JP2003164286A - マンナナーゼおよびマンナナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新規マンナナーゼ、該酵素をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによっ
て形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いた
マンナナーゼの製造方法を提供すること。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む蛋白質、該蛋白
質をコードするマンナナーゼ遺伝子、特定の塩基配列を
含むDNAを含むマンナナーゼ遺伝子、前記遺伝子を含有
する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換
体、および前記形質転換体を培養して得られる培養物か
らマンナナーゼ蛋白質を採取することを特徴とするマン
ナナーゼの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マンナナーゼ、該
酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクタ
ー、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び
該形質転換体を用いたマンナナーゼの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】β−１，４−マンナナーゼ（EC 3.2.1.7
8、本明細書では、マンナナーゼという）は、マンナ
ン、ガラクトマンナン、グルコマンナン等の１，４−β
−Ｄ−マンノシド結合を加水分解する酵素である。マン
ナナーゼによって分解される上記の物質は、植物の細胞
壁の主要な構成成分の一つであるヘミセルロースの構成
要素である。したがって、マンナナーゼは、食品、製紙
等の産業に有用な酵素である。

【０００３】マンナナーゼとしては、アスペルギルス・
アキュレアタス（米国特許5,795,764号）、トリコデル
マ・リーゼイ（Appl Environ Microbiol., 61(3):1090-
7, 1995）、等の子嚢菌類糸状菌由来のもの、担子菌類
糸状菌のアガリクス・ビスポラス（Appl Environ Micro
biol., 67(5):2298-303, 2001）由来のものが知られて
いる。バクテリア由来のものでは、バチルス・ズブチル
ス（Biochim Biophys Acta., 1243(3):552-4, 1995）、
ストレプトマイセス・リビダンス（Biochem J.,290 ( P
t 3):857-63, 1993）、シュードモナス・フルオレッセ
ンス（Biochem J., 305( Pt 3):1005-1010, 1995）由来
のもの等が知られている。以上のマンナナーゼは、遺伝
子についても報告されている。

【０００４】また、酵素のみが知られていて、遺伝子に
ついての報告が無いものとしては、アスペルギルス・タ
マリ（Biochem. J., 219(3):857-863, 1984）、ペニシ
リウム・マルチカラー（特開２００１−１４５４８５）
由来のものなどがある。

【０００５】黄麹菌であるアスペルギルス・オリゼーお
よび、アスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒
などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われ
てきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全
性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物で
ある。これら黄麹菌については、アスペルギルス・オリ
ゼー由来のマンナナーゼについての報告があるものの
（Cytobios, 105(409):115-30, 2001）、精製酵素につ
いての報告や、遺伝子についての報告はなされていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規マンナ
ナーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含
む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された
形質転換体及び該形質転換体を用いたマンナナーゼの製
造方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため研究を重ね、黄麹菌より新規マンナナーゼ
遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又
は(c)の蛋白質である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白
質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70％以上の
配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその
部分断片であり、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質

【０００８】さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は
(c)の蛋白質をコードするマンナナーゼ遺伝子である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白
質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70％以上の
配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその
部分断片であり、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質

【０００９】さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)
又は(d)のDNAを含むマンナナーゼ遺伝子である。 (a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を
含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質をコードする
DNA (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核
酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつマンナナーゼ活性を有す
る蛋白質をコードするDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の
配列同一性を示し、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白
質をコードするDNA

【００１０】さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する
組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換え
ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、
前記形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナナ
ーゼ蛋白質を採取することを特徴とするマンナナーゼの
製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】１．本発明のマンナナーゼ 本発明のマンナナーゼは、配列番号２で表されるアミノ
酸配列を含む蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペ
ルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹
菌の培養物から精製することができる。また、該酵素
は、上記黄麹菌等からクローニングしたマンナナーゼ遺
伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより
得られる。

【００１２】本発明のマンナナーゼは、酵素活性を有す
る限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
ていてもよい。さらに、マンナナーゼ活性を有する限
り、配列番号２で表されるアミノ酸配列と70％以上、望
ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以上、最も望
ましくは90％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含
む蛋白質、またはその部分断片であってもよい。

