gene, 63(1):11-22, 1988 ; Mo
l. Microbiol., 13(2):219-228, 1994 ;Eur. J. Bioche
m., 249(2):584-591, 1997 ; Appl. Environ. Microbio
l., 64:55-563, 1998)。黄麹菌であるアスペルギルス・
オリゼーおよび、アスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤
油・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古く
から使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用
による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要
な微生物である。これら黄麹菌については、アスペルギ
ルス・オリゼーの２種のセルラーゼ（CelA, CelB）およ
びその遺伝子が知られているに過ぎない（Appl Microbi
ol Biotechnol, 46(5-6):538-44, 1996）。上記トリコ
デルマ・リーゼイのように、糸状菌は多種にわたるエン
ドグルカナーゼを生産し、これらは相乗的に作用すると
考えられており、黄麹菌においても新規のエンドグルカ
ナーゼ及びその遺伝子の取得が期待されていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規エンド
グルカナーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝
子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換
された形質転換体及び該形質転換体を用いたエンドグル
カナーゼの製造方法を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため研究を重ね、黄麹菌より新規エンドグルカ
ナーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明
を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の
(a)、(b)又は(c)の蛋白質である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有す
る蛋白質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配
列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部
分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋
白質

【０００５】さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は
(c)の蛋白質をコードするエンドグルカナーゼ遺伝子で
ある。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有す
る蛋白質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配
列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部
分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋
白質

【０００６】さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)
又は(d)のDNAを含むエンドグルカナーゼ遺伝子である。 (a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を
含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコー
ドするDNA (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核
酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性
を有する蛋白質をコードするDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の配
列同一性を示し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する
蛋白質をコードするDNA さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクタ
ーである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含
む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換
体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋
白質を採取することを特徴とするエンドグルカナーゼの
製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】

【発明の実施の形態】１．本発明のエンドグルカナーゼ 本発明のエンドグルカナーゼは、配列番号２で表される
アミノ酸配列を含む蛋白質である。該酵素は、例えば、
アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ソーヤな
どの黄麹菌の培養物から精製することができる。また、
該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたエンドグ
ルカナーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させ
ることにより得られる。本発明のエンドグルカナーゼ
は、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されていてもよい。さらに、エンドグル
カナーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列と70%以上、望ましくは80％以上、さらに望ま
しくは85％以上、最も望ましくは90％以上の配列同一性
を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその部分断片
であってもよい。２つのアミノ酸配列または塩基配列に
おける配列同一性を決定するために、配列は比較に最適
な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップ
を入れることにより、他方の配列とのアラインメントの
最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基ま
たは塩基が比較される。第一の配列における、ある部位
に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基また
は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位にお
いて同一である。２つの配列における配列同一性は、配
列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸または
全塩基）数に対する百分率で示される。

【０００８】上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列ま
たは塩基配列における配列同一性は、Karlin および Al
tschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7:2264-2268, 1990およびProc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなア
ルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulらによ
って開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。
更に、Gapped BLASTはBLASTより感度良く配列同一性を
決定するプログラムである(Nucleic Acids Res.25:3389
-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配
列にたいし、高い配列同一性を示す配列をデータベース
中から検索するために用いられる。これらは、例えば米
国National Center for Biotechnology Informationの
インターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であ
る。配列間の配列同一性として、本明細書では、Tatian
a A. Tatusova らによって開発されたBLAST 2 Sequence
sソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 174:247-250,1
999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは
米国National Center for Biotechnology Information
のインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能で
あり、入手も可能である。用いるプログラムおよびパラ
メーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、
blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open g
ap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropof
f: 50,expect: 10, word size: 3, Filter: ON を用い
る。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメー
ターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for a
mismatch: -2, Strand option: Both strands, Open ga
p: 5 and extension gap: 2 penalties, gap x_dropo
ff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter:ON を用
いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフ
ォルト値として用いられているものである。ただし、上
記BLASTソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が
見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェ
ア(W.R. Pearson and D.J. Lipman,Proc. Natl. Acad.
Sci., 85:2444-2448, 1988)を用いて配列同一性を示す
配列をデータベースから検索することもできる。FASTA
ソフトウェアは例えば、ゲノムネットのウェブサイトで
利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値
を用いる。たとえば、塩基配列についての検索を行う場
合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用い
る。ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以
上、または70%以上のオーバーラップを示さない場合
は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないた
め、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いな
い。

