JP3874409B2 - 新規エンドグルカナーゼおよびエンドグルカナーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドグルカナーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ（EC 3.2.1.4、本明細書では、エンドグルカナーゼという）は、セルロース、リケニン、β−Ｄ−グルカンの１，４−β−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する酵素であり、セルラーゼのと呼ばれる酵素のうちの一つである。セルロースは、植物の細胞壁の主要成分であり、そのセルロースの内部のグリコシド結合を切断するエンドグルカナーゼは、植物性成分の分解において重要な役割を果たす。したがって、エンドグルカナーゼは、植物性バイオマスの分解、洗剤、食品加工など、幅広い産業分野において利用されており、活発な研究がなされてきた。エンドグルカナーゼについては、多数の報告がある。例えば、子嚢菌類由来では、アスペルギルス・ニガー（特表平１１−５０２１１２）、アスペルギルス・アキュリアタス（WO93/20193）、トリコデルマ・リーゼイ（特開平７−５１０７１）等、担子菌類では、マクロフォミア・ファセオリナ（Gene, 158(1):125-8, 1995）等、ツボカビ類では、ルーメン真菌であるオルピノマイセス・ジョヨニイ（Gene, 245(1),119-126, 2000）由来のものが知られている。バクテリア由来のものでは、例えば、バチルス・ラウタス（Gene, 93(1):55-60, 1990）、クロストリジウム・セルロボランス（Mol Gen Genet, 231(3):472-9, 1992）由来のもの等が知られている。以上のエンドグルカナーゼは、遺伝子についても報告されている。
また、アスペルギルス・カワチイ由来のエンドグルカナーゼについて、塩基配列（Itoら、translations from annotated coding regions in GenBank, BAB62317, 2001）・アミノ酸配列（Itoら、GenBank, AB055431, 2001）が報告されている。
エンドグルカナーゼに関する研究の進んでいる糸状菌トリコデルマ・リーゼイについては、前述の他にも4種のエンドグルカナーゼ及びその遺伝子が報告されている（Gene, 63(1):11-22, 1988 ; Mol. Microbiol., 13(2):219-228, 1994 ; Eur. J. Biochem., 249(2):584-591, 1997 ; Appl. Environ. Microbiol., 64:55-563, 1998)。
黄麹菌であるアスペルギルス・オリゼーおよび、アスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。これら黄麹菌については、アスペルギルス・オリゼーの２種のセルラーゼ（CelA, CelB）およびその遺伝子が知られているに過ぎない（Appl Microbiol Biotechnol, 46(5-6):538-44, 1996）。上記トリコデルマ・リーゼイのように、糸状菌は多種にわたるエンドグルカナーゼを生産し、これらは相乗的に作用すると考えられており、黄麹菌においても新規のエンドグルカナーゼ及びその遺伝子の取得が期待されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規エンドグルカナーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため研究を重ね、黄麹菌より新規エンドグルカナーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
【０００５】
さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコードするエンドグルカナーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
【０００６】
さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含むエンドグルカナーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の配列同一性を示し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取することを特徴とするエンドグルカナーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
１．本発明のエンドグルカナーゼ
本発明のエンドグルカナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
該酵素は、例えば、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ソーヤなどの黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたエンドグルカナーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得られる。
本発明のエンドグルカナーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその部分断片であってもよい。
２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基または塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基または塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸または全塩基）数に対する百分率で示される。
【０００８】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性は、Karlin および Altschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulらによって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTはBLASTより感度良く配列同一性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列にたいし、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列同一性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova らによって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 174:247-250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラムおよびパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 3, Filter: ON を用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for a mismatch: -2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ON を用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)を用いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値を用いる。たとえば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、または70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いない。
【０００９】
２．エンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌、その他の糸状菌、またはその他の真菌類から得ることが出来る。さらに具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、エンドグルカナーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分オートクレーブしたもの）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathalaらの方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製する。