【００１３】２つのアミノ酸配列または塩基配列におけ
る配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状
態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入
れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適
化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基または
塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、
第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基または塩
基が存在する場合、それらの配列は、その部位において
同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間
での同一である部位数の全部位（全アミノ酸または全塩
基）数に対する百分率で示される。

【００１４】上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列ま
たは塩基配列における配列同一性は、Karlin および Al
tschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7:2264-2268, 1990およびProc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなア
ルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulらによ
って開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。
更に、Gapped BLASTはBLASTより感度良く配列同一性を
決定するプログラムである(Nucleic Acids Res.25:3389
-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配
列にたいし、高い配列同一性を示す配列をデータベース
中から検索するために用いられる。これらは、例えば米
国National Center for Biotechnology Informationの
インターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であ
る。

【００１５】配列間の配列同一性として、本明細書で
は、Tatiana A. Tatusova らによって開発されたBLAST
2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 17
4:247-250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソ
フトウェアは米国National Center for Biotechnology
Informationのインターネット上のウェブサイトにおい
て利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラ
ムおよびパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸
配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとし
ては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties,
gap x_dropoff: 50,expect: 10, word size: 3, Filte
r: ON を用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを
用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, P
enalty for amismatch: -2, Strand option: Both stra
nds, Open gap: 5 and extension gap: 2 penalties,
gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Fil
ter:ON を用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサ
イト上でデフォルト値として用いられているものであ
る。

【００１６】ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な
配列同一性を示す配列が見つからない場合には、更に高
感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipm
an,Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)を用
いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索する
こともできる。FASTAソフトウェアは例えば、ゲノムネ
ットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメ
ーターはデフォルト値を用いる。たとえば、塩基配列に
ついての検索を行う場合は、データベースにnr-ntを用
い、ktup値は6を用いる。ただし、いずれの場合も、全
体の30%以上、50%以上、または70%以上のオーバーラッ
プを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずし
も推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す
値としては用いない。

【００１７】２．マンナナーゼ遺伝子のクローニング 本発明のマンナナーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギル
ス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌、そ
の他の糸状菌、またはその他の真菌類から得ることが出
来る。さらに具体的には、例えば、アスペルギルス・オ
リゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、マンナナ
ーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法に
より全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま
培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、
121℃・50分オートクレーブしたもの）を用いることが
できる。上記培地で適当な時間、例えば30時間培養した
のち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）
を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathalaらの方法（DNA,
2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製する。

【００１８】こうして得られた全RNAを鋳型として、RT-
PCRを行う。プライマーとしては、本発明の本発明のマ
ンナナーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせで
あればどのような組み合わせのものを用いてもよいが、
例えば、配列番号３および配列番号４の配列のオリゴヌ
クレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキ
ット、例えばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法
により行うことができる。得られた、本発明のマンナナ
ーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミ
ドに組み込むことができる。このようにして得られたDN
Aの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNA
シークエンサーを用いて決定することができる。このよ
うにして得られる本発明のマンナナーゼ遺伝子を含むDN
A及びそれによりコードされるマンナナーゼの例をそれ
ぞれ配列番号１および配列番号２に例示する。

【００１９】本発明のマンナナーゼ遺伝子は、上記のも
ののほか、マンナナーゼ活性を有する限り、配列番号２
で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含
む蛋白質をコードしているものであってもよい。このよ
うな遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる
選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得るこ
ともできる。