【０００９】２．エンドグルカナーゼ遺伝子のクローニ
ング 本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、例えば、アスペ
ルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹
菌、その他の糸状菌、またはその他の真菌類から得るこ
とが出来る。さらに具体的には、例えば、アスペルギル
ス・オリゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、エ
ンドグルカナーゼを生産する条件の培地で培養したもの
から、常法により全RNAを回収する。培地としては、例
えば、ふすま培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオ
ン水を加え、121℃・50分オートクレーブしたもの）を
用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30
時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量
（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathala
らの方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製す
る。

【００１０】得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行
う。プライマーとしては、本発明のエンドグルカナーゼ
遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどの
ような組み合わせのものを用いてもよいが、例えば、配
列番号３および配列番号４の配列のオリゴヌクレオチド
を用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例え
ばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法により行う
ことができる。得られた、本発明のエンドグルカナーゼ
遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに
組み込むことができる。このようにして得られたDNAの
塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシ
ークエンサーを用いて決定することができる。このよう
にして得られる本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を含
むDNA及びそれによりコードされるエンドグルカナーゼ
の例をそれぞれ配列番号１および配列番号２に例示す
る。

【００１１】本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、上
記のもののほか、エンドグルカナーゼ活性を有する限
り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであって
もよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼ
ーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法
によって得ることもできる。本発明のエンドグルカナー
ゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによ
る選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源として
は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス
・オリゼなどの黄麹菌があげられる。これらの生物か
ら、常法によりRNAまたはゲノムDNAを調製し、プラスミ
ドまたはファージに組み込み、ライブラリーを調製す
る。続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じ
た方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分
な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番
号１に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましく
は200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分また
は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプロ
ーブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするク
ローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイ
ゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハ
イブリダイゼーションによって、ファージライブラリー
ならプラークハイブリダイゼーションによって行うこと
ができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイ
ブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナ
ルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダ
イゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さに
よって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーシ
ョンの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変え
ることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイ
ブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合に
は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると
ともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより
特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリ
ッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応
じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを
安定化させることが出来る。このような最適化は、本技
術分野の研究者が容易に行いうるものである。

【００１２】ストリンジェントな条件の具体例として
は、例えば、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.
0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試
薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラ
ウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜
１６時間程度）で行ない、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/
V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15
分間、2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温
度は、50℃以上、好ましくは55℃以上、更に好ましくは
60℃以上、最も好ましくは67℃以上である。

【００１３】また、配列番号１に記載の塩基配列と70％
以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以
上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すような
塩基配列は、本発明のエンドグルカナーゼと実質的に同
等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられ
る。上記の様な塩基配列の配列同一性やコードするアミ
ノ酸配列の配列同一性を示すようなDNAは、上記の様に
ハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、
ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA
群や公共データベースのなかから例えば前述のBLASTソ
フトウェアを用いた検索により発見することも容易であ
る。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用い
ている方法である。このようにして得られたDNAがエン
ドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードしているこ
とは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当
な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してエンドグル
カナーゼ活性を測定することにより確認することができ
る。

【００１４】２．組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、本発明のエンドグルカナー
ゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得る
ことができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中
でエンドグルカナーゼを生産させうるものであればどの
ようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミ
ド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み
型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択すること
を可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよ
い。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのよ
うな、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシ
リンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対す
る抵抗遺伝子などが上げられる。また、組換えベクター
は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来
るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハン
サー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列
等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具
体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモータ
ー、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のた
めのタグをつける事もできる。例えば、エンドグルカナ
ーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチ
ジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続すること
により、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすること
ができる。