【００１０】
得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行う。プライマーとしては、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよいが、例えば、配列番号３および配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法により行うことができる。得られた、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるエンドグルカナーゼの例をそれぞれ配列番号１および配列番号２に例示する。
【００１１】
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、上記のもののほか、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌があげられる。これらの生物から、常法によりRNAまたはゲノムDNAを調製し、プラスミドまたはファージに組み込み、ライブラリーを調製する。続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００１２】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、 0.1 × SSC 、 0.1%(W/V)SDS を用い、 15 分間、 2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、 67 ℃以上である。
【００１３】
また、配列番号１に記載の塩基配列と70％以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すような塩基配列は、本発明のエンドグルカナーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
上記の様な塩基配列の配列同一性やコードするアミノ酸配列の配列同一性を示すようなDNAは、上記の様にハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群や公共データベースのなかから例えば前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
このようにして得られたDNAがエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してエンドグルカナーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００１４】
２．組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でエンドグルカナーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが上げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつける事もできる。例えば、エンドグルカナーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００１５】
３．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のエンドグルカナーゼを生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)の方法などを用いることができる。
【００１６】
４．エンドグルカナーゼの製造
本発明のエンドグルカナーゼの製造法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。本発明のエンドグルカナーゼが菌体内または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のエンドグルカナーゼを得ることができる。培養液中に本発明のエンドグルカナーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のエンドグルカナーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のエンドグルカナーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。また、精製用のタグ配列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する精製法を用いることもできる。例えば、ヒスチジン6残基の配列を付加してある場合には、ニッケルカラムを用いた精製を行うことができる。
【００１７】
本発明のエンドグルカナーゼの活性は、例えば、次の方法で測定できる。
［エンドグルカナーゼ活性測定法］
用いる溶液は下記のとおりである。
基質溶液：2% Azo-CM-cellulose (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5基質懸濁液: 2% Azo-alpha cellulose (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5 （不溶性）
基質懸濁液: 2% Azo-avicel (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5 （不溶性）
反応停止液: 4% 酢酸ナトリウム3水和物, 0.4% 酢酸亜鉛, 80% エタノール, pH5.0に塩酸で調整
基質溶液または基質懸濁液50μlと試料溶液50μlを混合し、37℃で保温する。反応時間は活性の強度に応じて調節する。反応停止液250μlを加え、混合した後、室温で10分間放置する（Ａ）。ブランクでは、基質溶液に反応停止液を加え、10分間放置してから試料溶液を加える（Ｂ）。10,000rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清の590 nmの吸光度を測定する。
（Ａ）の上清の吸光度から（Ｂ）の上清の吸光度を減じたものをΔODとし、この値の大きさを活性の指標とする。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本説明をより具体的に説明するが、本説明はこれらによって制限されるものではない。
１．アスペルギルス・オリゼーのエンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼー RIB40株の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された培養物から、Cathalaらの方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いてRT-PCRを行った。
逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側は開始コドンの直前から、3'側はポリA部分から増幅した。
C64FH: 5'- GCT TGT CAT AAT GCA ACC ATT AC -3' （配列番号3）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、54℃15秒、72℃2分を15サイクル行い、72℃3分を行った。なお、サーマルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJ Research製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった（以下のPCRでも同様）。
続いて、上記RT-PCRの増幅産物を鋳型として、上記C64FH及び下記のプライマーを用いて、PCRを行った。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、Tbr EXT DNA Polymerase（Fynnzymes製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
【００１９】
C64RH: 5'- AAC AGT CAA AGT AAA GTT GAC CGT AT -3' （配列番号4）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、60℃20秒、72℃1分45秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.7kbのバンドが確認された。