【００２０】本発明のマンナナーゼ遺伝子は、次のよう
に、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得る
こともできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギ
ルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの黄麹菌が
あげられる。これらの生物から、常法によりRNAまたは
ゲノムDNAを調製し、プラスミドまたはファージに組み
込み、ライブラリーを調製する。続いて、プローブとし
て用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プロー
ブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さで
あればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なく
とも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望まし
くは450塩基以上の部分または全体を含むものが挙げら
れる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな
条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリー
から選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミド
ライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによ
って、ファージライブラリーならプラークハイブリダイ
ゼーションによって行うことができる。ストリンジェン
トな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特
異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件
であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プロ
ーブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような
条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、
洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能であ
る。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強
く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション
及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の
塩濃度を下げることにより特異性を上げることができ
る。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出され
ない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度
を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げる
ことにより、ハイブリッドを安定化させることが出来
る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に
行いうるものである。

【００２１】ストリンジェントな条件の具体例として
は、例えば、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.
0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試
薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラ
ウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜
１６時間程度）で行ない、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/
V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15
分間、2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温
度は、52℃以上、好ましくは57℃以上、更に好ましくは
62℃以上、最も好ましくは67℃以上である。

【００２２】また、配列番号１に記載の塩基配列と70％
以上、望ましくは80％以上、さらに望ましくは85％以
上、最も望ましくは90％以上の配列同一性を示すような
塩基配列は、本発明のマンナナーゼと実質的に同等の活
性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。

【００２３】上記の様な塩基配列の配列同一性やコード
するアミノ酸配列の配列同一性を示すようなDNAは、上
記の様にハイブリダイゼーションを指標に得ることもで
きるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未
知のDNA群や公共データベースのなかから例えば前述のB
LASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容
易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通
常用いている方法である。

【００２４】このようにして得られたDNAがマンナナー
ゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述の
ように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質
転換し、形質転換体を培養してマンナナーゼ活性を測定
することにより確認することができる。

【００２５】２．組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、本発明のマンナナーゼ遺伝
子を適当なベクター上に連結することにより得ることが
できる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でマン
ナナーゼを生産させうるものであればどのようなもので
も用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色
体などのベクターを用いることができる。

【００２６】上記ベクターには、形質転換された細胞を
選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含ま
れていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、UR
A3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子
や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなど
の薬剤に対する抵抗遺伝子などが上げられる。また、組
換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現す
ることの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例
えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデ
ニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターと
しては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyB
プロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。ま
た、精製のためのタグをつける事もできる。例えば、マ
ンナナーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、
ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続す
ることにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にす
ることができる。

【００２７】３．形質転換体の取得 本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクタ
ーで形質転換することにより得られる。宿主としては、
本発明のマンナナーゼを生産することが出来るものであ
れば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビ
シエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペ
ルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペ
ルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バ
チルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換
は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。酵母
の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mo
l.Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法などを用いる
ことができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラス
ト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウム
を用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)の方
法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、
エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 19
4, 182-187(1990)の方法などを用いることができる。

【００２８】４．マンナナーゼの製造 本発明のマンナナーゼの製造法は、本発明の形質転換体
を培養し、得られる培養物からマンナナーゼ蛋白質を採
取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類
と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なもの
を選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエで
あり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例
えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培
養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源と
する液体最少培地に希釈・接種し、培養することによ
り、本発明のマンナナーゼを生産させることができる。
また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、
発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、
マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養すること
により、本発明のマンナナーゼを生産させることができ
る。

【００２９】また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現
制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有す
る液体培地で培養することにより本発明のマンナナーゼ
を生産させることができる。本発明のマンナナーゼが菌
体内または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地か
ら分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明
のマンナナーゼを得ることができる。例えば、サッカロ
ミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体
そのものを酵素剤として用いることもできるが、破砕し
た後、Triton X-100, Tween-20, Nonidet P-40等の非イ
オン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した
上清に本発明のマンナナーゼを回収することができる。
培養液中に本発明のマンナナーゼが生産された場合は、
遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発
明のマンナナーゼを得ることができる。何れの場合も、
硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、
限外ろ過等を用いた常法により、本発明のマンナナーゼ
を更に純度の高いものとして得ることもできる。