【００１５】３．形質転換体の取得 本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクタ
ーで形質転換することにより得られる。宿主としては、
本発明のエンドグルカナーゼを生産することが出来るも
のであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・
セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、
アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コ
リ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形
質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来
る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Me
thods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法など
を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロ
トプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カ
ルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(19
89)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は
例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzy
mol., 194, 182-187(1990)の方法などを用いることがで
きる。

【００１６】４．エンドグルカナーゼの製造 本発明のエンドグルカナーゼの製造法は、本発明の形質
転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナー
ゼ蛋白質を採取することからなる。培地及び培養方法
は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によ
って適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス
・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーター
である場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体
最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノ
ースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養
することにより、本発明のエンドグルカナーゼを生産さ
せることができる。また、例えば、宿主がアスペルギル
ス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターで
ある場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少
培地で培養することにより、本発明のエンドグルカナー
ゼを生産させることができる。また、例えば、宿主が大
腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場
合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発
明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。本
発明のエンドグルカナーゼが菌体内または菌体表面に生
産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適
当に処理することにより本発明のエンドグルカナーゼを
得ることができる。培養液中に本発明のエンドグルカナ
ーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体
を除去することにより本発明のエンドグルカナーゼを得
ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマ
トグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常
法により、本発明のエンドグルカナーゼを更に純度の高
いものとして得ることもできる。また、精製用のタグ配
列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する
精製法を用いることもできる。例えば、ヒスチジン6残
基の配列を付加してある場合には、ニッケルカラムを用
いた精製を行うことができる。

【００１７】本発明のエンドグルカナーゼの活性は、例
えば、次の方法で測定できる。 ［エンドグルカナーゼ活性測定法］用いる溶液は下記の
とおりである。 基質溶液：2% Azo-CM-cellulose (Megazyme) in 100 mM
酢酸ナトリウム, pH4.5 基質懸濁液: 2% Azo-alpha cellulose (Megazyme) in 1
00 mM 酢酸ナトリウム,pH4.5 （不溶性） 基質懸濁液: 2% Azo-avicel (Megazyme) in 100 mM 酢
酸ナトリウム, pH4.5 （不溶性） 反応停止液: 4% 酢酸ナトリウム3水和物, 0.4% 酢酸亜
鉛, 80% エタノール, pH5.0に塩酸で調整 基質溶液または基質懸濁液50μlと試料溶液50μlを混合
し、37℃で保温する。反応時間は活性の強度に応じて調
節する。反応停止液250μlを加え、混合した後、室温で
10分間放置する（Ａ）。ブランクでは、基質溶液に反応
停止液を加え、10分間放置してから試料溶液を加える
（Ｂ）。10,000rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清の
590 nmの吸光度を測定する。（Ａ）の上清の吸光度から
（Ｂ）の上清の吸光度を減じたものをΔODとし、この値
の大きさを活性の指標とする。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示し、本説明をより具体的に
説明するが、本説明はこれらによって制限されるもので
はない。 １．アスペルギルス・オリゼーのエンドグルカナーゼ遺
伝子のクローニング アスペルギルス・オリゼー RIB40株の分生子約100,000
個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地
（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体
窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒
素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて
念入りに粉砕した。粉砕された培養物から、Cathalaら
の方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを抽出し
た。更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase
I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた
全RNA0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造
製）を用いてRT-PCRを行った。逆転写反応のプライマー
はオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに
付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃
5分で行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キット
に添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメ
ラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、
キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを
用いて、5'側は開始コドンの直前から、3'側はポリA部
分から増幅した。 C64FH: 5'- GCT TGT CAT AAT GCA ACC ATT AC -3' （配列番号3） PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、54℃15秒、72℃2
分を15サイクル行い、72℃3分を行った。なお、サーマ
ルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJResear
ch製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコ
ントロールによった（以下のPCRでも同様）。続いて、
上記RT-PCRの増幅産物を鋳型として、上記C64FH及び下
記のプライマーを用いて、PCRを行った。耐熱性 DNAポ
リメラーゼとしては、Tbr EXT DNA Polymerase（Fynnzy
mes製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の
説明書に従った。