次いで、pYES2.1 TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1/V5-His-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F'株を形質転換し、形質転換体18クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素PvuII（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、8クローンがプロモーターに対して正しい向きに断片が挿入されていた。この8クローンについて塩基配列を決定した。
【００２０】
塩基配列の決定は、試薬としてCEQ DTCS Quick Start Kit（ベックマン・コールター製）を用い、シークエンサーとしてはCEQ 2000XL（ベックマン・コールター製）を用いて、サンガー法により行った。得られた8クローンの塩基配列を比較したところ、うち1クローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。この、変異を含まないクローンのプラスミド「pC64H」は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号Ｐ−１８６４１として寄託した。また、pC64Hに含まれるクローンの開始コドンからベクター由来配列直前までの塩基配列を配列番号１に記載する。pC64Hは、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内での自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターの間に、エンドグルカナーゼ遺伝子がC末にヒスチジンをコードする６コドンを含むベクター由来の配列との融合遺伝子として挿入された構造を持つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内でガラクトースによりエンドグルカナーゼを誘導生産することが可能となる。
【００２１】
配列番号１の塩基配列を解析したところ、このDNAは、569アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列同一性を示したのは、バチルス・ラウタスのエンドグルカナーゼＢ（Gene, 93(1):55-60, 1990）の537残基に対して、28%一致であった。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblastpを用いて配列同一性を求めたところ537残基中29%であった。これらの結果から、配列番号1に記載のDNAによりコードされた、配列番号2に記載のアミノ酸配列の蛋白質は、新規の配列を持つことが分かり、また、エンドグルカナーゼ活性を有することが推測された。
また、配列番号１の塩基配列について配列同一性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、有意な配列同一性を示したのは得られなかった。そこで、FASTAソフトウェア(http://fasta.genome.ad.jp/)を用いて、データベースnr-ntに対して検索したところ、アクレモニウムのエンドグルカナーゼ遺伝子（米国特許6,071,735、配列番号５）の、560塩基の部分に対して59%の配列同一性を示した。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblastnを用いて配列同一性を求めたところ80%の配列同一性を示す55塩基の部分が検出されたのみであった。
【００２２】
２．形質転換体の取得
酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラシル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpC64Hで形質転換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択することにより、形質転換体INVSc1/pC64H株を得た。また、ネガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2.1/V5-His/lacZ（ベクターにlacZ遺伝子が組込まれたプラスミド、以後pYES2.1lacZと略す）で形質転換したINVSc1/pYES2.1lacZ株を得た。
【００２３】
３．エンドグルカナーゼの製造
INVSc1/pC64H株及び、ネガティブコントロールのINVSc1/pYES2.1lacZ株を培養し、エンドグルカナーゼを得た。まず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含みウラシルを含まない20mlのSC培地（最少培地）に接種し、30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の600nmにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種したときにODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌体を2%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC培地（誘導培地）に懸濁し、30℃で振盪培養した。4時間, 8時間, 24時間後に10 mlずつサンプリングし、遠心分離後、菌体を回収した。菌体を1 mlの冷水に懸濁し、遠心分離。上澄を除き、菌体を-80℃で保存した。
菌体に下記の組成の緩衝液200 μlを加えて懸濁し、微量遠沈管に移し、ガラスビーズを250 μl程度加えた。マルチビーズショッカーMB-200（安井器械製）にセットし、80％出力で1 min破砕、1 min放置を15回繰り返した。破砕後、14000 rpmで20 min遠心分離し、上澄を回収し、-80℃で保存した。
菌体破砕用緩衝液
20 mM Tris-HCl, pH7.5
5 mM MgCl2
50 mM KCl
5% グリセロール
1 mM EDTA
5 mMメルカプトエタノール
1 mM PMSF
1μg/ml ペプスタチンA
菌体破砕上澄のエンドグルカナーゼ活性を測定した（表1）ところ、INVSc1/pC64H株の菌体破砕上澄に、Azo-CM-celluloseに対する加水分解活性があった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
以上により、配列番号1記載のDNAを組込んだ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によりエンドグルカナーゼを製造することができた。
また、配列番号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がエンドグルカナーゼ活性を有することも明らかになった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、新規なエンドグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体が提供された。また、本発明によりエンドグルカナーゼの製造方法が提供された。