【００３０】本発明のマンナナーゼの活性は、次の方法
で測定できる。 ［マンナナーゼ活性測定法］ 基質溶液: 2% Azo-carob-galactomannan (Megazyme) in
200 mM 酢酸ナトリウム, pH4.5 反応停止液: 4% 酢酸ナトリウム3水和物, 0.4% 酢酸亜
鉛, 80% エタノールpH5.0に塩酸で調整 基質溶液または基質懸濁液50μlと試料溶液50μlを混合
し、37℃で保温する。反応時間は活性の強度に応じて調
節する。反応停止液250μlを加え、混合した後、室温で
10分間放置する（Ａ）。ブランクでは、基質溶液に反応
停止液を加え、10分間放置してから試料溶液を加える
（Ｂ）。10,000rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清の
590 nmの吸光度を測定する。（Ａ）の上清の吸光度から
（Ｂ）の上清の吸光度を減じたものをΔODとし、この値
の大きさを活性の指標とする。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を示し、本説明をより具体的に
説明するが、本説明はこれらによって制限されるもので
はない。 １．アスペルギルス・オリゼーのマンナナーゼ遺伝子の
クローニング アスペルギルス・オリゼー RIB40株の分生子約100,000
個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地
（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体
窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒
素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて
念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Cathalaらの
方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを抽出した。
更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase I処
理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA
0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を
用いてRT-PCRを行った。

【００３２】逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側
にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用
い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。
次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書
にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加
え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属
のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側
は開始コドンの直前から、3'側はポリA部分から増幅し
た。 M65FH: 5'-CAC AAT GCG TTC CTT GTC GTC TA-3' （配列番号３） PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、53℃20秒、72℃1
分45秒を15サイクル行い、72℃5分を行った。なお、サ
ーマルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJ R
esearch製）を用い、温度コントロール法はカリキュレ
ートコントロールによった（以下のPCRでも同様）。

【００３３】続いて、上記RT-PCRの増幅産物を鋳型とし
て、上記M65FH及び下記のプライマーを用いて、PCRを行
い、5'側は開始コドンの直前から、3'側は終止コドン直
前から増幅した。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、Tb
r EXT DNA Polymerase（Fynnzymes製）を用い、反応液
の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。 M65RH: 5'-GTT CTT GTT GAC ATT TTC CAT AT-3' （配列番号４） PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、53℃20秒、72℃1
分30秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物
の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約
1.4kbのバンドが確認された。

【００３４】次いで、pYES2.1 TOPO TA Cloning Kit（I
nvitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1/V5-His
-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F'株を形質転
換し、形質転換体18クローンを得た。各形質転換体より
プラスミドを抽出し、制限酵素SacI及びXbaI（宝酒造
製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したとこ
ろ、8クローンがプロモーターに対して正しい向きに断
片が挿入されていた。この8クローンについて塩基配列
を決定した。

【００３５】塩基配列の決定は、試薬としてCEQ DTCS
Quick Start Kit（ベックマン・コールター製）を用
い、シークエンサーとしてはCEQ 2000XL（ベックマン・
コールター製）を用いて、サンガー法により行った。得
られた8クローンの塩基配列を比較したところ、うち1ク
ローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。こ
の、変異を含まないクローンのプラスミド「pM65H」
は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンターに寄託番号Ｐ−１８６４２として寄託した。ま
た、pC64Hに含まれるクローンの開始コドンからベクタ
ー由来配列直前までの塩基配列を配列番号１に記載す
る。pM65Hは、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリ
ン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内で
の自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモータ
ーとCYC1ターミネーターの間に、マンナナーゼ遺伝子が
C末にヒスチジンをコードする６コドンを含むベクター
由来の配列との融合遺伝子として挿入された構造を持
つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内でガラ
クトースによりマンナナーゼを誘導生産することが可能
となる。