【００１９】 C64RH: 5'- AAC AGT CAA AGT AAA GTT GAC CGT AT -3' （配列番号4） PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、60℃20秒、72℃1
分45秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物
の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約
1.7kbのバンドが確認された。次いで、pYES2.1 TOPO TA
Cloning Kit（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物
をpCR2.1/V5-His-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TO
P10F'株を形質転換し、形質転換体18クローンを得た。
各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素PvuII
（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動
したところ、8クローンがプロモーターに対して正しい
向きに断片が挿入されていた。この8クローンについて
塩基配列を決定した。

【００２０】塩基配列の決定は、試薬としてCEQ DTCS
Quick Start Kit（ベックマン・コールター製）を用
い、シークエンサーとしてはCEQ 2000XL（ベックマン・
コールター製）を用いて、サンガー法により行った。得
られた8クローンの塩基配列を比較したところ、うち1ク
ローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。こ
の、変異を含まないクローンのプラスミド「pC64H」
は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンターに寄託番号Ｐ−１８６４１として寄託した。ま
た、pC64Hに含まれるクローンの開始コドンからベクタ
ー由来配列直前までの塩基配列を配列番号１に記載す
る。pC64Hは、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリ
ン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内で
の自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモータ
ーとCYC1ターミネーターの間に、エンドグルカナーゼ遺
伝子がC末にヒスチジンをコードする６コドンを含むベ
クター由来の配列との融合遺伝子として挿入された構造
を持つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内で
ガラクトースによりエンドグルカナーゼを誘導生産する
ことが可能となる。

【００２１】配列番号１の塩基配列を解析したところ、
このDNAは、569アミノ酸からなる蛋白質をコードしてい
ることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記
載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配
列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索し
た。検索には、NCBI blastp(http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指
定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列
同一性を示したのは、バチルス・ラウタスのエンドグル
カナーゼＢ（Gene, 93(1):55-60, 1990）の537残基に対
して、28%一致であった。また、BLAST 2 Sequencesソフ
トウェアのblastpを用いて配列同一性を求めたところ53
7残基中29%であった。これらの結果から、配列番号1に
記載のDNAによりコードされた、配列番号2に記載のアミ
ノ酸配列の蛋白質は、新規の配列を持つことが分かり、
また、エンドグルカナーゼ活性を有することが推測され
た。また、配列番号１の塩基配列について配列同一性の
高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn(http://w
ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースと
しては、nrを指定した。その結果、有意な配列同一性を
示したのは得られなかった。そこで、FASTAソフトウェ
ア(http://fasta.genome.ad.jp/)を用いて、データベー
スnr-ntに対して検索したところ、アクレモニウムのエ
ンドグルカナーゼ遺伝子（米国特許6,071,735、配列番
号５）の、560塩基の部分に対して59%の配列同一性を示
した。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblastn
を用いて配列同一性を求めたところ80%の配列同一性を
示す55塩基の部分が検出されたのみであった。

【００２２】２．形質転換体の取得 酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラ
シル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpC64Hで形質転
換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択するこ
とにより、形質転換体INVSc1/pC64H株を得た。また、ネ
ガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2.1/
V5-His/lacZ（ベクターにlacZ遺伝子が組込まれたプラ
スミド、以後pYES2.1lacZと略す）で形質転換したINVSc
1/pYES2.1lacZ株を得た。