本発明により、上記エンドグルカナーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。本発明はまた、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【００２７】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドグルカナーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ（EC 3.2.1.4、本明細書では、エンドグルカナーゼという）は、セルロース、リケニン、β−Ｄ−グルカンの１，４−β−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する酵素であり、セルラーゼのと呼ばれる酵素のうちの一つである。セルロースは、植物の細胞壁の主要成分であり、そのセルロースの内部のグリコシド結合を切断するエンドグルカナーゼは、植物性成分の分解において重要な役割を果たす。したがって、エンドグルカナーゼは、植物性バイオマスの分解、洗剤、食品加工など、幅広い産業分野において利用されており、活発な研究がなされてきた。エンドグルカナーゼについては、多数の報告がある。例えば、子嚢菌類由来では、アスペルギルス・ニガー（特表平１１−５０２１１２）、アスペルギルス・アキュリアタス（WO93/20193）、トリコデルマ・リーゼイ（特開平７−５１０７１）等、担子菌類では、マクロフォミア・ファセオリナ（Gene, 158(1):125-8, 1995）等、ツボカビ類では、ルーメン真菌であるオルピノマイセス・ジョヨニイ（Gene, 245(1),119-126, 2000）由来のものが知られている。バクテリア由来のものでは、例えば、バチルス・ラウタス（Gene, 93(1):55-60, 1990）、クロストリジウム・セルロボランス（Mol Gen Genet, 231(3):472-9, 1992）由来のもの等が知られている。以上のエンドグルカナーゼは、遺伝子についても報告されている。
また、アスペルギルス・カワチイ由来のエンドグルカナーゼについて、塩基配列（Itoら、translations from annotated coding regions in GenBank, BAB62317, 2001）・アミノ酸配列（Itoら、GenBank, AB055431, 2001）が報告されている。
エンドグルカナーゼに関する研究の進んでいる糸状菌トリコデルマ・リーゼイについては、前述の他にも4種のエンドグルカナーゼ及びその遺伝子が報告されている（Gene, 63(1):11-22, 1988 ; Mol. Microbiol., 13(2):219-228, 1994 ; Eur. J. Biochem., 249(2):584-591, 1997 ; Appl. Environ. Microbiol., 64:55-563, 1998)。
黄麹菌であるアスペルギルス・オリゼーおよび、アスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。これら黄麹菌については、アスペルギルス・オリゼーの２種のセルラーゼ（CelA, CelB）およびその遺伝子が知られているに過ぎない（Appl Microbiol Biotechnol, 46(5-6):538-44, 1996）。上記トリコデルマ・リーゼイのように、糸状菌は多種にわたるエンドグルカナーゼを生産し、これらは相乗的に作用すると考えられており、黄麹菌においても新規のエンドグルカナーゼ及びその遺伝子の取得が期待されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規エンドグルカナーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたエンドグルカナーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため研究を重ね、黄麹菌より新規エンドグルカナーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
【０００５】
さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコードするエンドグルカナーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質
【０００６】
さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含むエンドグルカナーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の配列同一性を示し、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取することを特徴とするエンドグルカナーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
１．本発明のエンドグルカナーゼ
本発明のエンドグルカナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
該酵素は、例えば、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ソーヤなどの黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたエンドグルカナーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得られる。
本発明のエンドグルカナーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列と70%以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその部分断片であってもよい。
２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基または塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基または塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸または全塩基）数に対する百分率で示される。
【０００８】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性は、Karlin および Altschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulらによって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTはBLASTより感度良く配列同一性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列にたいし、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列同一性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova らによって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 174:247-250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラムおよびパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 3, Filter: ON を用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for a mismatch: -2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ON を用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)を用いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値を用いる。たとえば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、または70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いない。
【０００９】
２．エンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌、その他の糸状菌、またはその他の真菌類から得ることが出来る。さらに具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、エンドグルカナーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分オートクレーブしたもの）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathalaらの方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製する。
【００１０】