【００３６】配列番号１の塩基配列を解析したところ、
このDNAは、463アミノ酸からなる蛋白質をコードしてい
ることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記
載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配
列データベースに対して配列同一性の高い配列を検索し
た。検索には、NCBI blastp（http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/BLAST/）を用い、データベースとしては、nrを指
定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列
同一性を示したのは、トリコデルマ・リーゼイのβ−マ
ンナナーゼ（GenBank: L25310をアミノ酸配列に翻訳し
たもの）であり、57％の配列同一性を示す346残基の部
分および、43％の配列同一性を示す32残基の部分を持っ
ていた。また、BLAST 2 Sequencesソフトウェアのblast
pを用いて配列同一性を求めたところ上記と同じ結果が
得られた。

【００３７】また、配列番号１の塩基配列について配列
同一性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用い、デー
タベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する
配列は無く、最も高い配列同一性を示したのは、上記ト
リコデルマ・リーゼイのβ−マンナナーゼをコードする
遺伝子（GenBank: L25310）であった。しかし、検出さ
れたオーバーラップ領域は、もっとも長いもので79塩基
に過ぎなかった。そこで、FASTAソフトウェア(http://f
asta.genome.ad.jp/)を用いて、データベースnr-ntに対
して検索したところ、米国特許5,795,764号に記載のア
スペルギルス・アキュレアタスのマンナナーゼ遺伝子
と、1041塩基中66%の配列同一性を示した。

【００３８】２．形質転換体の取得 酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラ
シル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpM65Hで形質転
換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択するこ
とにより、形質転換体INVSc1/pM65H株を得た。また、ネ
ガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2.1/
V5-His/lacZ（ベクターにlacZ遺伝子が組込まれたプラ
スミド、以後pYES2.1lacZと略す）で形質転換したINVSc
1/pYES2.1lacZ株を得た。

【００３９】３．マンナナーゼの製造 INVSc1/ pM65H株及び、ネガティブコントロールのINVSc
1/pYES2.1lacZ株を培養し、マンナナーゼを得た。ま
ず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含みウ
ラシルを含まない20mlのSC培地（最少培地）に接種し、
30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の600n
mにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種したとき
にODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心
分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌体を
2%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC培地
（誘導培地）に懸濁し、30℃で振盪培養した。4時間, 8
時間, 24時間後に10 mlずつサンプリングし、遠心分離
後、菌体を回収した。菌体を1mlの冷水に懸濁し、遠心
分離。上澄を除き、菌体を-80℃で保存した。

【００４０】菌体に下記の組成の緩衝液200μlを加えて
懸濁し、微量遠沈管に移し、ガラスビーズを250 μl程
度加えた。マルチビーズショッカーMB-200（安井器械
製）にセットし、80％出力で1 min破砕、1 min放置を15
回繰り返した。破砕後、14000rpmで20 min遠心分離し、
上澄を回収し、-80℃で保存した。 菌体破砕用緩衝液 20 mM Tris-HCl, pH7.5 5 mM MgCl2 50 mM KCl 5% グリセロール 1 mM EDTA 5 mMメルカプトエタノール 1 mM PMSF 1 μg/ml ペプスタチンA 菌体破砕上澄のマンナナーゼ活性を測定した（表1）と
ころ、INVSc1/pM65H株の菌体破砕上澄に、Azo-carob-ga
lactomannanに対する加水分解活性があった。

【００４１】

【表１】

【００４２】以上により、配列番号1記載のDNAを組込ん
だ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によ
りマンナナーゼを製造することができた。また、配列番
号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2記載の
アミノ酸配列を含む蛋白質がマンナナーゼ活性を有する
ことも明らかになった。

【００４３】

【発明の効果】本発明により、新規なマンナナーゼ、マ
ンナナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び
形質転換体が提供された。また、本発明によりマンナナ
ーゼの製造方法が提供された。本発明により、上記マン
ナナーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。
本発明はまた、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産
に用いる微生物の改良にも用いることができる。