【００２３】３．エンドグルカナーゼの製造 INVSc1/pC64H株及び、ネガティブコントロールのINVSc1
/pYES2.1lacZ株を培養し、エンドグルカナーゼを得た。
まず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含み
ウラシルを含まない20mlのSC培地（最少培地）に接種
し、30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の
600nmにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種した
ときにODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、
遠心分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌
体を2%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC
培地（誘導培地）に懸濁し、30℃で振盪培養した。4時
間, 8時間, 24時間後に10 mlずつサンプリングし、遠心
分離後、菌体を回収した。菌体を1 mlの冷水に懸濁し、
遠心分離。上澄を除き、菌体を-80℃で保存した。菌体
に下記の組成の緩衝液200 μlを加えて懸濁し、微量遠
沈管に移し、ガラスビーズを250 μl程度加えた。マル
チビーズショッカーMB-200（安井器械製）にセットし、
80％出力で1 min破砕、1 min放置を15回繰り返した。破
砕後、14000 rpmで20 min遠心分離し、上澄を回収し、-
80℃で保存した。 菌体破砕用緩衝液 20 mM Tris-HCl, pH7.5 5 mM MgCl2 50 mM KCl 5% グリセロール 1 mM EDTA 5 mMメルカプトエタノール 1 mM PMSF 1μg/ml ペプスタチンA 菌体破砕上澄のエンドグルカナーゼ活性を測定した（表
1）ところ、INVSc1/pC64H株の菌体破砕上澄に、Azo-CM-
celluloseに対する加水分解活性があった。

【００２４】

【表１】

【００２５】以上により、配列番号1記載のDNAを組込ん
だ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によ
りエンドグルカナーゼを製造することができた。また、
配列番号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2
記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がエンドグルカナーゼ
活性を有することも明らかになった。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、新規なエンドグルカナー
ゼ、エンドグルカナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え
ベクター及び形質転換体が提供された。また、本発明に
よりエンドグルカナーゼの製造方法が提供された。本発
明により、上記エンドグルカナーゼの蛋白質工学的な改
良が行えるようになった。本発明はまた、食品加工用の
酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用
いることができる。