得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行う。プライマーとしては、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよいが、例えば、配列番号３および配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法により行うことができる。得られた、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるエンドグルカナーゼの例をそれぞれ配列番号１および配列番号２に例示する。
【００１１】
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、上記のもののほか、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌があげられる。これらの生物から、常法によりRNAまたはゲノムDNAを調製し、プラスミドまたはファージに組み込み、ライブラリーを調製する。続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００１２】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、 0.1 × SSC 、 0.1%(W/V)SDS を用い、 15 分間、 2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、 67 ℃以上である。
【００１３】
また、配列番号１に記載の塩基配列と70％以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すような塩基配列は、本発明のエンドグルカナーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
上記の様な塩基配列の配列同一性やコードするアミノ酸配列の配列同一性を示すようなDNAは、上記の様にハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群や公共データベースのなかから例えば前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
このようにして得られたDNAがエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してエンドグルカナーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００１４】
２．組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明のエンドグルカナーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でエンドグルカナーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが上げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつける事もできる。例えば、エンドグルカナーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００１５】
３．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のエンドグルカナーゼを生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)の方法などを用いることができる。
【００１６】
４．エンドグルカナーゼの製造
本発明のエンドグルカナーゼの製造法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のエンドグルカナーゼを生産させることができる。本発明のエンドグルカナーゼが菌体内または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のエンドグルカナーゼを得ることができる。培養液中に本発明のエンドグルカナーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のエンドグルカナーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のエンドグルカナーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。また、精製用のタグ配列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する精製法を用いることもできる。例えば、ヒスチジン6残基の配列を付加してある場合には、ニッケルカラムを用いた精製を行うことができる。
【００１７】
本発明のエンドグルカナーゼの活性は、例えば、次の方法で測定できる。
［エンドグルカナーゼ活性測定法］
用いる溶液は下記のとおりである。
基質溶液：2% Azo-CM-cellulose (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5基質懸濁液: 2% Azo-alpha cellulose (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5 （不溶性）
基質懸濁液: 2% Azo-avicel (Megazyme) in 100 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5 （不溶性）
反応停止液: 4% 酢酸ナトリウム3水和物, 0.4% 酢酸亜鉛, 80% エタノール, pH5.0に塩酸で調整
基質溶液または基質懸濁液50μlと試料溶液50μlを混合し、37℃で保温する。反応時間は活性の強度に応じて調節する。反応停止液250μlを加え、混合した後、室温で10分間放置する（Ａ）。ブランクでは、基質溶液に反応停止液を加え、10分間放置してから試料溶液を加える（Ｂ）。10,000rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清の590 nmの吸光度を測定する。
（Ａ）の上清の吸光度から（Ｂ）の上清の吸光度を減じたものをΔODとし、この値の大きさを活性の指標とする。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本説明をより具体的に説明するが、本説明はこれらによって制限されるものではない。
１．アスペルギルス・オリゼーのエンドグルカナーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼー RIB40株の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された培養物から、Cathalaらの方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いてRT-PCRを行った。
逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側は開始コドンの直前から、3'側はポリA部分から増幅した。
C64FH: 5'- GCT TGT CAT AAT GCA ACC ATT AC -3' （配列番号3）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、54℃15秒、72℃2分を15サイクル行い、72℃3分を行った。なお、サーマルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJ Research製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった（以下のPCRでも同様）。
続いて、上記RT-PCRの増幅産物を鋳型として、上記C64FH及び下記のプライマーを用いて、PCRを行った。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、Tbr EXT DNA Polymerase（Fynnzymes製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
【００１９】
C64RH: 5'- AAC AGT CAA AGT AAA GTT GAC CGT AT -3' （配列番号4）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、60℃20秒、72℃1分45秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.7kbのバンドが確認された。