【００４４】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Kikkoman Corporation <120> Mannanase and Mannanase Gene <160> 4 <210> 1 <211> 1389 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae (RIB40) <400> １ ATGCGTTCCT TGTCGTCTAT CGCACTCCTG TCTGTGGTGG GAGCTGCGTC TGCCCAGGCT 60 GGTCCTTGGG CTCAGTGTGG AGGCAAGTCC TTCTCCGGCT CATCCGAGTG TGCCTCGGGA 120 TGGAAATGTC AGGAGCTGAA CGAGTGGTTT AGCCAATGTG TACCTGGCGC CGAGTCCACG 180 ACTCCCACCG TGTCGAGCAC TCCCACGCCC ACTGACGCTC CTTCGGTGTC CATTACTGCA 240 TCTGTCACCA CGGGCATCAA CAAGTCGATC TCAGTTTCAT CAGCGTCGAA GTCCACTCCC 300 CTGCCGTCTT CGTCGTCGGC CTCGCCAAGC CCTCGTCCCA CGGGCAGCGG GTCCTTCGCC 360 AAGGCGGATG GATTGCAGTT CTCGATTGAC GGCGAGACCA AGTACTTCGC CGGCACAAAT 420 GCCTACTGGC TCCCCTTCCA AATGAACGAT GCGGACATTG ACTCCGTGTT CGATCATCTG 480 GAGCAGGCCG GATTGAAGAT CCTTCGTGTC TGGGGCTTCA ACGATGTTAA CACCGCTCCC 540 AGCCCCGGAA CGGTCTACTT CCAGCTCCAC GACAAGGAGA AGGGCACTTC CACCATCAAC 600 ACCGGCAAAG ACGGTCTCCA GCGTCTTGAC TATGTGGTTG CTGCCGCTGA GAAGCACGGC 660 GTCAAGCTCA TCATTCCTTT CGTGAACAGC TGGGACGACT ACGGCGGATA CAACGCCTAT 720 GTCAAGGCCT ACGGCGGCAG CAAGACTGAG TGGTTCACCA ACGAGAAGAT CCAGAGCGTG 780 TACCAGGCCT ATATCAAGGC CGTTGTCTCT CGGTACAGGG ACTCCCCGGC GATCTTTGCT 840 TGGGAGCTGG GCAACGAGCC TCGCTGCTCT GGATGCAGCA CTGATGTGAT CCACGGCTGG 900 GCCACCAAGA TCAGTGCCTA CATCAAGTCT CTGGATCCCA ACCACATGGT CGCCTTGGGT 960 GATGAGGGCA TGGGCTTGAC CATCGGCTCT GATCAGTCGT ACCCGTACGG CACCAGCGAA 1020 GGAAACGACT TTGAGAAGAA CCTGGCTATC CCGGACATTG ACTTCGGAAC TCTCCACCTT 1080 TACACCACTG ACTGGGGTAT CAAGGACAAC GCCTGGGGCA ATGGATGGGT TGAGAACCAC 1140 GCCAAGGCCT GCAAGGCTGC CGGTAAGCCA TGCTTGTTCG AGGAGTATGG CATGAAGGGC 1200 AATCACTGCA CCGACGAGCT GAAGTGGCAA AAGACCTCCC TGAGCTCGGG CACCGCGGCC 1260 GATCTCATCT GGCAGTATGG TCAGCAGCTG TCCACGGGCG AGTCTCCCAA GGATGCGTAC 1320 AGCATCTTTT ACGGCACAGA TGAGTGGAAG TGCGCCGTTA TGGACCATAT GGAAAATGTC 1380 AACAAGAAC 1389 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae (RIB40) <400> 2 Met Arg Ser Leu Ser Ser Ile Ala Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ser Ala Gln Ala Gly Pro Trp Ala Gln Cys Gly Gly Lys Ser Phe Ser 20 25 30 Gly Ser Ser Glu Cys Ala Ser Gly Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asn Glu 35 40 45 Trp Phe Ser Gln Cys Val Pro Gly Ala Glu Ser Thr Thr Pro Thr Val 50 55 60 Ser Ser Thr Pro Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ser Val Ser Ile Thr Ala 65 70 75 80 Ser Val Thr Thr Gly Ile Asn Lys Ser Ile Ser Val Ser Ser Ala Ser 85 90 95 Lys Ser Thr Pro Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Pro Arg 100 105 110 Pro Thr Gly Ser Gly Ser Phe Ala Lys Ala Asp Gly Leu Gln Phe Ser 115 120 125 Ile Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ala Tyr Trp Leu 130 135 140 Pro Phe Gln Met Asn Asp Ala Asp Ile Asp Ser Val Phe Asp His Leu 145 150 155 160 Glu Gln Ala Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val 165 170 175 Asn Thr Ala Pro Ser Pro Gly Thr Val Tyr Phe Gln Leu His Asp Lys 180 185 190 Glu Lys Gly Thr Ser Thr Ile Asn Thr Gly Lys Asp Gly Leu Gln Arg 195 200 205 Leu Asp Tyr Val Val Ala Ala Ala Glu Lys His Gly Val Lys Leu Ile 210 215 220 Ile Pro Phe Val Asn Ser Trp Asp Asp Tyr Gly Gly Tyr Asn Ala Tyr 225 230 235 240 Val Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Glu Trp Phe Thr Asn Glu Lys 245 250 255 Ile Gln Ser Val Tyr Gln Ala Tyr Ile Lys Ala Val Val Ser Arg Tyr 260 265 270 Arg Asp Ser Pro Ala Ile Phe Ala Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Arg 275 280 285 Cys Ser Gly Cys Ser Thr Asp Val Ile His Gly Trp Ala Thr Lys Ile 290 295 300 Ser Ala Tyr Ile Lys Ser Leu Asp Pro Asn His Met Val Ala Leu Gly 305 310 315 320 Asp Glu Gly Met Gly Leu Thr Ile Gly Ser Asp Gln Ser Tyr Pro Tyr 325 330 335 Gly Thr Ser Glu Gly Asn Asp Phe Glu Lys Asn Leu Ala Ile Pro Asp 340 345 350 Ile Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Thr Thr Asp Trp Gly Ile Lys 355 360 365 Asp Asn Ala Trp Gly Asn Gly Trp Val Glu Asn His Ala Lys Ala Cys 370 375 380 Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Phe Glu Glu Tyr Gly Met Lys Gly 385 390 395 400 Asn His Cys Thr Asp Glu Leu Lys Trp Gln Lys Thr Ser Leu Ser Ser 405 410 415 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Ile Trp Gln Tyr Gly Gln Gln Leu Ser Thr 420 425 430 Gly Glu Ser Pro Lys Asp Ala Tyr Ser Ile Phe Tyr Gly Thr Asp Glu 435 440 445 Trp Lys Cys Ala Val Met Asp His Met Glu Asn Val Asn Lys Asn 450 455 460 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 3 CACAATGCGT TCCTTGTCGT CTA 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 4 GTTCTTGTTG ACATTTTCCA TAT 23