【００２７】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Kikkoman Corporation <120> Novel Endoglucanase and Endoglucanase Gene <160> 4 <210> 1 <211> 1707 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae (RIB40) <400> １ ATGCAACCAT TACGGCTTTT GGCTCTCACA GCCATTCTTA AGGGCGCCTG GGCCCTCAGT 60 GCCAATTGTA CAGGGTCCTT TGACGCCATC TCGGCCTCTG ATTTCGTCGC AAATATCAAT 120 CCAGGGTGGA ATTTGGGAAA CAGTCTCGAT GCTACTCCCA ATGAAGATTC TTGGAATAAC 180 CCCACTGTTC AAGAATCGAC CTTTGACTAT GTCAAGGCAG CTGGTTTTAA AAGTGTTCGC 240 CTTCCAGTTA CTTGGACACA TCACTTCACT AGTGAATCTC CTGACTGGAC CGTTGATCCT 300 AAATGGCTGC AGAGAGTTTC TGATGTTATT GACATGATCA CGTCTCGTGG TCTGTACACT 360 ATTGTCAATG TCCATCACGA TTCCTGGGAA TGGGCGGATG TCACTAAATC TGATGCAAAC 420 ATCACCCAAA TTGAACAGAA ATTTGAGAAA CTTTGGTATC AGATTGGTAC TAAGTTGGCT 480 TGCAAGTCAA GCATGGTCGC TTTCGAAACC ATCAATGAAC CACCTTGCAA TACTGCTGAA 540 GATGGTGCCA AGATCAATAA ATTCAATGAA ATTTTCCTCA GAGCAATCAA TCGTGCCGGG 600 GGCTTCAATG CAAAGCGAGT CGTCAACCTG GTAGGTGGAG GAATGGACAG TGTGAAAACT 660 TCACAGTGGT TCAAGACCCC CGCCAATATC ACAAATCCAT GGGCTCTTCA GTTCCATTTC 720 TATAGTCCTT ACGACTTTAT CTTCAGCGCA TGGGGCAAGA CTATATGGGG CTCGGACTCA 780 GATAAGAGTG AGCTTGACAG CACTCTCGGC CTTCTTCGAG GCAACTTCAC CGATGTTCCT 840 ATAGTCCTTG GAGAATTCGA TGCCTCTCCG ACCAACACTG AACCTGCAGC ACGCTGGAAG 900 TATCACGACT ACCTCATTCG CTCCACGAAG AAGTACAACA TGAGCCCTAT CATCTGGGAC 960 AACGGACTTG ATCACCTGGA CCGCTCATCA GGCATTTGGC GCGACCCAGT GTCAATCGAG 1020 ATCATCACCA ATGGGAATGA GACCAACAGT CTTCCCGACA GCACCGTAGA CACCTCTGCG 1080 CCAAGCCAGT CGTCTTCGGC ATACATTTAC CACAAAGTGG GAACAGAAGT CACTGATCAG 1140 ACTCTCCCCT TCATATTTAA CGACAACACC CTCGTCTCTA TCCAAGACTC AAAGGGCACC 1200 ACCCTAAAGG CAGACACAGA TTATACCGTC TCCGGTTCCA ACATCACATT CCCTGCCTCG 1260 TTCCTCTCAA CTTACTACTC GGAAACCAGC GAGCCAGGCC TCCTCCCCAA CTTCACCCTC 1320 AAATTCTCAT CAGGCGCATC CCCCGTCGTC CAACTCGTCC AATGGGACAC CCCGACACTC 1380 TCAAAGACCT CCGCTGCTGC CTCATCTATC TCCGGATCCG ACCTTTCCAT CCCCATCACA 1440 TGGAAAGGAC TTCCTAAACT CGCCACCGTA AAGGCCCTCC TCAACAACGG CACATACTTA 1500 GTTGATGACT TCACCCAATG GTTCGGACCT TTTGGCGAAG CCAGAACAAC ATACAGCAAC 1560 CAATGGAACT GGGATGACAA GAATGTGATT CTCACACAGG CTACGGTTGA GGCTGTTGTT 1620 GCTGCGGGAC AGGATACGGT CTTTACGTTC GAGTTCTTTC CACGCGTTGA CACAACCACA 1680 AATACGGTCA ACTTTACTTT GACTGTT 1707 <210> 2 <211> 569 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae (RIB40) <400> 2 Met Gln Pro Leu Arg Leu Leu Ala Leu Thr Ala Ile Leu Lys Gly Ala 1 5 10 15 Trp Ala Leu Ser Ala Asn Cys Thr Gly Ser Phe Asp Ala Ile Ser Ala 20 25 30 Ser Asp Phe Val Ala Asn Ile Asn Pro Gly Trp Asn Leu Gly Asn Ser 35 40 45 Leu Asp Ala Thr Pro Asn Glu Asp Ser Trp Asn Asn Pro Thr Val Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Phe Asp Tyr Val Lys Ala Ala Gly Phe Lys Ser Val Arg 65 70 75 80 Leu Pro Val Thr Trp Thr His His Phe Thr Ser Glu Ser Pro Asp Trp 85 90 95 Thr Val Asp Pro Lys Trp Leu Gln Arg Val Ser Asp Val Ile Asp Met 100 105 110 Ile Thr Ser Arg Gly Leu Tyr Thr Ile Val Asn Val His His Asp Ser 115 120 125 Trp Glu Trp Ala Asp Val Thr Lys Ser Asp Ala Asn Ile Thr Gln Ile 130 135 140 Glu Gln Lys Phe Glu Lys Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Thr Lys Leu Ala 145 150 155 160 Cys Lys Ser Ser Met Val Ala Phe Glu Thr Ile Asn Glu Pro Pro Cys 165 170 175 Asn Thr Ala Glu Asp Gly Ala Lys Ile Asn Lys Phe Asn Glu Ile Phe 180 185 190 Leu Arg Ala Ile Asn Arg Ala Gly Gly Phe Asn Ala Lys Arg Val Val 195 200 205 Asn Leu Val Gly Gly Gly Met Asp Ser Val Lys Thr Ser Gln Trp Phe 210 215 220 Lys Thr Pro Ala Asn Ile Thr Asn Pro Trp Ala Leu Gln Phe His Phe 225 230 235 240 Tyr Ser Pro Tyr Asp Phe Ile Phe Ser Ala Trp Gly Lys Thr Ile Trp 245 250 255 Gly Ser Asp Ser Asp Lys Ser Glu Leu Asp Ser Thr Leu Gly Leu Leu 