次いで、pYES2.1 TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1/V5-His-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F'株を形質転換し、形質転換体18クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素PvuII（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、8クローンがプロモーターに対して正しい向きに断片が挿入されていた。この8クローンについて塩基配列を決定した。
【００２０】
塩基配列の決定は、試薬としてCEQ DTCS Quick Start Kit（ベックマン・コールター製）を用い、シークエンサーとしてはCEQ 2000XL（ベックマン・コールター製）を用いて、サンガー法により行った。得られた8クローンの塩基配列を比較したところ、うち1クローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。この、変異を含まないクローンのプラスミド「pC64H」は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号Ｐ−１８６４１として寄託した。また、pC64Hに含まれるクローンの開始コドンからベクター由来配列直前までの塩基配列を配列番号１に記載する。pC64Hは、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内での自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターの間に、エンドグルカナーゼ遺伝子がC末にヒスチジンをコードする６コドンを含むベクター由来の配列との融合遺伝子として挿入された構造を持つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内でガラクトースによりエンドグルカナーゼを誘導生産することが可能となる。
【００２１】
配列番号１の塩基配列を解析したところ、このDNAは、569アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列同一性を示したのは、バチルス・ラウタスのエンドグルカナーゼＢ（Gene, 93(1):55-60, 1990）の537残基に対して、28%一致であった。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblastpを用いて配列同一性を求めたところ537残基中29%であった。これらの結果から、配列番号1に記載のDNAによりコードされた、配列番号2に記載のアミノ酸配列の蛋白質は、新規の配列を持つことが分かり、また、エンドグルカナーゼ活性を有することが推測された。
また、配列番号１の塩基配列について配列同一性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、有意な配列同一性を示したのは得られなかった。そこで、FASTAソフトウェア(http://fasta.genome.ad.jp/)を用いて、データベースnr-ntに対して検索したところ、アクレモニウムのエンドグルカナーゼ遺伝子（米国特許6,071,735、配列番号５）の、560塩基の部分に対して59%の配列同一性を示した。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblastnを用いて配列同一性を求めたところ80%の配列同一性を示す55塩基の部分が検出されたのみであった。
【００２２】
２．形質転換体の取得
酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラシル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpC64Hで形質転換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択することにより、形質転換体INVSc1/pC64H株を得た。また、ネガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2.1/V5-His/lacZ（ベクターにlacZ遺伝子が組込まれたプラスミド、以後pYES2.1lacZと略す）で形質転換したINVSc1/pYES2.1lacZ株を得た。
【００２３】
３．エンドグルカナーゼの製造
INVSc1/pC64H株及び、ネガティブコントロールのINVSc1/pYES2.1lacZ株を培養し、エンドグルカナーゼを得た。まず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含みウラシルを含まない20mlのSC培地（最少培地）に接種し、30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の600nmにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種したときにODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌体を2%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC培地（誘導培地）に懸濁し、30℃で振盪培養した。4時間, 8時間, 24時間後に10 mlずつサンプリングし、遠心分離後、菌体を回収した。菌体を1 mlの冷水に懸濁し、遠心分離。上澄を除き、菌体を-80℃で保存した。
菌体に下記の組成の緩衝液200 μlを加えて懸濁し、微量遠沈管に移し、ガラスビーズを250 μl程度加えた。マルチビーズショッカーMB-200（安井器械製）にセットし、80％出力で1 min破砕、1 min放置を15回繰り返した。破砕後、14000 rpmで20 min遠心分離し、上澄を回収し、-80℃で保存した。
菌体破砕用緩衝液
20 mM Tris-HCl, pH7.5
5 mM MgCl2
50 mM KCl
5% グリセロール
1 mM EDTA
5 mMメルカプトエタノール
1 mM PMSF
1μg/ml ペプスタチンA
菌体破砕上澄のエンドグルカナーゼ活性を測定した（表1）ところ、INVSc1/pC64H株の菌体破砕上澄に、Azo-CM-celluloseに対する加水分解活性があった。
【００２４】
【表１】
以上により、配列番号1記載のDNAを組込んだ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によりエンドグルカナーゼを製造することができた。
また、配列番号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がエンドグルカナーゼ活性を有することも明らかになった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、新規なエンドグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体が提供された。また、本発明によりエンドグルカナーゼの製造方法が提供された。
本発明により、上記エンドグルカナーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。本発明はまた、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【００２７】
【配列表】
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質 - 以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするエンドグルカナーゼ遺伝子。
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質 - 以下の(a)又は(b)のDNAを含むエンドグルカナーゼ遺伝子。
(a)配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b)配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA - 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からエンドグルカナーゼ蛋白質を採取することを特徴とするエンドグルカナーゼの製造方法。
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