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 畑本 修 千葉県野田市野田399番地財団法人 野田 産業科学研究所内 (72)発明者 増田 力 千葉県野田市野田399番地財団法人野田産 業科学研究所内 (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 松田 俊文 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 伊藤 孝太郎 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 高橋 理 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 (72)発明者 松島 健一朗 千葉県野田市野田250番地キッコーマン株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA12 CA02 GA11 HA20 4B050 CC03 DD03 EE10 LL02 LL04 LL05 4B065 AA63Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA41 CA55 CA57 CA60

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白
   質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70％以上の
   配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその
   部分断片であり、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質
2. 【請求項２】 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコード
   するマンナナーゼ遺伝子。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列を含み、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白
   質 (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列と70％以上の
   配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその
   部分断片であり、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質
3. 【請求項３】 以下の(a)、(b) 、(c)又は(d)のDNAを含
   むマンナナーゼ遺伝子。 (a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を
   含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質をコードする
   DNA (c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核
   酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズし、かつマンナナーゼ活性を有す
   る蛋白質をコードするDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAと70%以上の配
   列同一性を示し、かつマンナナーゼ活性を有する蛋白質
   をコードするDNA
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有す
   る組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物からマンナナーゼ蛋白質を採取することを
   特徴とするマンナナーゼの製造方法。