260 265 270 Arg Gly Asn Phe Thr Asp Val Pro Ile Val Leu Gly Glu Phe Asp Ala 275 280 285 Ser Pro Thr Asn Thr Glu Pro Ala Ala Arg Trp Lys Tyr His Asp Tyr 290 295 300 Leu Ile Arg Ser Thr Lys Lys Tyr Asn Met Ser Pro Ile Ile Trp Asp 305 310 315 320 Asn Gly Leu Asp His Leu Asp Arg Ser Ser Gly Ile Trp Arg Asp Pro 325 330 335 Val Ser Ile Glu Ile Ile Thr Asn Gly Asn Glu Thr Asn Ser Leu Pro 340 345 350 Asp Ser Thr Val Asp Thr Ser Ala Pro Ser Gln Ser Ser Ser Ala Tyr 355 360 365 Ile Tyr His Lys Val Gly Thr Glu Val Thr Asp Gln Thr Leu Pro Phe 370 375 380 Ile Phe Asn Asp Asn Thr Leu Val Ser Ile Gln Asp Ser Lys Gly Thr 385 390 395 400 Thr Leu Lys Ala Asp Thr Asp Tyr Thr Val Ser Gly Ser Asn Ile Thr 405 410 415 Phe Pro Ala Ser Phe Leu Ser Thr Tyr Tyr Ser Glu Thr Ser Glu Pro 420 425 430 Gly Leu Leu Pro Asn Phe Thr Leu Lys Phe Ser Ser Gly Ala Ser Pro 435 440 445 Val Val Gln Leu Val Gln Trp Asp Thr Pro Thr Leu Ser Lys Thr Ser 450 455 460 Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ser Gly Ser Asp Leu Ser Ile Pro Ile Thr 465 470 475 480 Trp Lys Gly Leu Pro Lys Leu Ala Thr Val Lys Ala Leu Leu Asn Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Leu Val Asp Asp Phe Thr Gln Trp Phe Gly Pro Phe Gly 500 505 510 Glu Ala Arg Thr Thr Tyr Ser Asn Gln Trp Asn Trp Asp Asp Lys Asn 515 520 525 Val Ile Leu Thr Gln Ala Thr Val Glu Ala Val Val Ala Ala Gly Gln 530 535 540 Asp Thr Val Phe Thr Phe Glu Phe Phe Pro Arg Val Asp Thr Thr Thr 545 550 555 560 Asn Thr Val Asn Phe Thr Leu Thr Val 565 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 3 GCTTGTCATA ATGCAACCAT TAC 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 4 AACAGTCAAA GTAAAGTTGA CCGTAT 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 畑本 修 千葉県野田市野田399番地財団法人 野田 産業科学研究所内 (72)発明者 増田 力 千葉県野田市野田399番地財団法人野田産 業科学研究所内 (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 松田 俊文 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 伊藤 孝太郎 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 高橋 理 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 松島 健一朗 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA17 BA12 CA02 GA11 HA20 4B050 CC03 DD03 EE10 LL02 LL04 LL10 4B065 AA63Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA41 CA54 CA57

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質。 (a)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b)配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有す
   る蛋白質 (c)配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列
   同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分
   断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白
   質
2. 【請求項２】 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコード
   するエンドグルカナーゼ遺伝子。 (a)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b)配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有す
   る蛋白質 (c)配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列
   同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分
   断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白
   質
3. 【請求項３】 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む
   エンドグルカナーゼ遺伝子。 (a)配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (b)配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を
   含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコー
   ドするDNA (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核
   酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性
   を有する蛋白質をコードするDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の配
   列同一性を示し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する
   蛋白質をコードするDNA
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有す
   る組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取する
   ことを特徴とするエンドグルカナーゼの製造方法。